一、CONSTRUCTION OF ACTIVE RECOMBINANT CASPASE-3 EUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID AND EFFECT OF r-CASPASE-3 ON APOPTOSIS OF PANCREATIC CARCINOMA CELLS（论文文献综述）
张婉琪[1]（2021）在《NFATc3在人恶性黑素瘤中的表达及其抑制肿瘤细胞凋亡的作用机制研究》文中指出恶性黑素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤,其发病率以每年3%的速度快速增加。目前,除早期手术切除能获得相对较好的预后外,进展期恶性黑素瘤,因其抗凋亡水平普遍较高,对临床常规放化疗均不敏感,缺乏有效治疗手段,预后极差,一旦发生远处转移5年生存率不足15%。近年来,分子靶向治疗的应用带来了突破性的进展,然而对于好发肢端型恶性黑素瘤的亚洲人群而言,其应答率较低,且易出现获得性耐药,极大限制了患者的临床获益。因此,探索恶性黑素瘤新的分子治疗靶点,抑制其抗凋亡表型是目前研究的重点。活化T细胞核因子（Nuclear factor of activated T cells,NFAT）,是[Ca2+]相关转录因子家族成员。静息状态下,NFAT高度磷酸化局限于细胞质中,当细胞膜上[Ca2+]通道开放,胞内[Ca2+]浓度持续维持在较高水平时,NFAT发生构象改变,去磷酸化暴露核定位序列,随后与目标启动子元件结合并调控特定应答基因的转录,广泛调控着细胞的各项生命活动。研究表明,NFAT的调控不仅局限于神经发育和免疫系统中,在肿瘤细胞的各项活动和恶性转化中同样发挥重要作用。最新的研究证明,NFAT家族的表达水平与恶性黑素瘤的发生发展有着密切的联系,其中,NFATc3在包括食管癌、三阴性乳腺癌和恶性胶质瘤等恶性程度较高的疾病的病理生理过程中起着重要作用,但是NFATc3在恶性黑素瘤中的表达与功能如何,需要进一步研究。本实验采用临床转移性和未转移恶性黑素瘤样本以及不同恶性度人源黑素瘤细胞进行研究,探讨NFATc3在不同黑素瘤组织及细胞中的表达及其与恶性度的相关性,进一步通过构建NFATc3及其下游cLIP特异性敲减和过表达质粒并转染细胞,随后采用CCK-8、Western Blot、免疫荧光、流式细胞学等方法检测NFATc3及cLIP对恶性黑素瘤发生发展的影响及其可能的作用机制,为探索黑素瘤的潜在分子治疗靶点提供理论依据和数据支持。本实验结果分为四个部分:第一部分恶性黑素瘤蛋白表达差异及不同恶性度组织和细胞中NFATc3表达1.蛋白组学分析恶性黑素瘤组织与癌旁组织蛋白表达差异:蛋白组学检测发现,差异蛋白主要分布在细胞器、膜、细胞质、含蛋白复合体中,以结合、催化活性和结构分子活性等功能为主,参与代谢、发育、对刺激反应和定位等生物学过程,且在钙离子结合处富集最为显着。2.TCGA数据库分析表明NFATc3在恶性黑素瘤中呈高表达通过对数据库组织样本进行统计分析,结果表明,恶性黑素瘤组织中NFATc3的表达较正常组织显着增加（P<0.001）。3.NFATc3在恶性黑素瘤组织中均有表达,且在转移性黑素瘤中表达更高免疫组化染色方法检测病理石蜡切片中NFATc3的表达,发现NFATc3在恶性黑素瘤组织中均有表达（P<0.05）,且在转移性恶性黑素瘤组织中呈高表达（P<0.05）,在癌旁组织中几乎无表达（P<0.01）。4.恶性黑素瘤细胞中NFATc3的表达量与其恶性度呈正相关（1）qPCR检测不同品系恶性黑素瘤细胞中NFATc3的mRNA水平,结果显示NFATc3在4种恶性黑素瘤细胞系中的表达均高于正常色素细胞。且其在神经节转移来源的Mel-RM细胞中表达最高,在原位来源的A375细胞中表达相对较低（P<0.01）;（2）对不同恶性度的黑素瘤细胞进行免疫荧光染色,观察到NFATc3在神经节转移来源Mel-RM细胞中荧光强度明显高于皮肤原位来源A375细胞;上述结果均提示NFATc3在恶性黑素瘤中的表达较正常组织具有显着上调,并且其表达量与恶性程度呈正相关。第二部分CRISPR/Cas9技术构建NFATc3敲减质粒,体外转染并鉴定首先将设计合成的质粒分别转染293T细胞,结果显示转染sg RNA3-NFATc3重组质粒后,其NFATc3表达水平较其他两组显着减低（P<0.01）,表明sg RNA3-NFATc3敲减效果最优。将sg RNA3-NFATc3敲减质粒和阴性对照质粒sg RNA-NC转染MEL-RM细胞,转染48 h后,Western blot检测结果显示,敲减组细胞中NFATc3蛋白的表达显着低于对照组（P<0.01）,提示sg RNA3-NFATc3敲减的Mel-RM细胞构建成功,可用于后续研究。第三部分NFATc3通过抑制恶性黑素瘤细胞凋亡水平促进其存活及侵袭:1.敲减MEL-RM细胞NFATc3的表达,能降低细胞活性,但不影响细胞增殖:（1）CCK-8检测结果显示,敲减NFATc3后Mel-RM细胞活性明显降低（P<0.01）;（2）Ed U染色结果表明,敲减NFATc3后Mel-RM细胞中Ed U阳性细胞较对照组无明显差异（P>0.05）;免疫荧光检测可观察到,敲减NFATc3后Mel-RM细胞中PCNA阳性荧光细胞比率与转染阴性质粒的对照组无显着差异（P>0.05）。2.敲减NFATc3促进Caspase-8、Caspase-3活化,导致Mel-RM细胞凋亡（1）流式细胞学检测结果显示,敲减NFATc3后Mel-RM凋亡细胞比率增加（P<0.01）;（2）TUNEL凋亡染色发现,降低NFATc3的表达后Mel-RM细胞中,TUNEL阳性细胞比率明显增多（P<0.01）;（3）免疫荧光检测观察到,敲减组Mel-RM细胞中总Caspase-3阳性荧光信号分布于胞浆中,且阳性细胞比率较对照组明显升高（P<0.01）;（4）Western blot检测结果发现,敲减NFATc3可分别在18k Da及17k Da处观察到活化的Caspase-8及Caspase-3蛋白表达明显增加;3.敲减NFATc3抑制Mel-RM细胞侵袭、迁移能力（1）细胞划痕实验结果显示,敲减NFATc3后,MEL-RM细胞愈合百分比显着减小（P<0.01）;（2）Transwell迁移实验结果表明,与对照组相比,敲减NFATc3后细胞穿透小室的数量显着减少（P<0.01）;（3）Transwell侵袭实验观察到,敲减组转染Mel-RM细胞24h后,穿透小室的细胞数量较对照组显着减少（P<0.01）;4.pCMV-NFATc3过表达质粒转染A375细胞进行反向验证（1）通过Western Blot鉴定,转染pCMV-NFATc3后48h,A375细胞中NFATc3的表达增加,表明已成功构建NFATc3过表达的A375细胞。（2）使用凋亡诱导剂对A375细胞进行处理后,经流式细胞学检测结果显示,过表达NFATc3的A375细胞凋亡比率仍较对照组明显降低（P<0.05）;（3）经凋亡诱导剂处理后,TUNEL凋亡染色发现,过表达NFATc3的A375细胞TUNEL阳性细胞较对照组明显减少（P<0.01）;（4）Western blot检测结果证实,过表达NFATc3后可分别在18k Da及17k Da处观察到活化的Caspase-8及Caspase-3蛋白表达量明显降低;上述结果均表明,NFATc3能显着提高Mel-RM细胞活性,但对其增殖无明显影响;抑制NFATc3的表达能增强Caspase-8、Caspase-3活化,促进细胞凋亡的发生,同时减弱Mel-RM细胞迁移,并减弱其侵袭能力。第四部分NFATc3通过调控cLIP表达量影响恶性黑素瘤细胞的凋亡1.NFATc3与cLIP表达的呈正相关性（1）qPCR检测cLIP在不同品系恶性黑素瘤细胞系和正常色素细胞系中的表达,结果发现,cLIP在恶性黑素瘤细胞系中的表达均高于正常色素细胞系。并且与NFATc3表达一致,在神经节转移来源的Mel-RM细胞系中表达最高,而在皮肤原位来源的A375细胞系中表达相对较低（P<0.05）。（2）生物信息学证实NFATc3和cLIP表达在恶性黑素瘤中呈正相关性（R=0.51,P<0.01）。2.cLIP在恶性黑素瘤细胞中可促进细胞存活,增强细胞抗凋亡能力（1）敲减cLIP的Mel-RM细胞中,Western blot检测结果发现Mel-RM细胞Caspase-8及Caspase-3表达增加;TUNEL凋亡染色证实,TUNEL阳性细胞比例明显增多;流式细胞学表明,敲减cLIP后,Mel-RM细胞凋亡水平增高;（2）过表达cLIP的A375细胞经凋亡诱导剂处理后,Western blot检测结果发现A375细胞中Caspase-8及Caspase-3表达降低;TUNEL凋亡染色证实,TUNEL阳性细胞比例明显减少;流式细胞学表明,A375细胞抗凋亡水平增强;3.NFATc3可通过上调cLIP的表达增强细胞抗凋亡能力通过共转染技术证实,回补cLIP能逆转NFATc3敲除后对Mel-RM细胞凋亡水平上调的作用,提示NFATc3可通过上调cLIP的表达增强细胞抗凋亡能力;综上所述,本研究发现:1.NFATc3在恶性黑素瘤中表达升高,且在转移性来源的肿瘤中较原位来源的肿瘤表达更高,提示其表达量与恶性度呈正相关性。2.通过Crispr-cas9技术特异性敲减转移性恶性黑素瘤Mel-RM细胞中NFATc3的表达,可见Caspase-8、Caspase-3活化增强,凋亡水平升高,细胞活性降低,同时细胞迁移和侵袭能力减弱;在原位来源A375细胞系中过表达NFATc3可见Caspase-8、Caspase-3活化减少,凋亡水平受抑制,细胞活性增加。表明NFATc3能通过抑制Caspase-8、Caspase-3的活化水平对恶性黑素瘤凋亡产生负向调控,促进细胞存活并为其侵袭、转移创造条件。3.cLIP敲减后能够诱导高恶性Mel-RM细胞出现凋亡,通过cLIP过表达后增强了原位来源A375细胞对凋亡诱导剂的拮抗能力。最终通过共转染回补实验进一步证实,NFATc3在恶性黑素瘤细胞中主要通过上调cLIP表达进而抑制Caspase-8、Caspase-3的活化水平,从而促进恶性黑素瘤抗凋亡表型的表达。
闫欢[2]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中研究说明研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
张丽萌[3]（2020）在《FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究》文中研究指明FHL2（four and a half LIM domains protein 2）属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显着,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR（RT-PCR）方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测FHL2蛋白在绵羊卵巢组织中的表达分布;采用细胞免疫荧光检测FHL2蛋白在卵巢颗粒细胞中的定位。结果表明:绵羊卵巢中FHL2表达水平高于其它组织,克隆得到的绵羊卵巢FHL2基因CDS为 837bp,编码 279 aa,与GenBank预测序列一致,未发生氨基酸突变,绵羊氨基酸序列与人、牛、猪、马、鸡、狗、猴同源性分别为86%、98.3%、91.7%、89.3%、76.5%、88.2%、86.2%;FHL2主要分布在绵羊卵巢的卵泡（有腔卵泡和无腔卵泡）中,亚细胞定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中。利用分子克隆技术构建真核过表达载体pcDNA3.1-FHL2,设计合成siRNA 靶向siRNA的干扰序列,转染颗粒细胞后摸索干扰效率,在体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞中建立超表达和干扰两种卵巢颗粒细胞模型。结果表明:（1）成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FHL2,转染至绵羊颗粒细胞后24 h显着提高FHL2的表达;（2）成功合成3条FHL2基因的siRNA,通过RT-PCR和Western Blot检测摸索最佳转染时间和干扰效果,显示siFHL2-2在转染后72 h能够显着降低FHL2的表达。利用AlamarBlueTM HS检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,ELISA方法检测颗粒细胞雌激素和孕酮分泌变化,RT-PCR检测细胞凋亡（Bcl-2,Bax,p53和Caspase3）、细胞周期（CyclinD1,CyclinB1和p21）以及激素分泌（StAR,3β-HSD,CYP11,CYP19）相关基因的mRNA表达水平。结果表明:通过FHL2过表达模型证实:细胞转染后24 h,与对照组相比,FHL2过表达抑制绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）;正常细胞比例显着降低（P<0.05）,细胞晚期凋亡率升高（P<0.05）,检测细胞凋亡相关基因表达水平,Bcl-2表达水平显着下调（P<0.05）,Bax和Caspase3表达水平上调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值下调（P<0.01）,促进细胞凋亡;细胞周期G0/G1期和S期细胞的比例降低（P<0.001）,细胞周期因子Cyclin B1表达水平显着下调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2和P的分泌量显着降低（P<0.05）,CYP19Al、3β-HSD基因表达水平下调（P<0.05）。通过siRNA干扰模型证实:细胞转染后72 h,与对照组相比,干扰FHL2的表达能够促进绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）,检测细胞凋亡和凋亡相关基因的表达水平,正常细胞比例升高（P<0.05）,细胞晚期凋亡率降低（P<0.05）,Caspase3表达水平下调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值上调（P<0.05）,抑制细胞凋亡;细胞周期S期和G2/M期细胞的比例升高（P<0.05）,细胞周期因子Cyclin D1和p21表达上调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2分泌量升高（P<0.05）,CYP19A1、CYP11A1和StAR基因表达上调（P<0.05）。通过酵母双杂交技术构建绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交文库,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-FHL2,利用酵母双杂交文库筛选与FHL2蛋白互作的宿主蛋白。结果表明:成功构建了含有3×108个重组子的绵羊卵巢组织cDNA的酵母双杂交文库,文库滴度为2×107 cfu/mL,以及诱饵载体pGBKT-FHL2,检测诱饵载体无毒性及自激活活性。利用pGBKT7-FHL2诱饵质粒,在酵母文库中筛选出与FHL2互作的蛋白共 1 1 个（RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD）,Blast比对分析发现这些蛋白主要参与蛋白质合成、基因转录、细胞增殖分化、细胞凋亡及信号通路调控等过程。通过添加外源生长因子TGF-β1,研究在卵巢颗粒细胞中对FHL2的表达水平变化。利用TGF-β1蛋白及几个重要信号通路的抑制剂PI3K（Deguelin）、MEK（Combimetinib）、NF-κB（BAY11-7082）、JNK（SP600125）、MAPK（SB202190）处理体外培养的绵羊颗粒细胞,开展FHL2作用信号通路的试验验证。结果表明:外源添加TGF-β1蛋白使FHL2表达水平上调（P<0.05）,在此基础上,分别添加上述的信号通路抑制剂,结果显示添加PI3K和MARK信号通路抑制剂,导致FHL2表达水平下调（P<0.05）,证实PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的信号通路。综上所述,绵羊FHL2基因CDS序列全长837 bp,编码279个氨基酸,在卵巢组织中高表达,定位于卵泡颗粒细胞;FHL2影响颗粒细胞的增殖、凋亡、周期和类固醇激素（E2和P）分泌及相关基因表达;筛选获得与其互作蛋白有RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD共计11个,在绵羊卵泡发育中可能通过互作参与细胞的增殖、凋亡等信号通路过程;PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的细胞信号通路。
戴月娣[4]（2020）在《KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究》文中研究指明胰腺导管癌是一种恶性程度高、病程短、进展快、预后极差的恶性肿瘤,具有复杂的基因组环境。KLF2是Krüppel样因子家族的重要成员,文献报道在多种恶性肿瘤组织中表达下调,与恶性肿瘤关系密切。但是KLF2与胰腺癌的关系未见报道,关系不明确,结合既往研究我们推测KLF2可能协同其他分子参与异常信号通路调节,导致胰腺癌发生、发展。本研究旨在探讨KLF2对胰腺癌细胞生物学行为影响及其机制。第一部分KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响研究目的探讨KLF2对胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老的生物学行为影响。研究方法免疫组化法、Western Blot、RT-PCR法对52例胰腺导管癌组织和配对正常胰腺组织KLF2水平进行检测,观察胰腺癌组织KLF2表达变化,探讨KLF2与胰腺癌发生的关系。真核表达载体转染KLF2至BXPC3和Suit2细胞株,构建稳定生长过表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞;RNA干扰的病毒载体感染细胞株,构建稳定生长并低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞。Boyden chamber实验检测过表达和低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的迁移能力,结晶紫法检测过表达和低表达KLF2细胞的增殖生长能力。Lipofectamine 2000载体转染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的过表达KLF2细胞;RNA干扰病毒载体感染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的低表达KLF2细胞。SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2对HPAC和SW1990细胞衰老影响。荧光素酶基因标记低表达KLF2的BXPC3细胞注入裸鼠心脏,检测肿瘤转移光子数变化;裸鼠皮下种植过表达KLF2的SW1990细胞,测定肿瘤大小计算肿瘤体积,处死小鼠测肿瘤重量;观察KLF2表达对肿瘤体内生长和转移的影响。分离PDX-Cre KrasG12D（KC）小鼠胰腺组织,建立胰腺癌类器官,Lipofectamine 2000作为载体建立过表达KLF2的类器官,体外观察过表达KLF2对胰腺癌类器官生长影响。研究结果与正常胰腺组织相比,胰腺导管癌组织中KLF2 m RNA水平下降、KLF2免疫组化染色阴性增多、KLF2蛋白水平下调。敲减KLF2的BXPC3和Suit2细胞克隆形成和迁移能力增强,低表达KLF2的HPAC细胞和SW1990衰老细胞比例减少,低表达KLF2的BXPC3细胞在裸鼠体内转移光子信号更多。高表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的克隆形成和迁移降低;高表达KLF2的HPAC和SW1990细胞衰老细胞比例更高;高表达KLF2的SW1990细胞裸鼠皮下移植瘤体积更小、重量更轻。高表达KLF2的胰腺癌类器官生长大小更小、数量少。研究结论KLF2低表达与胰腺导管癌发生相关。KLF2高表达能够抑制胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并诱导细胞衰老,抑制胰腺癌干细胞生长;KLF2低表达能够促进胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并抑制细胞衰老。第二部分KLF2抑制胰腺癌的机制研究研究目的探讨KLF2调控胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老等生物学行为改变的机制。研究方法采用报告基因检测法分析过表达KLF2对β-catenin/TCF转录活性及其信号通路下游部分靶基因影响,探讨KLF2通过调控β-catenin/TCF信号抑制胰腺癌机制。Western Blot法及q PCR法测定KLF2变化对细胞衰老标记物p21蛋白及m RNA表达变化,阐明KLF2通过诱导胰腺癌细胞发生衰老抑制胰腺癌。免疫沉淀后质谱法鉴定KLF2的结合蛋白,纯化GST-KLF2融合蛋白进行GST pull-down实验,探讨内源性FOXO4与KLF2的相互作用;免疫共沉淀检测外源性FOXO4是否与KLF2形成复合物,探讨外源性FOXO4与KLF2的相互作用。敲减FOXO4检测KLF2变化,结合敲减KLF2检测FOXO4变化,Western Blot法检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对p21表达影响,SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对细胞衰老影响,探讨KLF2与FOXO4通过调控衰老抑制胰腺癌机制。过表达KLF2的HPAC细胞分别敲减FOXO4或p21,SA-β-Gal染色软琼脂实验观察衰老细胞克隆形成,观察敲减FOXO4和p21对细胞衰老的挽救作用。芯片实验检测KLF2和FOXO4与p21启动子的结合,Flag分别标记KLF2的AD、ID和ZF结构域后转染SW1990细胞,免疫沉淀Western Blot法检测KLF2与FOXO4结合的结构域,定位KLF2发挥抑制功能的结构区域。研究结果KLF2过表达可抑制氯化锂（Li Cl）诱导的Topflash报告基因激活,KLF2过表达可与β-catenin/TCF结合直接抑制其转录活性,也可下调β-catenin/TCF下游c-Jun、c-Myc、cyclin D1和Snail基因表达,抑制β-catenin/TCF信号通路。过表达KLF2诱导衰老特异标记物p21蛋白和m RNA水平显着升高;敲减KLF2后的胰腺癌细胞衰老减少,p21蛋白和m RNA水平降低。KLF2可与内源性FOXO4相互作用,与外源性FOXO4形成复合物,KLF2和FOXO4可通过与p21启动子结合协同诱导p21蛋白表达,共同诱导胰腺癌细胞衰老。敲减FOXO4和p21对KLF2诱导细胞衰老具有挽救作用。KLF2的AD区介导KLF2与FOXO4的相互作用,ID和ZF不能协同FOXO4诱导p21的表达,并且与FOXO4的共表达可能抑制FOXO4单独诱导p21表达作用,提示ID和ZF突变体为负调节因子。研究结论KLF2可直接与β-catenin/TCF结合抑制其转录活性、也可通过抑制其下游基因表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路后抑制胰腺癌。KLF2还可直接诱导p21表达,或与FOXO4结合协同诱导p21表达,诱导胰腺癌细胞衰老抑制胰腺癌。KLF2结构域的AD区与FOXO4绑定起正调节作用,ID和ZF突变体与FOXO4结合起负调节作用。调低FOXO4和p21表达能挽救KLF2诱导的胰腺癌细胞衰老。
张亮[5]（2020）在《miR-28-5p靶向MTSS1对食管癌生长的作用及机制研究》文中指出目的:食管癌（Esophageal Cancer）是消化道最常见的恶性肿瘤之一,它的发病率和死亡率在全球位居所有恶性肿瘤前列。我国是食管癌发生的最严重区域之一,中老年群体较多发,且男性的发病率高于女性。临床上食管癌呈现出两种病理组织类型:即腺癌（Esophageal Adenocarcinoma）和鳞癌（Esophageal Squamous cell carcinoma）,其中后者较为常见,约占所有食管癌的80%。食管癌具有早转移、晚发现的特点,治疗手段以手术和放、化疗为主,但疗效并不理想、患者生存率低且复发率高,严重威胁着公共健康。因此,深入研究探讨其致病机理具有重要的公共卫生意义。microRNA（mi RNA）是一类内源性、非编码小RNA分子,能通过调控下游靶基因而参与多种肿瘤的生长、分化、转移等方面,在肿瘤的发生发展过程中发挥着十分重要的作用。miR-28-5p是一个具有多种生物学功能的microRNA,能够调控肾癌和结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并与肝癌和卵巢癌发生发展过程关系密切。然而miR-28-5p在食管癌中的表达情况及作用机制还不清楚。基于此,本论文拟研究mi R-28-5p在食管癌组织中的表达情况并探索miR-28-5p及其靶基因肿瘤转移抑制子（Metastasis suppressor 1,MTSS1）在食管癌发生发展中的作用及相关机制。研究方法:1.收集新鲜食管癌及对应的癌旁组织各30例,qRT-PCR检测临床样本中miR-28-5p的表达水平。同样用qRT-PCR检测2种食管癌细胞中miR-28-5p的表达水平,并在转染miR-28-5p mimics或inhibitor后,用CCK-8试验、流式细胞术和western blotting分别检测它们对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。2.采用生物信息学方法、双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和wetsern blotting预测并鉴定miR-28-5p的下游靶基因。3.检测食管癌临床样本中MTSS1的表达水平,并将MTSS1过表达质粒与miR-28-5p mimics共转染TE-1细胞,再将MTSS1 siRNA与miR-28-5p inhibitor共转染细胞,CCK-8试验、流式细胞术和western blotting检测它们对细胞增殖和细胞周期的影响。4.皮下注射食管癌细胞TE-1建立裸鼠移植瘤模型,经注射miR-28-5p antagomir治疗后,观测裸鼠瘤体体积、组织病理学及MTSS1表达的变化情况,western blotting检测细胞周期相关蛋白（cyclin A、cyclin D1、cyclin E和CDK2）及凋亡相关蛋白（caspase3和caspase9）的表达。结果:1.与正常癌旁组织相比,miR-28-5p在食管癌组织中的表达显着升高,且在2种食管癌细胞株中也上调表达。上调食管癌细胞中miR-28-5p的表达能显着促进细胞的增殖、促进细胞由G1期向S期转化及抑制细胞凋亡;mi R-28-5p下调表达则抑制细胞的增殖、抑制细胞由G1期向S期转化并促进细胞凋亡。2.生物信息学方法预测MTSS1是miR-28-5p的潜在靶点,双荧光素酶报告基因系统鉴定、qRT-PCR和western blotting结果表明,MTSS1是miR-28-5p的下游靶基因,miR-28-5p与MTSS1 3’-UTR区互补结合。转染miR-28-5p mimics后,MTSS1的mRNA和蛋白表达水平显着降低;转染miR-28-5p inhibitor后,MTSS1的mRNA和蛋白表达水平显着升高。3.与癌旁组织相比,MTSS1在食管癌组织中的表达显着下降。MTSS1过表达质粒与miR-28-5p mimics共转染TE-1细胞后,细胞增殖能力显着降低,表明MTSS1过表达能逆转miR-28-5p对细胞增殖的促进作用,并促进凋亡;此外,MTSS1的敲减能逆转miR-28-5p抑制剂对癌细胞生长的抑制作用,并抑制凋亡。4.与对照组相比,注射mi R-28-5p antagomir能显着减小荷瘤裸鼠肿瘤瘤体体积,能使肿瘤细胞核萎缩并减少细胞数量而抑制癌细胞的增殖。另外,注射miR-28-5p antagomir还可显着上调裸鼠内MTSS1蛋白的表达,减少Ki-67的表达,通过下调cyclin A、cyclin D1、cyclin E和CDK2的表达并上调caspase3和caspase9的表达而使荷瘤裸鼠体内癌细胞发生G1细胞周期阻滞,最终促进肿瘤细胞凋亡。结论:miR-28-5p在食管癌中的表达上调,MTSS1是它的靶基因,miR-28-5p的表达与MTSS1的表达呈负相关,mi R-28-5p通过抑制MTSS1的表达而促进食管癌的细胞增殖和瘤体生长。
刘佳玉[6]（2019）在《重组irisin在毕赤酵母中的表达及其对人胰腺导管癌抗癌活性的研究》文中研究表明民众生活水平的逐渐改善以及运动的缺乏,导致肥胖及2型糖尿病患者的数量不断增加,也使得癌症的发病率不断增长。现代医学的发展对于癌症的控制已经取得很大的进展,但由于癌症的复杂性和化疗药物的毒副作用及耐药性,癌症仍然是全球范围内死亡率最高的疾病。已有研究证实锻炼及改善肥胖可以降低癌症的发病率以及复发风险,对肿瘤的辅助化疗起到积极作用,但相关作用机制仍在研究中。Irisin是近些年发现的一种骨骼肌伴随运动产生的肌因子,在体内分布广泛。研究表明irisin可以调节体重,并影响各种代谢性疾病,其中包括肥胖、2型糖尿病（T2DM）、脂质代谢和心血管疾病（CVD）、非酒精性脂肪肝（NAFLD）等。Irisin还可以通过上调过氧物酶体增殖物活化受体（PPAR）γ辅助活化因子1α（PGC-1α）和解偶联蛋白1（UCP1）,诱导白色脂肪组织的褐变。此外,作为运动相关的肌肉及脂肪因子,irisin在癌症患者体内水平的改变和irisin对多种癌症的体外影响及其机制研究已经得到了许多关注。因此,irisin有潜力成为治疗某些癌症的药物。本研究中,主要开展了三部分工作:第一部分,利用毕赤酵母（P.pastoris）真核表达系统,构建了重组irisin的表达体系,表达并纯化了糖基化修饰的E-irisin。针对已有报道的irisin对癌细胞生长的抑制作用,验证本研究中真核表达重组E-irisin和原核表达重组P-irisin的抗癌活性,并评估了重组irisin对几种肥胖相关癌症的影响。第二部分,主要研究重组irisin对胰腺导管癌细胞的增殖、迁移、侵袭的抑制作用及其作用机制。第三部分,探讨了irisin与化疗药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）共同作用对诱导胰腺导管癌凋亡的影响和可能的作用机制。第一部分:毕赤酵母真核表达重组E-irisn及重组irisin的抗癌活性测定根据P.pastoris密码子偏好合成了含有6×His tag的irisn序列;利用EcoR I,Not I将目的基因连接到表达质粒上,成功构建pPIC9K-irisin;将其线性化并导入至P.pastoris宿主菌GS115中,经G418抗性筛选获得高拷贝的GS115-pPIC9K-irisin转化子;进一步对P.pastoris表达条件进行了优化,以最佳诱导时间为96h、最佳甲醇剂量为1%、最佳温度30°C、最佳pH为6.0诱导获得了重组蛋白,并经免疫亲和实验（Western blot）和过碘酸希夫染色（Periodic Acid-Schiff stain,PAS）染色鉴定确认,纯化后得到糖基化修饰重组E-irisin。利用真核来源重组E-irisin和原核来源重组P-irisn,验证了本实验中的重组irisin对乳腺癌、肺癌均具有一定的抑制作用,与已有报道结果相符。此外,我们还发现重组E-irisin和重组P-irisn对胰腺导管癌MIA PaCa-2细胞也呈现出抗肿瘤活性,但对于肝癌细胞BEL-7402、人急性早幼粒细胞白血病NB4、人多发性骨髓瘤RPM18226均未见明显作用。第二部分:重组irisin对胰腺导管癌细胞MIA PaCa-2增殖、迁移、侵袭的抑制作用及作用机制免疫荧光分析显示irisin在MIA PaCa-2细胞膜表面可能存在有未知受体。MTT和细胞克隆形成实验表明,重组E-irisin和P-irisin均具有抑制MIA PaCa-2细胞的生长,抑制细胞克隆形成的能力。流式细胞术分析显示重组E-irisin和P-irisin会使MIA PaCa-2的细胞周期阻滞于G0/G1期,降低周期蛋白Cyclin D1的水平。划痕实验和Tanswell实验表明,MIA PaCa-2细胞的迁移和侵袭也受到抑制,并且重组E-irisin和P-irisin通过改变上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition,EMT）过程中的标志蛋白E-cadherin、vimentin的表达,抑制MIA PaCa-2细胞EMT过程。另外,本研究还发现重组E-irisin和P-irisin激活了细胞中生物能量代谢调节的关键分子AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）,引起MIA PaCa-2胞内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的抑制,进而下调其靶分子p70核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）,真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）的磷酸化,影响细胞中蛋白质的代谢。但本研究中未发现重组E-irisin和P-irisin在抑制胰腺导管癌过程中的显着区别,推测irisin是否进行糖基化修饰并不影响其在MIA PaCa-2细胞中的活性。第三部分:重组irisin对胰腺导管癌DOX化疗敏感性的影响本研究发现irisin可以显着降低DOX在MIA PaCa-2和BxPC-3细胞中的IC50值,增强低浓度DOX的抗癌活性,并能提高MIA PaCa-2和BxPC-3胞内caspase-3和PARP蛋白的剪切激活,降低BCL-2和BCL-xL的表达,增加DOX引起的MIA PaCa-2和BxPC-3细胞凋亡。在MIA PaCa-2和BxPC-3细胞中,irisin下调了丝氨酸/苏氨酸激酶AKT,核转录因子kappa B（nuclear factorκB,NF-κB）p65的磷酸化,上调了DOX引起的抑制核因子κB（IkB-α）的下降,通过抑制磷脂酰肌醇三激酶PI3K/AKT和NF-κB信号通路增强了MIA PaCa-2和BxPC-3细胞对DOX的敏感性。
姚艳丽[7]（2019）在《多糖HH1-1抗胰腺癌和糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC6促胰腺癌的功能及机制研究》文中认为胰腺癌作为恶性程度极高的实体肿瘤,具有发病率逐年升高,预后差,致死率高的特点。胰腺癌易复发和转移,并易对化疗药物产生耐药性。胰腺癌的高发病率和死亡率主要由两方面的临床困境造成,一是缺乏有效的早期检测方法,二是由于对胰腺癌发生发展机理缺乏深入了解而缺乏有效的治疗手段。因此,揭示胰腺癌的发病机制,寻求有效的早期检测方法和治疗策略是治疗胰腺癌的核心任务。本课题主要研究天然多糖对胰腺癌的干预机制以及细胞膜糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC6在胰腺癌中的功能及机制。细胞毒性的化疗一直是胰腺癌治疗的主要手段。目前临床上广泛使用的胰腺癌一线治疗是FOLFIRINOX（亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂等几种化疗药物联合用药方案）和吉西他滨-白蛋白紫杉醇联合用药方案。但胰腺癌对这些化疗药物易产生高耐药性,且化疗药物毒副作用大,将大大降低患者的生活质量。此外,由于胰腺癌特殊的肿瘤微环境特征,将阻碍药物渗透至肿瘤细胞,使其克服化疗药物的毒性,而实现肿瘤持续性增长。因此,胰腺癌新的治疗策略亟待开发。但是到目前为止,无论是靶向治疗还是免疫治疗,这两种癌症治疗的最新举措,都没有在胰腺癌的治疗上取得突破性的积极成果。多糖是构成生命体的重要组成成分具有广泛的生物活性。例如免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、降血糖、抗氧化、抗病毒、神经保护、抗Aβ42聚集以及缺血再灌注损伤保护等作用。此外,相对小分子化合物,大部分多糖几乎没有毒副作用。相比于细胞毒类药物,多糖类药物在临床上可改善患者生存质量,减轻毒副作用。基于此,我们从活血化瘀的中药红花中提取得到红花多糖,对其在胰腺癌中的作用进行深入研究。红花是最古老的作物之一,属于桔梗目、菊科、红花属植物,红花的入药部位是其干燥花。据《本草纲目》、《雷公炮制药性解》和《金匮要略》等书籍记载,红花广泛用于治疗血瘀,痛经和其他女性疾病。此外,红花的水提取物,羟基红花黄色素A（HSYA）,被用于治疗心血管疾病,疗效显着。由于该植物的广泛生物活性,越来越多研究正致力于研究红花中有效的活性成分和作用机制。目前据文献统计,已经分离和鉴定了来自红花的种子,根茎和花中超过100种化合物,主要包括类黄酮、生物碱、有机酸和聚乙炔。但是红花中的多糖成分研究较少,尤其在抗肿瘤领域更是鲜有研究。我们从红花中分离出粗多糖HH,对HH进行抗胰腺癌、乳腺癌、脑星形胶质母细胞瘤、肝癌、结肠腺癌、慢性髓系白血病、宫颈癌、恶性黑色素瘤和非小细胞肺癌九种肿瘤的活性筛选,发现HH对胰腺癌BxPC-3细胞生长有良好的抑制活性,抑制率为89.50%。随后,通过进一步分离纯化和结构解析,我们发现粗多糖HH中的主要成分HH1-1具有良好的抗胰腺癌活性。而该均一多糖对正常胰腺导管上皮细胞和肝细胞几乎没有毒性。克隆形成实验揭示HH1-1可显着抑制胰腺癌细胞形成的克隆数目和克隆大小。细胞周期检测发现,HH1-1处理后的胰腺癌BxPC-3和AsPC-1细胞周期会阻滞于S期,细胞周期相关蛋白磷酸化AKT,磷酸化CDK2,Cyclin A2表达下调,激酶抑制蛋白P21表达上调。Annexin V/PI双染色法、Hoechst 33258染色法和Caspase-3活性检测法的结果显示,HH1-1可诱导胰腺癌细胞BxPC-3和AsPC-1凋亡。Bcl-2在HH1-1处理后表达下调;Bax和Cleaved Caspase-3在HH1-1处理后表达量上调。此外,HH1-1还可以抑制胰腺癌细胞BxPC-3和AsPC-1的迁移和侵袭。通过HMEC-1细胞管腔形成实验和鸡胚尿囊膜实验发现,HH1-1可在体内和体外显着抑制血管新生。随后,我们通过体内实验,进一步证实了HH1-1的抗胰腺癌作用。通过胰腺癌细胞BxPC-3皮下移植瘤实验,我们发现0.5 mg/kg HH1-1可显着抑制肿瘤的体积和重量,其抑制作用与40 mg/kg阳性药吉西他滨的抑制作用相类似。我们使用人源性肿瘤组织异种移植模型（PDX）,来模拟胰腺癌病人肿瘤的血运特点、基质特征和坏死状况等。实验结果显示,HH1-1能够浓度依赖性的抑制PDX肿瘤的体积和重量,高浓度50 mg/kg时其相对抑制率达58.78%。并且,在两项动物实验中,我们发现HH1-1对小鼠的体重和状态没有明显的影响,表明HH1-1具有很好的安全性。针对HH1-1的结构特征,我们对它的靶向性进行了探索。HH1-1作为一种阿拉伯半乳聚糖,可能会与半乳糖凝集素家族成员发生相互作用。我们发现在HH1-1处理BxPC-3和AsPC-1细胞后,Galectin-1、3、7在mRNA水平会发生显着下调。表面等离子共振实验（SPR）结果显示,HH1-1能够和Galectin-3结合,KD=4.158E-6。但HH1-1不与Galectin-1和Galectin-7结合。且HH1-1不能与Galectin-3的配体EGFR结合,却能够抑制Galectin-3和EGFR的结合,从而阻断EGFR下游信号通路。EGFR作为肿瘤增殖、血管生成和肿瘤侵袭转移等过程的关键分子,阻断EGFR下游信号通路可显着抑制肿瘤进展。由于HH1-1可以抑制Galectin-3和EGFR的mRNA水平和蛋白水平,因此我们推测HH1-1可通过影响Galectin-3和EGFR的转录,进而影响两者的表达。通过分析和筛选Galectin-3和EGFR的转录因子,我们发现HH1-1处理胰腺癌细胞BxPC-3和AsPC-1后,两者的共同转录因子FOXO3表达量显着上调。通过构建shRNA敲减Galectin-3和EGFR,以及外源性加入Galectin-3蛋白的回补实验,我们进一步在mRNA和蛋白水平研究,发现HH1-1可通过抑制Galectin-3/EGFR/AKT/FOXO3信号通路,发挥抗胰腺癌的活性。通过免疫组化和Western Blot,我们在两种移植瘤模型中验证了HH1-1在体内也是通过这一信号通路发挥作用。综上所述,我们从红花中分离纯化出一种结构明确的均一多糖HH1-1。HH1-1具有良好的抗胰腺癌活性,且无明显毒副作用。HH1-1通过抑制胰腺癌细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制迁移和侵袭、抑制血管新生,发挥抗胰腺癌活性。靶向性研究发现HH1-1可结合Galectin-3。机制研究揭示,HH1-1结合Galectin-3,从而抑制Galectin-3与EGFR的结合,抑制EGFR下游信号通路:阻滞AKT的磷酸化水平,进一步导致FOXO3的磷酸化水平降低,FOXO3的表达量上升,转录因子FOXO3进入细胞核,影响关键分子的转录,最终呈现胰腺癌抑制表型。此外,FOXO3是Galectin-3与EGFR的转录负调控因子,当FOXO3表达量上升后,Galectin-3与EGFR的转录被抑制,最终导致Galectin-3与EGFR表达下调,进一步增加其抑制胰腺癌的作用。上述研究表明多糖HH1-1通过与Galectin-3结合,干预EGFR信号通路发挥抗胰腺癌活性。而在胰腺癌临床研究中的另一困境则揭露出,目前针对胰腺癌尚无有效的诊断标志物和药物靶点。因此,我们关注细胞膜表面的蛋白聚糖在胰腺癌发生发展中的功能和机制。前期已有研究表明糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族在多种肿瘤中具有重要的生物学作用,我们将聚焦糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族在胰腺癌发生发展过程中发挥什么生物活性呢?为了回答这一问题,我们首先利用5对胰腺癌病人样本的mRNA芯片,分析发现GPC6在胰腺癌肿瘤中表达量显着高于癌旁组织。随后我们采用111对胰腺癌病人样本的RT-qPCR和免疫组化进行验证,发现GPC6在79例胰腺癌患者肿瘤组织中高表达,提示GPC6有可能在胰腺癌中担任重要角色并可能成为胰腺癌的分子标志物或潜在药物作用靶点。将GPC6表达水平与临床样本信息整合,我们发现GPC6在恶性程度高的T3期表达显着升高,并且GPC6表达量高的患者存在总生存期短的特征。随后我们对GPC6在胰腺癌中的功能进行深入研究。首先通过构建GPC6敲减或过表达的胰腺癌稳转细胞株,我们发现GPC6可显着促进胰腺癌细胞PANC-1、BxPC-3和SW1990增殖,敲减GPC6则抑制胰腺癌细胞生长。此外,显微镜下观察可发现,过表达GPC6会导致胰腺癌细胞形态发生改变,使其具有间质细胞形态特征。同时,划痕愈合实验和迁移侵袭实验证实,GPC6可促进胰腺癌细胞PANC-1、BxPC-3和SW1990迁移和侵袭,而敲减GPC6则会抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭。体内实验运用BxPC-3和PANC-1细胞皮下移植瘤实验证实,敲减GPC6会显着抑制肿瘤的生长,导致肿瘤体积减小,重量减轻;反之,过表达GPC6则会显着促进皮下移植瘤的生长。重要的是,在胰腺癌PDX模型中敲减GPC6也能显着抑制肿瘤生长。通过尾静脉注射过表达GPC6的胰腺癌细胞SW1990及其对照细胞,发现过表达GPC6能显着促进胰腺癌细胞在肝脏和肺部肿瘤的形成。有趣的是,我们对皮下移植瘤的肿瘤组织进行HE染色和天狼猩红染色后发现,过表达GPC6可显着促进胰腺癌肿瘤组织的纤维化,而敲减GPC6后肿瘤组织纤维化程度降低。对转移性肝脏和肺部肿瘤组织进行天狼猩红染色后也可发现,过表达GPC6会显着促进肝脏组织纤维化,并轻微促进肺部肿瘤组织纤维化。此外,我们通过对纤维化相关蛋白的检测,发现敲减GPC6后,细胞胶原蛋白及其相关酶表达量均显着降低;转化生长因子家族蛋白TGFβI和TGFβ2表达量也显着降低;肌动蛋白和细胞骨架蛋白ACTN2,ABLIM1,LIMA1和ACTN4表达量均显着降低。基于此,我们推测,GPC6在促进肿瘤增殖、迁移侵袭和纤维化进程中担任关键角色。进一步的机制研究,我们发现GPC6可影响胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3EMT相关标志物的表达。敲减GPC6后,与细胞粘附和紧密连接相关的蛋白,如E-Cadherin、Claudin-1、ZO-1表达上调;反之,间质表型相关分子如N-Cadherin、Vimentin、?-Catenin、TCF8/ZEB1、Slug和Snail表达量则降低。因此,我们推测,GPC6可能通过影响EMT进程来影响胰腺癌肿瘤进展。上述研究表明,多糖HH1-1可能成为抗胰腺癌的候选药物,GPC6可能是抗胰腺癌的药物靶点。这些研究为我们理解胰腺癌的发生发展机理和基于多糖的创新药物研究奠定了坚实基础。
许柯[8]（2020）在《TUG1-miR-299-3p axis在胰腺癌中的调控功能及其机制研究》文中研究指明胰腺癌（Pancreatic cancer）是世界范围内最恶性的疾病之一。胰腺癌早期,多数患者无明显症状或体征,直到肿瘤细胞转移到其他器官后发展为晚期才被诊断出来。因此,寻找胰腺癌发生发展、早期诊断及预后相关的新的生物学指标,对于早期发现胰腺癌并改善胰腺癌患者的预后具有重要意义。随着基因组和转录组测序技术的进步,鉴定出许多新型非蛋白编码转录产物,在这些大量非蛋白质编码转录物中,长链非编码RNA（lncRNA）是一类新型的非蛋白质编码转录物,长度超过200个核苷酸,在多种病理生理过程中具有重要的调节作用。研究发现,TUG1是一种新型的长链非编码RNA,长度为7.1-kb,位于染色体22q12,首次发现被认为是一种新型的视网膜非编码RNA,为各种恶性肿瘤中的关键致癌基因。随着对TUG1研究增多,TUG1在多种肿瘤中被发现,然而目前在胰腺癌中TUG1的研究仍处于起步阶段,在胰腺癌发生发展中作用机制尚不明确,有待进一步阐释。miR-299-3p是miRNAs的一种,目前国内外文献对其有较少报道。有研究表明,miR-299-3p在骨肉瘤组织中表达下调,与肿瘤细胞增殖、凋亡以及化疗等有关。生物信息学分析显示,TUG1能够吸附调控miR-299-3p的表达,但miR-299-3p在胰腺癌中的具体作用机制还尚不清楚。本研究首先观察了 TUG1和miR-299-3p在人正常胰腺组织、癌旁组织、胰腺癌组织以及胰腺癌细胞系中的表达情况,并分析了 TUG1表达与胰腺癌TNM分期的关系,利用Starbase2.0在线预测TUG1与miR-299-3p的关系。其次利用双荧光素酶报告基因实验验证了TUG1能和miR-299-3p结合;并通过MTT、划痕、Transwell、western blot、流式细胞术、ELISA等生物学实验检测TUG1-miR-299-3p对胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3增殖、侵袭、迁移、凋亡、EMT以及Notch1信号通路的影响。进一步运用一系列分子生物学方法探讨TUG 1-miR-299-3p在胰腺癌发生发展中相互间调控关系和作用途径,以探索TUG1-miR-299-3p对胰腺癌影响的分子机制。最后建立了胰腺癌小鼠移植瘤模型,进一步研究TUG1-miR-299-3p对胰腺癌移植瘤的影响及机制。本文最终确立了 TUG1-miR-299-3p可能通过调控Notch1信号通路来影响胰腺癌细胞的生长、侵袭、迁移、凋亡以及EMT,进而调控胰腺癌肿瘤的生长,这为胰腺癌的治疗提供了新的思路。本研究共分以下三个部分:第一部分:TUG1和miR-299-3p在胰腺癌中的表达及临床意义研究方法1.qRT-PCR技术检测TUG1和miR-299-3p在31例胰腺癌组织和癌旁正常组织样本以及8例正常组织样本中的表达。2.结合31例胰腺癌组织中TUG1表达水平分析TUG1在胰腺癌组织中的表达与肿瘤的临床特征TNM分期的相关性。3.qRT-PCR技术检测正常胰腺细胞和胰腺癌细胞株中TUG1和miR-299-3p的表达水平。4.对TUG1与miR-299-3p在胰腺癌组织中表达关系进行Spearman’s相关分析。5.利用Starbase2.0在线预测TUG1与miR-299-3p的结合序列。结果1.qRT-PCR检测结果显示,与癌旁组织及正常胰腺组织相比,TUG1在胰腺癌组织中显着高表达,miR-299-3p明显低表达。2.结合3 1例胰腺癌组织中TUG1表达水平和胰腺癌病人的临床病例资料进行分析,结果发现与Ⅰ+Ⅱ期胰腺癌患者相比,Ⅲ+Ⅳ期胰腺癌患者癌组织中TUG1的表达显着增加。3.qRT-PCR检测结果发现,相对于正常胰腺导管上皮细胞（HPDE）,胰腺癌细胞株PANC-1、PSN-1、BXPC-3、HPAC中TUG1的表达水平均有不同程度的升高,其中PANC-1和BXPC-3细胞中TUG1表达量相对最高。与正常的胰腺细胞相比,PANC-1和BXPC-3细胞中miR-299-3p表达量明显降低。4.Spearman’s相关分析结果显示胰腺癌组织中TUG1表达与miR-299-3p表达呈负相关。Starbase2.0在线软件预测发现TUG1与miR-299-3p有结合序列。第二部分:TUG1和miR-299-3p在胰腺癌细胞中的功能研究方法1.双荧光素酶报告基因实验验证TUG1和miR-299-3p的关系。2.构建TUG1干扰、miR-299-3p干扰慢病毒载体。重组慢病毒包装和病毒滴度测定后,病毒颗粒感染胰腺癌细胞系PANC-1、BXPC-3,获得sh-NC、sh-TUG1、sh-TUG1+anti-NC、sh-TUG1+anti-miR-299-3p PANC-1、BXPC-3。并使用qRT-PCR检测TUG1干扰对miR-299-3p表达的影响。3.MTT法、Transwell、划痕实验实验、流式细胞术、ELISA法和western Blot测定TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3增殖、侵袭、迁移、凋亡、EMT以及Notch1信号通路的影响。结果1.双荧光素酶报告基因实验验证TUG1能够和miR-299-3p相互结合。2.在胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3中,干扰TUG1能够促进miR-299-3p的表达。3.干扰TUG1能够抑制细胞增殖、侵袭、迁移、EMT和Notch1信号通路的活性,并促进细胞调亡;而同时又下调miR-299-3p能够逆转干扰TUG1对胰腺癌细胞凋亡、增殖、侵袭、迁移、EMT和Notch1信号通路的影响。第三部分:TUG1和miR-299-3p影响胰腺癌细胞裸鼠成瘤的相关研究方法1.通过将 sh-NC、sh-TUG1、sh-TUG1+anti-NC、sh-TUG1+anti-miR-299-3p PANC-1细胞进行左腋窝皮下注射,构建PANC-1裸鼠移植瘤动物模型,待荷瘤成功后,每5天测量移植瘤肿瘤体积,30天后,颈椎脱臼处死小鼠,并称量各组小鼠肿瘤重量。2.qRT-PCR检测各组移植瘤组织中miR-299-3p表达。3.免疫组织化学法检测TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤组织中Ki67表达影响。4.Western blot检测TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤组织中EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Snail,以及Notch1信号通路相关蛋白Notch1、Survivin和CyclinD1表达的影响。结果1.相对于对照组,体内干扰TUG1显着抑制移植瘤肿瘤生长,而同时又干扰miR-299-3p则逆转干扰TUG1对移植瘤生长的抑制作用。2.干扰TUG1显着促进移植瘤肿瘤组织中miR-299-3p的表达。3.干扰TUG1显着抑制了移植瘤肿瘤组织中Ki67的表达,而TUG1和miR-299-3p同时被干扰后又促进Ki67的表达。4.在胰腺癌移植瘤中干扰TUG1后E-cadherin表达明显升高,N-cadherin和Snail表达显着降低,而同时又干扰miR-299-3p后E-cadherin表达明显降低,N-cadherin和Snail表达显着升高。5.与对照组相比,在胰腺癌移植瘤中干扰TUG1后Notch1、Survivin和CyclinD1表达明显降低,而同时又干扰miR-299-3p逆转了 TUG1干扰对Notch1、Survivin和CyclinD1表达的影响。全文结论1.在胰腺癌组织和细胞中TUG1明显高表达,而miR-299-3p明显低表达,二者表达呈负相关。TUG1的表达与TNM分期有密切关系。2.TUG1能够吸附miR-299-3p并抑制miR-299-3p的表达。3.TUG1-miR-299-3p axis能够通过调控Notch1通路的活性,影响胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、上皮间质转化（EMT）以及调亡。4.成功构建胰腺癌移植瘤动物模型,TUG1-miR-299-3p axis可以通过促进Notch1通路的活性,促进移植瘤的生长。5.TUG1发挥促癌的作用,miR-299-3p发挥抑癌的作用,二者可能是潜在的分子治疗靶点。
毛其芬,王海,陈弘磊,孔凡慧,姜凯[9]（2019）在《青蒿琥酯增强吉西他滨的抗胰腺癌活性》文中研究表明目的探讨青蒿琥酯对吉西他滨化疗胰腺癌的辅助治疗作用并研究其机制。方法 MTT法检测胰腺癌细胞系Capan-2在青蒿琥酯和不同浓度吉西他滨处理下的细胞活力。Westernblot检测吉西他滨和青蒿琥酯对Capan-2细胞FOXO1、Noxa、Bim表达水平,细胞色素C、Smac/DIABLO从线粒体中的释放量及caspase-9、caspase-3活化水平的影响。流式细胞术检测Capan-2细胞的线粒体膜电位和凋亡率。结果青蒿琥酯辅助治疗明显提高吉西他滨对Capan-2细胞的杀伤活性。青蒿琥酯处理能显着促进Capan-2细胞FOXO1的表达,转染FOXO1小干扰RNA（FOXO1 siRNA）后,青蒿琥酯对吉西他滨的辅助治疗效果受到明显抑制。青蒿琥酯联合吉西他滨能显着诱导Capan-2细胞中Noxa和Bim的过表达,线粒体膜电位的降低,细胞色素C、Smac/DIABLO的释放,caspase-9、caspase-3的活化及凋亡的发生。转染FOXO1siRNA后,青蒿琥酯联合吉西他滨对Capan-2细胞的凋亡诱导途径受到显着抑制。结论青蒿琥酯可上调FOXO1的表达,增强吉西他滨对胰腺癌细胞的凋亡诱导活性。
陈凌[10]（2017）在《ANXA2在人脑胶质瘤细胞中的作用及分子机制研究》文中研究表明目的:膜联蛋白A2（Annexin A2,Annexin II,ANXA2）的高表达是包括乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌及脑胶质瘤等在内的多种肿瘤细胞的共有特征之一,并与肿瘤发生发展的机制有重大关联。目前,对于ANXA2对肿瘤细胞实施影响的分子机制及潜在的分子间串话（Cross-talk）并不明确,且不同的细胞类型之间存在较大差异。本研究就ANXA2在脑胶质瘤细胞中的作用及潜在分子机制进行了深入的研究,旨在为实现神经胶质瘤细胞基因治疗奠定实验基础。方法:克隆了人类AnxA2编码序列,构建了ANXA2过表达及RNAi敲减的慢病毒表达载体,通过慢病毒感染的方法构建了稳定转染的ANXA2过表达及RNAi敲减的胶质瘤U251细胞模型,利用RT-PCR、Western-blot及细胞免疫荧光法检测了ANXA2过表达及RNAi干预的有效性;采用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术及裸小鼠荷瘤实验检测不同ANXA2表达背景下神经胶质瘤U251细胞增殖行为的差异;采用Western-blot、EMSA、药物抑制等方法初步探讨增殖相关的分子机制;采用流式细胞术评估细胞的凋亡情况,并用药物抑制及Western-blot、免疫荧光及免疫沉淀等方法开展对核转录因子NFκB-P65、Akt、Caspase3、PTEN与ANXA2之间在胶质瘤细胞凋亡调节方面的应答关系进行初步研究;采用划痕实验及含基质胶的Tranwell小室评估细胞的迁移和侵袭能力,并检测侵袭转移的主要效应分子MMPs的表达及功能情况。结果:通过慢病毒感染的方法成功构建了稳定转染的ANXA2过表达及RNAi敲减的胶质瘤U251细胞模型,ANXA2蛋白过表达增幅为42.7%±5.2%,p<0.05,敲减幅度为72.2%±3.2%,p<0.01。对于ANXA2与胶质瘤细胞增殖相关性的研究结果表明ANXA2的敲减可显着抑制U251细胞的增殖能力;对其分子机制的初步研究发现,ANXA2的敲减对STAT3的表达没有影响,却显着降低pSTAT3（Y705）及CyclinD1的表达水平、下调pSTAT3（Y705）的转录活性,形成G1/S阻断;进一步的实验结果表明ANXA2可能通过与STAT3的直接结合而调控其磷酸化水平,进而影响pSTAT3-CyclinD1通路所介导的细胞增殖。相关实验在神经胶质瘤U87细胞株中得以重复,表明该机制在胶质瘤细胞中具有一定的代表性。另一方面,ANXA2过表达在MTT实验及裸鼠移植瘤实验中表现出显着的促增殖作用,却对克隆形成率、细胞周期及增殖相关的pSTAT3-CyclinD1通路未见显着影响。深入的研究发现敲减细胞的ANXA2再表达能够一定程度地恢复pSTAT3（Y705）的表达量,表明重组ANXA2结构完整功能正常,而ANXA2过表达无法激活pSTAT3（Y705）的原因可能是内源性ANXA2存在冗余;在EGF的诱导下,过表达的ANXA2可提升pSTAT3（Y705）的表达量,表明EGF与ANXA2对pSTAT3-CyclinD1通路的激活具有正向协同作用,提示MTT及裸鼠移植瘤实验中冗余ANXA2表现出的促增殖作用可能缘于旁分泌因子EGF的累积和协同作用。对于ANXA2与胶质瘤细胞凋亡相关性的研究结果表明ANXA2过表达对U251细胞的凋亡及激活型Caspase-3没有明显抑制,提示ANXA2过表达细胞移植瘤体增大可能不是凋亡减少的结果;而在ANXA2敲减细胞中则观察到明显的凋亡增加及激活型Caspase-3的增加,提示ANXA2敲减细胞移植瘤体较小不仅缘于增殖抑制还有凋亡增多的贡献。对ANXA2调节Caspase-3分子机制的进一步研究结果显示:药物抑制pP65（S536）可增加激活型Caspase-3的表达及凋亡表型,pAkt（T308）磷酸化的药物抑制可下调pP65（S536）并上调激活型Caspase-3,ANXA2的敲减则既可抑制pAkt（T308）又可抑制pP65（S536）,而免疫沉淀的结果还表明ANXA2可与PI3K-Akt通路的阻断物PTEN直接结合。根据上述实验结果,对ANXA2敲减促进细胞凋亡的可能解释是:ANXA2的敲减导致PTEN的游离释放,后者阻断PI3K-Akt通路活化,抑制了pAkt（T308）形成,继而通过抑制IKKα下调pP65（S536）并导致激活型Caspase-3的增加和促进凋亡。对ANXA2过表达细胞未能抑制凋亡的可能解释是:PTEN作为抑癌基因在肿瘤细胞内含量极微,过表达细胞中多余的ANXA2无法结合更多的PTEN,因此也就没有表现出更为明显的凋亡抑制作用。对于ANXA2与胶质瘤细胞侵袭转移能力的相关性的研究结果表明,ANXA2的过表达可促进具有活性的MMP2/9的分泌,而ANXA2敲减细胞则相反,ANXA2可通过影响活性MMP2/9分泌而对U251细胞的侵袭和转移产生正调控效应。结论:ANXA2可能通过与STAT3的直接结合而调控STAT3的磷酸化过程。ANXA2的敲减显着降低pSTAT3（Y705）及CyclinD1的表达水平、下调pSTAT3（Y705）的DNA结合活力,从而抑制pSTAT3-CyclinD1通路所介导的细胞增殖;ANXA2的过表达不影响pSTAT3-CyclinD1通路,但EGF与ANXA2在pSTAT3（Y705）的磷酸化激活过程中存在协同关系。人脑胶质瘤细胞中ANXA2可能通过PTEN-AKT-P65-Caspase3信号链发挥对凋亡的影响。同时,ANXA2可通过影响活性MMP2/9分泌而对胶质瘤细胞的侵袭和转移产生正调控效应。
二、CONSTRUCTION OF ACTIVE RECOMBINANT CASPASE-3 EUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID AND EFFECT OF r-CASPASE-3 ON APOPTOSIS OF PANCREATIC CARCINOMA CELLS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CONSTRUCTION OF ACTIVE RECOMBINANT CASPASE-3 EUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID AND EFFECT OF r-CASPASE-3 ON APOPTOSIS OF PANCREATIC CARCINOMA CELLS（论文提纲范文）
（1）NFATc3在人恶性黑素瘤中的表达及其抑制肿瘤细胞凋亡的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 一.前言 |
| 二.材料和方法 |
| 三.结果 |
| 第一部分 恶性黑素瘤组织和细胞中蛋白表达差异及NFATc3表达情况 |
| 第二部分 构建NFATc3敲减质粒、转染Mel-RM细胞并鉴定 |
| 第三部分 敲减NFATc3对恶性黑素瘤Mel-RM细胞的影响 |
| 第四部分 NFATc3通过调控cFLIP表达量影响恶性黑素瘤细胞的凋亡 |
| 四.讨论 |
| 五.结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 NFAT转录因子通过调控细胞周期和凋亡参与肿瘤发生发展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 颗粒细胞在哺乳动物卵泡发育中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵泡发育的特点 |
| 1.1.2 卵泡发育的调控 |
| 1.1.3 颗粒细胞的功能 |
| 1.1.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响 |
| 1.1.5 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响 |
| 1.2 FHL2基因的研究进展 |
| 1.2.1 FHL2基因的结构 |
| 1.2.2 FHL2基因的表达与细胞定位 |
| 1.2.3 FHL2基因的主要生物学功能 |
| 1.2.4 FHL2影响卵巢颗粒细胞的功能研究 |
| 1.3 蛋白质互作研究进展 |
| 1.3.1 酵母双杂交技术 |
| 1.3.2 酵母双杂交技术的特点 |
| 1.3.3 酵母双杂交技术的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及表达和定位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 实验主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要生物信息学分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.2.2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及生物信息学分析 |
| 2.2.3 免疫组化分析 |
| 2.2.4 绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养及鉴定 |
| 2.2.5 FHL2在绵羊卵巢颗粒细胞中的表达分析 |
| 2.2.6 细胞定位 |
| 2.2.7 数据统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.3.2 绵羊FHL2基因CDS序列克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 FHL2在绵羊卵巢组织中的表达定位 |
| 2.3.4 绵羊卵巢颗粒细胞体外培养的形态与特征 |
| 2.3.5 FHL2在体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞中的表达定位 |
| 2.3.6 Western Blot检测绵羊卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 体外分离培养绵羊原代卵巢颗粒细胞 |
| 2.4.2 FHL2的表达及细胞定位研究 |
| 2.5 小结 |
| 3 绵羊FHL2基因过表达及siRNA干扰效果研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂与耗材 |
| 3.1.3 试验主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要溶液的配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 过表达载体pcDNA3.1-FHL2转染绵羊卵巢颗粒细胞 |
| 3.2.3 siRNA的设计合成和干扰效果检测 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 过表达质粒转染对FHL2mRNA和蛋白表达水平的影响 |
| 3.3.3 mRNA水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.3.4 蛋白水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 试验主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 FHL2基因过表达对绵羊卵巢颗粒功能的影响 |
| 4.2.2 干扰FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 4.2.3 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 过表达和干扰FHL2表达后对绵羊颗粒细胞形态变化的影响 |
| 4.3.2 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞增殖的影响 |
| 4.3.3 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞周期的影响 |
| 4.3.5 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 FHL2对细胞周期的影响 |
| 4.4.2 FHL2对细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 FHL2对激素分泌水平的影响 |
| 4.5 小结 |
| 5 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交CDNA文库的构建及FHL2互作蛋白的筛选 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定 |
| 5.2.2 绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 |
| 5.2.3 利用所构建酵母双杂交系统筛选与FHL2互作的蛋白 |
| 5.2.4 FHL2与筛选宿主蛋白的一对一互作验证 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绵羊卵巢酵母双杂交文库的构建 |
| 5.3.2 pGBKT7-FHL2酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.3.3 酵母双杂交互作蛋白对照实验 |
| 5.3.4 筛选与FHL2相互作用的蛋白 |
| 5.3.5 候选克隆质粒测序结果分析 |
| 5.3.6 FHL2与筛选宿主蛋白互作的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 酵母双杂交cDNA文库的构建 |
| 5.4.2 酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.4.3 利用酵母双杂交筛选互作蛋白研究 |
| 5.5 小结 |
| 6 FHL2在TGF-β信号通路中对绵羊卵巢颗粒细胞的调控作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 样品来源 |
| 6.1.2 试验主要溶液配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 绵羊TGF-β1蛋白的构建和表达 |
| 6.2.2 添加外源蛋白TGF-β1 |
| 6.2.3 FHL2表达对TGF-β1及TGF-βR基因的影响 |
| 6.2.4 TGF-β1抑制剂处理颗粒细胞 |
| 6.2.5 TGF-β1调控FHL2在不同信号通路中的作用研究 |
| 6.2.6 数据统计 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 真核表达载体pFUSERTL1-TGF-β1重组质粒的构建与鉴定 |
| 6.3.2 Western Blot鉴定TGF-β1蛋白的表达 |
| 6.3.3 TGF-β1促进卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.3.4 FHL2对TGF-β1、TGF-βR基因表达的影响 |
| 6.3.5 TGF-β信号通路对FHL2、TGF-β1和TGF-βR表达的影响 |
| 6.3.6 TGF-β1参与调控FHL2基因表达的信号通路研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 TGF-β1调控颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.4.2 TGF-β1调控FHL2基因的信号通路研究 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论 |
| 8 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 KLF2抑制胰腺癌的机制研究 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 衰老与恶性肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 博士期间发表的论文 |
| 参与的科研项目 |
| 致谢 |
（5）miR-28-5p靶向MTSS1对食管癌生长的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 :miR-28-5p在食管癌组织中的表达及其生物学功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-28-5p在食管癌及癌旁组织中的表达 |
| 3.2 miR-28-5p在食管癌细胞的表达及对食管癌细胞增殖的影响 |
| 3.3 miR-28-5p对食管癌细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :miR-28-5p靶向调控MTSS1 的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 食管癌临床组织样本中MTSS1的表达水平 |
| 3.2 miR-28-5p 靶向 MTSS1 的 3’-UTR |
| 3.3 miR-28-5p对 MTSS1 m RNA表达水平的影响 |
| 3.4 miR-28-5p对 MTSS1 蛋白表达水平的影响 |
| 3.5 miR-28-5p通过MTSS1 发挥作用的实验研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :miR-28-5p影响食管癌发生发展的体内试验 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各实验组的平均瘤体积测定 |
| 3.2 对肿瘤细胞形态的影响 |
| 3.3 对MTSS1蛋白表达的影响 |
| 3.4 对Ki67表达的影响 |
| 3.5 对细胞凋亡的影响 |
| 3.6 对细胞周期及凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）重组irisin在毕赤酵母中的表达及其对人胰腺导管癌抗癌活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Irisin介绍 |
| 1.1.1 Irisin的起源与结构 |
| 1.1.2 Irisin的功能和作用机理 |
| 1.2 胰腺导管癌 |
| 1.2.1 胰腺导管癌介绍 |
| 1.2.2 胰腺导管癌的诱因 |
| 1.2.3 胰腺导管癌的信号通路 |
| 1.2.4 胰腺导管癌的耐药性 |
| 1.3 毕赤酵母P.pastoris真核表达系统 |
| 1.4 选题依据 |
| 第二章 毕赤酵母真核表达E-irisn及其对癌细胞活力的影响 |
| 2.1 序言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验主要试剂及培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 毕赤酵母重组表达载体的构建 |
| 2.3.2 重组E-irisin的诱导表达及表达条件优化 |
| 2.3.3 重组E-irisin的鉴定及纯化 |
| 2.3.4 细胞培养 |
| 2.3.5 细胞活性检测(MTT比色法) |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 毕赤酵母重组表达载体的构建 |
| 2.4.2 重组E-irisin的成功表达 |
| 2.4.3 重组E-irisin高表达诱导条件的优化 |
| 2.4.4 重组E-irisin的鉴定 |
| 2.4.5 重组E-irisin的纯化 |
| 2.4.6 重组irisin的抗癌活性测定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 重组irisin对胰腺导管癌MIA PaCa-2 增殖,迁移侵袭的抑制作用及机制 |
| 3.1 序言 |
| 3.2 实验材料及仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验主要试剂及培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞膜受体免疫荧光分析 |
| 3.3.3 细胞活力检测(MTT比色法) |
| 3.3.4 细胞的克隆形成实验 |
| 3.3.5 细胞周期分析 |
| 3.3.6 细胞迁移实验 |
| 3.3.7 细胞侵袭实验 |
| 3.3.8 免疫印迹分析(Western blot analysis) |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 重组irisin与 MIA PaCa-2 细胞膜未知受体的结合 |
| 3.4.2 重组irisin抑制MIA PaCa-2 细胞增殖及细胞周期进展 |
| 3.4.3 重组irisin抑制MIA PaCa-2 细胞迁移,侵袭及EMT发生 |
| 3.4.4 重组irisin激活AMPK抑制MIA PaCa-2 细胞生长 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 重组irisin对胰腺导管癌化疗敏感性的影响 |
| 4.1 序言 |
| 4.2 实验材料及仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验主要试剂及培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 细胞活力检测(MTT比色法) |
| 4.3.3 细胞凋亡检测(TUNEL法) |
| 4.3.4 免疫印迹分析(Western blot analysis) |
| 4.3.5 细胞内阿霉素积累检测 |
| 4.3.6 NF-κB p65 核位移的免疫荧光分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 Irisin增强了DOX对 MIA PaCa-2,BxPC-3 细胞的抑制作用 |
| 4.4.2 Irisin增强了DOX诱导的MIA PaCa-2,BxPC-3 细胞凋亡 |
| 4.4.3 Irisin对 DOX诱导MIA PaCa-2,BxPC-3 中凋亡相关蛋白的影响 |
| 4.4.4 Irisin对 MIA PaCa-2,BxPC-3 细胞内DOX积累的影响 |
| 4.4.5 Irisin抑制AKT/NF-κB信号通路增强MIA PaCa-2,BxPC-3细胞对阿霉素敏感性 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）多糖HH1-1抗胰腺癌和糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC6促胰腺癌的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 胰腺癌 |
| 1.1.1 胰腺癌简介和流行病学 |
| 1.1.2 胰腺癌发病机制 |
| 1.1.3 胰腺癌治疗策略 |
| 1.1.4 胰腺癌肿瘤微环境和纤维化 |
| 1.2 多糖 |
| 1.2.1 多糖概述 |
| 1.2.2 红花多糖研究进展 |
| 1.3 糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖研究进展 |
| 1.3.1 糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖概述 |
| 1.3.2 Glypican-1研究进展 |
| 1.3.3 Glypican-2研究进展 |
| 1.3.4 Glypican-3研究进展 |
| 1.3.5 Glypican-4研究进展 |
| 1.3.6 Glypican-5研究进展 |
| 1.3.7 Glypican-6研究进展 |
| 1.4 科学问题与研究意义 |
| 1.5 研究路线与方法 |
| 第2章 红花多糖HH1-1抗胰腺癌靶向性及作用机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 药材,细胞和质粒 |
| 2.2.2 实验试剂与试剂盒 |
| 2.2.3 实验仪器与耗材 |
| 2.2.4 实验常规试剂配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 MTT实验 |
| 2.3.3 克隆形成实验 |
| 2.3.4 半定量PCR及实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.5 表面等离子共振实验(Surface Plasmon Resonance,SPR) |
| 2.3.6 Western Blot |
| 2.3.7 细胞周期检测 |
| 2.3.8 细胞凋亡检测 |
| 2.3.9 Caspase-3活性检测 |
| 2.3.10 Hoechst 33258染色 |
| 2.3.11 管腔形成实验 |
| 2.3.12 鸡胚绒毛尿囊膜实验(Chick Embryo Chorioallantotic Membrane,CAM) |
| 2.3.13 划痕愈合 |
| 2.3.14 迁移和侵袭实验 |
| 2.3.15 免疫荧光 |
| 2.3.16 慢病毒包装转染 |
| 2.3.17 免疫组化 |
| 2.3.18 裸鼠皮下移植瘤 |
| 2.3.19 人源肿瘤异种移植(Patient-derived Tumor Xenografts,PDX)模型 |
| 2.3.20 小鼠脾细胞分离 |
| 2.3.21 NO检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 红花多糖抗肿瘤活性筛选 |
| 2.4.2 HH1-1抑制胰腺癌增殖和克隆形成 |
| 2.4.3 HH1-1诱导胰腺癌细胞周期阻滞 |
| 2.4.4 HH1-1诱导胰腺癌细胞凋亡 |
| 2.4.5 HH1-1抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.4.6 HH1-1在体内体外抑制新生血管生成 |
| 2.4.7 HH1-1抑制胰腺癌细胞BxPC-3细胞皮下移植瘤的生长 |
| 2.4.8 HH1-1抑制胰腺癌PDX的生长 |
| 2.4.9 HH1-1靶向并结合Galectin-3 |
| 2.4.10 HH1-1抑制Galectin-3与EGFR的结合 |
| 2.4.11 HH1-1可影响相关转录因子的表达 |
| 2.4.12 转录因子FOXO3参与HH1-1介导的抗胰腺癌活性 |
| 2.4.13 敲减Galectin-3或EGFR可促进转录因子FOXO3表达和入核 |
| 2.4.14 外源性加入Galectin-3蛋白回补HH1-1的抗胰腺癌作用 |
| 2.4.15 组织水平检测HH1-1对Galectin-3/EGFR/AKT/FOXO3信号通路的影响 |
| 2.4.16 HH1-1具有免疫激活作用 |
| 2.5 总结与讨论 |
| 第3章 糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC6在胰腺癌中功能及机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞和质粒 |
| 3.2.2 实验试剂与试剂盒 |
| 3.2.3 实验仪器与耗材 |
| 3.2.4 实验常规试剂配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 胰腺癌患者组织标本高通量mRNA芯片分析 |
| 3.3.2 GPC6敲减和过表达稳转细胞系构建 |
| 3.3.3 GPC6基因CRISPR/Cas9质粒构建 |
| 3.3.4 PDC和CAFs细胞分离 |
| 3.3.5 RT-qPCR引物 |
| 3.3.6 苏木素-伊红染色液(HE染色) |
| 3.3.7 苦味酸天狼猩红染色 |
| 3.3.8 四种转基因小鼠基因型的鉴定 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 胰腺癌组织和癌旁组织mRNA芯片分析 |
| 3.4.2 GPC6在111例胰腺癌组织中表达量的分析检测 |
| 3.4.3 胰腺腺癌患者中GPC6表达与临床因素的相关性分析 |
| 3.4.4 GPC6在胰腺癌细胞增殖中作用的研究 |
| 3.4.5 GPC6在胰腺癌细胞迁移侵袭中作用的研究 |
| 3.4.6 GPC6可促进胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 3.4.7 GPC6可促进胰腺癌的肝转移和肺转移 |
| 3.4.8 GPC6可促进胰腺癌纤维化 |
| 3.4.9 GPC6促进纤维化作用机制研究 |
| 3.4.10 GPC6促进胰腺癌进展的作用机制研究 |
| 3.4.11 GPC6蛋白表达纯化与活性验证 |
| 3.4.12 利用CRISPR/Cas9技术敲除胰腺癌细胞中GPC6 |
| 3.4.13 RNA Sequence分析敲除GPC6和对应空载细胞的mRNA表达谱 |
| 3.4.14 KPC小鼠和GPC6基因条件性敲除小鼠的构建与鉴定 |
| 3.5 总结与讨论 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 4.1 总结 |
| 4.1.1 红花多糖HH1-1抗胰腺癌活性和机制研究 |
| 4.1.2 GPC6促胰腺癌的功能和机制研究 |
| 4.2 尚待解决的问题 |
| 4.2.1 HH1-1特异性抗胰腺癌活性的作用机制有待进一步研究 |
| 4.2.2 探索HH1-1与吉西他滨等细胞毒类药物联合用药的方案 |
| 4.2.3 探索GPC6结合的关键蛋白 |
| 4.2.4 基于敲除GPC6的单克隆细胞的功能和机制研究 |
| 4.2.5 GPC6在肿瘤相关成纤维细胞中的功能和机制研究 |
| 4.2.6 GPC6在转基因小鼠模型中的功能和机制研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）TUG1-miR-299-3p axis在胰腺癌中的调控功能及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TUG1和miR-299-3p在胰腺癌中的表达及临床意义研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 标本来源 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 主要试剂配制 |
| 2.5 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 胰腺癌细胞系培养 |
| 3.2 荧光定量PCR检测TUG1在和miR-299-3p组织和细胞中的表达 |
| 3.3 统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 TUG1在胰腺癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达 |
| 4.2 TUG1在胰腺癌恶性等级(TNM分期)中的表达 |
| 4.3 TUG1在正常胰腺导管上皮细胞(HPDE)和胰腺癌细胞系PANC-1、PSN-1、BXPC-3、HPAC中的表达差异 |
| 4.4 miR-299-3p在胰腺癌组织中的表达 |
| 4.5 miR-299-3p在胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3中的表达 |
| 4.6 胰腺癌组织中TUG1与miR-299-3p表达的相关性分析 |
| 4.7 Starbase2.0在线预测TUG1与miR-299-3p的结合序列 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TUG1和miR-299-3p在胰腺癌细胞中的功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要试剂配制 |
| 2.4 主要实验设备与仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 双荧光素酶报告基因实验检测TUG1和miR-299-3p的结合情况 |
| 3.2 构建TUG1干扰慢病毒载体和miR-299-3p干扰慢病毒载体 |
| 3.3 重组慢病毒载体的包装和滴定 |
| 3.4 稳定细胞系的构建 |
| 3.5 qRT-PCR检测稳定细胞系中TUG1和miR-299-3p的表达 |
| 3.6 MTT法测定细胞系PANC-1、BXPC-3的增殖情况 |
| 3.7 流式细胞术检测胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3的凋亡情况 |
| 3.8 划痕实验测定胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3的迁移情况 |
| 3.9 Transwell实验测定胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3的侵袭情况 |
| 3.10 ELISA测定胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3中Caspase-3的活性 |
| 3.11 Western Blot |
| 3.12 统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 TUG1能够和miR-299-3p相互结合 |
| 4.2 plenti-sh-TUG1和plenti-anti-miR-299-3p载体的构建 |
| 4.3 重组慢病毒的包装和滴定 |
| 4.4 稳定细胞系的构建 |
| 4.5 各组胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3中TUG1的表达 |
| 4.6 各组胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3中miR-299-3p的表达 |
| 4.7 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞增殖的影响 |
| 4.8 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞凋亡的影响 |
| 4.9 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞迁移的影响 |
| 4.10 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞侵袭的影响 |
| 4.11 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞EMT的影响 |
| 4.12 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞中Notch1信号通路的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TUG1和miR-299-3p影响胰腺癌细胞裸鼠成瘤的相关研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株和实验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要试剂配制 |
| 2.4 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 裸鼠移植瘤模型构建 |
| 3.2 移植瘤组织石蜡切片 |
| 3.3 免疫组织化学检测移植瘤组织中增殖标志蛋白Ki67的表达 |
| 3.4 Western b1ot |
| 3.5 统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤生长的影响 |
| 4.2 TUG1干扰对移植瘤中miR-299-3p表达的影响 |
| 4.3 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤中Ki67表达的影响 |
| 4.4 TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤中EMT的影响 |
| 4.5 TUG1-miRNA-299-3p调控网络对North1信号通路的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 长链非编码RNA在胰腺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（9）青蒿琥酯增强吉西他滨的抗胰腺癌活性（论文提纲范文）
| 1 仪器与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 FOXO1基因沉默 |
| 2.3 FOXO1基因过表达 |
| 2.4 细胞活力试验 |
| 2.5 线粒体分离 |
| 2.6 线粒体膜电位 (Δφ) 检测 |
| 2.7 Western blot试验 |
| 2.8 细胞凋亡试验 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 青蒿琥酯显着增强吉西他滨对胰腺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2 青蒿琥酯通过FOXO1途径提高吉西他滨对Capan-2细胞的杀伤活性 |
| 3.3 青蒿琥酯联合吉西他滨诱导Capan-2细胞发生线粒体途径凋亡 |
| 4 讨论 |
（10）ANXA2在人脑胶质瘤细胞中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 AnxA2编码序列的克隆及慢病毒介导的稳转细胞株的构建 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 ANXA2对胶质瘤细胞增殖的作用及分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 ANXA2对胶质瘤细胞凋亡、侵袭转移的作用及分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:ANXA2在肿瘤细胞中的作用及其机制 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、CONSTRUCTION OF ACTIVE RECOMBINANT CASPASE-3 EUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID AND EFFECT OF r-CASPASE-3 ON APOPTOSIS OF PANCREATIC CARCINOMA CELLS（论文参考文献）
- [1]NFATc3在人恶性黑素瘤中的表达及其抑制肿瘤细胞凋亡的作用机制研究[D]. 张婉琪. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [3]FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究[D]. 张丽萌. 河北农业大学, 2020(01)
- [4]KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究[D]. 戴月娣. 苏州大学, 2020(06)
- [5]miR-28-5p靶向MTSS1对食管癌生长的作用及机制研究[D]. 张亮. 中国医科大学, 2020(01)
- [6]重组irisin在毕赤酵母中的表达及其对人胰腺导管癌抗癌活性的研究[D]. 刘佳玉. 吉林大学, 2019(02)
- [7]多糖HH1-1抗胰腺癌和糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC6促胰腺癌的功能及机制研究[D]. 姚艳丽. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2019(07)
- [8]TUG1-miR-299-3p axis在胰腺癌中的调控功能及其机制研究[D]. 许柯. 郑州大学, 2020(02)
- [9]青蒿琥酯增强吉西他滨的抗胰腺癌活性[J]. 毛其芬,王海,陈弘磊,孔凡慧,姜凯. 中国现代应用药学, 2019(08)
- [10]ANXA2在人脑胶质瘤细胞中的作用及分子机制研究[D]. 陈凌. 福建医科大学, 2017(04)