一、不同湿热环境下猫颅脑损伤后生命体征变化及生存曲线分析（论文文献综述）
吴明[1]（2021）在《重症中暑横纹肌溶解介导急性肾损伤的临床特征及分子机制研究》文中认为目的:劳力型重症中暑因合并横纹肌溶解（RM）、急性肾损伤（AKI）等,其致残率及死亡率明显增加。因此,深入了解患者的临床特征及细胞损伤机制,将为患者救治提供临床参考及潜在的治疗靶点。方法1、回顾性收集2008年1月至2019年6月南部战区总医院重症医学科收治的重症中暑患者的临床资料。分别以90天结局进行病例对照研究、以RM、AKI及RM&AKI进行队列研究,利用多因素Logistics及Cox回归模型确定导致AKI及患者90天预后的危险因素,通过曲线拟合和分段回归确定危险因素的临床截点及与器官功能的关系,并探讨肌红蛋白≥1000ng/ml对重症中暑患者各器官功能及预后的影响;2、构建人肌红蛋白（MB）与热打击联合作用的近曲小管上皮细胞（HK-2）热打击模型,模拟重症中暑横纹肌溶解急性肾损伤,首先检测细胞生存率、铁死亡相关蛋白（P53、SLC7A11、GPX4）及内质网应激（ERS）相关蛋白的表达、铁离子含量和ROS含量的表达;其次先后利用4-PBA（ERS特异性抑制剂）及黄芩素处理模型,检测上述指标的变化,明确MB的损伤机制及黄芩素的保护作用。结果:1、重症中暑导致的器官损伤依次为急性肝损伤（AHI）72.8%、RM48.0%,AKI43.9%、弥漫性血管内凝血（DIC）34.5%,患者90天病死率12.2%,其中RM、AKI、RM&AKI患者90天病死率分别为16.5%、26.8%、34.1%;入院时SOFA评分是重症中暑、RM、AKI患者90天预后的独立危险因素,其临床截点均为7.5分。2、在RM患者中,AKI发生率48.8%,与non-RM相比,RM的PCT/CRP升高、RM与DIC及AHI成正相关。在AKI患者中,RM发生率52.6%,与non-AKI相比,AKI的PCT水平升高,DIC及AHI发生率均增高。与non-RM&AKI相比,RM&AKI患者DIC发生率升高。MB≥1000ng/ml、炎症及凝血是重症中暑并发AKI的独立危险因素;D二聚体是RM导致AKI的独立危险因素,其临床截点0.4mg/L。生存分析示AKI及RM&AKI患者90天生存时间均明显缩短（P<0.001）。3、MB≥1000ng/ml 患者的 AHI、AKI、DIC 发生率分别为 94.0%、73.1%、54.8%,其90天病死率28.8%;MB≥1000ng/ml、DIC及AKI均与90天病死率增加相关;生存分析示MB≥1000ng/ml患者90天生存时间明显缩短（P<0.001）。4、在热打击下,MB导致HK-2细胞生存率降低,P53蛋白表达升高,SLC7A11和GPX4蛋白表达下降,铁离子含量增多,ROS累积。siRNA干扰P53后,逆转SLC7A11和GPX4蛋白表达量下降,并激活ERS相关通路。给予4-PBA处理后,可以提高细胞生存率,降低P53蛋白表达,提高SLC7A11和GPX4蛋白表达,减少铁离子和ROS含量。5、黄芩素处理模型后,提高了细胞生存率,降低了 ERS相关蛋白及P53蛋白表达,增加了 SLC7A11和GPX4蛋白表达,减少了铁离子和ROS含量。结论1、重症中暑容易合并RM、AKI、DIC等器官功能不全。肌红蛋白参与重症中暑AKI的发生发展。以MB≥1000ng/ml作为RM血清学诊断标准,更能准确预测重症中暑AKI的发生及90天预后。基于改善入院SOFA评分治疗策略可能是改善重症中暑（含RM、AKI）预后的第二“关键点”。2、在热打击下,肌红蛋白直接导致HK-2细胞铁死亡,其机制可能与ERS相关。黄芩素通过抑制ERS减轻细胞铁死亡。提示黄芩素可作为临床治疗重症中暑横纹肌溶解并发急性肾损伤的潜在药物。
杜鹃[2]（2021）在《CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究》文中研究表明1 研究背景急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）是以肾滤过功能快速丧失为特点的临床综合征,表现为尿素氮、肌酐等代谢产物的蓄积和/或尿量的减少,其病理特点主要为急性肾小管坏死。研究发现住院患者的发生率约为2-21%,其在社区医院发病率约为2%,而在大型医院发病率可达20%,重症监护病房（Intensive care unit,ICU）的发病率可达50%以上。AKI导致死亡率增加,住院时间延长,以及慢性肾病（Chronic kidney disease,CKD）的发病率增加。总之,AKI给公共卫生及社会资源带来巨大的压力,成为严重的健康问题。传统与新发现的肾病生物学标志物,如血尿素氮、血肌酐、尿NGAL、KIM-1及TIMP2-IGFBP7乘积等,可协助进行AKI的预测和诊断。但它们都仅仅指向预测肾功能降低或肾损伤的发生,缺乏预测肾功能恢复的能力。患者肾损伤的持续时间及肾功能转归可显着影响患者远期预后,因此,早期预测、识别患者的恢复表型,及早干预,促进肾功能早期恢复、改变恢复表型,或能显着改善AKI患者的预后。在预测肾功能恢复的生物学标志物方面,存在较大空白。目前临床亟需理想的生物标志物预测AKI肾功能的转归。外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm的微小囊泡,其中包含完整的膜蛋白（尤其是糖蛋白）、外周膜蛋白、胞质、核蛋白以及细胞内组分,如miRNA,mRNA和代谢产物。同时外泌体通过受体与配体的相互作用,与靶细胞膜的附着/融合或被受体细胞内化,来进行细胞间通讯以及蛋白质和核酸的细胞间交换,从而发挥细胞间信使的作用,参与增殖、凋亡、免疫、凝血等多种生理及病理过程。尿液外泌体主要起源于肾单位管腔和泌尿道内衬的细胞,循环外泌体难以穿过肾小球滤过膜。多项研究发现,尿液外泌体RNA,miRNA和蛋白质可以较尿液其他生化成分更早的反映肾脏疾病中基因表达的变化。尿液外泌体有望成为一种有效且非侵入性的肾脏疾病生物标记物。同时,临床前研究提示外源性外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进修复,提示外泌体可能直接参与肾脏损伤与修复过程。因此,较其他尿液中的分子,外泌体更及时、更直接地体现肾脏细胞的病理生理状态,在预测预后方面更具有优势。CD26,又称为二肽基肽酶 Ⅳ（Dipeptidyl-peptidase 4,DPP4）,是广泛表达于多种细胞表面的一种糖蛋白,可以裂解多种底物的N端二肽基,包括神经肽、肽激素、血管活性肽、趋化因子以及一些生长因子和细胞因子。另外CD26是多功能蛋白,除蛋白水解作用外,以多种方式发挥多种促增殖、免疫和炎症调节等作用。但CD26在AKI中的作用仍待阐明。最近的一项蛋白组学研究发现,与其他尿液及血清蛋白相比,尿CD26在AKI后发生显着变化,推荐尿CD26,尤其尿细胞外囊泡的CD26,为AKI候选生物标志物,值得进一步研究。多项尿液外泌体的组学研究也发现尿液外泌体富含CD26,主要由CD26表达极为丰富的远端肾小管上皮细胞及其他肾脏细胞所释放。尿液中外泌体结合CD26较尿液游离CD26更具有肾脏特异性,且已证实与外泌体结合是尿CD26的主要存在形式,因此,尿外泌体CD26可能对肾功能转归的预测更具有优势。综上,与AKI的早期预测相比,预测肾功能转归的生物标志物仍有较大空白,为临床所亟需。尿外泌体有可能成为新的肾损伤、肾功能转归预测的生物标志物,尿外泌体CD26能否作为AKI的预后标志物有待进一步研究。2目的（1）比较重症AKI患者与重症非AKI患者之间尿外泌体CD26水平的变化,探索尿外泌体CD26是否与AKI相关;（2）探讨尿外泌体CD26是否与AKI分期相关;（3）探讨尿外泌体CD26是否与90天内主要肾脏不良事件相关;（4）（4）探讨尿外泌体CD26是否与AKI肾功能恢复相关;（5）探讨尿外泌体CD26对AKI肾脏功能恢复的预测价值。3方法3.1研究设计该研究为单中心前瞻队列观察性研究。我们同时也收取了入住ICU的非AKI患者作为对照,首先比较两组间尿外泌体CD26表达的差异,以探讨尿外泌体CD26表达与AKI发生是否相关,并通过多元线性回归分析各临床因素对尿外泌体CD26表达有无影响。在AKI患者中按CD26+尿外泌体比率分为CD26高表达和低表达组,首先通过双向比较研究尿外泌体CD26与AKI分期、住院死亡率的关系,继而用生存分析的方法比较尿外泌体CD26表达的高/低与90天内主要肾脏不良事件（MAKE）的关系。其中MAKE包含3个成分,即死亡、接受肾脏替代治疗及肾功能持续恶化,对3个终点和组合终点分别进行分析及检验。应用同样的方法分析尿外泌体CD26表达水平与28天内肾功能恢复的关系,并进一步应用Cox回归分析进行多因素分析;进而在AKI存活者中对3个肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复）进行分析,通过单因素和多因素分析验证尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复和院内肾功能恢复之间的关系。最后,在AKI存活者中检验尿外泌体CD26对早期肾功能恢复,出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测价值,并进行亚组分析。3.2研究对象研究连续纳入2017年1月至2018年1月入住山东大学齐鲁医院ICU,符合AKI诊断的成年患者,构成研究队列。AKI的诊断按照2012 KIDIGO指南推荐的诊断标准。排除标准为:（1）无尿;（2）严重的尿路感染;（3）泌尿系结石或肿瘤;（4）既往应用CD26/DPP4抑制剂;（5）患者或法定代表人拒绝。对照组的患者通过连续筛查2017年1月-2017年3月入住ICU的不符合AKI诊断标准的成年重症患者。排除标准同AKI组。入选患者均按照2012 KIDIGO指南的推荐进行治疗。3.3临床资料的采集采集患者的一般情况,包括:性别,年龄,身高、体重;采集患者的慢性病史及急性合并症;采集患者用药史;生命体征;采集入住ICU 24h内的Scr、尿量,及血常规、血生化、肝功能等数值。计算入住ICU第一天的APACHEII评分及非肾脏APACHE II。3.4临床终点的定义及随访本研究定义的主要终点是90天主要肾脏不良事件（MAKE）,包含:死亡、接受肾脏替代治疗（RRT）和持续肾功能恶化（较入组时肌酐≥200%）。次要终点为肾功能恢复。肾功能恢复的定义为不再符合AKI和CKD的任何一条诊断标准。肾功能恢复终点包含:早期肾功能恢复（7天内）,出院肾功能恢复（出院时处于肾功能恢复状态）和院内肾功能恢复（住院期间发生过肾功能恢复）。随访患者至90天,随访其存活与否,有无接受肾脏替代治疗（RRT）及肌酐数值等。若发生以上事件,记录事件发生的时间,以进行分析。3.5标本采集及保存入组患者在入住ICU的24小时内留取新鲜尿液15ml。常温下,以300g转速离心10min,弃沉渣,取上清,放入-80℃冰箱备用。3.6外泌体分离纯化通过差速超速离心法对尿液标本中的外泌体进行分离和纯化。3.7电镜观察外泌体显微结构样品前处理后,透射电镜观察AKI患者尿液外泌体的超微表征。3.8检测外泌体特征性蛋白利用Western blot及流式细胞术检测外泌体特征性蛋白。3.9乳胶微球辅助的流式细胞术检测尿液外泌体中CD26醛/硫酸盐乳胶微球吸附分离提纯的尿液外泌体,荧光素标记的流式抗体孵育结合的乳胶微球,流式细胞仪检测CD26阳性的尿液外泌体的阳性率。3.10统计学方法对采集的临床资料及检验数据,连续变量用中位数及四分位间距描述,分类变量的描述为病例数（n）和百分比（%）。对于连续变量,采用Student’s t-test检验用于呈正态分布的数据比较,Mann-Whitney检验和Kolmogorov-Smirnov检验用于呈非正态分布的数据比较。对于分类变量,用Pearson’s chi-squared检验进行数据间的比较。首先对AKI组和对照组间进行CD26+尿外泌体比率进行比较,探讨在AKI发生时尿外泌体CD26表达是否发生改变。进而纳入所有患者,以CD26+尿外泌体比率为因变量,纳入临床因素为自变量,进行相关及多元线性回归分析,来除外各临床因素对尿外泌体CD26表达的影响。为研究尿外泌体CD26与90天内MAKE及28天内肾功能恢复间的关系,我们应用类似生存分析KM曲线的方法,并对28天内肾功能恢复应用Cox进行多元回归分析,探讨其独立影响因素。在AKI存活者中进行双向比较,按临床终点分类（早期肾功能恢复/早期肾功能未恢复,出院肾功能恢复/出院肾功能未恢复,院内肾功能恢复/无院内肾功能恢复）,比较两个结局间CD26+尿外泌体比率;分别应用单因素和多因素的方法研究尿外泌体CD26与三个AKI肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复、院内肾功能恢复）的关系。单因素分析将尿外泌体CD26表达水平与三个肾功能恢复终点分别进行单因素chi-squared检验,多因素分析分别以三个肾功能恢复终点为因变量,自变量纳入尿外泌体CD26表达水平和各临床因素进行多元Logistic回归分析。最后进行敏感性分析,在AKI存活者中,通过制作ROC曲线,研究尿外泌体CD26对三个肾功能恢复终点的预测能力,并分亚组进行分析。以上分析,生存分析和ROC曲线应用GraphPad Prism 8进行分析,余统计过程均应用SPSS 17.0进行。4 结果4.1研究对象纳入研究对象为山东大学齐鲁医院重症医学科住院的成年患者,共入组AKI队列133人,非AKI对照组68人。4.2提取的外泌体形态与大小应用透射电镜和动态光散射测量结果显示提取的尿液外泌体形态与大小符合文献报道的经典外泌体特征,不含细胞碎片、微粒等其他细胞成分,可以用于下一步检测。4.3提取的外泌体生物标志物Western blot与流式细胞检测术显示 CD63,CD81,GRP94,Calnexin,CD61以及TSG101在所提取的外泌体中表达丰富。4.4 AKI队列与对照组临床特征及尿外泌体CD26的比较基线特征进行比较:两组间年龄、性别、非肾脏APACHEII评分匹配。AKI组住院死亡率显着增高。两组间住院时间和住ICU时间相比较,均无明显差异。AKI组CD26+尿外泌体比率显着低于对照组,6.4%（1.2%-22.0%）vs.23.9%,（6.6%-64.5%）;p<0.001。4.5尿外泌体CD26与临床指标的相关性分析CD26+尿外泌体比率与非肾脏APACHE II评分、糖尿病、慢性肾病（CKD）及AKI呈负相关,与外科术后呈正相关,与余临床指标不相关。多元线性相关分析显示,仅AKI与CD26+尿外泌体比率独立相关adjusted β=-15.95（-23.60,-8.29）,p<0.001。4.6尿外泌体CD26表达高/低两组间临床特点的比较以中位数为界值,定义CD26+尿外泌体比率≥6.4%为尿外泌体CD26高表达（n=67）,CD26+尿外泌体比率<6.4%为尿外泌体CD26低表达（n=66）。尿外泌体高表达和低表达组之间进行临床特点的比较,显示两组间年龄、性别、APACHEII评分及非肾脏APACHE II评分相匹配。比较两组间住院时间、住ICU时间及住院死亡率无显着性差异。高表达组院内接受RRT比率显着低表达组（p=0.016）,早期肾功能恢复、院内肾功能恢复显着高于低表达组（p<0.05）,而出院肾功能恢复率无显着性差异。4.7尿外泌体CD26表达与AKI分期之间的关系尿外泌体CD26表达高/低两组间比较AKI 3个分期的构成,结果显示无统计学差异（p=0.084）。将CD26+尿外泌体比率作为连续变量,在AKI 3个分期间进行比较,两两比较各组无差异。因此,尿外泌体CD26与AKI的分期无显着性关系。提示,尿外泌体CD26表达与肾损伤的严重程度无关。4.8尿外泌体CD26表达与AKI患者预后的关系4.8.1尿外泌体CD26与MAKE 90的关系针对复合终点MAKE的组成成分逐一进行分析。为分析尿外泌体CD26与死亡终点的关系,首先在出院存活与死亡患者间比较CD26+尿外泌体比率无显着性差异。尿外泌体CD26表达高/低两组间比较住院死亡率无显着差异。最后在高表达组和低表达组间比较90天死亡率,Kaplan-Meier分析显示CD26高表达组与CD26低表达组90天死亡率无显着差异（p=0.907）。以上结果提示,尿外泌体CD26与近期死亡无关。对MAKE的另一成分——接受RRT治疗,与尿外泌体CD26的关系进行分析。CD26高表达组较低表达组院内应用RRT的比率显着降低（p=0.016）。KM分析显示,CD26高表达组90天内接受RRT比率显着低于低水平组（p=0.013）。提示,CD26高表达预示90天内RRT应用风险较低。对MAKE的最后一个成分——持续肾功能恶化进行分析。KM分析显示,90天内持续肾功能恶化在两组间无统计学差异（p=0.717）。对复合终点MAKE进行分析,CD26高表达组90天内MAKE的发生率显着低于CD26低表达组,具有统计学差异（p=0.018）,主要是RRT应用这一结局的影响。提示,尿外泌体CD26高表达预示近期内MAKE发生风险较低,较好的肾脏相关预后。4.8.2尿外泌体CD26与肾功能恢复的关系4.8.2.1尿外泌体CD26与28天内肾功能恢复的关系Kaplan-Meier分析比较AKI患者尿外泌体CD26高/低表达组间28天内肾功能恢复发生率,结果显示高表达组28天内肾恢复率显着高于CD26低表达组（p<0.001）。进一步的多因素Cox回归分析,尿外泌体CD26 表达水平进入方程（HR,1.90;95%CI,1.15-3.14;p=0.012）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进AKI肾功能恢复。4.8.2.2 AKI存活者中尿外泌体CD26与肾功能恢复终点的关系AKI组81名存活者,依据3个肾功能结局进行分组,分别为早期肾功能恢复组/早期肾功能未恢复组、出院肾功能恢复组/出院肾功能未恢复组、院内恢复组/院内肾功能未恢复组,分别比较3组CD26+尿外泌体比率,显示各良好结局组CD26+尿外泌体比率均显着高于不良结局组（p<0.05）。在CD26表达高/低两组间比较肾功能早期恢复的差异,高表达组29（72.5%）例患者早期恢复,而低表达组仅有15（3 6.6%）例患者早期恢复,卡方检验显示两组间早期肾功能恢复存在显着差异（OR=4.57,p=0.001）。逐步多元Logistic回归分析显示,早期肾功能恢复与AKI分期及尿外泌体CD26表达水平独立相关（OR=4.67,p=0.007）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进早期肾功能恢复的因素。在CD26高/低表达两组间比较肾功能出院恢复的差异,高表达组34（85.0%）名患者出院恢复,而低表达组有23（56.1%）名患者出院恢复,卡方检验显示两组间出院肾功能恢复存在显着差异（OR=4.44,p=0.004）。以出院肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期和尿外泌体CD26表达水平（OR=3.50,p=0.039）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进出院肾功能恢复的因素。在CD26表达高/低两组间比较院内肾功能恢复,高表达组35（87.5%）例患者院内肾功能恢复,低表达组有23（56.1%）例患者在院期间肾功能恢复,存在显着差异（OR=5.48,p=0.002）。以院内肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期以及CD26表达水平（OR=4.66,p=0.019）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进院内肾功能恢复。4.8.3尿外泌体CD26对肾功能恢复终点的预测价值CD26+尿外泌体比率在AKI存活者中分别预测早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复,经ROC方法检测仅对早期肾功能恢复的预测具有统计学意义,曲线下面积（AUROC）为0.65（0.53-0.77）,p=0.021。对于出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测不能达到统计学意义。利用预测早期肾功能恢复的ROC曲线选取曲线上最佳截断值,为6.8%。利用该值计算尿外泌体CD26对3个肾功能恢复终点的预测能力,显示其对出院肾功能恢复和院内肾功能恢复有较高的特异性和阳性预测值。分析显示,大于此截断值的患者其中90%的患者将在院期间发生肾功能恢复。提示,尿外泌体CD26对肾功能转归的预测具有一定的临床应用价值。进一步在亚组中检测尿外泌体对3个肾功能恢复终点的预测能力。因为脓毒症是AKI最重要的病因,按是否合并脓毒症分类后,显示在非脓毒症相关AKI的患者中尿外泌体CD26的预测价值显着提高,预测早期肾功能恢复:AUROC=0.71,p=0.046;预测出院肾功能恢复:AUROC=0.79,p=0.009;预测院内肾功能恢复:AUROC=0.83,p=0.003。提示,在非脓毒症相关AKI患者,尿外泌体CD26对肾功能恢复有较强的预测价值,值得进一步研究。5结论（1）尿外泌体CD26表达的降低与重症患者AKI的发生相关,但尿外泌体CD26表达水平与AKI肾损伤的严重程度不相关;（2）尿外泌体CD26与近期死亡率不相关,但尿外泌体CD26与90天内主要肾脏不良事件发生率相关,尿外泌体CD26高表达预示着较低的90天内主要肾脏不良事件发生风险;（3）尿外泌体CD26与肾功能恢复独立相关,尿外泌体CD26高表达可预测AKI早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复。利用尿外泌体CD26早期预测肾功能转归,实现个体化精准治疗,以期能改善患者的长期预后。1 研究背景急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是住院患者尤其重症患者的严重并发症,除导致住院死亡率显着升高外,会导致长期死亡率升高和慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）及终末期肾病的发病率增加,造成沉重的疾病负担。目前对于AKI尚无有效的预防或治疗措施,仍为支持治疗。外泌体是一种细胞外囊泡,广泛存在于各种体液中。其脂质双分子层携带来源细胞的蛋白及核酸的结构使其作为一种细胞间信使,通过与受体细胞结合,广泛参与各种生理及病理过程的调节。外泌体作为疾病诊断和预后标志物越来越受到重视,已发现数种外泌体蛋白及RNAs与AKI有关。晚近的几项研究发现,外源性的外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进肾功能恢复,但其作用机制及关键分子尚不清楚。论文I的研究发现,与对照组相比,AKI患者尿外泌体CD26表达显着降低;而AKI患者队列内部,尿外泌体CD26高表达组比低表达组有更高的出院肾功能恢复率;经过校正性别、年龄、慢性合并症、急性病因、危重程度、AKI分期之后,尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复等肾脏预后仍有独立的关联。因肾小球滤过膜的存在,尿外泌体较少来自于循环,肾脏细胞是尿外泌体的主要来源。由此我们推断表达CD26的肾脏细胞来源的外泌体可能有减轻肾脏损伤、促进肾脏修复的功能。CD26是细胞表面的跨膜糖蛋白,通常也被称作Dipeptidyl peptidase-4（DPP4）。其具备丝氨酸蛋白酶活性,广泛表达于多种类型的细胞中,在肾脏其表达于肾小球足细胞的基底膜,并高度表达于远端肾小管上皮细胞（TEC）的刷状缘微绒毛。研究发现CD26与细胞增殖、炎症调节等过程相关。TEC的再生是AKI修复的主要环节,研究发现CD26有促进细胞增殖的作用。并且CD26参与炎症反应的调节,其底物包含一些系列趋化性细胞因子。AKI主要病理过程发生于TEC,尤其远端TEC的损伤、坏死或凋亡,进而炎症细胞浸润、间质炎症反应的发生。肾脏修复主要过程为TEC的增生,替代丧失的TEC、修复肾小管上皮组织,炎症反应参与调控这一过程。良好的增生和调控,导致完全的修复和肾功能的恢复;反之则导致纤维化的加重,最终导致CKD。因此,我们假设CD26+外泌体可能通过促进TEC增生,抑制炎症反应,减轻纤维化,减轻肾损伤、促进肾脏修复。由此,我们拟通过体外培养小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1,通过体外模拟AKI的主要致病过程缺血再灌注（ischemia/reperfusion injury,IR）,获取培养基上清中的生理外泌体（ExoNormal）,IR程序获取ExoIR,探索生理与IR条件下尿液中CD26的表达。过表达CD26腺病毒载转染TCMK1,构建TEC来源的CD267过表达的外泌体（ExoCD26）;利用手术构建IR相关的AKI小鼠动物模型,进一步利用外泌体进行干预,通过与对照组在肾脏功能、组织病理及增生、炎症等指标对照间的比较,探讨CD26+外泌体对AKI肾脏修复的影响,及其可能的机制。2 目的（1）体外实验中探讨缺血再灌注对肾小管上皮细胞（TEC）外泌体中CD26表达的影响;（2）利用CD26过表达的腺病毒载体转染肾小管上皮细胞,构建CD26过表达的TEC外泌体;（3）IR-AKI动物体内,示踪TEC外泌体能否被肾脏细胞摄取;（4）通过体内实验,探讨CD26过表达外泌体能否减轻肾损伤、促进肾脏修复,并探讨其可能的机制。3方法3.1细胞培养及病毒转染TCMKI细胞分别常规培养及缺血缺氧程序培养,两种培养条件下的细胞均按标准程序转染CD26过表达腺病毒与空载体。留取细胞培养基上清。3.2外泌体分离纯化及表达鉴定用超速差速离心法提取TCMK-1小鼠肾小管细胞上清中的外泌体。分别对常规培养细胞释放的外泌体ExoNormal,缺氧培养细胞释放的外泌体ExoIR,正常培养条件下CD26转染后细胞释放外泌体ExoCD26,及缺氧培养并转染的细胞释放的外泌体ExoIR+CD26,分别进行CD26表达的检测。外泌体与抗CD26抗体和荧光素结合的二抗充分反应后,加入流式细胞分析。3.3 AKI（IR）动物模型的建立C57BI/6雄性成年小鼠（8周）,戊巴比妥麻醉后,显微镜下,一侧肾蒂紧密结扎后,将肾脏切除;对侧肾动脉用动脉夹夹闭,观察肾脏变色,呈缺血改变,覆盖湿润纱布,夹闭30分钟。3.4外泌体的体内示踪避光条件下操作,使用PKH26标记外泌体,经尾静脉注入IR小鼠体内;分别于注射15分钟、2小时及12小时在麻醉下取肾脏组织;OCT包埋组织块,制成冰冻切片;切片经双蒸水水化、PBS清洗后,应用BSA终止反应;加入AQP1一抗,4度湿盒孵育过夜后,PBS清洗,加入荧光素偶联的AQP1二抗,37℃孵育30分钟,PBS清洗,DAPI染色、封片,即刻荧光显微镜下观察。3.5 IR小鼠干预措施及分组分为对照组,IR+BSA 组,IR+ExoNormal 组,1IR+ExoIR组,IR+ExoCD26组,每组各10只;对照组不做肾脏处理,余操作同IR手术各组;IR各组于手术后12h分别经尾静脉注入等蛋白质量的BSA,ExoNormal,ExoIR及ExoCD26进行干预。3.6 肾功能指标检测干预后72h,取血样。各血样离心后,保存血清。分别应用尿素氮和肌酐试剂盒进行检测,以得出尿素氮和肌酐的浓度数值。3.7 肾脏组织病理学检测干预后72h,进行肾脏取材。各肾脏组织分别进行HE染色和PAS染色,显示肾小管上皮损伤情况,并用半定量的方法,在各组间进行比较。3.8 肾脏增殖指标的检测免疫荧光技术检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在各组肾脏的表达;Western blot的方法检测p21和p53在肾脏的表达。3.9 肾脏炎症指标的检测免疫荧光技术分别应用抗MOMA2抗体、抗neutrophil抗体及抗CXCR4抗体显示巨噬细胞、中性粒细胞在肾脏的浸润和趋化性细胞受体CXCR4在肾脏的表达。并应用Western blot的方法检测趋化性细胞因子SDF-1（CXCR4的配体）在肾脏的分布。3.10肾脏纤维化指标的检测Western blot的方法测定1型胶原在各组肾脏中的表达。4 结果4.1 外泌体鉴定电镜下可见纯化成分为双凹圆盘状的高电子密度囊泡,大多直径位于30-150nm;使用动态光散射技术检测微粒的粒径大小,结果提示分离纯化的囊泡直径呈单峰分布,平均直径在30-100nm左右。结果提示,使用经典的超速差速离心方法获得的为典型的外泌体囊泡,可用于下一步功能试验。4.2外泌体中CD26表达分析流式细胞分析显示,生理条件下TCMK-1细胞培养液上清中分离纯化的外泌体ExoNormal中CD26表达量较少,经过IR程序的TCMK-1细胞上清外泌体ExoIR中CD26表达轻度增加。分别向TCMK-1细胞系（常规条件培养）转染空载体病毒Vector和过表达CD26的病毒（VirusCD2）。病毒转染后,细胞系培养液上清分离纯化外泌体,流式测得该外泌体高度表达CD26,阳性率大于70%,即ExoCD26。同样方法转染缺氧条件下培养的TCMK-1细胞系,从细胞培养液上清采集的外泌体（ExoIR+CD26）,也高度表达CD26,与ExoCD26相似。各组外泌体进行western blot检测,显示ExoNormal对CD26的表达均少,ExoIR对CD26的表达较ExoNormal轻度增加;常规培养的细胞系转染VirusCD26后释放的外泌体（ExoCD26）对CD26表达显着增加;缺氧条件下培养的细胞系,转染VirusCD26后,其外泌体（ExoIR+CD26）对CD26的表达也显着增加,与ExoCD26无明显差异。4.3 AKI动物模型的鉴定经过一侧肾动脉钳夹,对侧肾脏切除,72h后小鼠血尿素氮、肌酐显着升高,肾脏组织出现IR病理学改变,证实AKI造模成功。4.4动物体内外泌体示踪PKH26标记的外泌体通过尾静脉注入IR小鼠体内,2h后取材,制冰冻切片,荧光标记AQP1。显示肾小管上皮细胞内可见外泌体荧光标记,肾脏其他类型细胞内未见外泌体荧光标记。提示,肾小管上皮细胞（TEC）来源的外泌体选择性的被TEC所摄取。4.5外泌体对肾脏功能指标的影响IR小鼠血清尿素尿素氮及肌酐水平显着增高:与BSA相比,ExoNormal及ExoIR对肾功能指标无影响,而ExoCD26显着降低了血清尿素氮和肌酐水平。4.6外泌体对肾脏组织损伤的影响HE染色及PAS染色显示,IR小鼠肾脏出现明显损伤,包含肾小管扩张,刷状缘缺失,肾小管上皮细胞的坏死,管型的形成等;与BSA相比,ExoNomal及ExoIR未能减轻肾脏损伤,而ExoCD26显着降低了肾损伤评分和损伤肾小管分数,减轻了肾脏组织损伤。4.7外泌体对TECs增生的影响免疫荧光染色示,IR小鼠肾脏增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）显着降低;与 BSA 相比,ExoNormal 及 ExoIR 未能增加PCNA的表达,而ExoCD26显着增加了 PCNA的表达,PCNA沿肾小管分布。此外,IR小鼠肾脏p21和p53表达显着升高,提示细胞分裂增生的阻滞;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能降低p21和p53的表达,但ExoCD26显着降低了两者的表达。以上结果提示,ExoCD26促进了 TECs细胞的增生。4.8外泌体对肾脏炎症反应的影响免疫荧光显示,IR肾脏中性粒细胞、巨噬细胞浸润显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着降低中性粒细胞和巨噬细胞的浸润,而ExoCD26显着降低了两种炎症细胞的浸润。同时,Western blot和免疫荧光结果显示,SDF-1和CXCR4这一对趋化因子及受体在IR肾脏表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能明显改变其表达,但ExoCD26显着降低了两者表达。提示,ExoCD26能降低趋化性细胞因子及受体的表达,并改善炎症细胞的浸润。4.9外泌体对肾脏纤维化的影响Western blot结果显示,IR肾脏1型胶原表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着改变其表达,而ExoCD26显着降低了 1型胶原表达。提示,ExoCD26抑制早期肾纤维化。5.结论（1）缺血再灌注使肾小管上皮细胞系来源的外泌体CD26的表达增加;（2）肾小管上皮细胞系来源的外泌体在IR-AKI小鼠动物模型体内,可被TEC摄取;（3）ExoCD26可改善AKI小鼠肾脏功能指标,减轻肾脏损伤,其可能的机制是ExoCD26被TEC摄取后,促进TEC增殖,减轻肾脏炎症反应和纤维化,从而促进肾脏的修复。
李磊[3]（2021）在《地衣芽孢杆菌对热射病大鼠的防护作用及基于肠道屏障与菌群的机制研究》文中认为研究背景热射病（Heat Stroke,HS）是一种因机体暴露于高温环境和/或高强度作业而导致产热与散热失衡,以核心体温显着升高（>40℃）与中枢神经系统功能异常为典型特征,常伴有系统性炎症反应综合征（Systemic Inflammatory Response System,SIRS）、多器官功能障碍综合征（Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS）与弥散性血管内凝血（Disseminated Intravascular Coagulation,DIC）等症状的临床综合征。HS以其起病急、进展快、抢救难和病死率高而受到广泛关注。HS患者肠道损伤后出现的肠道屏障功能障碍诱使肠腔内毒素入血发生内毒素血症,进而触发系统性炎症反应和多器官损伤,最终导致HS患者死亡,这提示肠道损伤是HS发病过程中的始动环节,起至关重要的作用。因此,针对肠道损伤探索相关医学防护措施,寻找能够增强热耐受能力和提高肠道屏障功能的干预措施,有助于降低HS发病率和病死率。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniforms,BL）是一种临床常见的益生菌菌种,其活菌制剂具有调节肠道功能紊乱,缓解肠道疾病损伤等肠道保护作用。研究表明,BL可通过调节肠道菌群结构,拮抗肠道疾病产生的炎症,提高肠道屏障功能,改善肠道吸收消化功能等多种方式发挥其益生作用。BL已被应用于畜牧业防护家禽免受饲养环境热应激的损伤,并提高生产效能。基于此,本课题提出假设:BL活菌制剂可能对HS造成的炎症反应与多器官损伤具有防护作用,并且该防护作用可能是通过靶向调节肠道菌群,缓解肠道损伤,提高肠道屏障功能等方式所介导。研究目的本课题主要研究地衣芽孢杆菌对HS的防护作用,基于前期工作基础和文献建立HS大鼠模型,以肠道为研究对象,从肠道菌群变化及肠道屏障功能等角度阐述地衣芽孢杆菌对HS的防护作用机制。研究方法（1）设定温度40℃和相对湿度65%的高温高湿环境建立大鼠HS模型,并通过胶囊体温计精确测量大鼠核心体温,以确定模型构建的最佳条件。选取HS发病后0.5小时、3小时和6小时时间点,利用全自动血生化仪检测血生化指标肌酐（Creatinine,CREA）,肌酸磷酸激酶（Creatine Phosphokinase,CK）,尿素氮（Blood Urea Nitrogen,BU）,天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase,AST）和丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase,ALT）,利用酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）试剂盒检测炎症因子指标肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）,白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）。根据血生化指标和炎症因子检测结果确定适宜取材点即HS发病后3小时,并利用苏木精-伊红染色法检测肝、肺、肾和肠组织,确定HS大鼠模型成功建立。（2）为考察BL对HS的防护作用,使用经菌种鉴定后的BL活菌,于磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline,PBS）中制成1×108 CFU/m L的BL活菌制剂悬液,对照组大鼠（灌胃PBS）,BL组分三个亚组分别灌胃BL悬液3天、7天和14天,每天灌胃两次,每次灌胃PBS或BL菌液1 m L。完成菌液灌胃后大鼠当晚禁食,第二天进行HS模型诱导,记录分析各组大鼠核心温度变化曲线,选择最适宜BL菌液灌胃周期（为BL连续灌胃7天）,并考察BL对HS的整体防护作用,检测指标为大鼠的核心体温、炎症反应指标（TNF-α、IL-1β和IL-6）、器官损伤情况（ALT、AST、BU、CREA、CK和病理切片）及生存率。（3）通过检测血液生物标记物D-乳酸,肠型脂肪酸结合蛋白（Intestinal Fatty Acid Binding Protein,I-FABP）,内毒素并开展4k Da异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖苷（4 k D fluorescein isothiocyanate,FITC-dextran,FD4）肠渗透性实验评估肠道损伤程度和肠道屏障功能,利用免疫荧光检查肠道组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和E-Cadherin,利用透射电镜检查肠道上皮紧密连接的超微结构,综合考察BL对HS致肠道损伤的防护作用。（4）为深入探索BL防护HS的机制,在确定的HS发病后3小时实验取材点收集各组大鼠肠道粪便,通过16S r RNA测序检测益生菌BL与HS对于大鼠肠道微生态多样性的影响,通过对各组肠道菌群的物种组成分析与差异分析,明确BL对于肠道菌群的调控作用。研究结果（1）连续监测大鼠核心体温,其平均核心温度变化曲线呈现典型日周期节律,夜晚最高平均温度为38.03±0.50℃,最低温度平均值为36.33±0.59℃。构建环境温度40±1℃,相对湿度65±5%的高温高湿环境,将成年雄性SD大鼠置于该环境加热约60分钟进行HS诱导,其核心体温超过42℃并保持相对稳定,达到HS发病初步诊断标准。多时间点炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和血生化指标（ALT、AST、BU、CREA和CK）检测结果显示,在HS发病后3小时时间点指标均升高,具有统计学差异（P<0.05）,而CK,TNF-α和IL-1β三个指标在3小时时间点达到了最高值（分别为2134±976.7 U/L,17.13±2.64 pg/m L和64.45±24.36 pg/m L）,并在6小时时间点TNF-α显着下降（P=0.004）。组织病理学检查结果显示大鼠于3小时时间点出现明显肝、肾、肺和肠损伤,符合HS病理生理改变。（2）比较3天、7天和14天三种BL预灌服周期的大鼠在诱导HS发生期间的核心体温与最高体温,发现BL-7d组与BL-14d组HS大鼠最高体温平均值与对照组HS大鼠的最高核心体温平均值相比显着降低,均有统计学差异（P<0.001）,而BL-7d与BL-14d两组的最高核心体温平均值相比无统计学差异（P=0.79）,最终确定7天为最佳预灌胃周期。进一步研究发现BL预灌服7天可显着减轻HS大鼠发病后核心体温升高的速度与幅度,HS+BL组大鼠最高核心体温平均值比HS+PBS组降低约1.125℃,具有统计学差异（P<0.001）。同时BL预灌服7天可提高HS大鼠生存率（33.3%vs 88.9%）,具有统计学差异（P=0.0003）。同时预灌服7天的HS大鼠与对照组HS大鼠相比,其炎症反应指标（TNF-α、IL-1β和IL-6）与多器官损伤生化指标（ALT、AST、BU、CREA和CK）显着降低,均具有统计学差异（P<0.05）。与HS+PBS组相比,HS诱发的肝、肾、肺和肠损伤在HS+BL组程度较轻,组织病理评分同样较低,其中肝、肾和肠损伤病理评分差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）BL预灌服7天的HS大鼠的肠道损伤相关指标D-乳酸、I-FABP、内毒素和FD4在血液浓度低于对照组HS大鼠,具有统计学意义（P<0.05）。肠道组织免疫荧光发现BL预灌服7天可明显上调肠道TJ蛋白ZO-1、Occludin和E-Cadherin蛋白表达及其连续性。透射电镜检查肠道上皮超微结构发现BL可维持肠道在高温环境下的紧密连接结构,缓解HS对肠道紧密结构的破坏作用。（4）16S rRNA测序比对与普通PCR实验结果证实课题采用的活菌菌粉制剂为益生菌BL63516菌株,且该菌株属地衣芽孢杆菌种。16S r RNA测序发现BL预灌服7天可显着改变大鼠肠道菌群多样性及结构组成,增加有益细菌如乳杆菌和乳球菌在肠道菌群中比例,尤其是乳杆菌比例显着升高至43.88%,具有统计学差异（P<0.05）,并提高大鼠肠道菌群在高温高湿环境下的稳定性。同时HS模型诱导同样可显着改变大鼠肠道菌群,发现HS+PBS组大鼠肠道菌群内特定细菌Romboutsia比例为7.15%,与正常Con+PBS组Romboutsia菌比例3.87%相比显着升高,具有统计学差异（P<0.05）,而HS+BL组与HS+PBS组相比该菌比例低至3.20%,差异具有统计学差异（P<0.05）。结论本课题通过建立高温高湿环境致大鼠HS模型,证实BL预灌服7天可实现对HS的防护:缓解过高的核心体温、提高HS大鼠生存率以及减轻系统性炎症反应和多器官损伤;BL对HS的防护作用机制主要是:通过调节肠道菌群,缓解HS早期出现的肠道损伤,维持肠道屏障功能,从而防护HS的发生与病情进展。
林颖[4]（2021）在《多发伤创伤评分方法优选与海战伤伤情评分方法探索》文中研究表明第一部分多发伤创伤评分方法优选创伤对公众健康构成严重威胁,尤其是多发伤。如何快速准确地评估多发伤患者伤情是展开进一步紧急救治的前提和基础。创伤评分是对不同伤情进行定量评估的一种方法,通过评分区分伤情轻重,并展开分级救治。如今已建立多种创伤评分方法,每种评分方法各有优缺点,目前临床上缺乏对不同创伤评分的系统比较。本部分研究通过对多发伤患者病历资料进行回顾性分析,比较不同创伤评分与多发伤患者生存情况相关性及死亡风险评估能力,以筛选最佳的创伤评分方法,并探讨了多发伤患者死亡相关风险因素。研究主要内容:（1）患者选择及资料收集回顾性分析203例多发伤患者,纳入标准:（1）符合多发伤的诊断标准;（2）年龄≥18岁;排除标准:（1）年龄>90岁或<18岁;（2）既往患有严重的心肺、肝肾功能障碍、肿瘤等疾病;（3）数据不完整或存在明显错误的病历资料;（4）孕妇。收集患者人口统计学资料,基本生命体征,入院后首次获得的临床检验指标、影像学结果等。根据患者生存情况分为生存组和死亡组,利用患者的基本生命体征、全身体格检查及影像学结果等分别进行CRAMS评分、PHI评分、MEWS评分、RTS评分及AIS-ISS评分。（2）多发伤不同创伤评分方法的应用比较比较五种创伤评分对伤情轻重的判断;采用Spearman秩相关性分析比较五种创伤评分与多发伤患者生存情况相关性;运用ROC曲线及曲线下面积比较五种创伤评分预测多发伤患者死亡风险的评估能力。（3）多发伤患者死亡风险因素分析利用单因素与多因素Logistic回归分析筛选与死亡相关的风险因素,并采用ROC曲线下面积评价筛选的指标预测死亡风险的评估能力。研究结果和结论:（1）患者基本情况根据纳入排除标准,最终纳入185例多发伤患者,生存组164例,死亡组21例;车祸伤和坠落伤是常见的致伤机制,头颈部是常见的致伤部位。（2）多发伤不同创伤评分方法的应用比较CRAMS评分、PHI评分及ISS评分能将大部分死亡患者识别为危重伤,所占比例分别为86%、82%、95%,MEWS评分与RTS评分对死亡患者识别为危重伤的能力明显低于其他三种评分,所占比例分别为57%、0%;CRAMS评分与生存情况相关系数|r|最大为0.220,即CRAMS评分与生存情况相关性较强。CRAMS评分、PHI评分、MEWS评分、RTS评分、ISS评分对多发伤患者死亡风险评估能力比较的ROC曲线下面积分别为0.698、0.696、0.693、0.692、0.651。即CRAMS评分对多发伤患者死亡风险评估效能较高（p<0.05）。因此,可以优先采用CRAMS评分方法对多发伤患者进行伤情评估。（2）多发伤患者死亡风险因素分析将单因素logistic回归分析中有统计学意义的指标GCS评分、ISS评分、RTS评分、MEWS评分、PHI评分、CRAMS评分、SI、p H值、Lac、PCT、PT、APTT纳入多因素分析,结果显示Lac（OR=1.636,95%CI:1.041-2.571,p=0.033）和PCT（OR=1.042,95%CI:1.009-1.076,p=0.012）与多发伤患者生存情况相关。Lac和PCT预测多发伤患者死亡风险AUC值分别为0.755（95%CI:0.638-0.872）和0.684（95%CI:0.527-0.841）,最佳界限值分别为2.05mmol/L、3.32ng/L。故Lac和PCT是影响多发伤患者存活的风险因素,且Lac对多发伤患者死亡风险的预测能力高于PCT。第二部分海战伤伤情评分方法探索我国海域辽阔,海上冲突愈演愈烈,海上作战可能成为未来我军主要作战形式之一。海上作战时,伤员极有可能合并海水浸泡,低温、高渗、富含特殊致病菌的海水会导致伤情更加复杂。目前国内外较少开展海水浸泡特殊环境下伤情评估研究,普通类型创伤评分也并不完全适用于海战伤情评估,急需建立海战特殊环境下的创伤评分方法。因此,本部分研究创伤合并海水浸泡大鼠病理生理变化特点,同时建立针对海水浸泡特殊环境下的创伤评分方法,旨在为研究海战伤伤情分类救治及优先处置原则提供参考。主要实验方法:利用SD大鼠建立创伤合并海水浸泡模型（包括失血休克和复合伤两种创伤）:规定存活时间明显长于出水后4 h的记为存活,明显短于出水后4 h的记为死亡,记录大鼠死亡情况和存活时间;检测生理指标（呼吸、血压、肛温）;抽血测血气(Glu、p H值、Lac、PO2、PCO2、HCO3-、Na+、Cl-、Ca2+、K+)、器官功能（肝、肾、心）、凝血功能以及血常规等指标变化。探讨创伤合并海水浸泡大鼠病理生理变化特点并通过散点图的方式建立创伤合并海水浸泡大鼠伤情评分表。研究主要内容:（1）创伤合并海水浸泡大鼠病理生理变化特点1.利用SD大鼠建立创伤合并海水浸泡模型,记录大鼠死亡情况和存活时间;检测创伤后大鼠生理指标。2.利用SD大鼠建立创伤合并海水浸泡模型,记录大鼠死亡情况和存活时间;检测创伤后大鼠血气情况。3.利用SD大鼠建立创伤合并海水浸泡模型,检测创伤后大鼠器官功能、凝血功能以及血常规血液指标。（2）创伤合并海水浸泡大鼠伤情评分方法探索研究为了建立创伤合并海水浸泡大鼠伤情评估的评分方法,根据创伤合并海水浸泡组出水后4 h的存活情况分为生存组及死亡组,通过第一部分获得的生理指标、血气指标等,分析并筛选影响存活的指标,再建立各指标对应的死亡率-散点图,根据散点图中各指标不同区间走向趋势,对各区间赋一评分值,作为其对伤情轻重影响权重,即可建立创伤合并海水浸泡大鼠伤情评分表。研究结果和结论:（1）创伤合并海水浸泡大鼠病理生理变化特点1.创伤合并海水浸泡组总死亡率为28%（9/32）,单纯创伤组总死亡率为6%（2/32）（p<0.05）,伤后4-7 h为死亡高峰;创伤合并海水浸泡组存活时间[（8.1±3.7）h]短于单纯创伤组[（11.3±4.8）h]（p<0.05）,故创伤合并海水浸泡大鼠早期死亡率显着增加,存活时间明显缩短,损伤更加严重;2.创伤合并海水浸泡组呼吸[（58.8±2.9）次/min],血压[（80.0±25.1）mm Hg],肛温[22.4（20.1,25.0）℃],pH值（7.1±0.1）较单纯创伤组[（100.4±7.2）次/min,（89.8±18.1）mm Hg,31.7（30.5,33.2）℃,（7.3±0.1）]抑制或下降;PO2[（196.3±34.1）mm Hg],PCO2[45.5（35.1,51.1）mm Hg,Na+[145.0（142.0,148.0）mmol/L],Cl-[120.0（115.0,124.5）mmol/L],Ca2+[（1.3±0.1）mmol/L],K+[（3.6±0.8）mmol/L]较单纯创伤组[（149.4±22.6）mm Hg,29.7（25.6,34.5）mm Hg,142.0（139.0,144.0）mmol/L],118.0（114.0,121.0）mmol/L,（1.2±0.1）mmol/L,（3.3±0.6）mmol/L]上升（p均<0.05）,其余指标差异无统计学意义（p均>0.05）;故创伤合并海水浸泡大鼠主要表现为呼吸抑制,血压下降显着、低体温,机体内环境严重紊乱,呈现明显的酸中毒,血钠、血氯、血钙、血钾升高;3.创伤合并海水浸泡组肝脏损伤指标较单纯创伤组无统计学差异（p>0.05）;肾脏损伤指标肌酐两组之间无统计学差异（p>0.05）,而尿素氮[8.0（7.2,8.8）umol/L]反而较单纯创伤组[10.6（7.2,12.3）umol/L]降低（p<0.05）;心肌损伤指标肌钙蛋白[1.24（0.25,2.89）ug/L]较单纯创伤组[0.12（0.06,0.21）ug/L]显着升高（p<0.05）。凝血功能方面,创伤合并海水浸泡组凝血酶原时间、国际标准化值均较单纯创伤组延长（p均<0.05）,而部分活化凝血酶原时间两组之间变化不明显（p>0.05）;血常规方面,白细胞[（3.8±3.2）×10^9/L]较单纯创伤组[（8.1±3.5）×10^9/L]明显减少（p<0.05）,血小板及红细胞变化两组之间无明显差异（p均>0.05）;故创伤合并海水浸泡大鼠器官功能损伤会加重,尤其是心脏,但肝脏、肾脏损伤变化不是很明显;凝血功能呈现延长趋势;白细胞显着抑制。（2）创伤合并海水浸泡大鼠伤情评分方法探索研究分析死亡组和生存组结果,死亡组呼吸[36.0（30.0,36.0）次/min]、血压[（43.1±21.8）mm Hg]、肛温[（20.0±1.9）℃]、pH值（7.1±0.1）、HCO3-[（12.3±2.2）mmol/L]较生存组[60.0（48.0,78.0）次/min、（86.6±19.3）mm Hg、（23.0±3.1）℃、7.2±0.1、（14.6±2.3）mmol/L]均显着抑制或下降（p均<0.05）,其余指标差异无统计学意义（p均>0.05）。故筛选出影响大鼠存活情况的呼吸、血压、肛温、pH值、HCO3-,分别计算这5个指标在划分区间内的死亡率,并绘制各指标对应的死亡率-散点图,可见各指标在划分区间内的死亡率均存在一种较为明显的上升或下降趋势。根据不同区间对应死亡率的高低,对该区间赋一评分值,作为其对伤情轻重影响权重。将每一指标不同区间均赋以相应的评分值,从而建立创伤合并海水浸泡大鼠伤情评分表。
田军[5]（2021）在《降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究》文中认为创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）的定义是由于外部机械力造成的脑损伤,并导致大量的死亡和残疾,许多受害者有功能障碍,如运动和感觉功能障碍,甚至认知功能缺陷。据估计,全世界每年约有5000万人被诊断为TBI。颅脑损伤根据发生的不同过程和阶段,可分为原发性和继发性脑损伤,都是由脑外伤引起的复杂疾病。组织丢失和细胞死亡是主要的损伤,TBI后由于原发性颅脑损伤导致的继发性脑损伤,导致激活的小胶质细胞、募集的中性粒细胞和巨噬细胞以及血液代谢物中引起的炎症反应均可导致继发性脑损伤,进而导致进一步的功能性和器质性的脑损伤。炎症反应被认为是TBI继发性损伤的重要机制。从理论上讲,减少炎症改善受损脑组织能量及代谢可以减轻TBI引起的继发性脑损伤。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide CGRP）是由37个氨基酸组成的多肽,广泛表达于中枢和外周神经系统。目前,CGRP被认为是最有效的血管舒张药。CGRP在脑组织中起保护作用。当脑组织受到损伤并出现缺血时,小鼠脑TBI后产生大量自我保护物质,CGRP是其中最重要的保护物质之一。研究表明,在TBI后的病理过程中,CGRP的分泌在TBI后增多。增加的目的是使脑血管扩张,尽快为损伤后缺血缺氧的脑组织提供血液供应。然而,当脑组织损伤缺血较严重时,脑组织产生的CGRP不能完全防御这种损伤。因此出现了严重的脑组织继发性和永久性损伤。考虑到CGRP具有保护脑损伤的潜力,而自噬和凋亡在TBI诱导的继发性损伤中发挥重要作用,我们检测了CGRP是否能抑制TBI小鼠的自噬和凋亡的表达。结果表明,CGRP通过减轻脑水肿、调节神经元自噬和凋亡,减低TBI后神经炎症反应来保护大脑。第一部分创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系目的:临床工作中,观察不同TBI患者CGRP表达变化、判断伤情程度,进一步探讨CGRP与TBI患者病情程度及预后的关系,并探讨CGRP是否可以作为判断TBI预后的可靠指标。方法:选取138例TBI患者进行分组:健康体检者54例（对照组）,重度TBI组73例,轻度TBI组65例。采用酶联免疫分析试剂法（ELISA）,测定TBI患者特定时间的血清CGRP水平。采用格拉斯哥昏迷量表（GCS）判定TBI严重程度。统计分析:各组不同时间CGRP比较采用重复测量资料的方差分析,同一时间组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。采用wilicoxon秩和检验分析患者血清CGRP水平与临床变量的关系。结果:1.TBI后患者血清CGRP的变化对照组随时间变化呈现平稳状态,TBI（轻度组）和TBI（重度组）先下降后逐渐上升。两组血清CGRP水平均低于对照组。入院时、1天、3天、7天和14天时间点,TBI（重度组）低于TBI（轻度组）,差异显着,有统计学意义;入院时、1天、3天时间点,TBI（轻度组）低于对照组,差异显着,有统计学意义;入院时间点7天和14天,TBI（轻度组）低于对照组,但差异不显着。2.入院时TBI患者血清CGRP水平与临床病理特征关系相对于GCS评分<5分的患者,GCS评分≥5分的患者血清CGRP水平较高（Z=-2.277,P=0.023）。存活患者的CGRP水平高于死亡患者（Z=-3.571,P<0.001）。3.入院血清CGRP预测TBI患者伤后死亡的价值评估血清CGRP水平预测TBI患者伤后死亡的特异度为88.24%,灵敏度为68.82%,CGRP预测最佳临界值为13.255pg/ml。4.TBI患者预后与血清CGRP的相关性CGRP高水平组患者生存情况优于低水平组患者,差异显着;单因素Cox分析发现,年龄,中线结构移位,GCS分数,CGRP水平与TBI患者预后相关;多因素Cox分析发现,中线结构移位,CGRP水平是TBI患者独立预后因素。小结:1.TBI后患者血清中的CGRP变化趋势为随伤后时间变化先降低,然后逐渐升高。约至24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡,而且该预测效能较高。第二部分降钙素基因相关肽（CGRP）对小鼠创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用目的:通过重物打击法（Feeney重物下降挫伤法）,建立开放性创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）动物模型,并予以脑室注射联合尾静脉注射外源性降钙素基因相关肽（CGRP）干预TBI模型小鼠;通过旷场实验、水迷宫实验、巴恩斯迷宫实验、跳台实验对实验小鼠的行为学评分进行测量,验证（CGRP）对创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用。通过测量CGRP干预前后小鼠脑挫伤面积比较、脑水肿比较、血脑屏障破坏程度等方面的比较,来探讨CGRP对TBI小鼠脑损伤的保护作用。方法:清洁级（SPF）雄性BALB/C小鼠390只,随机分为sham组、TBI组和TBI+CGRP组。用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg,i.p.i.）麻醉小鼠,根据Feeney重物下降法,建立开放性颅脑创伤模型。TBI+CGRP两组分别用CGRP肽（脑室注射+尾静脉注射）,术后每日采用改良神经严重程度评分（m NSS）检测各组小鼠的神经功能缺损程度。各组小鼠分别于术后相应的时间点（1、3、5、7天）取材;苏木精伊红染色（HE染色法）和（TTC）染色法:测量小鼠脑组织损伤面积,并进行组间对比;通过干湿重法测量不同组别小鼠的脑组织含水量;通过测量Evans Blue（EB）渗透率的方法,来判定TBI后血脑屏障的破坏程度。通过蛋白质印迹法（Western blot）测量脑组织CGRP蛋白的表达量。通过行为学测试对小鼠神经行为学进行测量:术后第8、9天进行旷场实验;术后第10-15天行水迷宫实验;术后第16-22天行巴恩斯迷宫实验;术后第23、24天为跳台实验的训练和测试阶段。结果:1.创伤性颅脑损伤（TBI）（Feeney重物下降挫伤法）动物模型稳定:术后小鼠平均昏迷时间约为1.5-2h,生命体征较平稳,体温恢复,呼吸平稳,逐渐苏醒和爬行,可进食水。脑组织经解剖,均可见局部挫伤灶,局部坏死、淤血,伴部分脑组织的凹陷缺损;部分样本损伤灶同侧可见蛛网膜下腔出血。2.各组小鼠m NSS评分差异术后第1天,TBI+CGRP组和TBI组相对sham组,神经功能均受损明显。TBI+CGRP组和TBI组神经功能基本相同,差异无统计学意义;在TBI后第2-7天,TBI+CGRP组小鼠m NSS评分低于TBI组,差异显着;第2-7天TBI+CGRP组和TBI组神经功能逐渐有所好转,两组小鼠的分数逐渐下降。3.TBI小鼠神经功能行为学评分结果旷场实验（Open field test）评分结果:总活动距离测试:sham组总距离最长,TBI+CGRP组小鼠的总距离居中间水平,TBI组的总距离最短。TBI+CGRP组小鼠的总距离相比TBI组的总距离长,差异显着。静止次数和静止时间和测试方面:TBI组小鼠静止次数最多,sham组和TBI+CGRP组静止次数较低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。TBI组小鼠静止时间最长,sham组和TBI+CGRP组静止时间相对较最低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。水迷宫实验:定位航行实验阶段:水迷宫测试小鼠发现平台的潜伏期,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比TBI组小鼠的潜伏期时间短,差异显着,有统计学意义。TBI组小鼠比sham组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。空间探索实验阶段:在测试的第五天小鼠穿过平台次数,sham组最多,TBI组最少,TBI+CGRP组居中。TBI组穿过平台次数相比sham组少,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组穿越平台次数多于TBI组,差异显着,有统计学意义。巴恩斯迷宫测试:训练阶段:TBI组小鼠的潜伏期相比较TBI+CGRP组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。第六天试验中,第一次探查目标洞（无暗箱）前的错误探查次数比较,TBI+CGRP组小鼠的探错次数相比TBI组小鼠多,差异显着,有统计学意义。跳台实验评分:在跳台试验测试阶段,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比较TBI组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义;错误次数:TBI+CGRP组小鼠的错误次数相比较于TBI组小鼠的错误次数少,差异显着,有统计学意义。4.不同组别小鼠脑组织标本创伤面积的测量和比较:三组小鼠脑组织切片相比较:TBI+CGRP组与TBI组相比较,均可见一定程度的脑组织损伤及局灶性神经细胞组织缺失,早期缺损范围的差异性较小。随着时间的推移,TBI小鼠脑组织切片可见更严重的脑损伤;定量计算脑损伤体积,TBI+CGRP组小鼠脑组织切片与TBI组小鼠脑组织切片相比较,损伤面积略小,但差异不显着,无统计学意义。5.脑水肿测定:外源性CGRP干预,将TBI术后脑水肿消退的时间点提前,减少了TBI诱导的脑水肿在TBI后持续时间,加速了TBI诱导的脑组织水肿的吸收,进而减轻脑损伤;另一方面,TBI+CGRP组小鼠的脑含水量在1天、3天、5天、7天这四个时间点,脑水肿程度均低于TBI组小鼠,差异显着,有统计学意义。6.血脑屏障损伤程度:TBI术后第1天,sham组未见明显依文思蓝（EB）渗出,TBI+CGRP组小鼠（EB）渗透率和TBI组相比无明显差异;TBI后第3、5、7天,TBI+CGRP组和TBI组小鼠依文思蓝（EB）渗透率仍较高,TBI+CGRP组小鼠依文思蓝（EB）渗透率低于TBI组,两者差异显着,有统计学意义。7.TBI后各组小鼠CGRP蛋白表达水平的差异:TBI组小鼠脑组织中CGRP表达水平显着降低,并随着时间的推移逐渐升高;TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的开放性颅脑损伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。2.CGRP干预减低了创伤性颅脑损伤小鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度。3.通过蛋白印迹法可见TBI后小鼠脑组织中CGRP的表达水平显着降低,24h达最低,随时间推移逐渐回升。TBI+CGRP组小鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示本实验采用的脑室注射+尾静脉注射干预途径有效可靠。第三部分降钙素基因相关肽（CGRP）对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响目的:通过对小鼠挫伤脑组织部位取材,对其进行自噬和凋亡相关标志性蛋白检测,观察对比CGRP干预前后自噬和凋亡标志性蛋白的变化情况,探讨CGRP在TBI环境下对自噬和凋亡的调控作用。方法:通过免疫荧光双染法:定位分析LC3和Neu N及GFAP蛋白;蛋白质印迹法,定量分析LC3、P62、Beclin-1、cleaved-caspase-3表达量;TUNEL和Neu N双染色法,分析TBI后神经元凋亡的表达变化情况。结果:1.CGRP对TBI小鼠神经元细胞自噬的影响免疫荧光双染法:脑皮层挫伤区LC3（+）蛋白定位于挫伤部位神经元的胞质中,Sham组可见少量阳性表达,随时间推移阳性表达程度无变化。TBI组于伤后1天可见LC3（+）细胞显着增多,随时间推移表达程度逐渐增强,高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组与TBI组比较,LC3（+）细胞数量较少,表达程度明显减弱,TBI后第1天,差异不显着,无统计学意义;而TBI后第3、5、7天,两组差异性逐渐增强,差异显着,有统计学意义。蛋白质印迹法:部分自噬标志物LC3、P62、Beclin-1蛋白表达与双染结果一致。TBI+CGRP组的LC3II/LC3I比值和Beclin-1水平较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。P62水平的变化则相反,与sham组相比,TBI导致小鼠P62表达降低,TBI+CGRP组的P62较TBI组明显升高,差异显着,有统计学意义。CGRP的干预导致P62蛋白表达逐渐增强并维持在一个相对较高的阶段。2.CGRP对TBI小鼠神经元细胞凋亡的影响:TUNEL和Neu N双染色显示:TBI导致神经元凋亡增加,挫伤灶周围TUNEL（+）细胞明显增加;TBI+CGRP组的TUNEL（+）较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义;蛋白质印迹法:（Western blot法）:TBI导致神经元凋亡,小鼠挫伤灶脑组织凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达升高,皮层组织细胞凋亡增加。TBI+CGRP组的cleaved-caspase-3较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。3.CGRP对TBI小鼠神经元细胞神经胶质纤维酸性蛋白GFAP的影响:与sham组相比,TBI导致小鼠神经元细胞GFAP数量明显增加,Neu N数量明显减低,而CGRP的干预降低了神经元细胞损伤。脑皮层挫伤区GFAP（+）表达:Sham组可见少量阳性细胞表达,表达不明显。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见阳性细胞显着增多。TBI组GFAP（+）计数率高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组GFAP（+）计数率低于TBI组第1、3天差异无显着性,第5、7天差异显着,有统计学意义。脑皮层挫伤区Neu N（+）表达:Sham组可见适量Neu N（+）表达。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见Neu N（+）细胞显着减少。TBI组Neu N（+）计数率低于Sham组,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组Neu N（+）计数率高于TBI组差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,予以外源性CGRP干预,有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡;2.TBI后小鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在显着增加,CGRP干预后,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位的胶质纤维酸性蛋白的出现,保护神经细胞功能。第四部分AKT/m TOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控目的:通过利用CGRP干预TBI小鼠模型,在信号通路层面探讨CGRP对自噬和凋亡相关通路蛋白的调控情况,进一步探讨CGRP对自噬和凋亡的调控机制。方法:通过CGRP干预TBI小鼠模型,采用蛋白质印迹法（Western Blot法）,测定CGRP干预前后挫伤灶局部脑组织的AKT/m TOR、Fox O3a通路相关标志蛋白的变化情况,并对比CGRP干预前后的蛋白表达变化差异。结果:1.CGRP对AKT/m TOR通路的影响TBI术后导致了小鼠脑神经元细胞内p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR水平降低,TBI+CGRP组和TBI组均低于sham组,差异显着,有统计学意义。CGRP使这两者比值均升高。其中,CGRP对p-Akt/Akt激活作用较明显,术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的p-Akt/Akt相比TBI组表达升高,差异显着,有统计学意义;CGRP对p-m TOR/m TOR激活作用较弱,术后第1、3天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异显着,有统计学意义;术后第5、7天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异不显着,无统计学意义;同时,Akt/m TOR信号的激活也在TBI后逐渐增强。2.CGRP对Fox O3a表达的影响TBI术后细胞核中Fox O3a蛋白水平显着升高,而细胞浆中Fox O3a蛋白水平显着降低,证实TBI导致了小鼠脑神经元细胞内Fox O3a蛋白分布的变化。CGRP使细胞核内Fox O3a增加逐渐减弱,而胞浆中Fox O3a逐渐升高。细胞核中Fox O3a蛋白表达情况可见,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达低于TBI组,差异显着,有统计学意义;而细胞浆中Fox O3a表达情况可见,TBI术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预促进了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡的降低,起到了脑保护作用。2.TBI促进了Fox O3a蛋白向神经元细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预可缓解细胞核内的Fox O3a升高趋势,保护神经元细胞。结论:1.临床TBI患者血清样本中CGRP变化趋势为先迅速降低然后逐渐升高,约24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰,与动物模型变化趋势相同。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡情况,而且该预测的效能较高。CGRP高水平组远期预后、存活率优于CGRP低水平组;存活患者血清CGRP水平高于因TBI死亡的患者。CGRP可以作为TBI预后不良及死亡评估的参考指标。3.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的颅脑挫伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。4.CGRP干预,减低了创伤性颅脑损伤鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度;通过蛋白印迹法,可见TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示脑室注射联合尾静脉注射的外源性干预途径有效可靠。5.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,神经胶质纤维酸性蛋白GFAP增加;CGRP的干预有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位GFAP的表达。6.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡水平升高,同时促进了Fox O3a蛋白向细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;相反,外源性CGRP干预可促进Akt/m TOR信号通路的激活,抑制了神经元细胞自噬和凋亡,缓解了细胞核内的Fox O3a升高趋势,起到了脑保护作用。
龚振宇[6]（2020）在《靶向RBM19调节胶质母细胞瘤放疗敏感性的作用与机制研究》文中研究指明胶质瘤是中枢神经系统最为常见的恶性肿瘤,而胶质母细胞瘤（GBM）作为其中最为常见的一类,具有恶性度极高、治疗难度大、易复发等特点。当前临床上针对该类疾病的标准疗法是确保安全条件下最大范围的外科手术切除,随后辅以放化疗。但因颅内解剖结构复杂或肿瘤毗邻重要功能区,外科手术无法达到全切时,辅助治疗就成为治疗过程中的重要一环。其中放疗作为重要的辅助治疗手段,对于提升患者生存质量,延长患者生存期起到了关键作用,然而随着患者进一步接受放疗,多数患者会逐渐产生不同程度的放疗抵抗,从而导致治疗效果大打折扣。该现象提示我们,提高胶质母细胞瘤的放疗敏感性、减少放疗抵抗是提高放疗效果的重要切入点,是胶质母细胞瘤治疗相关研究中的亟待解决的科学问题。本课题组前期引入麻省理工学院张锋团队的CRISPR Cas9全基因组文库,筛选出了多个胶质瘤放疗增敏的相关基因,本研究中,我们选择RBM19进行深入研究,探索其在胶质母细胞瘤放疗增敏中的价值以及相关的分子机制。已有研究表明RNA模体结合蛋白家族（RBM）在多种肿瘤的发展过程中扮演了重要角色,包括促进肿瘤的增殖、凋亡等等。近期有相关研究表明,RBM19与小鼠早期胚胎发育、肠上皮细胞的增殖/分化等相关,但其在肿瘤放疗甚至肿瘤方面,当前没有相关文献报道。本课题中,我们首先利用GEO公共数据库中下载的4个胶质母细胞瘤患者的基因表达数据集（共包含70例正常样本和267例GBM）分别对其进行差异表达分析,我们发现RBM19确实在GBM和正常脑组织中存在差异表达,并且在GBM中表达上调,随后我们利用GSEA对RBM19进行了功能富集分析,发现RBM19基因与DNA损伤密切相关,DNA损伤是电离辐射导致细胞死亡的主要原因,也是本课题下一步重点探讨的内容。最后借助下载的TCGA数据库中患者的临床资料与随访数据进行筛选和生存分析,我们发现接受放疗的GBM患者中,RBM19的表达量与患者的总生存期（OS）以及无病生存期（DFS）相关,而与无进展生存期（PFS）没有明显相关性。接下来我们探讨了RBM19对胶质瘤放射敏感性的影响和初步分子机制。首先,我们构建了RBM19敲低的质粒并利用慢病毒感染U251和U87细胞,从而构建稳定敲低的细胞系以完成下一步实验。利用构建好的细胞系,我们在体外进行了一系列实验验证,发现敲低RBM19具有明确的放疗增敏效果。CCK-8实验检测辐照后的U251和U87细胞系,我们发现RBM19敲低后,细胞的增殖能力和细胞活力都显着下降。随后我们利用流式细胞仪检测了照后胶质瘤细胞系的凋亡情况,发现在敲低RBM19后,U251和U87细胞系的凋亡率明显升高。而在细胞周期的检测中,没有发现RBM19敲低后与对照组细胞有明显差别。前期的生物信息学分析提示RBM19与DNA损伤高度相关,于是我们借助免疫荧光技术,对RBM19在细胞内定位进行了明确,结果发现,RBM19定位于细胞核内。为了验证RBM19参与DNA损伤修复过程,我们通过Western Blot对DNA损伤修复相关蛋白的表达水平进行了验证,我们发现与NC对照组相比,辐照后的RBM19敲低组U87和U251细胞系的DNA损伤修复通路相关蛋白激活均显着降低,证明在不同胶质瘤细胞系中,RBM19敲低后都显着的抑制了DNA损伤修复（DDR）通路的激活。通过Western Blot技术,我们证明了敲低RBM19在胶质母细胞瘤放疗增敏过程中是通过DNA损伤修复通路发挥作用。为了进一步寻找与RBM19互相作用的蛋白,我们借助免疫沉淀技术发现了CHEK1能够与RBM19直接相互作用,可能是RBM19参与DNA损伤修复通路的重要媒介。通过以上的体外实验,我们对敲低RBM19能够增强胶质母细胞瘤放疗敏感性的分子机制做了初步探索。最后我们在体内进行了实验,构建了裸鼠胶质母细胞瘤荷瘤放疗的模型,我们将对照组U87细胞和RBM19敲低的U87细胞接种于裸鼠颅内,发现在接受辐照后,RBM19敲低组的荷瘤裸鼠生存期明显延长,且借助H&E染色切片可观察到同期时间条件下,RBM19敲低组荷瘤裸鼠的肿瘤体积也相对更小,放疗敏感性有明显提升。综上所述,本课题首次证实了敲低RBM19对胶质母细胞瘤有明显的放疗增敏作用,并证明RBM19通过调控DNA损伤修复来影响胶质母细胞瘤的放疗敏感性,同时我们也发现与RBM19相互作用的蛋白是CHEK1。以上的研究结果证明RBM19是胶质母细胞瘤放疗增敏的新的分子靶点。为临床胶质母细胞瘤放疗增敏提供了一个新的研究方向和潜在的治疗手段,对增强胶质母细胞瘤放疗效果有一定意义。
施辉[7]（2020）在《具有靶向作用的纳米载体双载TMZ和siPLK1增加胶质瘤化疗敏感性的研究》文中研究说明目的:本研究设计一种具有靶向作用且可以双载化疗药物替莫唑胺及小干扰RNA（si RNA）si PLK1的纳米载体,观察其是否能增加脑胶质瘤对化疗药物替莫唑胺（TMZ）的敏感性,为临床治疗脑胶质瘤提供新的视角。方法:1.应用悬浮滴定、透析及静电吸附等方法将相关材料组装成纳米载体A2PEC及纳米聚合物TMZ-A2PEC/si PLK1;2.纳米聚合物组装后,运用马尔文粒度仪（Nano-ZS粒度测定仪）检测其物理特征,用透射电子显微镜检测纳米载体A2PEC及纳米聚合物TMZ-A2PEC/si PLK1是否构建成功;3.运用琼脂糖凝胶电泳技术检测纳米载体A2PEC对si PLK1药物的包载率;4.运用酶标仪检测纳米载体A2PEC对化疗药物替莫唑胺的包载率及载药量;5.运用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测纳米载体A2PEC对U87R细胞的靶向作用及U87R细胞对纳米聚合物的内吞效果;6.运用MTT实验检测TMZ-A2PEC/si PLK1对U87R细胞和LN-229细胞的毒性;7.运用细胞周期实验检测TMZ-A2PEC/si PLK1对U87R细胞和LN-229细胞的细胞周期的影响;8.运用流式细胞仪检测TMZ-A2PEC/si PLK1对U87R细胞凋亡的影响;9.运用q RT-PCR、Western blot技术检测TMZ-A2PEC/si PLK1对U87R细胞目的基因及蛋白表达的调控作用;10.对U87原位小鼠脑胶质瘤荧光强度的变化运用活体成像检测,并根据荧光强度变化绘制统计图,同时绘制小鼠生存曲线及体重变化曲线;11.运用HE染色检测TMZ-A2PEC/si PLK1对模型小鼠主要脏器的毒性效应。结果:1.对纳米聚合物的理化性质的检测结果显示其形态均匀一致,粒径大小合适,且其电位大小符合实验要求;2.琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,纳米载体A2PEC在N/P为1时可以有效负载si RNA药物（si PLK1）;3.酶标仪检测结果显示,纳米载体A2PEC可以有效负载TMZ;4.流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示,纳米载体A2PEC对U87R细胞具有较好的靶向作用,且U87R细胞能有效地内吞纳米聚合物;5.细胞周期实验检测结果显示,TMZ-A2PEC/si PLK1能有效地将U87R细胞和LN-229细胞的细胞周期阻滞在G2/M期;6.流式细胞仪及MTT实验检测结果显示,TMZ-A2PEC/si PLK1具有促进U87R细胞凋亡作用以及抑制U87R细胞和LN-229细胞增殖的作用（P<0.001）;7.q RT-PCR、Western blot技术检测结果显示,TMZ-A2PEC/si PLK1对U87R细胞目的基因及蛋白的表达具有显着下调作用（P<0.001）;8.活体成像及HE染色检测结果显示,TMZ-A2PEC/si PLK1能够有效抑制U87原位小鼠脑胶质瘤的增殖（P<0.01）,并能够显着延长实验小鼠的生存期（P<0.001）,且未对主要脏器组织造成明显损害。结论:本研究成功研制了纳米聚合物TMZ-A2PEC/si PLK1,体内外实验结果均表明,TMZ-A2PEC/si PLK1能够对胶质瘤细胞发挥靶向作用,对胶质瘤细胞的增长产生抑制效应,增强了脑胶质瘤对化疗药物TMZ的敏感性,动物实验中小鼠的生存期增加,且对主要脏器无毒副作用,可以为胶质瘤的治疗提供一种新的解决方案。
孟洁[8]（2020）在《miR-182在阿尔茨海默病中的诊断价值及作用机制》文中指出第一部分AD患者血清miR-182表达水平测定及临床意义研究目的探讨血清标记物miR-182在首诊阿尔茨海默病（AD）患者治疗前后血清中的表达变化及其临床意义。研究方法收集40例首诊AD患者美金刚治疗前后的血清样本,并以40例健康志愿者作为对照,采用荧光定量PCR技术检测血清miR-182表达水平,ROC曲线评价血清miR-182表达水平对AD诊断的敏感度和特异度;同时评估AD患者治疗前后的简易智力状态检查量表（MMSE）,分析血清miR-182表达水平与MMSE的相关性。研究结果1.miR-182在首诊AD患者血清表达水平显着高于对照组（z=-7.612,P<0.01）。2.美金刚治疗4个月后AD患者血清中miR-182表达较治疗前明显降低（z=-4.302,P<0.05）。3.患者血清miR-182表达水平与MMSE评分呈现负相关性（r=-0.546,P<0.05）。4.AD诊断的血清miR-182 ROC曲线下面积为0.904（95%CI:0.8460.963,P<0.01）,其灵敏度为89.1%,特异度为80.0%。结论本研究表明,miR-182可作为AD的血清标记物,在AD的诊断及评估病情方面具有良好的临床应用价值。第二部分mi R-182对AD模型细胞增殖及BDNF表达的影响研究目的通过验证mi R-182在AD模型细胞中的表达情况,探讨其对AD模型细胞增殖的影响,进一步寻找并研究mi R-182与目标基因之间的作用关系,从而对mi R-182在AD中的作用机制作初步探讨。研究方法选用不同浓度的Aβ1-40体外诱导SH-SY5Y细胞构建增殖活性受到抑制的AD细胞模型。q PCR法检测正常SH-SY5Y细胞和模型细胞中mi R-182的表达情况。Lipofectamine2000瞬时转染法转染AD模型细胞,再运用q PCR实验判断转染效果。CCK-8实验检测mi R-182对AD模型细胞的增殖活性的影响。选用mi Randa、Target Scan两大生物信息学数据库检索发现mi R-182的潜在下游靶基因BDNF,q PCR和Western blot检测过表达和敲低mi R-182对BDNF m RNA和蛋白水平的影响。研究结果1.mi R-182在AD模型细胞中的表达水平明显高于正常SH-SY5Y细胞（P<0.05）。2.与对照组相比,转染mi R-182组细胞的增殖率被明显抑制,而si RNA-mi R-182组细胞增殖能力显然较强（P<0.05）。3.在线数据库检索结果显示,mi R-182与BDNF的3’UTR之间存在碱基互补结合位点。4.过表达mi R-182组细胞BDNF的m RNA和蛋白表达显着降低,而敲低mi R-182,BDNF的m RNA和蛋白表达明显上调（P<0.05）。结论本研究提示,mi R-182在AD发病机制中可通过抑制细胞增殖、降低BDNF的表达发挥作用,为进一步揭示AD的发病机制提供新的实验支持。
侯志君[9]（2019）在《中医辨证联合抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者肝硬化发生率影响的真实世界研究》文中认为目的:本研究基于真实世界研究的理念,旨在评估中医辨证联合抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者肝硬化发生率的影响,并探究慢性乙型肝炎患者发生肝硬化的相关影响因素。方法:采用回顾性队列研究,共纳入521例慢性乙型肝炎患者,按照其接受中医辨证治疗程度的不同划分为中西医结合队列261例和西医队列260例,对两队列乙型肝炎肝硬化发生率、HBV-DNA阴转率、HBeAg血清学转换率、HBsAg阴转率、抗-HBs阳转率、肝功能（TBiL、ALT、AST、ALB复常率）、肝组织病理学及乙型肝炎肝硬化发生的相关危险因素等进行分析研究,探讨长期中医药治疗在延缓乙型肝炎肝硬化中的作用。结果:1.中西医结合队列和西医队列的中位随访时间均为8年。两队列治疗5年肝硬化累积发生率为6.5%vs 11.9%,治疗7年肝硬化累积发生率为6.5%vs 13.5%,治疗10年肝硬化累积发生率为6.9%vs 13.5%,两队列均有统计学差异（P<0.05）。至随访终点,中西医结合队列有18例进展为肝硬化,西医队列有35例进展为肝硬化,两队列总体肝硬化发生率为6.9%vs 13.5%,有统计学差异（P=0.013）;2.在治疗0.5年时中西医结合队列和西医队列的HBVDNA阴转率为64.4%vs55.76%,有统计学差异（P<0.05）,而在治疗1年、2年、3年、5年、7年、10年时,两队列的HBVDNA阴转率均无显着性差异（P>0.05）;中西医结合队列和西医队列耐药发生率为8.81%vs 19.62%,差异有统计学意义（P<0.05）;中西医结合队列和西医队列治疗5年HBeAg血清学转换率为33.48%vs 24.43%,治疗7年HBeAg血清学转换率为39.16%vs 24.28%,有统计学差异（P<0.05）;至随访终点,中西医结合队列和西医队列的HBsAg阴转率为10.73%vs 6.54%,但统计学比较提示无显着性差异（P>0.05）;中西医结合队列和西医队列的抗-HBs阳转率为5.7%vs 3.5%,统计学比较提示无显着性差异（P>0.05）;3.在治疗3年时,中西医结合队列和西医队列的ALT复常率为90.04%vs 80.77%,存在统计学差异（P<0.05）,两队列治疗5年、7年、10年时两队列ALT复常率无统计学差异（P>0.05）;在治疗3年和10年时,中西医结合队列和西医队列的AST复常率分别为86.9%vs 77.3%、93.24%vs 81.2%,存在显着性差异（P<0.05）,在治疗5年、7年,两组队列间的AST复常率无统计学差异（P>0.05）;在治疗3年和5年时,中西医结合队列的ALB正常率为96.93%vs 90%、98.21%vs 94.6%,存在显着性差异（P<0.05）,在治疗7年、10年时,两组队列间的ALB正常率无统计学差异（P>0.05）;4.共有38例患者完成治疗前后肝穿刺组织检查,其中中西医结合队列20例,西医队列18例。治疗后中西医结合队列和西医队列的纤维化分期总改善率为45%vs 11.11%,有统计学差异（P<0.05）;5.中西医结合队列和西医队列的中医证候总体有效率为95.4%vs 83.1%（P<0.05）;中西医结合队列和西医队列在治疗3年、5年、7年和10年的中医证候积分差值,均有统计学差异（P<0.05）;6.基于基线资料的肝硬化发生情况的单因素分析,男性的肝硬化发生率高于女性（P=0.038）,年龄≥40岁的患者肝硬化发生率高于年<40岁的患者（P=0.012）;HBV感染病程10～15年的肝硬化发生率高于0～5年的患者（P=0.007）,HBV感染病程>15年的肝硬化发生率高于0～5年的患者（P=0.001）;治疗前HBeAg阳性患者肝硬化发生率高于HBeAg阴性患者（P=0.04）;治疗前HBV DNA载量≥107的患者肝硬化发生率高于HBV DNA≥载量103的患者（P=0.036）;有HBV相关家族史的患者肝硬化发生率高于无HBV感染家族史的患者（P=0.022）,有饮酒史的患者肝硬化发生率高于无饮酒史的患者（P=0.000）;不同ALT水平之间的肝硬化发生率无显着性差异（P=0.542）;不同中医证型之间肝硬化发生率无显着性差异（P=0.653）;7.Cox 比例风险回归模型进行多因素分析显示,男性（95%CI:0.080-0.917,P=0.031）、年龄≥40岁（95%CI:1.001-1.050,P=0.040）、有HBV感染相关家族史（95%CI:1.335-4.327,P=0.006）、饮酒史（95%CI:2.477-11.174,P=0.000）、HBVDNA定量≥ 107（P<0.05）、HBeAg 阳性（95%CI:1.032-4.563,P=0.041）是乙型肝炎肝硬化发生的独立危险因素,而中医辨证治疗是延缓乙型肝炎肝硬化发生的保护因素。8.在接受中医药长期辨证治疗过程中动态监测患者的肾功能、血常规、尿常规、心电图等指标,结果提示患者在接受长期中医辨证治疗期间,未出现病情加剧或恶化。9.药物频数分析显示,累积使用频率达到30%以上的中药包括炒白术、苍术、延胡索、茵陈、茯苓、炒山栀、六月雪、乌贼骨、制半夏9味;药性频数统计结果显示以寒性药为主,温性药和平性药次之,凉性、热性药物使用频率较低,热性药物使用频数最少;药味频数统计结果显示以苦、甘味药为主,辛味药次之;药物归属足厥阴肝经最多,其次是足阳明胃经、足太阴脾经、手太阴肺经和足少阴肾经。结论:1.中医辨证联合抗病毒长期治疗慢性乙型肝炎可以降低乙型肝炎肝硬化发生率。2.中西医结合治疗可相对提高病毒学应答率、HBeAg血清学转换率、ALT复常率,显着改善患者的中医临床证候、肝脏组织学和影像学,治疗安全性良好。3.多因素分析显示基线男性、年龄≥40岁、有HBV相关家族史、饮酒史、HBeAg阳性、HBV DNA定量≥107是慢性乙型肝炎发生肝硬化的危险因素。4.导师陈建杰教授主张从“湿”论治慢性乙型肝炎,强调“清热化湿,顾护中州”的治疗原则,同时认为当以“和”为主,攻补兼施,不忘兼症,讲究用药剂量,用药平和轻灵。5.真实世界研究符合中医临床实际情况,可为评判中医辨证论治的临床疗效提供一定的科学依据。
黎之惟[10]（2017）在《氨甲环酸在肘关节僵硬治疗中的应用》文中研究指明目的肘关节僵硬是肘关节损伤后导致肘关节功能障碍最常见的并发症之一,目前肘关节切开松解术仍是治疗肘关节僵硬最重要的方法。肘关节松解术存在术中出血量大及术后关节肿胀、关节内积血、积液等诸多问题,影响患者术后早期锻炼,进而影响肘关节切开松解的预后。本课题提出了在肘关节切开松解术前应用氨甲环酸,以减少术中出血及围手术期关节及组织渗血,促进术后康复锻炼,减少术后异位骨化复发,拟研究其在肘关节僵硬治疗中应用的有效性和安全性,为肘关节僵硬治疗的围手术期管理提供理论依据。方法本课题为前瞻性随机对照临床研究,将我院创伤性肘关节僵硬拟行肘关节切开松解术的患者随机分为两组,实验组术前30分钟予以氨甲环酸静滴,对照组则不予给药。术后两组患者均在医师指导下积极行肘关节系统性功能康复训练以改善关节活动度。通过比对患者术前、术后1天血象及生化指标,结合患者年龄、体重、性别等一般因素计算患者术中出血量,并通过记录比对术后1天、2天、3天、5天、7天时患者关节内引流量,从而评估氨甲环酸对减少术中及术后关节内渗血的止血效果及减少术后关节积液的疗效。通过对比两组患者术后1天、2天、3天,5天的视觉量化疼痛量表（VAS）评价其在减轻术后功能锻炼时疼痛可能存在的潜在效果。通过比对术前、术后2周、6周、3月、6月患者肘关节活动度、肘关节功能评分评价其在肘关节僵硬治疗中应用的有效性。在术后6周、3月、6月分别予以患者肘关节X片检查,应用Hastings分级分析肘关节异位骨化复发情况。患者术前及术后1天的肝功能、肾功能指标（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、血清肌酐、血尿素氮）被记录比对以查明可能存在的止血药物肝肾损害,评价氨甲环酸在肘关节僵硬切开松解术前静脉应用的安全性。结果患者术中失血量根据血红蛋白测定法及红细胞比容测定法两种估算方法进行估算,实验组较对照组术中失血量有明显减少,具有统计学意义（P<0.05）。实验组术后1天、2天、3天时的关节内引流量较对照组有明显减少,具有统计学意义（P<0.05）,术后第5天、第7天引流量组间无差异。实验组患者术后1天、2天、3天、5天时VAS评分显示疼痛较对照组减轻（P<0.05）,随后的VAS评分组间无明显统计学差异（P>0.05）。实验组在术后1天、2天、3天、2周至6月间,肘关节活动度均优于对照组,具有统计学差异（P<0.05）。肘关节功能评分试验组于术后2周、6周、3月随访时优于对照组,但术后6月随访时与对照组无统计学差异。Hastings分级评价异位骨化发生中,I级异位骨化复发试验组较对照组有显着减少（P<0.05）,但II级异位骨化复发有减少趋势但未达到统计学显着性。在安全性评价方面,两组患者术前及术后肝肾功能均无统计学差异,亦未发生脑、肺栓塞等不良事件,提示氨甲环酸在肘关节僵硬切开松解术中应用时对肝肾功能损害风险较小。结论肘关节僵硬患者在肘关节切开松解术前静脉应用氨甲环酸可有效减少术中出血及术后关节积液,并改善患者的术后功能锻炼与预后,减少术后异位骨化复发。氨甲环酸的应用对于无肝肾疾病及心血管抗凝需求的肘关节僵硬患者无明显肝肾损害影响,是安全有效的。
二、不同湿热环境下猫颅脑损伤后生命体征变化及生存曲线分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同湿热环境下猫颅脑损伤后生命体征变化及生存曲线分析（论文提纲范文）
（1）重症中暑横纹肌溶解介导急性肾损伤的临床特征及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 重症中暑横纹肌溶解介导急性肾损伤的临床特征 |
| 前言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 本部分小结 |
| 讨论 |
| 本部分创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 第二章 热打击肌红蛋白诱导肾小管细胞损伤机制及黄芩素的干预效应 |
| 前言 |
| 第一节、铁死亡参与了热打击下肌红蛋白诱导的肾小管损伤 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本章节小结 |
| 第二节 黄芩素调控铁死亡减轻热打击Mb诱导肾小管损伤 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本章节小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 成果·研究生期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（2）CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ CD26阳性尿外泌体与重症患者急性肾损伤预后关系的前瞻性队列研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2 方法与材料 |
| 3 结果 |
| 4 讨沦 |
| 5 结论 |
| 6 局限性 |
| 附图与附表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ CD26阳性外泌体对急性肾损伤后肾脏修复作用的机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 6.局限性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞外囊泡与肾脏疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 发表论文1 |
| 发表论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）地衣芽孢杆菌对热射病大鼠的防护作用及基于肠道屏障与菌群的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 热射病大鼠模型的构建 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 地衣芽孢杆菌对热射病大鼠的防护作用研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 地衣芽孢杆菌对热射病大鼠防护作用的机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 肠道损伤在热射病发病机制中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 论文发表与参与科研情况 |
| 致谢 |
（4）多发伤创伤评分方法优选与海战伤伤情评分方法探索（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一部分 多发伤创伤评分方法优选 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 多发伤不同创伤评分方法的应用比较及死亡风险因素筛选 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第二部分 海战伤伤情评分方法探索 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 创伤合并海水浸泡大鼠病理生理变化特点及评分方法探索研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 启示 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| Meta分析 比较CRAMS评分与PHI评分系统预测创伤患者死亡风险的Meta 分析 |
| 参考文献 |
| 文献综述 海战伤合并海水浸泡致伤特点及优先处置原则 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文情况 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（5）降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤模型小鼠的神经功能保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 AKT/mTOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 自噬和凋亡在颅脑创伤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 降钙素基因相关肽CGRP在神经系统疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）靶向RBM19调节胶质母细胞瘤放疗敏感性的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 胶质母细胞瘤放疗敏感性生物信息学分析 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 RBM19调节胶质母细胞瘤放疗敏感性及分子机制研究 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 RBM19调节胶质母细胞瘤放疗敏感性体内研究 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 DNA损伤修复途径在胶质瘤放疗增敏中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章及参与科研情况 |
| 致谢 |
（7）具有靶向作用的纳米载体双载TMZ和siPLK1增加胶质瘤化疗敏感性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基于纳米聚合物为载体治疗恶性胶质瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（8）miR-182在阿尔茨海默病中的诊断价值及作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 AD患者血清miR-182 表达水平测定及临床意义 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 miR-182对AD模型细胞增殖及BDNF表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论和展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 第五章 综述 |
| 1 miRNA概述 |
| 2 miRNA与神经系统的相关性研究 |
| 3 miRNA与痴呆的相关性研究 |
| 讨论 |
| 综述参考文献 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（9）中医辨证联合抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者肝硬化发生率影响的真实世界研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 临床资料与治疗方法 |
| 1. 临床资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 样本量的计算 |
| 1.3 诊断标准 |
| 1.4 纳入标准 |
| 1.5 排除标准 |
| 2. 研究方案 |
| 2.1 研究设计类型及队列分组 |
| 2.2 治疗方法 |
| 2.3 临床病例资料收集 |
| 2.4 临床随访 |
| 2.5 疗效指标及判定标准 |
| 2.6 统计分析方法 |
| 结果 |
| 1. 病例纳入情况 |
| 2. 两队列基线资料的分析 |
| 2.1 一般资料比较 |
| 2.2 基线HBV DNA比较 |
| 2.3 基线肝功能比较 |
| 2.4 基线AFP水平比较 |
| 2.5 基线肝脏组织病理学的比较 |
| 2.6 中医证型分布 |
| 2.7 病例随访情况 |
| 2.8 抗病毒治疗情况 |
| 3.临床疗效分析 |
| 3.1 乙型肝炎肝硬化发病率 |
| 3.2 不同基线特征乙型肝炎肝硬化发生率 |
| 3.3 HBV-DNA阴转率 |
| 3.4 HBeAg血清学转换率 |
| 3.5 HBsAg阴转率 |
| 3.6 抗-HBs 阳转率 |
| 3.7 耐药的发生率 |
| 3.8 肝功能主要指标比较 |
| 3.9 肝脏组织病理学改善情况 |
| 3.10 中医证候学改善 |
| 3.11 影像学改善率 |
| 4. 乙型肝炎肝硬化发生的相关影响因素分析 |
| 5. 安全性分析 |
| 5.1 血常规正常率的比较 |
| 5.2 肾功能正常率的比较 |
| 6. 中药处方分析 |
| 6.1 药物频数分布 |
| 6.2 药物四气五味统计 |
| 6.3 药物归经统计 |
| 讨论 |
| 1 真实世界研究与中医临床研究 |
| 1.1 真实世界研究的研究现状 |
| 1.2 RWS与RCT的比较 |
| 1.3 中医药临床研究与RWS |
| 2 长期抗病毒治疗对慢性乙型肝炎临床转归的影响 |
| 2.1 慢性乙型肝炎感染的自然史 |
| 2.2 慢性乙型肝炎的抗病毒治疗现状 |
| 2.3 乙型肝炎肝硬化的发生和诊断方法 |
| 3 中医药防治慢性乙型肝炎 |
| 3.1 中医病因病机转化 |
| 3.2 中医辨证论治 |
| 4 中医辨证联合抗病毒治疗的临床疗效分析 |
| 4.1 中医辨证联合抗病毒治疗对乙型肝炎肝硬化发生率的影响 |
| 4.2 不同基线特征与乙型肝炎肝硬化发生率的关系 |
| 4.3 HBV DNA阴转率 |
| 4.4 HBeAg血清学转换率 |
| 4.5 HBsAg阴转率和抗-HBs阳转率 |
| 4.6 对生化学的影响 |
| 4.7 对肝脏组织学的影响 |
| 4.8 对中医证候学的影响 |
| 4.9 影响乙型肝炎肝硬化发生的相关因素分析 |
| 4.10 长期使用中药的安全性分析 |
| 4.11 导师陈建杰教授治疗慢性乙型肝炎的用药规律和临证经验 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1. 文献综述 中医药联合抗病毒治疗慢性乙型肝炎的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 2. 在校期间公开发表论文 |
| 3. 查新报告 |
（10）氨甲环酸在肘关节僵硬治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照 |
| 中文部分 |
| 第一章 绪论 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 研究现状 |
| 2.1 关节周围血肿与异位骨化形成机制 |
| 2.2 氨甲环酸在关节手术中的应用 |
| 2.3 肘关节僵硬切开松解术 |
| 3. 本章小结 |
| 第二章 氨甲环酸减少肘关节松解术围手术期失血的疗效 |
| 1. 引言 |
| 2. 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 氨甲环酸的使用 |
| 2.3 手术方法 |
| 2.4 术后治疗与康复训练 |
| 2.5 数据采集 |
| 2.5.1 一般资料 |
| 2.5.2 血象、出凝血与生化指标 |
| 2.5.3 术后引流量 |
| 2.5.4 疼痛视觉模拟评分 |
| 2.5.5 并发症及不良反应观察 |
| 2.5.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 术前血常规及出凝血功能 |
| 3.3 围手术期出血评估 |
| 3.3.1 围手术期出血的估计方法 |
| 3.3.2 血红蛋白测定法估算出血量 |
| 3.3.3 红细胞比容法估算出血量 |
| 3.4 术后引流量 |
| 3.5 疼痛视觉模拟评分 |
| 3.6 氨甲环酸应用相关不良反应与并发症 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 氨甲环酸在肘关节松解术围手术期的作用原理 |
| 4.2 氨甲环酸在肘关节松解术围手术期应用的疗效 |
| 4.3 氨甲环酸应用的不良反应或并发症 |
| 5. 本章小结 |
| 第三章 氨甲环酸促进肘关节僵硬切开松解术的功能预后 |
| 1. 引言 |
| 2. 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 氨甲环酸的使用 |
| 2.3 手术方法 |
| 2.4 术后治疗与康复 |
| 2.5 数据采集 |
| 2.5.1 一般资料 |
| 2.5.2 肘关节活动度 |
| 2.5.3 肘关节功能评分 |
| 2.5.4 异位骨化复发评估 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 肘关节活动度 |
| 3.3 肘关节功能评分 |
| 3.4 肘关节异位骨化复发 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 氨甲环酸应用对肘关节功能预后的作用 |
| 4.2 氨甲环酸改善肘关节松解预后功能 |
| 4.3 氨甲环酸减少异位骨化复发 |
| 5. 本章小结 |
| 第四章 全文总结和展望 |
| 1. 全文总结 |
| 2. 本课题的创新点 |
| 3. 今后工作展望 |
| 英文部分 |
| CHAPTER I. INTRODUCTION |
| 1. Research background |
| 2. Current Research Status |
| 2.1 The mechanism of the formation of heterotopic ossification around thejoints |
| 2.2 Application of tranexamic acid in the joint surgery |
| 2.3 Open arthrolysis of elbow joint stiffness |
| 3. Sumary |
| CHAPTER II. THE CURATIVE EFFECT OF TRANEXAMIC ACID INREDUCING THE BLEEDING OF ELBOW JOINT ARTHROLYSIS |
| 1. Introduction |
| 2. Materials and methods |
| 2.1 Research object |
| 2.2 The application of tranexamic acid |
| 2.3 Operative method |
| 2.4 Postoperative treatment and rehabilitation training |
| 2.5 Data Acquisition |
| 2.5.1 General information |
| 2.5.2 hemogram, blood coagulation and biochemical indexes |
| 2.5.3 postoperative drainage |
| 2.5.4 pain visual analogue scale |
| 2.5.5 Complications |
| 2.5.6 statistical method |
| 3. Results |
| 3.1 general information |
| 3.2 preoperative blood routine and blood coagulation function |
| 3.3 perioperative bleeding assessment |
| 3.3.1 Estimation of perioperative bleeding |
| 3.3.2 hemoglobin determination of blood loss |
| 3.3.3 hematocrit method to estimate the amount of bleeding |
| 3.4 postoperative drainage |
| 3.5 pain visual analogue scale |
| 3.6 application of tranexamic acid related adverse reactions and complications |
| 4. Discussion |
| 4.1 The role of principle solution in the perioperative period of tranexamicacid in elbow joint arthrolysis |
| 4.2 The effect of tranexamic acid perioperative application in elbow jointarthrolysis |
| 4.3 Adverse reactions or complications of tranexamic acid application |
| 5. Summary |
| CHAPTER III.TRANEXAMIC ACID PROMOTE STIFF ELBOW FUNCTION ANDPROGNOSIS OF THE SURGERY CUT LOOSE SOLUTION |
| 1. Introduction |
| 2. materials and methods |
| 2.1 research objects |
| 2.2 The application of tranexamic acid |
| 2.3 Operative method |
| 2.4 Postoperative treatment and rehabilitation |
| 2.5 data acquisition |
| 2.5.1 General information |
| 2.5.2 Elbow range of motion |
| 2.5.3 Mayo Elbow Performance Score |
| 2.5.4 Recurrence of heterotopic ossification |
| 2.6 Statistical methods |
| 3. Results |
| 3.1 General information |
| 3.2 Elbow range of motion |
| 3.3 elbow joint function score |
| 3.4 Recurrence of heterotopic ossification of elbow joint |
| 4. Discussion |
| 4.1 Effect of tranexamic acid on Application of elbow joint function andprognosis |
| 4.2 Tranexamic acid to improve the prognosis of elbow joint release function |
| 4.3 Tranexamic acid reduces the recurrence of heterotopic ossification |
| 5. Summary |
| CHAPTER IV.SUMMARY AND OUTLOOK |
| 1. Summary |
| 2. The innovation of this research |
| 3. Future work prospects |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
四、不同湿热环境下猫颅脑损伤后生命体征变化及生存曲线分析（论文参考文献）
- [1]重症中暑横纹肌溶解介导急性肾损伤的临床特征及分子机制研究[D]. 吴明. 南方医科大学, 2021
- [2]CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究[D]. 杜鹃. 山东大学, 2021(11)
- [3]地衣芽孢杆菌对热射病大鼠的防护作用及基于肠道屏障与菌群的机制研究[D]. 李磊. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [4]多发伤创伤评分方法优选与海战伤伤情评分方法探索[D]. 林颖. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究[D]. 田军. 河北医科大学, 2021(02)
- [6]靶向RBM19调节胶质母细胞瘤放疗敏感性的作用与机制研究[D]. 龚振宇. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]具有靶向作用的纳米载体双载TMZ和siPLK1增加胶质瘤化疗敏感性的研究[D]. 施辉. 南京医科大学, 2020(06)
- [8]miR-182在阿尔茨海默病中的诊断价值及作用机制[D]. 孟洁. 江苏大学, 2020(02)
- [9]中医辨证联合抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者肝硬化发生率影响的真实世界研究[D]. 侯志君. 上海中医药大学, 2019(03)
- [10]氨甲环酸在肘关节僵硬治疗中的应用[D]. 黎之惟. 上海交通大学, 2017(08)