一、脊髓损伤后一氧化氮合酶活性变化的动态观察及其基因表达（论文文献综述）
朱昊如[1]（2020）在《基于衰老分子机制探讨脾虚证-补中益气汤相关的生物学基础》文中研究表明基于“方证相关”理论剖析复杂方证关系是目前方剂学界面临的主要问题之一,而网络药理学为研究方证关系的现代内涵提供了新方法。中医学认为衰老与脾虚证关系密切,但目前脾虚与衰老关系的分子生物学研究几未有见,脾虚-衰老的分子机制尚不清楚。因此本研究基于方证相关理论,以补中益气汤与脾气虚证高度关联为逻辑依据,从衰老相立论,利用现代网络药理学方法探查补中益气汤分子药理网络;进一步根据该方的作用预测,在整体-系统-分子水平上,动态观察脾虚证模型演变过程中衰老相关病理生理及生物分子变化,以及补中益气汤的相关效用机制。论文分为文献综述和实验研究两部分。文献综述主要涉及近年“方证相关”的研究进展、脾虚证-衰老相关研究进展及补中益气汤现代研究进展三方面内容;实验研究主要包括脾虚证分子内涵与补中益气汤作用相关的网络药理学研究、脾虚证演变与衰老相关的探讨、以及从衰老探察脾虚证现代内涵及补中益气汤效用机制三部分。研究一脾虚证分子内涵与补中益气汤作用相关的网络药理学研究方法:利用TCMSP平台,分别检索补中益气汤组方药味（黄芪、白术、升麻、陈皮、柴胡、人参、甘草、当归、生姜、大枣）活性成分及其关联靶点,利用STRING平台建立靶点PPI网络并导入cytoscape,利用MCODE插件对PPI网络进行聚类来提取核心靶点簇后,使用ClueGO插件对核心靶点进行GO及KEGG富集,提取主要病/生理功能及生物分子信号通路。结果:①筛选得到补中益气汤活性成分143种,关联靶点162个,其中155个靶点之间存在PPI关系,聚类得到核心簇9个。②富集得到GO条目13组,包括NO生物合成、促进平滑肌细胞增殖等;富集得到KEGG条目12组,包括AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路等。结论:脾虚证-补中益气汤的关联机制内涵可能涉及由AGE-RAGE通路、IL-17通路及松弛素通路主导的,通过介导核转录因子NF-kB来调节促炎细胞因子分泌的炎性调节过程。研究二脾虚证演变与衰老相关的探讨方法:Wistar大鼠随机分为对照组与模型组,每组各18只。对照组常规饲养,模型组采用“游泳力竭+饥饱失常”法复制脾虚模型。各组大鼠:①隔日观察外观行为评分,每日称量摄食量,每周末观测体质量及粪便含水率。②于实验第2-4周末进行强迫负重游泳实验,测定负重游泳时长;实验第3、4周进行Morris水迷宫实验,测定定位航行实验逃避潜伏期和空间探索实验的游泳速度、潜伏期、平台穿梭次数、目标象限路程比及探索路线。③于实验第14、21、28d灌服D-木糖溶液后收集尿液,ELISA法测定尿D-木糖含量,计算D-木糖排泄率。于实验第15、22、29d随机分三批麻醉处杀:取脾脏、胸腺称重计算脏器指数;取血清,利用ELISA法测定GAS、MTL、AGEs、BDNF、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平,利用生化法测定CRP水平;取海马,利用ELISA法测定AGEs、Aβ1-40、Aβ1-42、glu、GABA、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。结果:较之于对照组,模型组大鼠:①a.实验第2-4周皮肤毛发、行为状态、活跃程度、睡眠状态积分显着升高（P<0.01）;第1-4周体质量、摄食量显着降低（P<0.01）;第3、4周粪便含水率升高（P<0.05）。b.实验第4周负重游泳时间显着降低（P<0.01）。c.实验第4周脾脏指数与胸腺指数显着降低（P<0.01）;第2-4周尿D-木糖排泄率显着降低（P<0.01）,血清VIP水平降低;第3、4周血清GAS水平降低;第4周血清MTL水平降低（P<0.05或0.01）。②a.实验第3、4周空间探索潜伏期升高、穿越平台次数减少、目标象限路程比降低（P<0.05）,探索路线呈随机策略。b.实验第2-4周海马GABA水平降低;第3、4周海马IL-1β水平显着升高;第4周海马Aβ140、血清BDNF水平降低（P<0.05 或 0.01）,海马 AGEs、Aβ1-42/Aβ1-40、glu、IL-6、TNF-α 水平升高（P<0.05或0.01）。c.实验第2周血清IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05或0.01）;第4周血清IL-1β、TNF-α水平显着降低（P<0.01）。结论:脾虚大鼠模型演化过程逐渐出现学习记忆能力下降的脑衰老表现,其分子特征体现为海马毒性蛋白累积、炎性水平升高与递质稳态兴奋性失衡。研究三从衰老探察脾虚证现代内涵及补中益气汤效用机制方法:Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量给药组与高剂量给药组,每组各8只。对照组常规饲养,模型组及各给药组按研究二方法持续造模4周,低、高剂量给药组自第15d至第28d起分别按5.85g/kg/d、17.55g/kg/d灌服补中益气汤水煎液。各组大鼠:①按研究二时间及方法观测外观行为评分、摄食量、体质量及粪便含水率。②按研究二方法,于实验第4周末进行强迫负重游泳实验;第4周进行Morris水迷宫实验。③实验第28d按研究二方法测定尿D-木糖排泄率。于实验第29d麻醉处杀后:取脾脏、胸腺计算脏器指数;取血清,ELISA法测定GAS、MTL、BDNF、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平;取海马,ELISA 法测定 AGEs、Aβ1-40、Aβ1-42、glu、GABA、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平,免疫组化法测定 p65NF-kB,Western-blot 测定 p65NF-kB、p-p65NF-kB、RAGE、Iba-1,免疫荧光双标法测定NeuN+cleavedcaspase-3、Iba-1+TNF-α、Iba-1+TGF-β1共表达;取下丘脑,免疫组化法测定p65 NF-kB,Western-blot测定p65 NF-kB、p-p65 NF-kB、Iba-1。结果:①较之于对照组,模型组大鼠:a.皮肤毛发、行为状态、活跃程度、睡眠状态积分升高（P<0.05或0.01）,体质量、摄食量显着降低（P<0.01）;粪便含水率升高（P<0.05）。b.负重游泳时间显着降低（P<0.01）;尿D-木糖排泄率,血清GAS、MTL水平显着降低（P<0.01）;血清VIP水平显着升高（P<0.01）。c.空间探索潜伏期显着增加（P<0.01）,穿梭平台次数与目标象限路程比均降低（P<0.05）,空间探索路线呈随机式策略。d.血清BDNF水平降低（P<0.05）;海马AGEs、Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40、RAGE、glu、Iba-1、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平上升（P<0.05 或 0.01）;p65NF-kB 表达量及活化程度上升（P<0.05或0.01）,GABA、TGF-β1水平降低（P<0.05或0.01）,NeuN 与 cleaved caspase3、Iba-1 与 TNF-α 共表达数增加（P<0.05 或 0.01）。e.下丘脑Iba-1表达量、p65NF-kB表达量及其活化程度显着上升（P<0.01）,GnRH表达量显着降低（P<0.01）。f.脾脏及胸腺指数显着降低（P<0.01）,血清IL-1β、TNF-α及TGF-β1水平显着降低（P<0.01）。②较之于模型组,各给药组大鼠:a.一般表征行为积分、体质量、摄食量、粪便含水率均有不同程度改善（P<0.05或0.01）。b.负重游泳时间显着增加（P<0.01）;尿D-木糖排泄率,血清GAS、MTL水平均升高（P<0.05或0.01）;血清VIP水平均显着降低（P<0.01）。c.空间探索潜伏期显着缩短（P<0.01）,空间探索路线呈趋向式策略;高剂量组大鼠穿梭平台次数增加（P<0.05）。d.血清BDNF水平升高（P<0.05）;海马NeuN与cleaved caspase3、Iba-1与TNF-α共表达数均降低（P<0.05）,Iba-1与TGF-β1共表达数均增加（P<0.05或0.01）;p65NF-kB表达量及活化程度均下调（P<0.05 或 0.01）;AGEs、Aβ1-42、RAGE、glu、Iba-1、IL-1β 水平均降低（P<0.05或0.01）,其中低剂量组大鼠海马IL-6与TNF-α水平显着降低（P<0.01）;TGF-β1水平显着升高（P<0.01）。e.下丘脑Iba-1表达量、p65NF-kB表达量及其活化程度降低（P<0.05或0.01）,GnRH表达量均升高（P<0.05）。f.高剂量组大鼠胸腺指数、血清IL-1β及TNF-α水平均升高（P<0.05或0.01）;各给药组大鼠血清TGF-β1水平均升高（P<0.05 或 0.01）,IL-6 水平显着降低（P<0.01）。结论:脾虚大鼠同时存在海马炎性衰老与外循环免疫衰老,AGEs/RAGE/NF-kB通路介导的小胶质细胞M1型激活与神经元凋亡可能是脾虚大鼠出现脑衰老表现的潜在机制。补中益气汤具有良好的健脾抗衰效用,其机制可能涉及抑制海马AGEs/RAGE/NF-kB信号通路过度激活及诱导小胶质细胞向M2型转化来保护神经元。本研究将方证相关理论与网络药理学分析手段相结合,以衰老为切入点,从整体-器官-细胞-分子层面系统探察了补中益气汤-脾虚证关联的机制,为探索中医方-证关联的生物学基础提供了新思路。
郭秋岩[2]（2020）在《乌头汤缓解神经病理性疼痛的药效物质基础及其作用机制探索》文中提出研究目的1.采用脊神经结扎（Spinal Nerve Ligation,SNL）模型,模拟神经病理性疼痛（Neuropathic Pain,NP）的疾病状态,考察乌头汤缓解NP的镇痛作用特点,并分析其作用于NP的病理环节。2.通过网络药理学方法预测乌头汤缓解NP的分子调控机制,并结合化学特性评价、分子对接模拟、表面等离子共振结果筛选乌头汤缓解NP的关键药效物质。3.采用两种NP动物模型,借助激动剂和拮抗剂从正、反两个方向,验证乌头汤缓解NP关键药效物质的镇痛作用及其分子调控机制。研究方法1.乌头汤缓解NP的药效特点及其药理作用探索1.1动物及分组实验动物为雄性ICR小鼠（8周龄）,无特定病原体（SPF）级。组别设置为:假手术组（Sham）、SNL组、SNL-乌头汤低剂量组（3.15g/kg,约为临床日剂量的0.5倍）、SNL-乌头汤中剂量组（6.30g/kg,约为临床日剂量的1倍）、SNL-乌头汤组（12.60g/kg,约为临床日剂量的2倍）。从手术后第一天开始灌胃给药,连续给药21天,Sham组及SNL组用等体积的蒸馏水代替。1.2镇痛药效学指标的检测1.2.1机械痛阈值在符合行为学检测的场所,使用不同力度的von Frey纤维丝在实验动物左后肢足底给予机械刺激,每次持续刺激3-4s,采用上-下法检测动物缩足或停止缩足的数值,间隔5分钟,共测3次,利用公式计算机械痛阈值。1.2.2热痛阈值将动物放入有机玻璃盒组成的隔间装置中,隔着玻璃在左后肢足底表面的中部使用红外辐射热源给予温度刺激,为防止动物组织损伤,将功率设置为40 W,切断时间为20 s,间隔5分钟,共测3次,分别记录每次实验动物对热辐射刺激的延迟时间。1.2.3炎症因子及趋化因子蛋白表达量的检测采用ELISA试剂盒,按照说明书操作,检测不同组别小鼠L5脊髓背角组织中炎症因子IL-1 β、TNF-α以及趋化因子CCL2、CXCL1的含量。1.3转录组表达谱检测检测组别为Sham组、SNL组和SNL-乌头汤（12.60 g/kg）组,提取并纯化上述组别小鼠脊髓背角组织中的总RNA,按照安捷伦表达谱芯片的说明操作,共检测41174个编码基因。1.4差异表达基因的筛选与分析不同组别差异表达基因的选择标准为①|log2-fold change（FC）|>0.5②P<0.05,将符合标准的差异表达基因使用R热图包进行分层聚类分析、基于欧氏距离的3.0聚类软件进行聚类分析。1.5“基因-基因”相互作用网络的构建与分析根据转录组表达谱检测得到的差异表达基因信息,分别构建“SNL所致NP失衡网络”、“乌头汤-SNL相互作用网络”,采用Navigator软件（Version 2.0.1）进行网络可视化。若基因-基因之间的相互作用值高于均数则用于下一步分析。网络中基因被定义为节点;节点之间的连线被定义为边,代表基因之间的相互作用关系;具有拓扑重要性的节点被称作hub节点,节点的拓扑特征值包括连接度、节点介度、节点紧密度和K-core值。1.6通路富集分析基于KEGG生物学通路数据库,采用DAVID在线分析工具,对乌头汤发挥镇痛作用的关键候选靶标进行通路富集分析,若信号通路P<0.05,则被视为具有富集显着性。2.乌头汤缓解NP的分子机制挖掘及关键药效物质筛选2.1乌头汤候选靶标谱的获取以及疾病相关基因的收集本课题组前期基于化合物-药物的结构相似性原理,预测了乌头汤所含化学成分的候选靶标谱;从OMIM和Drug bank数据库检索NP相关的基因,去除冗余得到NP疾病相关的基因集。2.2“NP相关基因-乌头汤候选靶标”相互作用网络的构建与分析采用STRING数据库获取NP相关基因与乌头汤候选靶标的相互作用关系,进而构建“NP相关基因-乌头汤候选靶标”相互作用网络,网络可视化后计算其中节点的拓扑特征值,所有拓扑特征值的中位数设置为卡值,若节点的所有网络拓扑特征值均大于中位数值,则认为该节点具有拓扑重要性,可视为乌头汤缓解NP的关键网络靶标。2.3通路富集分析见 P2,1.6。2.4分子对接通过ChemDraw软件准备化合物的结构信息,从RCSB蛋白数据库收集靶标的蛋白信息。采用pyMOL插件GetBox Plugin确定分子对接的活性口袋（适用于含有配体的蛋白分析,也适用于没有配体但有文献报道的蛋白）,运用分子对接软件Ledock进一步模拟乌头汤镇痛候选活性成分与其靶标蛋白的结合情况。若分子对接数值的绝对值大于5,则认为化合物与相应靶标之间存在强结合。2.5表面等离子共振实验首先,活化靶标蛋白并通过共价反应将其固定在CM5芯片表面,封闭芯片,平衡体系,对于参考道,仅活化、封闭芯片表面,不固定靶标蛋白。其次,配置校正溶液,使不同浓度的化合物流经芯片表面,若化合物与靶标蛋白有相互作用,则会产生结合解离曲线。最后,通过Langmuir结合模型拟合响应曲线,即可得到化合物与靶标蛋白的结合速率常数ka、解离速率常数kd,以及解离平衡常数KD。2.6药物的药代动力学特征检测采用液-质联用的方法,检测健康雄性SD大鼠单次灌胃芍药苷-甘草苷组合或乌头汤后,芍药苷、甘草苷在血浆中的药代动力学特征。根据镇痛药效的预实验确定药物的剂量,其中,乌头汤选择镇痛最佳剂量即15g/kg（相当于4倍临床日用量）;芍药苷-甘草苷组合为芍药苷37.3mg/kg+甘草苷15.1mg/kg（4倍临床日用量乌头汤中芍药苷、甘草苷的含量）。根据药代动力学预实验的结果,设置四个检测时间点于实验动物眼内眦取血,分别为给药后5min、30min、120min和360min。3.乌头汤缓解NP关键药效物质的镇痛作用及其分子调控机制验证3.1动物及分组健康雄性SD大鼠（180-220g）,用于构建两种NP模型,分别是SNL模型、鞘内注射CCR5的天然配体巨噬细胞炎性蛋白（Macrophage Inf lammatory Protein,MIP）诱导的NP模型。为考察关键药效物质组合（Bioactive compounds,BAC）的镇痛作用和分子调控机制,共设置两个实验集。基于SNL模型的实验集共设置10个组别:Sham组、SNL组、SNL-乌头汤组、SNL-BAC（芍药苷+甘草苷）组、SNL-Maraviroc（CCR5 的拮抗剂 MVC）组、SNL-MVC+乌头汤组、SNL-MVC+BAC组、SNL-芍药苷（Paeoniflorin,PAE）组、SNL-甘草苷（Liquiritin,LIQ）组、SNL-普瑞巴林（Pregabalin,PGB）组;基于MIP诱导NP模型的实验集设置4个组别:Sham组、MIP组、MIP+乌头汤组、MIP+BAC组。3.2镇痛药效学指标的检测3.2.1机械痛阈值见 P11,2.1。3.2.2冷痛阈值在符合行为学检测的场所,将动物置于检测装置内,待其处于清醒、安静的状态后,使用20 μ L丙酮刺激左侧后肢的足跖部皮肤。记录30s内动物缩足或舔足的次数,间隔5分钟,共测3次。评分标准为:0分-动物无反应;1分-动物立即缩足但次数少于2次;2分-缩足3次以上;3分-持续性缩足并舔足。3.3乌头汤镇痛关键药效物质的分子机制验证3.3.1乌头汤及其镇痛药效物质对趋化因子信号通路的调控作用分别采用Western blot、RT-PCR、免疫组织化学染色方法,检测趋化因子信号通路成员分子在蛋白和基因水平的表达情况。3.3.2乌头汤及其镇痛药效物质对炎症因子的调控作用采用ELISA方法,按照TNF-α、IL-1 β和IL-6试剂盒的说明,分别检测不同组别大鼠血清中上述三种炎症因子的含量。研究结果1.乌头汤的镇痛作用特点1.1 SNL模型的评价与Sham组相比,SNL模型导致动物短期（1-2天）及持续性的（21天）的机械痛阈值降低、对热刺激的延迟时间缩短（均P<0.05）;脊髓背角组织中炎性因子和趋化因子的蛋白表达量增加（均P<0.05）。1.2乌头汤可以有效缓解SNL小鼠的疼痛症状行为学结果表明,SNL小鼠在乌头汤给药后机械痛阈值和热痛阈值均显着升高（均P<0.05）。给药后持续至少2小时,其中给药1小时后效果最佳。连续每天给药的情况下,第7天给药后乌头汤镇痛时-效关系与第1天类似,表明动物未对乌头汤产生药物耐受问题。Sham组小鼠在乌头汤给药后,机械痛阈值和热痛阈值基线均未改变,提示乌头汤仅改变NP状态下动物的疼痛症状。ELISA结果表明,乌头汤在3.15～12.60 g/kg范围内可有效降低SNL小鼠L5脊髓背角中IL-1 β、TNF-α、CCL2、CXCL1的蛋白表达量。1.3 NP相关基因主要参与胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症转录组检测结果表明,SNL组与Sham组具有显着性差异,共有567个差异表达基因（上调基因331个、下调基因236个）,包含18个已知NP相关基因（ADCY1、ADRA2A、B4GALT3、BRAF、BTG2、CHRNA4、DYNC1H1、EGFR、GL01、HTR1D、IL1R1、PDGFRA、PDPK1、PGR、PNPLA6、SCN1B、TEK 和 WARS）。“SNL所致NP失衡网络”包含765个节点和4774条边,其中248个hub节点为NP相关基因。通路富集分析结果表明,上述基因主要显着富集在胶质细胞活化、神经-免疫反应以及神经炎症相关的信号通路（P<0.05）。1.4乌头汤镇痛相关基因主要调控胶质细胞活化和神经炎症反应转录组检测结果显示,SNL-乌头汤组与SNL组,共有442个差异表达基因,其中171个为上调基因,271个为下调基因。此外,分层聚类分析结果表明,SNL-乌头汤组与SNL组具有显着性差异。根据上述差异表达基因构建的“乌头汤镇痛药效相关网络”,由375个节点和3077条边组成。其中,94个关键hub基因为乌头汤发挥镇痛效应的关键基因。通路富集分析显示,上述关键hub基因主要富集于胶质细胞活化和神经炎症相关的信号通路（P<0.05）。2.乌头汤镇痛关键药效物质及其网络调控机制的研究结果本课题组共鉴定出乌头汤及其所含五味中药水煎液中162种化学成分,用于药物的ADME特性评价。前期共得到乌头汤候选靶标1744个,其中107个是现存镇痛药物的作用靶标。通路富集分析显示,上述靶标主要参与神经炎症反应相关的信号通路,如趋化因子信号通路和TNF信号通路,等。基于“NP相关基因-乌头汤候选靶标”互作网络,筛选出453个hub节点,构建其直接相互作用网络,将其中具有网络拓扑重要性的130个关键hub节点,视为乌头汤的候选镇痛靶标。通路富集分析显示,上述靶标在趋化因子信号通路的富集显着性最高（P=6.30E-31）,参与该通路的方药靶标有CCL5、CCR5、GNAI1、SRC、PIK3CA 和 AKT。将乌头汤中41种具有较好口服生物利用度和成药性的化学成分与其对应靶标进行分子对接,以分子对接的绝对值大于5.0作为卡值发现其中8种与其对应靶标具有请结合,其中芍药苷、甘草苷靶标中涉及多个趋化因子信号通路成员分子。进一步分别模拟芍药苷、甘草苷与趋化因子信号通路6个成员分子的结合情况,发现二者与上述6个靶标均呈现强结合。表面等离子共振实验检测结果表明,芍药苷、甘草苷与趋化因子信号通路最上游的CCL5蛋白之间的解离平衡常数（KD）分别为6.667μM、10.85μM,提示芍药苷、甘草苷均与CCL5蛋白具有微摩尔级别的强亲和力。血浆中药物的浓度可以在一定程度上反映药物在体内环境产生的药理效应,单次给药乌头汤（临床四倍等效量）或相当剂量的芍药苷-甘草苷组合后,发现与乌头汤相比,芍药苷-甘草苷组合给药后镇痛关键药效物质芍药苷、甘草苷的血药浓度峰值高、血药浓度达峰值时间短,提示组合药物在体内具有更大的暴露量。3.乌头汤镇痛关键药效物质组合的作用特点及其分子机制验证结果3.1乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效缓解SNL大鼠的症状采用SNL模型和MIP诱导NP模型的行为学检测结果表明,芍药苷-甘草苷组合可有效升高大鼠的机械痛阈值和冷痛阈值（均P<0.05）,且药效与乌头汤全方相比,不存在显着性差异,但是优于单独给药芍药苷或甘草苷组（均P<0.05）。3.2乌头汤及其关键镇痛药效物质均可抑制趋化因子信号通路免疫组化结果显示,与Sham组相比,SNL大鼠脊髓背角组织中CCL5的表达明显增强;乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可显着降低SNL大鼠的CCL5的表达（均P<0.05）;而单独给药芍药苷或甘草苷对CCL5的表达均无明显影响。此外,SNL大鼠L5左侧脊髓背角组织中CCL5、CCR5、GNAI1、SRC、PIK3CA和AKT的基因表达量均显着升高（均P<0.05）,乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均显着下调其基因表达量（均P<0.05）,且芍药苷-甘草苷组合用药的效果优于单独使用芍药苷或甘草苷（均P<0.05）。蛋白水平的检测结果与基因水平的检测结果一致。ELSIA结果表明,乌头汤及芍药苷-甘草苷组合可以减少SNL大鼠血清中TNF-α、IL-1 β和IL-6的蛋白含量（均P<0.05）。上述研究结果表明,芍药苷-甘草苷组合可有效抑制趋化因子信号通路并减少炎症因子的表达量,表明芍药苷和甘草苷是乌头汤发挥镇痛效应的关键药效物质（均P<0.05）。研究结论本研究通过计算机预测与实验验证相结合的方法,预测乌头汤缓解NP的分子作用机制并筛选其关键镇痛药效物质,主要研究结论如下:1.采用SNL模型的药效学实验明确了乌头汤缓解NP的药效,具体表现在乌头汤可有效升高模型动物的机械痛阈值和热痛阈值,显着降低与胶质细胞活化相关的炎症因子和趋化因子的蛋白表达量;根据转录组表达谱的检测结果,分析NP的发病机制与乌头汤的镇痛机制,发现胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症是NP疾病进程中的三个关键病理环节,乌头汤的镇痛效应基因主要参与调控胶质细胞活化和神经炎症。2.预测乌头汤缓解NP的网络调控机制为抑制趋化因子信号通路（CCL5-CCR5-GNAI1-SRC-PIK3CA-AKT）介导的神经炎症,根据机制重要性,芍药苷和甘草苷被筛选为乌头汤缓解NP的关键镇痛药效物质。3.采用经典的SNL模型及鞘内注射MIP诱导的NP大鼠模型,验证了芍药苷-甘草苷组合缓解NP的药效（芍药苷、甘草苷的使用剂量为四倍临床等效剂量乌头汤中的含量）,在该剂量条件下芍药苷-甘草苷组合的药效优于单独使用芍药苷或甘草苷。分子机制层面,芍药苷-甘草苷组合可以显着抑制趋化因子信号通路及炎症因子的表达。综上,本文综合利用转录组表达谱检测、药物靶标预测、网络构建与分析、分子对接、表面等离子共振检测、药代动力学特征分析、实验验证等方法,明确了经方乌头汤缓解NP的镇痛药效,揭示了乌头汤的镇痛关键药效物质芍药苷-甘草苷组合通过抑制趋化因子信号通路介导的神经炎症发挥缓解NP的分子机制。上述科学发现丰富了治痹经方乌头汤的镇痛科学内涵,同时,为研发药效成分清楚、作用机制明确、源于中药的镇痛组合药物提供实验依据。
赵颖[3]（2020）在《基于转录组分析揭示一氧化氮调控紫花苜蓿响应干旱胁迫的机理》文中认为紫花苜蓿（Medicago sativa L.）目前是世界上栽培最广泛的多年生豆科牧草,因其丰富的营养价值在草地畜牧业扮演重要作用。干旱胁迫作为最主要的非生物胁迫因子之一,严重制约了苜蓿的种子萌发和幼苗生长。因此,研究干旱胁迫对紫花苜蓿的影响及其适应干旱的机制、及寻找提高紫花苜蓿抗旱的方法对克服干旱地区苜蓿栽培的制约具有重要意义。一氧化氮（Nitric oxide,NO）是一种可通过细胞膜扩散的气体信号分子,通过信号转导能够调控植物生长发育及逆境响应等多个生物学过程。目前,有关NO缓解逆境胁迫的研究主要集中在盐胁迫上,研究的物种也以拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays L.）、番茄（Solanum lycopersicum）、小麦（Triticum aestivum L.）和燕麦（Avena sativa L）为主,而NO在牧草上的应用尤其是紫花苜蓿上的报道较少。与此同时,当今关于NO调控苜蓿抗逆性的研究尚处在生理生化水平,而NO对紫花苜蓿抗旱调控的分子机理尚未见报道。本文采用聚乙二醇（PEG-6000）模拟干旱胁迫条件,硝普钠（SNP）为外源NO供体,Carboxy-PTIO（cPTIO）为内源NO清除剂,以紫花苜蓿（“阿尔岗金”、“三得利”、“金皇后”）为研究材料,通过形态、生理生化分析和转录组测序（RNA-Seq）技术等方法,从NO对干旱胁迫下不同品种紫花苜蓿抗旱性调节差异、萌发生长及抗氧化系统的影响、碳同化及碳代谢的调控、萌发期及幼苗期的转录组分析等方面解析了NO调控紫花苜蓿响应干旱胁迫的机理。主要结果如下:（1）通过对外源NO调控干旱胁迫下不同品种紫花苜蓿萌发期抗旱指标变化比较分析,SNP浸种降低干旱胁迫下不同品种紫花苜蓿丙二醛（MDA）含量,增加脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量,提高了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性,对8个与抗性相关指标变化进行隶属函数法分析,发现3个紫花苜蓿品种对外源NO的敏感性由强到弱依次为:三得利>金皇后>阿尔岗金。选择对NO最为敏感的品种“三得利”为材料研究NO调控紫花苜蓿抗旱机制。（2）通过对NO调控干旱胁迫下“三得利”紫花苜蓿萌发生长及抗氧化系统研究,发现外源SNP浸种提高了干旱胁迫下紫花苜蓿的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数,萌发第7天的苜蓿芽苗干重和含水量增加,根长降低;外源cPTIO浸种抑制了干旱下种子的萌发,芽苗干重和根长降低。叶片喷施SNP或cPTIO对干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗茎长和根长无显着影响,但施加SNP显着增加了幼苗分枝数对侧根无显着影响;施加cPTIO显着降低了幼苗侧根数对分枝数目无显着影响。干旱胁迫下,外源施加SNP降低了紫花苜蓿萌发期芽苗和幼苗期叶片内O2˙ˉ、H2O2和MDA的积累,·OH清除速率提高,APX、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性及抗坏血酸（AsA）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量增加,最终缓解干旱胁迫引起的氧化损伤。而施加cPTIO引起活性氧水平显着提高,抗氧化酶活性和抗氧化物质含量降低,进一步加剧了干旱胁迫的损伤。（3）通过对NO调控干旱胁迫下“三得利”紫花苜蓿碳同化和碳代谢关键酶进行分析,外源施加SNP增加了干旱胁迫下紫花苜蓿萌发期苗芽和幼苗期叶片卡尔文循环中果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（TBA）、三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、核酮糖二磷酸羧化酶（Rubisco）活性,柠檬酸循环中丙酮酸脱氢酶（PDH）、柠檬酸合酶（CS）、α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）和NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）活性。而外源施加cPTIO可调控干旱下编码卡尔文循环及三羧酸循环代谢中间酶的基因下调表达,且其酶活性降低,在一定程度上抑制了碳同化和碳代谢进程效率。（4）RNA-Seq分析NO调控干旱胁迫下“三得利”紫花苜蓿萌发期芽苗的结果显示,干旱胁迫处理与对照的差异表达基因（DEGs）有3524个（FDR<0.01,FC≥2）,GO和KEGG分析表明,DEGs主要与类黄酮、黄酮、苯丙烷、单萜、倍半萜和三萜类等次生物质生物合成,光合作用、光合天线蛋白、淀粉和蔗糖代谢、谷胱甘肽代谢及植物激素信号转导通路有关。干旱下施加SNP与干旱处理相比引起2208个DEGs（FDR<0.01,FC≥2）,DEGs主要富集在苯丙烷类生物合成、氮代谢、肌醇磷酸代谢及淀粉蔗糖代谢通路。干旱胁迫下施加cPTIO（PEG-NO）与干旱处理相比引起3461个DEGs（FDR<0.0001,FC≥2）,内源NO介导的基因主要参与柠檬酸循环、丙酮酸代谢、乙醛酸代谢、精氨酸合成代谢、及光合器官的碳同化,且绝大多数基因均下调表达。（5）通过RNA-Seq对NO调控干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗期叶片进行研究,干旱胁迫处理与对照间叶片有947个DEGs（FDR<0.01,FC≥2）,显着富集在类胡萝卜素和类黄酮生物合成通路上。干旱下喷施SNP与干旱处理相比有852个DEGs（FDR<0.01,FC≥2）,显着富集在苯丙烷类化合物、类黄酮和类胡萝卜素化合物合成通路,且参与这些通路的基因几乎全部下调表达。干旱下喷施cPTIO与干旱处理间鉴定出2891个DEGs（FDR<0.01,FC≥4）,多数参与光合器官碳同化、氧化磷酸化、碳代谢、柠檬酸循环及氨基酸代谢且下调表达。
郭咏梅[4]（2020）在《硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究》文中研究说明围产期和泌乳前期的高产奶牛由于生理的变化和高的代谢水平,抗氧化功能显着降低,容易诱发氧化应激,导致疾病易感性增加。奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）是乳脂和乳蛋白合成与分泌的重要场所,其细胞的生物合成能力决定了奶牛乳腺的产奶能力。因此,深入研究硒（Se）减缓BMEC氧化应激的机理对科学合理的补加Se,缓解奶牛氧化应激,优化奶牛抗氧化防御能力具有重要的理论与实际意义。本论文以BMEC为细胞模型,分别以外源性一氧化氮（NO）诱导细胞氧化损伤、以二硝基氯苯（DNCB）抑制硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性并诱导细胞氧化损伤、以白介素1受体拮抗剂（IL-1Ra）抑制白介素-1（IL-1）生物活性、以丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路抑制剂抑制其磷酸化水平、并结合过表达技术对TrxR1进行过表达,从TrxR1/MAPK/NO途径深入研究了 Se缓解BMEC氧化损伤的可能机制。本论文共分为6个试验。试验1采用单因子完全随机试验设计,研究不同剂量的Se（0、10、20、50、100、150、200 nmol/L）对BMEC抗氧化功能的调节作用,初探正常生理条件下Se对TrxR活性和NO合成的影响,为进一步探讨其促进机理提供基础。结果表明,Se对BMEC的相对增殖率（RGR）、TrxR、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性及其基因表达、超氧化物歧化酶（SOD）活性与总抗氧化能力（T-AOC）的促进作用,以及对丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的抑制作用呈显着的剂量依赖效应,即Se对BMEC的抗氧化功能的促进作用呈剂量依赖性。综合多项指标得出,以50 nmol/L处理组较好,100～200nmol/L处理组促进作用削弱。然而,Se的添加对正常BMEC的炎症细胞因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性及其基因表达、NO含量、核转录因子E2相关因子2（Nrf2）的基因表达无显着影响。试验2采用完全随机试验设计,以RGR、抗氧化及炎症因子等指标为判断指标,研究不同浓度的 NO（0、250、500、750、1000、1250、1500μmol/L）,分别作用 2、4、6、8、12和24 h,筛选出适宜的NO氧化损伤建模浓度及作用时间。结果显示,过量的NO可诱导BMEC的氧化应激,以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物（DETA/NO）作为外源性NO,处理浓度为1000 μmol/L作用时间为6h,RGR降低至76.61%,引起SOD、CAT、GPx活性降低,MDA含量、炎症因子及NO含量、iNOS活性升高,可以作为建立BMEC氧化损伤模型的适宜条件。试验3以试验2为基础,以NO诱导BMEC的氧化损伤,采用完全随机试验设计,研究不同剂量的Se（0、10、20、50、100、150及200 nmol/L）对BMEC氧化损伤的保护和可能的调节作用机制,并筛选出Se的适宜添加剂量。结果表明,NO过量诱导BMEC发生了氧化应激,引起RGR与SOD、T-AOC、CAT活性显着下降,GPx、TrxR的活性及其基因与蛋白表达、Nrf2的基因表达呈现相似的变化;而ROS活性、MDA含量呈现相反的变化趋势;p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的基因表达也显着升高,并增加了其下游IL-1等炎症因子、iNOS的表达。Se的添加显着逆转了上述指标的变化,说明Se对NO诱发的氧化应激具有显着的减缓效果,减少了 IL-1的生成,降低了 iNOS的活性与NO的释放。这可能与增高的TrxR活性及其基因与蛋白表达,进而抑制了 MAPK信号通路的激活有关。Se对过量NO诱导的细胞损伤的保护作用呈剂量依赖性,其中以20～100 nmol/L的Se保护组保护作用较好,尤其以50 nmol/L的Se保护组的保护效果更好,然而,过高浓度的Se则未能逆转NO诱导的细胞损伤,甚至会对细胞造成一定的损伤作用。试验4以试验3为基础,采用完全随机试验设计,以DNCB抑制TrxR活性并诱导BMEC氧化应激,以IL-Ra抑制IL-1生物活性,从TrxR/IL-1/NO途径探究Se缓解NO诱导BMEC氧化应激的机理。将BMEC随机分为8组,分别是:对照组（CON）、Se 处理组（Se）、DNCB 损伤组（DNCB）、IL-1Ra 处理组（IL-1Ra）、Se+DNCB预保护组（S+D）、Se+IL-1Ra 处理组（S+I）、DNCB+IL-1Ra 保护组（D+I）、Se+DNCB+IL-1Ra处理组（S-D+I）。结果表明,DNCB抑制了 TrxR的活性及其基因与蛋白质的表达,导致凋亡信号调节激酶-1（ASK-1）活性升高,激活了 p38MAPK及JNK信号通路,增加了下游因子IL-1及NO浓度,诱导BMEC发生了氧化应激。IL-1Ra抑制了 IL-1的生物活性,降低了 NO过量生成,减缓了 DNCB引起的氧化应激,说明IL-1是诱发NO大量产生引起细胞氧化应激的关键因子。Se对DNCB引起的BMEC氧化损伤具有缓解作用,Se的添加促进了 TrxR的活性及其基因与蛋白质的表达;可逆转DNCB引起的p38MAPK及JNK信号通路的激活,进而抑制IL-1的生成、iNOS活性及NO的过量产生。这说明Se通过TrxR抑制IL-1的活性发挥其对BMEC氧化应激的减缓作用。试验5采用完全随机试验设计,以DNCB抑制TrxR活性并诱导BMEC氧化应激,以 SB203580、SP600125、PD98059 分别抑制 p38MAPK、JNK、ERK1/2 信号通路,将第三代贴壁生长的BMEC随机分为7个处理组,分别是:对照组、DNCB损伤组、Se 处理组、DNCB+Se 预保护组、DNCB+SB203580、DNCB+SP600125、DNCB+PD98059,从TrxR/MAPK/NO途径探究Se缓解NO诱导BMEC氧化应激的机理。结果表明,DNCB抑制了 TrxR活性,ASK-1活性增加,下游p38MAPK及JNK通路被激活,并导致IL-1过量释放,诱发BMEC氧化应激,Se的预保护作用逆转了 BMEC内的氧化损伤,增强了 TrxR的表达,ASK-1活性及p38MAPK及JNK通路磷酸化水平受到抑制,逆转了 IL-1的过量释放及其下游iNOS-NO级联。当p38MAPK及JNK通路分别受到SB203580、SP600125抑制后,DNCB诱导的细胞氧化损伤被抑制,MAPK信号通路下游因子IL-1含量、iNOS活性及其基因和蛋白表达受到显着抑制,进而保护细胞免受NO蓄积的损伤,这提示Se通过TrxR抑制p38MAPK及JNK通路的激活缓解BMEC的氧化损伤。试验6采用完全随机试验设计,以NO诱导BMEC氧化损伤,采用基因过表达技术对TrxR1进行过表达,将BMEC随机分为4个组,分别是:对照组、NO损伤组、NO+Se预保护组、NO+TrxR1 OE组,进一步研究TrxR1对细胞中iNOS、IL-1β等炎症因子及p38MAPK及JNK信号通路相关因子的表达的影响,验证TrxR1基因是否是Se缓解BMEC氧化损伤的关键基因。结果表明,过表达TrxR1基因显着降低了 p38MAPK及JNK信号通路的基因表达及磷酸化水平,及其下游IL-1β和iNOS的基因与蛋白表达,减缓了 NO诱导的氧化损伤,进一步验证了 TrxR1是Se缓解BMEC氧化应激损伤的关键基因。综上所述,本研究从TrxR1/MAPK/NO途径探讨了 Se促进BMEC抗氧化功能、缓解NO诱导BMEC氧化应激的保护机制,即Se通过促进TrxR1的基因和蛋白表达,抑制了 p38MAPK/JNK信号通路的磷酸化水平,进而降低了 IL-1β和iNOS的基因与蛋白质表达,抑制了 NO的过量释放,保护了 BMEC免受氧化应激的损伤。
郑亚光[5]（2020）在《壳聚糖通过NF-κB信号通路调节奶牛抗氧化功能与抗炎症反应的机理研究》文中研究指明奶牛在泌乳过程中由于高的营养需求和代谢水平,通常伴随着一氧化氮（NO）等自由基类代谢产物的增加,进而加剧其炎症反应,引起产奶性能和乳品质的降低。壳聚糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等生物学活性,在食品、制药、猪禽养殖等领域的应用较为广泛。有限的研究资料报道,壳聚糖可提高奶牛的抗氧化功能与抗炎症反应,但其机制尚不清楚。鉴于此,本论文研究了日粮添加壳聚糖对奶牛产奶性能、抗氧化功能和抗炎症反应的调节作用,并结合体外法以奶牛外周血单个核细胞（PBMC）为模型、通过NO和脂多糖（LPS）诱导PBMC的氧化损伤,利用基因沉默技术从NF-κB信号通路深入研究了壳聚糖对奶牛抗氧化功能与抗炎症反应的调节机理,为通过日粮调控奶牛的抗氧化能力、提高产奶性能和改善乳品质提供理论依据。论文分为7个试验:试验1采用完全随机试验设计,将40头高产奶牛根据泌乳天数（200±15d）、产奶量（34.80±4.95kg/d）、胎次（2-3胎）等相近的原则随机分为五个日粮处理组,每个处理组8头,包括对照组（CON）和壳聚糖组C500、C1000、C1500和C2000,CON组饲喂不添加壳聚糖的基础日粮,壳聚糖组分别在基础日粮中添加500、1000、1500、2000 mg/kg（干物质基础）的壳聚糖,每天记录采食量、产奶量,在试验期的第0、2、4、6、8周收集牛奶样品用于分析乳品质,试验期的第60天尾静脉采血分离血清和PBMC用于分析血液抗氧化及免疫功能。结果表明:日粮中添加壳聚糖,提高了奶牛的干物质采食量、产奶量、能量矫正乳、乳蛋白和乳糖产量,降低了奶牛的体细胞指数;对抗氧化能力和免疫功能的促进作用呈剂量依赖性,可显着提高血清中血清超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性,降低丙二醛含量;显着增加淋巴细胞中CD4+和CD8+的比例,CD3+的比例和CD4+/CD8+比值均呈上升趋势。日粮添加壳聚糖对奶牛血清NO含量的降低呈剂量依赖性,显着降低了 iNOS活性,白介素1β（IL-1β）的含量呈下降趋势;显着或趋于显着地降低了 PBMC的IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的基因与蛋白质的表达;显着降低了 NF-κBp65的蛋白磷酸化水平。综合多项指标,日粮中添加壳聚糖可以促进奶牛的产奶性能、抗氧化能力和免疫功能,其中1500mg/kg的壳聚糖具有较好的促进效果。提示壳聚糖调节奶牛抗氧化能力和免疫反应的机制可能与抑制NF-κB信号通路、降低了 iNOS活性,从而减少了过量的NO产生有关。试验2采用单因素随机试验设计,将体外分离得到的PBMC随机分为5组,一是对照组（CON）组,细胞培养液中不添加COS;其余4组为COS40、COS80、COS160和COS320组,分别在细胞培养液中添加40、80、160和320μg/mL的壳寡糖（COS）,研究体外添加COS对奶牛PBMC抗氧化功能和炎症因子含量的影响。结果表明,体外添加COS对PBMC抗氧化功能的促进效果呈剂量效应,可增强抗氧化酶CAT、SOD的活性,其中以160 ug/mL的COS具有较好的效果。COS可抑制炎症因子IL-1β、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的产生,降低iNOS的活性与NO的含量,并呈现剂量依赖性,以160μg/mLCOS具有较好抑制作用,320μg/mLCOS的抑制作用减弱。添加COS抑制了 NF-κBp50和NF-κBp65的基因表达,提示COS可能通过抑制NF-κB信号通路活性,降低iNOS与炎症因子的基因表达,降低了 NO的生成,进而促进了抗氧化功能,降低了炎症因子的产生。试验3利用二乙烯三胺/一氧化氮聚合物（DETA/NO）建立了 PBMC体外氧化损伤模型,将细胞培养于终浓度为0、50、100、200、300、500 μmol/L的DETA/NO细胞培养液中,分别作用2、4、6、8、12 h。结果显示,200 μmol/LDETA/NO作用PBMC4h,可以作为建立PBMC氧化损伤模型的适宜条件,NO过量引起PBMC氧化损伤,抗氧化能力降低,炎症因子IL-1β、NO含量上升。试验4采用单因子完全随机的设计,将分离得到的PBMC随机分为1个对照组（CON组）和4个COS组。其中,CON组在无COS、但含有DETA/NO的培养基中进行处理;COS40、COS80、COS160和COS320组分别在添加40、80、160和320μg/mL COS培养基中预处理,再用DETA/NO继续处理。结果显示,COS对NO诱导的PBMC抗氧化功能的降低具有显着的减缓效果,降低了炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放,抑制了 NF-κB通路活性,且具有剂量依赖性。其中,以160μg/mL的COS具有较好的抑制效果,320μg/mLCOS抑制效果减弱。提示COS可能通过抑制IL-1β产生降低NF-κB的通路活性,从而抑制iNOS的活性及NO的产生发挥其对细胞抗氧化功能的促进作用。试验5包括两个部分,第一部分首先以细胞活力为指标筛选LPS的损伤时间和剂量,采用单因素完全随机试验设计,LPS浓度包括0、0.1、1、10和20μg/mL 5个不同的LPS浓度处理,其中以0μg/mL剂量组为对照组（CON）,LPS作用于细胞的时间包括6、12和24h,筛选可诱导奶牛PBMC细胞损伤的适宜的LPS损伤浓度和作用时间。结果显示,10μg/mL的LPS作用24h可以作为建立LPS诱导PBMC氧化损伤模型的适宜条件。第二部分试验采用单因子完全随机试验设计,将分离的PBMC分为6个处理组:对照组（CON）,不进行COS和LPS处理;LPS组,只进行 LPS 处理;CL40、CL80、CL160 和 CL320 组分别接受 40、80、160 和 320μg/mL的COS处理,之后用LPS处理。结果表明,LPS可以诱导PBMC发生氧化应激,NF-kBp65的磷酸化水平增加,导致抗氧化功能降低,促炎因子的基因与蛋白质表达增强。COS对由LPS诱导引起的奶牛PBMC氧化损伤具有剂量依赖性的保护作用,可提高抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶和SOD活性,降低IL-1 β、IL-6、TNF-α等促炎性因子的含量与NO的生成,以160μg/mL的COS有较好的保护效果。提示COS可能通过调节NF-κB信号通路影响iNOS活性,进而抑制NO的生成,促进奶牛PBMC的抗氧化功能与抗炎症反应。试验6是在试验1饲养试验的基础上进行的。饲养试验结束时,分别从饲喂不同剂量壳聚糖（0、500、1000、1500和2000mg/kg）的5组奶牛血液中分离PBMC。试验分为6个处理组:将上述0剂量组奶牛的PBMC样本分为2部分,一部分不进行LPS处理,为对照组;另一部分进行LPS损伤处理,为LPS损伤组;其他壳聚糖饲喂组分离得到的PBMC均进行LPS损伤,设为CL500、CL1000、CL1500、CL2000组。结果显示,未饲喂壳聚糖的对照组奶牛PBMC在LPS的诱导下引起了氧化损伤;饲喂壳聚糖的奶牛PBMC细胞对体外LPS诱导引起的氧化损伤具有减缓作用,并呈剂量效应,引起NF-κBp65的磷酸化水平降低,iNOS酶活性及其基因与蛋白质的表达降低,NO的生成降低;其中,日粮壳聚糖添加剂量以1000-2000mg/kg减缓作用较好;进一步说明壳聚糖调节奶牛抗氧化能力与抗炎症反应的机制可能与NF-κB-NO调节途径有关。试验7试验分为2部分进行,第一部分利用siRNA沉默PBMC的NF-κBp65基因,选择具有最佳沉默效果的干扰序列。结果显示,siRNA可以成功沉默奶牛PBMC中NF-κBp65的基因表达,沉默效率为61%,NF-κBp65蛋白磷酸化表达降低了 38.5%。第二部分利用siRNA对NF-κBp65基因沉默的同时,以LPS诱导PBMC的氧化损伤,添加适宜的COS,揭示NF-κBp65基因在COS缓解PBMC氧化应激损伤中的作用。试验分为8个处理组,对照组、LPS处理组、siRNA+COS+LPS组、siRNA组、COS 组、siRNA+COS 组、siRNA+LPS 组、COS+LPS 组和 siRNA+COS+LPS 组。结果表明利用siRNA沉默NF-κBp65后,降低了由LPS引起的氧化损伤程度,下调了 iNOS的基因与蛋白质的表达,促进了细胞的抗氧化应激能力,说明NF-κB是引起细胞氧化损伤的关键通路,NF-κBp65是COS调节奶牛抗氧化能力的关键基因,COS通过抑制NF-κB通路降低了 iNOS的基因与蛋白质表达,缓解了由LPS诱导引起的氧化应激。综上,日粮中添加壳聚糖可以促进奶牛的产奶性能、抗氧化能力和抗炎症反应,其中以1500mg/kg的壳聚糖具有较好的促进效果;本文从NF-κBp65-NO途径诠释了其影响机制,即壳聚糖通过抑制NF-κB通路降低了 iNOS的基因与蛋白质表达,降低了 NO的过量生成,抑制了炎症反应,促进了奶牛的抗氧化应激能力,抑制了炎症反应。
苏芮[6]（2019）在《硒通过Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-κB信号通路对一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的减缓作用》文中进行了进一步梳理本论文旨在研究硒（Se）通过Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-κB信号通路对二乙烯三胺/一氧化氮聚合物（NO/DETA）诱导损伤的奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）的减缓作用,以期为生产过程中科学补Se,提高奶牛乳腺组织的抗氧化功能提供理论依据。论文分为3个试验进行研究。试验一采用单因子完全随机试验设计,将第三代BMECs分为8个处理组,每个处理6个重复,第一组为对照（CON）组,不添加Se和NO/DETA,培养30h;第2～8组分别为NO/DETA损伤组和6个Se保护组,是在CON组培养基中添加不同剂量的Se（0、10、20、50、100、150、200 nmol/L）,培养24h后,添加1000 μmol/L的NO/DETA作为应激源,与Se共同作用6h,探讨不同剂量的Se对NO损伤后的BMECs的预保护作用,结合硒蛋白酶、炎症因子的基因表达和酶活性以及过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARy）、转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）和核转录因子-κB（NF-kB）信号通路的相关基因表达量探讨其可能存在的机理,并筛选适宜的Se保护剂量。试验二分为两个部分,均采用单因子随机试验设计,第一部分为添加不同剂量的PPARy抑制剂（GW9662）,培养6h,通过测定细胞增殖率确定GW9662在细胞中的适宜添加剂量;第二部分利用GW9662（浓度依据第一部分确定）阻断PPARy,将BMECs分为七个组,第1组为CON组;第2～7组分别为NO/DETA损伤组、GW9662抑制剂组、单独加Se组（根据试验一确定Se浓度）、Se+DETA（Se 预保护）组、Se+GW9662 组、Se+DETA+GW9662 组。研究Se是否从PPARγ-NF-κB信号通路来缓解NO造成的细胞氧化损伤。试验三利用沉默GPX1技术,将试验分为7个处理组,分别是CON组、NO/DETA损伤组、Se处理组、Se+DETA（Se 预保护）组、Se+GPX1shRNA 组、Se+DETA+GPX1shRNA 组。探讨Se从Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-kB信号通路缓解BMECs氧化应激的机理。试验一结果得出,不同剂量的Se对过量NO诱导的BMECs氧化损伤具有不同程度的减缓作用,且表现出显着的剂量依赖效应,增加了 GPX、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）、总抗氧化酶（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性以及GPX、TrxR、PPARγ的基因表达;激活了 Nrf2信号通路的基因表达;抑制了炎症通路NF-κB的活化,降低了丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）以及炎症因子白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、抗肿瘤坏死因子（TNF-α）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的活性及基因表达。综合多项指标,当Se添加剂量为50～100nmol/L时对氧化应激的减缓作用较好,添加剂量为50 nmol/L时,减缓效果最好。试验二的结果得出,在Se+DETA组中添加GW2.5抑制剂后,与Se+DETA组比,发现PPARγ基因表达量被显着抑制,抗氧化酶GPX、T-AOC、T-SOD、CAT酶活性,TrxR、SelP的mRNA水平及酶活性均显着降低（P<0.01）;炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及NF-κBp50的基因表达量均显着升高,且MDA、NO含量,ROS及iNOS活性也呈相似的变化规律。表明当PPARγ被抑制,Se不能发挥其抗氧化功能,说明Se是通过激活PPARγ,抑制NF-κB信号通路的活化,降低炎症因子的生成,减少NO生成,进而发挥减缓氧化应激的作用。试验三结果得出,沉默了 GPX1的Se+DETA组显着抑制了 Se+DETA组的PPARγ、Nrf2的基因表达量,降低了抗氧化酶GPX1、TrxR的mRNA水平及酶活性和T-AOC、CAT的活性,显着升高了 NF-κBp65的基因表达量和炎症因子IL-1β、TNF-α与iNOS基因表达量及酶活性,且ROS活性,MDA、NO含量也呈相似的变化规律（P<0.01）。表明GPX1是Se发挥抗氧化功能的关键基因,GPX1基因被沉默后,可抑制细胞中PPARγ的基因表达,激活NF-κB信号通路,进而增加下游炎症因子的浓度及基因表达量,削弱了 Se对细胞的抗氧化功能。综上所述,本论文从Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-κB信号通路探讨了 Se对过量的NO诱导的BMECs氧化应激的减缓作用与机理,即Se是通过激活信号通路Nrf2,促进了 GPX1的基因及其酶活性的升高,增加了 PPARγ的基因表达,抑制了 NF-κB信号通路的激活,降低炎症因子IL-1β的释放,进一步减少NO的过量生成,进而起到保护细胞免受氧化应激的作用。
李强[7]（2013）在《丙戊酸对大鼠臂丛根性撕脱伤后脊髓神经元存活和再生的影响》文中进行了进一步梳理臂丛根性撕脱伤是临床最严重的周围神经损伤类型，常见于交通事故或产瘫，它导致上肢感觉的完全丧失和所有肌群的麻痹，给病人带来严重的身心障碍外，也带来沉重的社会负担。与其它类型的神经损伤（如钳夹、切断等）相比，根性撕脱伤由于最靠近脊髓的神经元胞体，会引起大量神经元细胞死亡。而周围神经损伤后，只有神经元细胞体存活，神经才能再生，如果神经损伤后相应的神经元细胞体死亡，那么神经再生将成为不可能。大量脊髓神经元的死亡大大限制了臂丛撕脱伤外科修复后神经的再生和功能的恢复，导致临床治疗效果非常差。因此，对于臂丛撕脱伤，寻找能既能保护脊髓神经元而减少其死亡，同时又可以促进残存神经元再生的药物或方法是非常有价值的。传统的神经生长因子家族，虽然已被证实有明确的神经保护和促进再生作用，但由于其属于肽类物质，难以通过血脑及血神经屏障进入脊髓，而且由于其生物半衰期短，临床长期大量给药容易引起副作用，因此目前临床应用还有许多问题需要解决。丙戊酸（valproic acid，VPA）神经保护作用的发现给这一难题带来希望。由于其属于小分子无机化合物，易于通过血脑屏障，且不容易被酶降解，因此相对于神经生长因子具有较大优势。VPA在临床用于抗癫痫治疗30余年，1995年又被FDA批准用于抑郁症，安全性已得到广泛验证。现已证实VPA对坐骨神经切断伤导致的脊髓运动神经元损伤具有保护作用，而且能促进切断的坐骨神经再生和功能恢复。但对于导致大量神经元死亡的臂丛撕脱伤，VPA是否能一样发挥神经保护和促进神经再生作用呢？为了明确这一问题，本研究设计了大鼠臂丛根性撕脱伤的动物模型，通过对大鼠口服给予VPA，观察VPA对脊髓神经元的影响，以明确VPA是否可以对臂丛撕脱伤后的脊髓神经元起到保护和促进再生作用，并对其神经保护作用的机制进行探讨。研究证实神经型一氧化氮合酶（neuronal NOS, nNOS）与神经根撕脱后脊髓前角运动神经元的死亡密切相关，根性撕脱伤后nNOS的大量表达会导致神经元的死亡。而已经明确的是在神经损伤导致的神经元死亡中，细胞内Ca2+超载是主要机制之一。nNOS发挥活性依赖于细胞内Ca2+，但同时nNOS自身的表达也受到细胞内Ca2+的调控。因此，在臂丛撕脱伤导致的脊髓神经元死亡过程中，nNOS以及细胞内Ca2+的变化起到了至关重要的作用。生长相关蛋白（Growth Associated Protein,GAP-43）是目前研究神经元再生能力的理想指标，神经元内GAP-43表达的升高即提示神经元再生能力的增强。因此，本研究通过TUNEL法检测确定VPA对臂丛撕脱伤后脊髓神经元具有保护作用后，进一步通过检测VPA对脊髓神经元内nNOS以及细胞内Ca2+的影响来探索VPA发挥神经保护作用的机制。另外，通过检测脊髓神经元内GAP-43的变化，来明确VPA对撕脱伤后的神经元是否有促进再生的作用。本试验建立Wistar大鼠臂丛根性撕脱伤的动物模型，随机分为空白组（仅暴露臂丛，不做神经损伤），对照组（行臂丛撕脱）和VPA组（撕脱伤后口服给予VPA）。三组动物在D1、D2、D3、D7、D14、D28（D表示天）6个时间点进行脊髓中运动神经元凋亡、nNOS表达、细胞内Ca2+浓度、GAP-43四个指标的检测。对脊髓运动神经元凋亡的检测采用TUNEL法，对nNOS的检测采用Real-time PCR、Western blot法和免疫组化染色法，对细胞内Ca2+浓度采用荧光指示剂Fura-2/AM检测，对GAP-43的检测采用Real-time PCR和Western blot法。实验结果显示：1.空白组没有神经元的凋亡出现。空白组大鼠脊髓中nNOS、GAP-43在整个实验中均呈低水平表稳态表达，细胞内Ca2+浓度无明显变化。2.对照组在撕脱伤后的28天内，凋亡神经元的比例、脊髓中nNOS的表达和细胞内Ca2+浓度、以及GAP-43的表达均出现先升高后下降的过程，其中凋亡神经元峰值出现在D7，nNOS峰值出现在D2，细胞内Ca2+浓度峰值出现在D2，GAP43峰值出现在D14。3.与空白组相比，VPA组在撕脱伤后，凋亡神经元的比例、nNOS表达、细胞内Ca2+浓度和GAP-43的变化趋势及峰值时间同对照组类似。但相对于对照组，VPA在D3、7时明显减少了凋亡神经元的数目，在D1、2、3、7时明显下调了nNOS的表达，在D2、3、7时明显降低了细胞内Ca2+浓度，且在D2D28明显上调了GAP-43的表达。分析以上结果，可以得出结论：1.大鼠臂丛根性撕脱伤后，口服VPA可以减少脊髓神经元的凋亡，对神经元产生保护作用。2.大鼠臂丛根性撕脱伤后，VPA可以通过下调脊髓神经元中nNOS的表达对神经元产生保护作用。3.大鼠臂丛根性撕脱伤后，VPA可以通过降低脊髓神经元内Ca2+浓度对神经元产生保护作用。另外，VPA对nNOS表达的下调可能是通过降低神经元内Ca2+浓度来实现的。4.大鼠臂丛根性撕脱伤后，VPA可以通过上调脊髓神经元中GAP-43表达来促进受损神经元的再生。该结论为在临床应用VPA治疗神经损伤提供了更丰富的理论支持。
王婷婷[8]（2009）在《电针不同介入时间对急性脊髓损伤大鼠NO、MDA和SOD影响的实验研究》文中研究表明随着社会的发展,人们生活日新月异,各种外伤事故数量也随之激增,导致急性脊髓损伤（SCI）的发病率日益升高。作为外伤的常见病,治疗急性脊髓损伤越来越受到医学界的重视。各国专家学者进行了大量的关于急性脊髓损伤的临床和动物实验研究,发现急性脊髓损伤后,其损害结果常由两种机制引起:原发性损伤和继发性损伤。虽然关于急性脊髓损伤的发病机制现在仍然不是很清楚,但是,已经发现控制继发性损伤对于保护脊髓组织,治疗SCI有相当积极的作用。针灸疗法作为中国传统医学的一部分,对于治疗急性脊髓损伤有其独特的优势。本实验以Allen’s打击法制作的急性脊髓损伤大鼠模型为观察对象,通过不同时间电针介入治疗急性脊髓损伤大鼠,将损伤脊髓组织内NO、MDA及SOD含量作为观察指标,同时结合损伤脊髓节段的组织形态学改变,观察电针不同的介入时间对于急性脊髓损伤大鼠的影响,从而探索电针治疗急性脊髓损伤大鼠的最佳介入时间。实验目的:探索电针治疗急性脊髓损伤大鼠的最佳介入时间。实验方法:选取65只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、电针Ⅰ组（造模后2小时电针治疗）、电针Ⅱ组（造模后6小时电针治疗）、电针Ⅲ组（造模后12小时电针治疗）,用改良Allen’s打击法制成脊髓损伤模型,造模后2h用运动联合计分法（CBS）对大鼠脊髓损伤状况进行评估,造模24h后取材,进行指标检测。（1）用改良的Gress法测定损伤后局部组织一氧化氮含量;（2）用黄嘌呤氧化酶法测定损伤后局部组织超氧化物歧化酶含量;（3）采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定损伤后局部组织丙二醛含量;（4）采用HE染色制作损伤脊髓局部组织形态切片。结果:（1）模型组与空白组比较,损伤脊髓组织SOD含量降低,MDA含量升高,差异显着（P＜0.05）。（2）各电针组与模型组进行比较,电针组损伤脊髓组织SOD含量均比模型组升高,MDA含量降低,且差异显着（P＜0.05）,其中电针Ⅰ组与模型组比较,差异极显着（P＜0.01）。各电针组与空白组进行比较,SOD与MDA含量的差异不显着（P＞0.05）。（3）模型组损伤脊髓组织NO含量明显高于空白组,差异显着（P＜0.05）。由此可见,大鼠造模后,损伤脊髓组织NO含量明显增高。各电针组与模型组损伤脊髓组织NO含量进行比较,电针组损伤脊髓组织NO含量均比模型组降低,特别是电针Ⅰ组（造模后2小时电针治疗）差异显着（P＜0.05）。各电针组与空白组损伤脊髓组织NO含量进行比较,差异不显着（P＞0.05）。结论:（1）电针治疗可以明显提高急性脊髓损伤大鼠损伤脊髓SOD含量,降低MDA、NO的含量。（2）大鼠急性脊髓损伤后2h进行电针治疗,可以显着提高急性脊髓损伤大鼠损伤脊髓SOD含量,降低MDA、NO的含量,使其含量接近正常水平。并且损伤脊髓SOD含量升高,MDA、NO含量降低的改变幅度大于6h、12h电针治疗组。电针介入时间越晚,所测定各项指标改变的幅度越小。提示脊髓损伤后,电针治疗应及早介入。（3）电针可以通过提高SOD含量,降低MDA、NO含量达到保护脊髓组织的目的,从而降低急性脊髓损伤带来的伤害。
刘曾旭[9]（2007）在《严重烫伤早期大鼠血脑屏障损害及其机制的探讨》文中研究表明脑水肿是引起严重烧伤患者死亡的主要原因,但脑水肿症状往往被其它并发症掩盖,容易被医生忽视。过去的研究表明:严重烧伤后脑水肿的形成与血脑屏障损害是密切相关的,其发生率与烧伤的严重程度成正比。但烧伤后血脑屏障损害及脑水肿形成的机制尚不完全明了。本研究目的是探讨严重烫伤对大鼠血脑屏障的损害及其调控机制;为如何防治脑水肿的形成,减少患者死亡率提供新的思路。方法与内容:第一部分研究严重烫伤大鼠血脑屏障的结构损害与脑水肿之间的关系,用透射电镜观察大鼠脑组织内神经元、突触及血脑屏障超微结构的改变。第二部分用紫外分光光度计检测各组大鼠脑组织内伊文氏蓝（Evans blue,EB）的含量、测量脑组织的脑百分含水量,探讨严重烫伤对大鼠血脑屏障通透性的损伤,用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）及Western免疫印迹（Western-blot）检测严重烫伤大鼠脑内ZO-1基因及蛋白的表达变化。探讨严重烫伤引起血脑屏障损伤的分子机制。第三部分用免疫组织化学方法检测严重烫伤大鼠模型脑内明胶酶B（MMP-9）及胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）表达变化,探讨MMP-9及GFAP与严重烫伤后血脑屏障损伤之间的关系。第四部分观察运用一氧化氮合酶抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME）、钙通道阻滞剂尼莫地平（Nimodipine）对烫伤大鼠血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的保护作用。为临床上防治严重烫伤对血脑屏障损害及脑水肿的形成提供新的思路。结果:严重烫伤大鼠脑内EB含量、脑百分含水量明显增高, MMP-9及GFAP阳性表达升高,ZO-1mRNA及蛋白表达下降,具有显着差异。电镜显示:烫伤以后脑毛细血管周围出现空泡化,内皮肿胀,基底膜厚薄不均,星形胶质细胞足突空泡化。突触数量及突触小泡减少,突触间隙增宽。用L-NAME及尼莫地平治疗后,脑EB含量及百分含水量与假烫组比较明显下降,ZO-1mRNA表达升高。经L-NAME治疗后显示MMP-9表达恢复至正常水平,脑毛细胞血管的超微结构基本恢复到正常。结论:①严重烫伤后大鼠血脑屏障通透性增高与血脑屏障的超微结构变化,突触结构异常有关。②严重烫伤后大鼠血脑屏障的通透性增高与脑内MMP-9及GFAP表达升高及ZO-1mRNA及蛋白的表达下降（P<0.01）有关,提示MMP-9、GFAP在严重烫伤对血脑屏障的损害及脑水肿的形成中起着重要的作用。③早期应用L-NAME能明显减轻烫伤对脑BBB的损伤,可能是与L-NAME能抑制MMP-9的表达,防止ZO-1mRNA表达水平降低有关。④严重烫伤后早期应用尼莫地平能防止ZO-1mRNA表达下降,并能起到保护BBB的作用。
李娟[10]（2007）在《脾虚模型脑内信号转导相关因子及其基因表达的研究》文中研究说明目的:从五脏藏神理论出发,探讨脾胃与神志的密切联系。通过检测脾虚模型大鼠脑内信号转导相关因子表达的变化,探讨脾虚大鼠模型学习记忆变化机制。方法:理论方面:本研究从五脏藏神的角度出发,阐述了脾在五脏藏神理论中的重要地位,并通过对脾胃与神志相关理论的梳理,从生理、病理、治疗方面归纳了脾与神志相关理论的机制,同时,本文还对脾藏意主思中“意”和“思”的含义以及脾与脑相关等进行了探讨。实验方面:以Wistar大鼠为研究对象,分为正常组、模型组、治疗1组（造模加灌胃归脾汤）、治疗2组（造模加灌胃柴胡疏肝散）。采用苦降泻下、饮食失节、劳倦过度相结合的方法,复制脾虚动物模型。观察大鼠的体重、进食量、外观表现和动态变化等对模型进行筛选。采用免疫组化方法检测BDNF、AChE、NOS和即早基因C-FOS,采用原位杂交方法检测即早基因C-JUN mRNA在脾虚大鼠脑内的表达变化,探索其与学习记忆的关系,从而为脾藏神理论提供实验依据。结果:1脾虚模型复制结果模型组大鼠从造模第三天起,开始出现类似脾虚的症状:大便溏泻,消瘦,扎堆,精神萎靡等。第八天症状最重,出现食少,稀便或粘液便,肛周毛色污秽,懒动,扎堆,眯眼,乏力,耳尖色淡,畏寒,尾凉,体重不增或增加缓慢甚或降低,背毛松散,毛色不荣或掉毛发枯表现;治疗1组在第一周也出现类似的情况,但此后症状逐渐减少消失,体重增长迅速。模型组的体重增长缓慢,体重较轻,与正常组比较,差异极显着（P<0.01）,说明造模成功。2 BDNF、AChE和NOS的免疫组化检测结果1) BDNF免疫阳性反应物在脾虚大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值降低,与正常组比较,差异极显着（P<0.01）;归脾汤治疗组（治疗1组）大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值升高接近正常组,与模型组比较,差异极显着（P<0.01）;治疗2组MOD值与模型组比较无显着差异。2) AChE免疫阳性反应物在脾虚大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值较高,与正常组比较,差异极显着（P<0.01）;归脾汤治疗组（治疗1组）大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值较低与正常组类似,与模型组比较,差异极显着（P<0.01）;治疗2组MOD值与模型组比较无显着差异3) NOS免疫阳性反应物在脾虚大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值较低,与正常组比较,差异极显着（P<0.01）;归脾汤治疗组（治疗1组）大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值较高接近正常组,与模型组比较,差异极显着（P<0.01）;治疗2组MOD值与模型组比较无显着差异。3即早基因C-FOS的免疫组化、C-JUN的原位杂交检测结果1) C-FOS免疫阳性反应物在脾虚大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值较低,与正常组比较,差异极显着（P<0.01）;归脾汤治疗组（治疗1组）大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值较高,与模型组比较,差异极显着（P<0.01）;治疗2组MOD值与模型组比较无显着差异。2) C-JUN mRNA阳性细胞在脾虚大鼠脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值较低,与正常组比较,差异极显着（P<0.01）;归脾汤治疗组（治疗1组）脑内海马、前额叶皮层和下丘脑MOD值较高,与模型组比较,差异极显着（P<0.01）;治疗2组MOD值与模型组比较无显着差异。结论: 1脾藏神理论在五脏藏神理论中居于重要的地位,而在五脏皆藏神的整体协调关系中,脾胃起着枢轴或曰关键的作用。脾胃所化生的营血精微是产生神的物质基础,同时,脾的转枢气机和运化水湿的功能正常又是“神”正常表达的重要保证。脾藏意,主思,而“意”、“思”的含义包括了学习记忆的过程,脾与学习记忆关系密切。2采用苦降泻下、饮食失节加劳倦过度的方法复制脾虚模型,模型复制成功。3脾虚大鼠脑内与学习记忆有关的信号转导相关因子表达变化:AChE表达升高,BDNF、NOS、C-FOS和C-JUN mRNA表达降低;经归脾汤治疗后大鼠脑内AChE表达降低,BDNF、NOS、C-FOS和C-JUN mRNA表达升高,提示脾虚对大鼠学习记忆能力有一定的影响。4结合本课题组对脾虚大鼠行为学研究的结果,提示归脾汤通过调节脾虚大鼠脑内信号转导相关因子的表达而对学习记忆有明显的改善作用。
二、脊髓损伤后一氧化氮合酶活性变化的动态观察及其基因表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脊髓损伤后一氧化氮合酶活性变化的动态观察及其基因表达（论文提纲范文）
（1）基于衰老分子机制探讨脾虚证-补中益气汤相关的生物学基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 “方证相关”研究进展 |
| 前言 |
| 1 方证相关的文献研究与数据挖掘 |
| 2 方证相关的临床应用 |
| 3 方证相关的实验探索 |
| 4 方证相关的生物信息学研究 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 脾虚证与衰老相关的研究进展 |
| 1 脾虚与衰老关系的中医学认识 |
| 2 脾虚与衰老相关性的临床研究进展 |
| 3 脾虚与衰老相关性的实验研究进展 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 补中益气汤现代研究进展 |
| 1 补中益气汤的临床应用 |
| 2 补中益气汤药理研究 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 研究一 脾虚证分子内涵与补中益气汤作用相关的网络药理学研究 |
| 1 数据库及软件 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 脾虚证演变与衰老相关的探讨 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究三 从衰老探察脾虚证现代内涵及补中益气汤的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 立论背景及研究思路 |
| 2 脾虚模型大鼠的衰老样变及其生物学表征 |
| 3 脾虚证脑衰老样变的炎性损伤机制 |
| 4 补中益气汤的抗衰作用及其分子机制 |
| 5 研究创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）乌头汤缓解神经病理性疼痛的药效物质基础及其作用机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 文献研究 |
| 综述一 中医药缓解神经病理性疼痛的研究进展 |
| 综述二 网络药理学在组合药物研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 引言 |
| 课题研究思路与技术路线图 |
| 第一部分 乌头汤缓解NP的药效及其药理作用探索 |
| 1. 材料 |
| 1.1 数据库 |
| 1.2 软件 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验用药物及试剂 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 SNL模型的构建 |
| 2.3 乌头汤镇痛药效学指标的检测 |
| 2.4 转录组表达谱样本的制备及检测方法 |
| 2.5 差异表达基因的筛选 |
| 2.6 “基因-基因相互作用网络”的构建与分析 |
| 2.7 通路富集分析 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 SNL模型显着降低小鼠的机械痛阈值和热痛阈值 |
| 3.2 乌头汤可显着改善NP小鼠的疼痛症状 |
| 3.3 NP发病相关的基因主要调控胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症 |
| 3.4 乌头汤镇痛效应基因显着富集于胶质细胞活化和神经炎症相关的信号通路 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 NP的关键病理环节包括胶质细胞活化、神经-免疫反应以及神经炎症 |
| 4.2 乌头汤可有效缓解NP的症状 |
| 4.3 乌头汤的镇痛作用与抑制胶质细胞活化和神经炎症有关 |
| 5. 小结 |
| 第二部分 乌头汤缓解NP的分子机制挖掘及关键药效物质筛选 |
| 1. 材料 |
| 1.1 数据库 |
| 1.2 软件 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验用药物及试剂 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 乌头汤候选靶标谱的收集 |
| 2.2 “NP相关基因-乌头汤候选靶标”互作网络的构建与分析 |
| 2.3 重要网络节点的通路富集分析 |
| 2.4 分子对接模拟化合物与靶标蛋白的结合情况 |
| 2.5 表面等离子共振技术检测化合物与蛋白的结合情况 |
| 2.6 药代动力学检测 |
| 2.7 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 乌头汤的镇痛候选靶标显着富集于趋化因子信号通路 |
| 3.2 乌头汤的镇痛关键药效物质筛选 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 趋化因子信号轴可介导神经炎症 |
| 4.2 芍药苷和甘草苷具有镇痛作用 |
| 5. 小结 |
| 第三部分 乌头汤镇痛关键药效物质的作用特点及其分子机制的验证研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验用药物及试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 动物与分组 |
| 2.2 NP模型构建 |
| 2.3 疼痛评价方法 |
| 2.4 取材及组织处理方法 |
| 2.5 动物组织冰冻切片 |
| 2.6 免疫组化染色法检测GFAP、NeuN及CCL5的表达 |
| 2.7 Real-time PCR方法检测趋化因子信号通路成员分子的基因表达水平 |
| 2.8 Western blot方法检测趋化因子信号通路成员分子的蛋白表达水平 |
| 2.9 ELISA方法检测炎症因子的含量 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效缓解SNL大鼠的疼痛症状 |
| 3.2 乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效降低SNL大鼠L5脊髓背角组织中GFAP以及CCL5的表达 |
| 3.3 乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可显着抑制趋化因子信号通路的表达 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 CCL5和CCR5与NP的发生和维持密切相关 |
| 4.2 芍药苷-甘草苷组合有望成为新的镇痛组合药物 |
| 5. 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 一、论文的主要研究成果 |
| 二、论文的特色与创新点 |
| 三、本课题的不足之处 |
| 四、本课题的拓展研究计划 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（3）基于转录组分析揭示一氧化氮调控紫花苜蓿响应干旱胁迫的机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述与立题依据 |
| 1 紫花苜蓿抗旱研究进展 |
| 1.1 紫花苜蓿重要性及面临问题 |
| 1.2 紫花苜蓿对干旱胁迫的响应 |
| 1.2.1 紫花苜蓿应答干旱胁迫的萌发特性 |
| 1.2.2 紫花苜蓿应答干旱胁迫的形态特征 |
| 1.2.3 紫花苜蓿应答干旱胁迫的光合特性及光合碳同化响应 |
| 1.2.4 紫花苜蓿应答干旱胁迫的响应机制研究 |
| 2 一氧化氮在植物中的研究 |
| 2.1 植物体内NO的生物合成 |
| 2.1.1 氧化途径 |
| 2.1.2 还原途径 |
| 2.2 NO对植物生长发育的调控 |
| 2.2.1 种子萌发 |
| 2.2.2 幼苗的生长发育 |
| 2.3 NO调控植物抗旱性的研究进展 |
| 3 转录组学技术在研究苜蓿抗逆机理中的应用 |
| 3.1 转录组学的概述 |
| 3.2 转录组测序技术在苜蓿抗逆研究中的应用进展 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 5 研究内容与技术路线 |
| 5.1 研究内容 |
| 5.2 技术路线 |
| 第二章 外源NO对不同品种紫花苜蓿萌发期抗旱性影响的比较分析 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料与处理 |
| 1.2 测定指标与方法 |
| 1.3 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 SNP溶液浸种对PEG胁迫下紫花苜蓿种子MDA含量的影响 |
| 2.2 SNP浸种对PEG胁迫下紫花苜蓿种子渗透调节物质含量的影响 |
| 2.3 SNP浸种对PEG胁迫下紫花苜蓿种子抗氧化酶活性的影响 |
| 2.3.1 SOD活性 |
| 2.3.2 POD活性 |
| 2.3.3 CAT活性 |
| 2.3.4 APX活性 |
| 2.4 不同处理及不同PEG胁迫时间对3品种紫花苜蓿抗性的影响 |
| 2.5 SNP浸种对PEG胁迫下不同品种紫花苜蓿调控效应综合评价 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿萌发生长及抗氧化能力的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验设计及处理 |
| 1.2.1 萌发期试验 |
| 1.2.2 幼苗期试验 |
| 1.3 测定指标及方法 |
| 1.3.1 种子萌发指标的测定 |
| 1.3.2 生长指标的测定 |
| 1.3.3 生理指标的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿种子萌发及芽苗生长的影响 |
| 2.2 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗生长的影响 |
| 2.3 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿活性氧积累及MDA含量的影响 |
| 2.4 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿抗坏血酸-谷胱甘肽(ASA-GSH)循环的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿碳同化及碳代谢的影响 |
| 前言 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 供试材料与实验设计 |
| 1.2 测定指标与方法 |
| 1.2.1 碳同化关键酶活性测定 |
| 1.2.2 三羧酸循环关键酶活性的测定 |
| 1.2.3 碳代谢产物含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿碳同化关键酶活性的的影响 |
| 2.2 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿三羧酸循环关键酶活性的影响 |
| 2.3 NO对干旱胁迫下紫花苜蓿柠檬酸和氨基酸含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 NO调控干旱胁迫下紫花苜蓿萌发期芽苗的转录组分析 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料与试验设计 |
| 1.2 RNA的提取,CDNA文库构建及测序 |
| 1.2.1 RNA的提取 |
| 1.2.2 cDNA文库的构建 |
| 1.2.3 Illumina测序 |
| 1.3 转录本拼接 |
| 1.4 Unigene的功能注释 |
| 1.5 差异基因表达分析 |
| 1.6 差异表达基因GO和 KEGG富集分析 |
| 1.7 差异表达基因的实时荧光定量PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA样品质检 |
| 2.2 萌发期紫花苜蓿芽苗转录组测序数据质量 |
| 2.3 转录组拼接结果 |
| 2.4 Unigene功能注释 |
| 2.5 差异表达基因分析 |
| 2.6 DEGS的 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.6.1 干旱胁迫诱导的紫花苜蓿萌发期种子中DEGs的 GO和 KEGG分析 |
| 2.6.2 NO供体(SNP)诱导紫花苜蓿萌发期种子DEGs的 GO和 KEGG分析 |
| 2.6.3 NO清除剂(cPTIO)诱导紫花苜蓿萌发期种子DEGs的 GO和 KEGG分析 |
| 2.7 NO调控干旱胁迫下紫花苜蓿芽苗DEGS的主要代谢通路分析 |
| 2.7.1 外源NO调控的苯丙烷类合成通路分析 |
| 2.7.2 外源NO调控的淀粉与蔗糖代谢通路分析 |
| 2.7.3 外源NO调控的氮代谢通路分析 |
| 2.7.4 内源NO调控的有机酸代谢通路分析 |
| 2.8 RNA-Seq结果的实时定量PCR验证分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 干旱胁迫对紫花苜蓿芽苗转录调控分析 |
| 3.2 外源NO对干旱胁迫下紫花苜蓿芽苗转录调控分析 |
| 3.3 内源NO对干旱胁迫下紫花苜蓿芽苗转录调控分析 |
| 4 小结 |
| 第六章 NO调控干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗功能叶片的转录组分析 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料与试验设计 |
| 1.2 RNA的提取,CDNA文库构建及测序 |
| 1.2.1 RNA的提取 |
| 1.2.2 cDNA文库的构建 |
| 1.2.3 Illumina测序 |
| 1.3 转录组拼接 |
| 1.4 基因功能注释 |
| 1.5 差异表达分析 |
| 1.6 差异表达基因GO和 KEGG富集分析 |
| 1.7 差异表达基因实时荧光定量PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA样品质检 |
| 2.2 幼苗期紫花苜蓿叶片转录组测序数据质量 |
| 2.3 转录组拼接结果 |
| 2.4 Unigene功能注释 |
| 2.5 幼苗叶片差异表达分析 |
| 2.6 DEGS的 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.6.1 干旱胁迫诱导的紫花苜蓿叶片中DEGs的 GO和 KEGG分析 |
| 2.6.2 NO供体(SNP)诱导紫花苜蓿幼苗叶片DEGs的 GO和 KEGG分析 |
| 2.6.3 NO清除剂(cPTIO)诱导紫花苜蓿幼苗叶片DEGs的 GO个 KEGG分析 |
| 2.7 NO调控干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗叶片DEGS的主要代谢通路分析 |
| 2.7.1 次级代谢产物合成通路分析 |
| 2.7.2 光合器官碳同化通路分析 |
| 2.7.3 氧化磷酸化通路分析 |
| 2.7.4 碳素代谢通路分析 |
| 2.7.5 三羧酸循环通路分析 |
| 2.8 RNA-Seq结果的实时定量PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗叶片转录水平调控分析 |
| 3.2 外源NO对干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗叶片转录水平调控分析 |
| 3.3 内源NO对干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗叶片转录水平调控分析 |
| 4 小结 |
| 第七章 全文结论与创新点 |
| 1 全文结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 氧化应激的危害及其防治 |
| 1.1.1 氧化应激的产生 |
| 1.1.2 氧化应激的诱发因素 |
| 1.1.3 氧化应激对奶牛的危害 |
| 1.1.4 缓解氧化应激的措施 |
| 1.2 硒对奶牛生产性能的促进作用 |
| 1.2.1 硒在反刍动物体内的代谢与利用 |
| 1.2.2 硒对奶牛生产性能的影响 |
| 1.3 硒缓解奶牛乳腺氧化应激的研究进展 |
| 1.3.1 硒对奶牛乳腺氧化应激的调节作用 |
| 1.3.2 硒减缓氧化应激的可能机制 |
| 1.4 论文研究目的与意义 |
| 1.5 论文研究内容和技术路线 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 不同剂量硒对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化功能的调节作用 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 试验材料和方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 过量一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的建立 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 硒对一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的减缓作用 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 试验材料与方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 硒通过硫氧还蛋白还原酶抑制白介素-1活性对细胞损伤的减缓作用 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 试验材料与方法 |
| 2.4.3 结果 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 硒通过抑制MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞的氧化损伤 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 试验材料与方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.5.4 讨论 |
| 2.5.5 小结 |
| 2.6 硫氧还蛋白还原酶1的过表达对硒缓解BMEC氧化应激损伤的影响 |
| 2.6.1 引言 |
| 2.6.2 试验材料与方法 |
| 2.6.3 结果 |
| 2.6.4 讨论 |
| 2.6.5 小结 |
| 3 论文总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 过量NO对细胞抗氧化功能及炎症因子的调节作用 |
| 3.1.2 Se对BMEC氧化应激的减缓作用具有剂量依赖性 |
| 3.1.3 Se缓解BMEC氧化应激的机理 |
| 3.2 总体结论 |
| 3.3 存在的问题及进一步研究的领域 |
| 3.4 本研究的创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）壳聚糖通过NF-κB信号通路调节奶牛抗氧化功能与抗炎症反应的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstracts |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 壳聚糖及其衍生物的生物学特性 |
| 1.2 氧化应激的产生及其在炎症反应及免疫失调中的作用 |
| 1.2.1 氧化应激的产生 |
| 1.2.2 氧化应激在炎症反应及免疫失调中的作用 |
| 1.3 壳聚糖及其衍生物对反刍动物生产性能的作用效果 |
| 1.4 壳聚糖及其衍生物对动物抗氧化和抗炎症的调节作用 |
| 1.5 壳聚糖促进抗氧化与抗炎症反应的可能机理 |
| 1.5.1 可能通过调节体内免疫调节因子发挥抗炎症作用 |
| 1.5.2 可能通过抑制NF-κB信号通路降低NO产生 |
| 1.5.3 可能通过抑制MAPK信号通路降低NO的生成 |
| 1.5.4 可能通过调节脂类代谢发挥抗氧化应激作用 |
| 1.6 论文研究的目的与意义 |
| 1.7 论文研究的内容与技术路线 |
| 1.7.1 技术路线 |
| 1.7.2 主要试验内容 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 壳聚糖对奶牛产奶性能、抗氧化功能与抗炎症反应的影响 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 壳寡糖对奶牛PBMC抗氧化功能的促进作用 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 二乙烯三胺/一氧化氮诱导奶牛PBMC氧化损伤模型的建立 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 试验材料和方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 壳寡糖对二乙烯三胺/一氧化氮诱导的奶牛PBMC氧化损伤的减缓作用 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 试验材料与方法 |
| 2.4.3 结果 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 壳寡糖对LPS诱导的奶牛PBMC氧化损伤的减缓作用 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 试验材料与方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.5.4 讨论 |
| 2.5.5 小结 |
| 2.6 体内与体外结合研究日粮添加壳聚糖对奶牛抗氧化功能与抗炎症反应的调节机理 |
| 2.6.1 引言 |
| 2.6.2 试验材料与方法 |
| 2.6.3 结果 |
| 2.6.4 讨论 |
| 2.6.5 小结 |
| 2.7 通过siRNA沉默NF-κBp65基因研究COS缓解LPS引起PBMC氧化应激的机制 |
| 2.7.1 引言 |
| 2.7.2 试验材料与方法 |
| 2.7.3 结果 |
| 2.7.4 讨论 |
| 2.7.5 小结 |
| 3 论文总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 壳聚糖对奶牛抗氧化功能与抗炎症反应的调节作用 |
| 3.1.2 壳聚糖促进奶牛抗氧化功能与抗炎症反应的机制 |
| 3.1.3 壳聚糖对奶牛产奶性能的影响和日粮中的添加剂量 |
| 3.2 总体结论 |
| 3.3 存在问题及进一步研究领域 |
| 3.4 本研究的创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）硒通过Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-κB信号通路对一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的减缓作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 奶牛氧化应激 |
| 1.1.1 奶牛氧化应激的产生机制 |
| 1.1.2 引起奶牛氧化应激的因素 |
| 1.2 氧化应激缓解措施 |
| 1.2.1 机体抗氧化酶 |
| 1.2.2 外源性抗氧化剂 |
| 1.3 硒的概述 |
| 1.3.1 硒对奶牛氧化应激的减缓作用 |
| 1.3.2 硒对奶牛乳腺免疫功能的调节作用 |
| 1.3.3 硒减缓氧化应激的可能机制 |
| 1.4 PPARγ在脂肪代谢与氧化应激中的作用 |
| 1.4.1 PPARγ概况 |
| 1.4.2 PPARγ在脂肪代谢中的作用 |
| 1.4.3 PPARγ缓解氧化应激的作用 |
| 1.5 论文研究内容与技术路线 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 不同剂量的硒对NO诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的减缓作用 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 试验材料与方法 |
| 2.1.3 结果分析 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 硒通过PPARγ对NO诱导的BMECs氧化应激的减缓作用 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.3 结果分析 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 通过沉默GPX1基因研究硒减缓MECs氧化损伤的机制 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 结果分析 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 3 论文总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 硒对BMECs氧化应激的减缓作用 |
| 3.1.2 硒对BMECs氧化应激的减缓机制 |
| 3.2 总体结论 |
| 3.3 存在的问题及进一步研究的领域 |
| 3.4 本论文的创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）丙戊酸对大鼠臂丛根性撕脱伤后脊髓神经元存活和再生的影响（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1篇 文献综述 |
| 第1章 一氧化氮合酶与神经损伤 |
| 1 神经损伤后脑和脊髓神经元中 NOS 的表达变化 |
| 1.1 中枢神经系统损伤后神经元中 NOS 的表达 |
| 1.2 周围神经损伤后脑和脊髓神经元 NOS 的表达 |
| 1.3 损伤诱导的 NOS 阳性神经元的超微结构变化 |
| 1.4 神经损伤后 NOS 表达的影响因素 |
| 2. NOS 在神经损伤后发挥的作用及其机制 |
| 2.1 NOS 表达与神经元死亡 |
| 2.2 NOS 表达与神经保护和神经再生 |
| 3 NOS 活性的调控 |
| 4 小结 |
| 第2章 丙戊酸的神经保护机制 |
| 1 VPA 调节基因表达 |
| 1.1 转录因子途径 |
| 1.2 HDAC 途径 |
| 2 VPA 对激酶途径的影响 |
| 2.1 PI3K/Akt 通路 |
| 2.2 MAPKs 通路 |
| 2.3 VPA 抑制 GSK-3β通路 |
| 2.4 VPA 对 PKC 和 PKA 的作用 |
| 3 VPA 对离子通道的作用 |
| 4 结语 |
| 第2篇 VPA 对大鼠臂丛撕脱伤后脊髓神经元存活和再生影响的研究 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 动物模型的建立、分组及取材 |
| 1 实验动物的来源 |
| 2 主要仪器和试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 臂丛撕脱伤动物模型的建立 |
| 4 实验动物的分组及给药 |
| 5. 组织标本取材 |
| 第3章 臂丛撕脱伤后脊髓运动神经元凋亡的检测 |
| 第1节 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 TUNEL 法测定细胞凋亡的原理 |
| 2.2 TUNEL 法步骤 |
| 2.3 结果判断和图像分析 |
| 3 统计学分析 |
| 第2节 实验结果 |
| 1 C5-T1 脊髓节段中运动神经元凋亡的检测结果 |
| 第4章 臂丛撕脱伤后脊髓神经元内NNOS的检测 |
| 第1节 材料与方法 |
| 1 脊髓神经元内 nNOS mRNA 的 Real-time PCR 检测 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 脊髓神经元内 nNOS 的 Western Blot 检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 脊髓神经元内 nNOS 的免疫组织化学检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 4 统计学分析 |
| 第2节 实验结果 |
| 1 脊髓神经元中 nNOS mRNA 的 Real-time PCR 检测结果 |
| 2 脊髓神经元中 nNOS 蛋白的 Western blot 检测结果 |
| 3 脊髓神经元中 nNOS 的免疫组织化学检测结果 |
| 第5章 臂丛撕脱伤后脊髓神经元中 [Ca~(2+)]i 浓度的检测 |
| 第1节 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 脊髓神经元内[Ca~(2+)]i 浓度测定方法 |
| 2.1 钙荧光指示剂 Fura-2/AM 测定细胞内[Ca~(2+)]i 浓度的原理 |
| 2.2 脊髓神经元细胞悬液制备 |
| 2.3 Ca~(2+)荧光探针 Fura-2/AM 负载 |
| 2.4 Ca~(2+)荧光强度的测定 |
| 3 统计学分析 |
| 第2节 实验结果 |
| 1 脊髓神经元内 [Ca~(2+)]i 的检测结果 |
| 第6章 臂丛撕脱伤后脊髓神经元中 GAP-43 的检测 |
| 第1节 材料与方法 |
| 1 GAP-43 mRNA 的 Real-time PCR 检测 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 GAP-43 蛋白的 Western Blot 检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 第2节 实验结果 |
| 1 脊髓神经元中 GAP-43 mRNA 的 Real-time PCR 检测结果 |
| 2 脊髓神经元中 GAP-43 的 Western blot 检测结果 |
| 第7章 讨论 |
| 第1节 研究的背景、现实意义和创新性 |
| 1 臂丛根性撕脱伤的治疗现状 |
| 2 臂丛根性撕脱伤后的神经元死亡和保护 |
| 3 丙戊酸的神经保护作用和优势 |
| 4 本研究的现实意义和创新性 |
| 第2节 动物模型设计和给药的合理性分析 |
| 1 动物模型的设计 |
| 2 给药方式的确立 |
| 第3节 VPA 对大鼠臂丛撕脱伤后神经元的保护及机制探讨 |
| 1 VPA 对大鼠臂丛撕脱伤后神经元凋亡的影响 |
| 2 VPA 对大鼠臂丛撕脱伤后脊髓神经元 nNOS 表达的影响 |
| 3 VPA 对大鼠臂丛撕脱伤后脊髓神经元 Ca~(2+)浓度表达的影响 |
| 4 VPA 作用下神经元内 nNOS 和 Ca~(2+)关系 |
| 第4节 VPA 对大鼠臂丛撕脱伤后神经元再生的促进作用 |
| 第3篇 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及参加的科研课题 |
| 致谢 |
（8）电针不同介入时间对急性脊髓损伤大鼠NO、MDA和SOD影响的实验研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 脊髓损伤的机理 |
| 1 现代医学对脊髓损伤的认识 |
| 1.1 脊髓损伤的机制 |
| 1.2 脊髓损伤的病理改变 |
| 2 中医对脊髓损伤的认识 |
| 3 小结与展望 |
| 综述二 针灸治疗脊髓损伤的临床与实验研究进展 |
| 1 针灸治疗脊髓损伤的临床研究进展 |
| 2 针灸治疗脊髓损伤的实验研究进展 |
| 3 针灸治疗脊髓损伤的时效性研究进展 |
| 4 小结与展望 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要设备和试剂 |
| 2 方法 |
| 结果 |
| 1 各组大鼠一般状况观察结果 |
| 2 CBS计分结果 |
| 3 各组大鼠损伤脊髓组织SOD含量检测结果 |
| 4 各组大鼠损伤脊髓组织MDA含量检测结果 |
| 5 各组大鼠脊髓组织中NO含量检测结果 |
| 6 各组大鼠局部脊髓组织形态学观察结果 |
| 讨论 |
| 1 取穴依据 |
| 2 模型选择 |
| 3 电针对脊髓损伤大鼠脊髓组织超氧化物岐化酶和丙二醛含量的结果分析 |
| 4 电针对脊髓损伤大鼠脊髓组织一氧化氮含量的结果分析 |
| 5 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一参考文献 |
| 综述二参考文献 |
| 实验研究参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）严重烫伤早期大鼠血脑屏障损害及其机制的探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 本项目的研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状及分析 |
| 第二章 严重烫伤早期大鼠血脑屏障超微结构的变化 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 严重烫伤后脑内 ZO-1 表达变化与血脑屏障功能的关系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 严重烫伤早期大鼠脑内MMP-9、GFAP 表达变化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章L-NAME及尼莫地平对严重烫伤大鼠BBB通透性的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 文献综述(一) |
| 文献综述(二) |
| 文献综述(三) |
| 附录 B(附图) |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（10）脾虚模型脑内信号转导相关因子及其基因表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 综述一 脾虚证的现代研究概述 |
| 综述二 脑源性神经营养因子对学习记忆作用的研究进展 |
| 综述三 AChE、NOS 与学习记忆关系的研究进展 |
| 综述四 即早基因c-fos、c-jun 与学习记忆关系的研究进展 |
| 理论研究 中医脾与学习记忆相关的理论研究 |
| 1 五脏藏神理论探讨 |
| 2 五脏藏神脾胃为先 |
| 3 中医脾影响学习记忆的理论基础 |
| 4 中医脾影响学习记忆的实验基础 |
| 5 结语 |
| 实验一 脾虚大鼠造模实验 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二 脾虚大鼠脑内BDNF 表达的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三 脾虚大鼠脑内AchE 和NOS 的表达的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验四 脾虚大鼠脑内即早基因c-fos、c-jun 的表达的研究 |
| c-fos 免疫组化表达的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| C-JUN mRNA 原位杂交表达的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 照片 |
四、脊髓损伤后一氧化氮合酶活性变化的动态观察及其基因表达（论文参考文献）
- [1]基于衰老分子机制探讨脾虚证-补中益气汤相关的生物学基础[D]. 朱昊如. 北京中医药大学, 2020(04)
- [2]乌头汤缓解神经病理性疼痛的药效物质基础及其作用机制探索[D]. 郭秋岩. 中国中医科学院, 2020(01)
- [3]基于转录组分析揭示一氧化氮调控紫花苜蓿响应干旱胁迫的机理[D]. 赵颖. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [4]硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究[D]. 郭咏梅. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [5]壳聚糖通过NF-κB信号通路调节奶牛抗氧化功能与抗炎症反应的机理研究[D]. 郑亚光. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [6]硒通过Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-κB信号通路对一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的减缓作用[D]. 苏芮. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [7]丙戊酸对大鼠臂丛根性撕脱伤后脊髓神经元存活和再生的影响[D]. 李强. 吉林大学, 2013(08)
- [8]电针不同介入时间对急性脊髓损伤大鼠NO、MDA和SOD影响的实验研究[D]. 王婷婷. 北京中医药大学, 2009(10)
- [9]严重烫伤早期大鼠血脑屏障损害及其机制的探讨[D]. 刘曾旭. 南昌大学, 2007(03)
- [10]脾虚模型脑内信号转导相关因子及其基因表达的研究[D]. 李娟. 北京中医药大学, 2007(02)