一、嘧啶核苷类物质乳清酸产生菌的选育（论文文献综述）
徐哲文[1]（2020）在《中国被毛孢高产核苷菌株的选育及关键酶表达分析》文中研究表明冬虫夏草是虫草真菌寄生于蝙蝠蛾幼虫而生成的子座与虫体的虫菌复合体,中国被毛孢（Hirsutella sinensis）是公认的冬虫夏草无性型真菌,其功能和成分与冬虫夏草高度相似,已成为野生冬虫夏草的替代品。核苷作为中国被毛孢产品的一个重要指标,其对于提高产品质量和增强市场竞争力至关重要。本文针对中国被毛孢首次研究其原生质体制备与再生,建立了原生质体常压室温等离子（ARTP）与甲基磺酸乙酯（EMS）复合诱变技术,获得核苷高产菌株,并探究了核苷代谢途径中关键酶的基因表达差异。本文首先对中国被毛孢菌株Hirsutella sinensis ZJB18002原生质体的制备与再生方法进行优化,考察了渗透压稳定剂种类及浓度、裂解酶种类及浓度、酶解温度、酶解时间和培养时间等因素对原生质体制备的影响,获得了最适的原生质体制备条件:将培养7 d的中国被毛孢菌丝体悬浮于5 m L含0.6 mol/L KCl和3mg/m L破壁酶、4 mg/m L溶壁酶和3 mg/m L崩溃酶的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（p H=5.5）中,于18℃,120 rpm酶解0.5 h,原生质体产量达4.37×107/g湿重;在此基础上,进一步优化了原生质体再生条件,包括再生培养基成分、酶解条件和涂布浓度,结果表明:将浓度为5×104/m L的原生质体涂布于再生培养基上,于16℃黑暗培养21 d,得到成熟的中国被毛孢单菌落,再生率为12.89%。其次,对原生质体诱变条件进行了筛选,建立了ARTP与EMS复合诱变中国被毛孢原生质体的条件:最佳ARTP处理时间为80 s,最佳EMS诱变剂量为40μL/m L,选取ARTP诱变的正突变菌株进行EMS诱变,最终筛选出突变菌株Hirsutella sinensis ZJB19050,其腺苷含量为3.36 mg/g、鸟苷含量为2.7 mg/g和尿苷含量为6.46 mg/g,较原始菌株分别提高了160.2%、67.4%和113.5%。论文最后对核苷代谢途径中涉及的关键酶基因表达量进行定量检测。预测和构建了中国被毛孢腺苷、鸟苷和尿苷的生物代谢途径,对代谢途径中涉及的8个关键酶及其对应的功能基因序列进行验证,并成功克隆表达。根据2-ΔΔCt相对定量的结果进行分析,发现了核苷代谢途径中的4个表达上调和3个表达下调的关键酶基因;其中5’-核苷酸酶与转甲酰基酶的活性分别比原来提高了658.8%和222.5%,而腺苷脱氢酶的表达量仅为原始菌株的31.2%;鸟苷代谢途径中的次黄嘌呤核苷酸脱氢酶和GMP合成酶均为表达上调基因,分别为原始菌株的195.6%和179.6%;尿苷代谢途径中尿苷激酶和乳清酸核苷酸脱羧酶的表达量为原始菌株的36.1%和23.5%。
张丽娜[2]（2020）在《微生物体内游离胞嘧啶的检测及胞苷单磷酸水解酶的相关研究》文中研究说明胞嘧啶（cytosine,C）是核酸分子4种基本碱基之一,在生物体内主要以核苷或核苷酸形式存在,游离状态的胞嘧啶很少。以杀稻瘟菌素（blasticidin S,BS）为例,绝大多数以游离胞嘧啶为前体的核苷类抗生素的生物合成基因簇中会编码水解胞苷单磷酸（CMP）生成游离碱基的水解酶,但谷氏菌素生物合成基因簇及其产生菌的基因组中均没有类似的水解酶,其体内游离胞嘧啶的来源尚未阐明。本研究为探究谷氏菌素原始产生菌中特殊现象产生的原因,以稳定表达BS的异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2（S.lividans WJ2）及其它十种常见的微生物为研究对象,探究游离胞嘧啶的可能来源及产生途径,并对链霉菌中潜在的CMP水解酶进行寻找。通过PCR-targeting的方式敲除S.lividans WJ2中的bls M基因,高效液相色谱（HPLC）检测突变株和WJ2的发酵产物,突变株仍能产生终产物BS及其它三种衍生物,但各组分产量与WJ2菌株相比均明显降低;液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测了11个经过分级纯化的微生物细胞裂解液上清（CFE）,其中变铅青链霉菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的CFE处理液中检测到了含量较高的游离胞嘧啶。通过饱和硫酸铵溶液分级沉淀再复性的方法来富集变铅青链霉菌及天蓝色链霉菌CFE中的假定CMP水解酶活性,再利用蛋白的物化差异性对活性进一步细分,结合混合蛋白质谱鉴定及生物信息学分析在这两种链霉菌中寻找潜在的CMP水解酶,将潜在的候选蛋白进行异源表达及纯化后体外验证其功能,并将活性蛋白在链霉菌中敲除或过表达以确定活性及功能,最终确定了8个假定的CMP水解酶。综上所述,我们基于LC-MS建立了一种灵敏的细胞液胞嘧啶含量的检测方法,证明了变铅青链霉菌中游离胞嘧啶的存在,并寻找到游离胞嘧啶含量较高的三种细菌;另外,本研究对变铅青链霉菌及天蓝色链霉菌中潜在的CMP水解酶进行了初步探索。本论文对变铅青链霉菌等细菌体内游离胞嘧啶来源的研究,能完善细菌体内嘧啶代谢途径,增强对微生物体内核酸代谢的认识,对于研究微生物次级代谢中主代谢的协同作用提供了一定的借鉴意义。通过对变铅青链霉菌及天蓝色链霉菌中潜在CMP水解酶的寻找,可以丰富目前已知的水解酶库,并加深对这两种异源表达宿主的认知。
王茹[3]（2020）在《常压室温等离子体诱变技术结合CRISPR/Cas9系统选育胞苷高产菌株的研究》文中研究指明胞嘧啶核苷,又名胞苷,是多种抗癌药物和保健食品的重要原料。胞苷主要通过微生物发酵方法获得,但现有菌株的胞苷发酵水平不高,受到多种因素影响。为获得胞苷高产菌株,从全局代谢网络角度设计并优化胞苷代谢合成途径是有效提高胞苷合成能力的策略之一。本文主要针对胞苷降解途径、前体物PRPP代谢支路和乙酸代谢支路,提出了 3种有利于胞苷高效生物合成的策略,采用常压室温等离子体（Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP）诱变技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术改造胞苷代谢网络,构建高产菌株。主要研究内容如下:1、应用ARTP技术选育组氨酸营养缺陷型的产胞苷大肠杆菌突变株。ARTP诱变筛选技术,具有设备更精良,操作方法更简易,安全系数更高,突变频率高等优点。为了筛选高产胞苷菌株,通过ARTP技术诱变筛选组氨酸营养缺陷型突变菌,以阻断PRPP向组氨酸的代谢支路,从而提高胞苷的合成量。以大肠杆菌K-12（△thrA）为作出发菌株,使用ARTP诱变技术,在放电功率110 W,气流量10 SLPM,诱变时间为70 s的条件下,筛选得到组氨酸营养缺陷型突变菌E.coli K-12（△thrA His-）。2、应用CRISPR/Cas9系统构建cdd基因缺失大肠杆菌突变株。CRISPR/Cas9基因编辑技术近年来被用于微生物基因组改造,优化微生物基因的表达和调节,以提高化学、生物品的产量。在大肠杆菌的胞苷从头合成途径中,阻断胞苷的降解途径是胞苷大量合成的必须策略。通过敲除编码胞苷脱氨酶的cdd基因,切断胞苷的降解途径,可增加胞苷的积累。以大肠杆菌K-12（△thrA His-）为出发菌株,将CRISPR/Cas9与γ-Red系统结合,采用双质粒策略敲除出发菌株中的cdd基因。根据目的基因中设计ccd引物,将cdd基因拼接到pTargetF上,构建得到pTargetF-cdd质粒,然后,通过电转化,使质粒和同源臂结合到出发菌株的基因组上,引导Cas9蛋白识别并切割cdd基因,然后结合λ-Red重组酶,实现同源片段整合,从而使目的基因cdd被敲除,消除pTargetF和pCas质粒后,得到无抗性的突变菌株E.coli K-12（△thrA His-△cdd）。3、应用CRISPR/Cas9系统构建poxB基因缺失大肠杆菌突变株。敲除大肠杆菌中poxB基因,糖代谢产生的丙酮酸对胞苷合成是有利的。通过减弱丙酮酸向乙酸的代谢分流,为菌体生长提供更多能量,减少乙酸对大肠杆菌生长的危害,增强胞苷的从头合成的前体物质供应,从而提高胞苷合成量。以E.coli K-12（△thrA His-△cdd）作为出发菌株,应用CRISPR/Cas9结合γ-Red敲除poxB基因。根据目的基因poxB设计引物,成功构建pTargetF-poxB质粒,然后,将pTargetF-poxB电转化至含质粒pCas的大肠杆菌感受态细胞,使质粒和同源臂结合到出发菌株细胞基因组上,引导Cas9蛋白识别靶序列进行切割,并结合λ-Red重组酶,完成同源片段重组,从而敲除目的基因poxB,消除pTargetF和pCas后,得到无抗性的突变菌株 E.coli K-12（△thrA His-△cddApoxB）。4、重组菌株发酵产胞苷能力研究。将构建得到的突变菌株E.coli K-12（△thrA）、E.coli K-12（△thrA His-）、E.coli K-12（△thrA His-△cdd）和 E.coli K-12（△thrA His-△cdd△poxB）在 37℃、180 rpm条件下发酵48 h,研究发酵过程中菌体浓度、pH、葡萄糖消耗量以及胞苷产量。突变菌株E.coli K-12（△thrA His-）与对照组E.coli K-12（△thrA）相比,生长状况无明显区别,葡萄糖的消耗一直低于照组E.coli K-12（△thrA）,是对照组的82.78%。E.coli K-12（△thrA）的胞苷产量为0.549± 0.015 g/L,突变菌株发酵液中的胞苷浓度为0.60± 0.011 g/L,是对照组的1.10倍。E.coli K-12（△thrA His-）的糖苷转化率提高了 30.95%。敲除cdd基因,得到的突变菌E.coli K-12（△thrA His-△cdd）,生长曲线与出发菌E.coli K-12（△thrA His-）基本一致,葡萄糖消耗量略高于出发菌株,是对照组E.coli K-1 2（△thrA His-）的1.23倍。对照菌E.coli K-12（△thrA His-）的胞苷产量为 0.604±0.011 g/L,突变菌E.coli K-12（△thrA His-△cdd）的胞苷产量为 0.789±0.016 g/L,是对照组E.coli K-12（△thrA His-）的1.31倍,E.coli K-12（△thrA His-△cdd）的糖苷转化率提高了 8.18%。以E.coli K-12（△thrA His-△cdd）为出发菌株,敲除poxB基因,得到突发菌E.coli K-12（△thrA His-△cdd△poxB）。结果发现,突变菌E.coli K-12（△thrA His-△cdd△poxB）的生长速率比对照菌快,且菌体浓度也高,E.coli K-12（△thrA His-△cdd△poxB）葡萄糖的消耗量比较低,是对照组K-12（△thrA His △cdd）的88.3%。对照菌E.coli K-12（△thrA His-△cdd）的胞苷产量为 0.789± 0.016 g/L,突变菌 E.coli K-12（△thrA His-△cdd△poxB）的胞苷产量为 0.989±0.018 g/L,是对照组E.coli K-1 2（△thrA His-△cdd）的 1.25倍。E.coli K-1 2（△thrA His-△cdd△poxB）的糖苷转化率提高了 41.18%。综上所述,通过阻断PRPP向组氨酸代谢的分流、切断胞苷的降解途径以及减弱乙酸合成途径等全局代谢网络改造策略,可以有效提高大肠杆菌细胞的胞苷合成能力。
马若霜[4]（2019）在《过表达pyrP基因与NupC基因对大肠杆菌发酵分泌胞苷的影响》文中研究说明胞嘧啶核苷,也称为胞苷,是核苷类保健食品与药物重要的原料,市场需求量很大。胞苷主要通过微生物发酵方法获得,但现有菌株的胞苷发酵水平不高,受到多种因素影响。优化菌株细胞内胞苷的合成代谢方式及提高胞苷分泌效率是提高发酵单位的主要途径。胞苷可能是通过多种转运方式进行跨膜转运的,尿嘧啶通透酶（pyrP,EC3.1.3.104,由pyrP基因编码,分子量48KDa）和核苷转运蛋白（NupC,EC2.3.1.256,由NupC基因编码,分子量43 KDa）可能与胞苷分泌过程有关。本研究通过构建尿嘧啶通透酶和核苷转运蛋白NupC过表达体系,分析这两个基因的过表达对菌体细胞生长与胞苷发酵的影响,研究尿嘧啶通透酶和核苷转运蛋白在胞苷分泌过程的作用,从而不断提高菌体发酵胞苷的产率。具体研究内容如下:1、异源pyP基因过表达载体构建及其对胞苷发酵的影响。从解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组DNA上PCR扩增pyrP基因,并与pSTV28载体进行连接构建质粒载体pSTV28-pyrP。采用化学转化法将其转入Escherichia coliBG-08中,得到重组菌E.coliBG-08P。使用0.5 mmol/L IPTG诱导6h后,离心、收集菌体细胞,超声破碎取上清液,通过SDS-PAGE电泳分析,结果发现在48 kDa处蛋白条带较对照组明显增强。重组菌E.coli BG-08P在36℃、180 rpm发酵40 h,分析菌体浓度、葡萄糖消耗速率、pH以及胞苷产量。结果发现,重组菌与对照组比较生长情况无明显差别,过表达异源pyrP基因对菌株生长无影响,葡萄糖消耗速率的变化趋势与对照菌株一致,发酵液中的胞苷浓度为0.91±0.03 g/L,是对照菌株的1.30倍,表明过表达pyrP基因对胞苷的分泌有积极促进作用。2、异源NupC基因过表达载体构建及其对胞苷发酵的影响。从解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组DNA上PCR扩增NupC基因,连接到pSTV28载体上,构建质粒载体pSTV28-NupC。采用化学转化法将其转入E.coliBG-08中,得到重组菌E.coliBG-08C。使用0.5 mmol/L IPTG诱导6 h后,收集菌体细胞,超声破碎取上清液,通过SDS-PAGE电泳分析,结果发现在43 kDa处蛋白条带较对照组明显增强。将重组菌E.coli BG-08C在36℃、180 rpm发酵40 h,分析发酵过程中菌体浓度、葡萄糖消耗速率、pH以及胞苷产量。结果发现,重组菌与对照组比较生长情况无明显差别,过表达异源NupC基因未对菌株的生长造成影响,葡萄糖消耗速率的趋势与对照菌株一致,发酵液中的胞苷浓度为1.26±0.05g/L,是对照组的1.80倍,表明过表达NupC基因对胞苷发酵单位的提高有积极促进作用。3、异源pyrP和NupC基因串联过表达载体构建及其对胞苷发酵的影响。将pyrP和NupC基因串联拼接到pSTV28载体上,构建质粒载体pSTV28-pyrP-NupC,转化到E.coli BG-08中,获得重组菌E.coliBG-08PC。使用0.5mmol/LIPTG诱导6h后,离心、收集菌体细胞,超声破碎取上清液,通过SDS-PAGE电泳分析,在43 kDa和48 kDa处出现两条明显蛋白条带。重组菌E.cooiBG-08PC在36℃、180 rpm发酵40 h,对发酵过程中的菌体浓度、葡萄糖消耗速率、pH以及胞苷产量分析可知,重组菌与对照组比较生长情况无明显差别,表明过表达异源串联基因不会对菌株的生长造成影响,葡萄糖消耗速率的趋势与对照菌株一致,发酵液中的胞苷浓度为1.59±0.05g/L,是对照组的2.27倍。说明这两个基因的串联表达对胞苷浓度的提高有协同促进作用。4、pyrP和NupC基因在发酵中对胞苷分泌的促进作用。通过对构建的重组菌株E.coli BG-08P、E.coli BG-08C、E.coliBG-08PC和对照菌株比较分析。结果发现,发酵过程中的菌体浓度、葡萄糖消耗速率、pH与对照菌株差异不大,发酵液中胞苷浓度均有不同程度的提高,说明单独过表达pyr基因,增加了细胞中尿嘧啶通透酶的生成,增强了嘧啶的转运,促进了胞苷的分泌;单独过表达NupC基因,增加核苷转运蛋白的合成剂量,触发了细胞膜两侧胞苷结合位点的交替开放,增强了胞苷的转运作用;串联表达pyP和NupC基因,与对照菌株相比胞苷产量有了大幅度提高,表明这两个基因在胞苷分泌过程中发挥着协同促进的作用。
郝柿田[5]（2019）在《乳清酸合成工艺研究》文中提出乳清酸是维生素B13,化学名为1,2,3,6-四氢-2,6-二氧代-4-嘧啶羧酸,是一种营养药,在保肝、抗肿瘤、抗病毒、促进细胞代谢等方面具有重要的作用;乳清酸还是嘧啶类化合物的前体,在药物合成上有很重要的应用;近几年也有学者发现乳清酸可以抗衰老,增加细胞的代谢能力,所以乳清酸还用在化妆品和饮品领域。所以乳清酸是一种应用前景广阔产品,研究其工艺优化具有重要的实际意义。本文以马来酸酐、尿素和溴素为主要原料,经缩合、溴化环合、消除酸化和精制等四步操作合成了乳清酸。通过工艺研究得到了合成乳清酸的适宜的工艺条件。第一步缩合反应中,以马来酸酐和尿素为原料,以冰乙酸为溶剂合成了马来酰脲。通过分析合成马来酰脲的反应机理,开发了质子酸催化的方法。优化后的合成马来酰脲的反应条件为:催化剂对甲苯磺酸用量为马来酸酐的0.25%（wt）,摩尔比n（马来酸酐）:n（尿素）为1.0:1.3,反应时间为4 h,反应温度为45℃,在此条件下套用溶剂冰乙酸,马来酰脲的平均收率为95.7%,纯度为99.8%,乙酸的消耗量降低了41.0%。第二步溴化环合以马来酰脲和溴素为原料,经过溴化和环合反应得到溴化物。本文通过加入氢氧化钠使得反应溶液为均相。优化的合成溴化物的适宜条件为:摩尔比n（马来酰脲）:n（溴素）:n（氢氧化钠）为1.0:1.1:1.1,依次加入马来酰脲47.9 g（0.3 mol）,蒸馏水80.0 g和氢氧化钠13.2 g;0℃快速加入溴素,每0.5 h升1℃,14℃反应4h,之后每0.5h升1℃升温至18℃,18℃保温1h,总反应时间为14 h,在此条件下溴化物的收率提高至91.8%,纯度提高至97.2%。第三步消除酸化以溴化物、氢氧化钠和盐酸为原料,经消除酸化反应得到粗品乳清酸。优化后的反应条件为:摩尔比为n（溴化物）:n（氢氧化钠）=1.0:4.6,依次加入蒸馏水68.3 g,30%氢氧化钠78.0 g,调氢氧化钠浓度为16.0%,分5批加入30.0 g溴化物,迅速升温至80℃,反应1.5 h,之后降温至25℃,加入98.3 g 30%盐酸,反应1h,得到粗乳清酸,收率为88.1%,纯度为97.6%。本文尝试了将溴化环合和消除酸化两步操作合二为一的“一锅法”工艺。“一锅法”的操作为马来酰脲的投料量为22.5 g,溴化环合与上述优化后的方法相同;消除酸化过程中,用98.4 g 30%氢氧化钠和40.0g蒸馏水配制16.8%的氢氧化钠溶液,于18℃分批加入溴化反应液,搅拌15 min后快速升温至80℃,反应1.5 h,降温至25℃,加95.8 g 30%的盐酸酸化,反应1 h,抽滤得到乳清酸粗品。“一锅法”的乳清酸粗品收率为93.5%,纯度为96.9%。收率较分步法提高了12.6%,而且废水量降低了23.4%,纯度上无明显差别。第四步采用碱溶酸析法法对粗品乳清酸进行精制。优化后的操作条件为:摩尔比n（乳清酸）:n（氨水）:n（30%盐酸）为1.0:2.5:2.8,依次加入粗品乳清酸10.0 g（0.06 mol）,蒸馏水110.0 g,升温至80℃后加入25%氨水,1.5 g活性炭,100℃搅拌45 min后趁热抽滤,滤液迅速升温至100℃,加入30%盐酸酸化,慢慢降温析出乳清酸晶体,抽滤干燥得到产品。优化后的收率达到90.1%,纯度99.9%,废水量降低了30.3%。优化后整体反应收率提高至69.7%。采用“一锅法”工艺路线的收率提高至80.6%。
李国梁[6]（2018）在《代谢工程改造大肠杆菌制备尿苷》文中进行了进一步梳理尿苷作为抗病毒抗肿瘤药物的中间体,具有极其重要的医药价值,已广泛应用于医药行业。微生物发酵法生产尿苷具有条件温和,操作简单,易操作等优点,是工业化生产尿苷的理想方法,高产尿苷的优良菌种构建是发酵法生产的前提条件。本研究采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术对野生型大肠杆菌Escherichia coli W3110进行系统的代谢工程改造,构建尿苷高产菌株。首先,将Bacillus subtilis A260的嘧啶核苷操纵子基因整合至E.coli W3110基因组上,构建了菌株UR1。摇瓶发酵结果显示,菌株UR1的发酵液中尿苷的浓度呈现先升高后下降的趋势,然而副产物尿嘧啶在整个发酵周期不断积累;发酵32 h,尿苷产量为3g/L,尿嘧啶产量为4.5g/L。其次,为了减少副产物尿嘧啶的积累,阻断了尿苷的降解,敲除与尿苷分解代谢相关的基因（udp,udk,rihA/B/C）,构建菌UR2-5。摇瓶发酵结果显示,尿苷产量为7.8 g/L,与菌株UR1相比提高了 136%,但副产物尿嘧啶仍有少量积累,产量为0.6 g/L。最后,为了进一步增加尿苷的积累量,对尿苷合成的前体物质氨甲酰磷酸,天冬氨酸和PRPP的合成和代谢相关途径进行改造。（1）以UR2-5菌株为出发菌株,过表达氨甲酰磷酸合成酶得到菌株UR3。摇瓶发酵结果显示,菌株UR3的尿苷产量为9.3 g/L,同UR2-5相比提高了 19.23%。（2）在UR3菌株的基础上,敲除thrA基因得到菌株UR4。摇瓶发酵结果显示,菌株UR4的尿苷产量为12.2g/L,同UR3相比提高了 31.18%。（3）在UR4菌株的基础上,过表达prsA基因得到菌株UR5。摇瓶发酵结果显示,菌株UR5的尿苷产量为13.8 g/L,相比UR4提高了 13.11%,糖苷转化率提高47.16%。该菌株5 L发酵罐培养64 h,可积累尿苷70 g/L,糖苷转化率为22.3%,最大生产强度为1.5 g/L/h,是目前报道的发酵法生产尿苷的最高水平,为尿苷发酵生产的产业化奠定了坚实基础。
袁辉[7]（2017）在《代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产尿苷的研究》文中指出尿苷作为抗病毒抗肿瘤药物的中间体,具有极其重要的医药价值,已广泛应用于医药行业。微生物发酵法生产尿苷具有条件温和,操作简单,易操作等优点,但在国内尚没有实现工业化生产。本课题组之前的研究通过常压室温等离子（ARTP）诱变结合高通量筛选（HTS）的方法选育一株尿苷产量较高的菌株,将该菌株命名为B.subtilisF126。本文以F126菌株为出发菌株,通过基因工程的方法进一步提升其尿苷生产能力。在F126菌株中过表达5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）合成酶编码基因prs,构建F126-1菌株。摇瓶发酵结果显示,F126和F126-1菌株的尿苷产量分别为5.72 g/L和8.76 g/L。5 L罐发酵结果显示,F126和F126-1菌株分别积累尿苷20.16g/L和24.52 g/L,同时分别积累了58.62 g/L和56.62 g/L的副产物乙偶姻。为了减少副产物乙偶姻的积累,在F126-1菌株中分别敲除乙偶姻合成代谢中的alsS和alsD基因。摇瓶发酵结果显示,F126-1△alsS和F126-1△alsD菌株分别积累尿苷0.48 g/L和 6.43 g/L。F126-1△alsD菌株在 5 L 发酵罐上积累尿苷 18.32 g/L,比 F126-1降低了 25.29%,积累乙偶姻18.56 g/L,下降了 67.22%。因此,直接阻断乙偶姻的合成不利于尿苷的积累。为了弱化丙酮酸的支路代谢,在F126-1菌株中过表达丙酮酸羧化酶基因pycA,F126-1△nprE:pycA菌株在摇瓶上能积累8.03g/L的尿苷;该菌株在5 L发酵罐上积累尿苷18.38 g/L,比F126-1下降了 25.04%,积累乙偶姻45.85 g/L,下降了 18.53%,pycA基因的过表达也能减少乙偶姻的积累,但不利于尿苷的合成。以F126-1为出发菌株,分别敲除udk和argF基因,构建了 F126-1△udk和F126-1△argF菌株。摇瓶发酵结果显示,F126-1△udk和F126-1△argF菌株分别积累尿苷9.07 g/L和12.46g/L,比F126-1分别提高了 3.54%和42.24%。5 L罐发酵结果显示,F126-1△udk和F126-1 △argF菌株分别积累尿苷23.68 g/L和28.55 g/L,前者尿苷产量与F126-1相比没有明显变化,后者提高了 16.45%。同时分别积累乙偶姻52.56 g/L和51.91 g/L,与F126-1分别下降了 7.11%和7.73%;综上所看,argF基因的缺失有利于尿苷产量的提高和副产物乙偶姻的减少。
吴鹤云[8]（2016）在《常压室温等离子诱变结合高通量筛选选育尿苷产生菌》文中研究指明尿苷广泛应用于食品、保健品、化妆品和医药行业,尤其作为多种抗病毒抗肿瘤药物的中间体,具有极其重要的医药价值。利用微生物发酵生产尿苷具有诸多优势,但国内尚无应用于工业化生产的高产菌株。解除氨甲酰磷酸合成酶的反馈阻遏和反馈抑制是尿苷能够大量积累的关键,因此诱变筛选尿苷酸结构类似物突变株是一种选育尿苷产生菌的有效方法。此外,为了提高筛选效率,本文对尿苷产生菌的高通量筛选进行了系统研究。首先建立了常压室温等离子（ARTP）诱变和高通量筛选（HTS）的方法:确立了 ARTP作用的时间,摸索出了用96孔微孔板培养枯草芽孢杆菌的培养基和培养条件,并建立了用酶标仪高通量检测发酵液中尿苷浓度的方法。以尿苷·产生菌B.subtilis TD131为出发菌,经ARTP处理以后,以不同浓度不同种类的尿苷酸结构类似物作为初筛手段,逐步筛选抗尿苷酸结构类似物突变株,再利用高通量筛选的方法筛选出其中的尿苷高产菌。最终获得了四株尿苷产量显着提高且产量性状能够稳定遗传的突变株,分别命名为5.subtilis A219,B.subt li A260,B.subtilis A566和B.subtilis F126。在未经发酵工艺优化的条件下,它们在5L发酵罐上发酵尿苷的最终产量分别为12 g/L,14.5 g/L,16 g/L和18 g/L,是出发菌株的3.4倍,4.1倍,4.5倍和5.1倍,具备工业化应用的潜力。将筛选到的尿苷高产菌中嘧啶核苷操纵子基因进行测序,通过和出发菌株进行序列比对,发现了氨甲酰磷酸合成酶大亚基上的两个突变位点,P1016L和E949*,这两个位点可能是氨甲酰磷酸合成酶的变构调控的关键位点。本研究首次将ARTP诱变结合高通量筛选的方法用于尿苷产生菌的选育,较传统的诱变筛选方法,此法省时省力,大大提高了筛选效率;找出了两个可能与氨甲酰磷酸合成酶变构调节相关的关键位点。高通量筛选方法的应用以及氨甲酰磷酸合成酶关键调控位点的发现,可以为以后的尿苷产生菌的选育提供借鉴和指导。
吴庆[9]（2016）在《解淀粉芽孢杆菌胞苷代谢途径分析与高效基因敲除系统构建的研究》文中指出胞苷,即胞嘧啶核苷,可用作功能性食品及核营酸类保健食品的生产原料,也用于合成抗病毒和抗肿瘤药物的中间体及饲料添加剂,用途广泛,需求量逐年增加。微生物发酵法是工业生产胞苷的主要方法,高产菌株是其关键因素,已有枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与解淀粉芽孢杆菌发酵产胞苷的研究报道。但目前国内胞苷高产菌株的发酵能力有限,受到多种因素的影响,而菌株细胞自身合成代谢网络的优化是提高胞苷发酵产量必须要解决的问题。同时,为使解淀粉芽孢杆菌胞苷代谢网络修饰更加快速高效,需建立方便易操作的基因敲除系统。论文主要从以下两个方面进行了研究。1、解淀粉芽孢杆菌胞苷合成代谢途径分析。（1）胞苷代谢网络整体分析。基于嘧啶生物合成代谢调控和胞苷代谢网络分析,提出了5种解淀粉芽孢杆菌胞苷生产菌育种策略,即提高嘧啶操纵子转录水平,强化胞苷合成代谢途径、增大磷酸戊糖途径向胞苷合成途径的分流量、提高胞苷合成前端代谢物PRPP的合成量、增强中心碳代谢流向胞苷合成途径和阻断胞苷降解途径等方法,选育胞苷高产菌株。（2）嘧啶操纵子在胞苷合成中的作用分析。确定首先改造解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子调控区域,研究其对胞苷合成的影响。操纵子调控区存在一个弱化调节蛋白PyrR,由pyrR基因编码。该调节蛋白通过作用于pyr操纵子非翻译区域的三段转录终止位点控制胞苷合成基因的表达与调控,但胞苷的过量合成与pyrR基因缺失影响尚不清楚。因此,可通过基因敲除技术,定向选育pyrR基因缺失菌株,研究其对解淀粉芽孢杆菌胞苷生物合成途径的调控机制。2、解淀粉芽孢杆菌高效基因敲除系统的构建。为实现解淀粉芽孢杆菌胞苷代谢网络的修饰改造,建立高效的基因敲除系统显得尤为重要。本研究构建了两个基因敲除载体系统,并对其敲除效率做了比较分析。（1）自杀型敲除载体pKS1-pyrR的构建。以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用PCR分别扩增pyrR基因的上、游同源序列,定向克隆至含卡那霉素抗性基因的温敏型载体pKS1上,构建自杀型敲除载体pKS1-pyrR,酶切、PCR验证与测序分析均证明pKS1-pyrR载体构建正确。将pKS1-pyrR载体转化宿主细胞,通过同源重组将靶基因替换。结果表明,该方法重组敲除效率较低、且有抗性基因片段残留,增加菌体负担。（2） CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建。首先构建基因敲除载体系统pHT01-Cas9-donor。在解淀粉芽孢杆菌pyrR基因的45f和181r区通过PAM定位选择合适的靶位点并合成sg RNA。改造pHT01质粒改造,构建质粒pHT01-Cas9。通过酶切酶连操作依次将RBS序列、RepA序列、p43启动子序列、sg RNA序列（45f/181r）和pyrR基因左右同源臂合并序列克隆至pHT01-Cas9载体中,酶切、PCR验证与测序分析均证明pHT01-Cas9-donor载体构建正确。（3）Cas9蛋白表达与pyrR基因诱导敲除。提取质粒pHT01-Cas9-donor,转化解淀粉芽孢杆菌,菌落PCR及酶切验证均表明pHT01-Cas9-donor载体已成功转化解淀粉芽孢杆菌。同时利用IPTG成功诱导Cas9蛋白表达。优化Cas蛋白表达条件,得出Cas9蛋白最优诱导条件为诱导温度30℃,IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为6h。结果表明,pHT01-Cas9-donor敲除系统中各元件均能在解淀粉芽孢杆菌中很好的工作。但在最优诱导条件下,尝试敲除pyrR基因,均未成功,分析原因可能是设计的靶点基因sg RNA未表现活性。（4）两种敲除系统的应用与比较分析。自杀型敲除载体系统和CRISPR-Cas9系统都可以对目标基因组进行定点编辑。自杀型敲除载体系统是传统经典方法,至今仍被广泛应用,但是对于解淀粉芽孢杆菌来说,其转化效率与重组效率较低,且很难将重组到基因组上的抗性基因再替换下来,会给将来工程菌株的生产应用带来麻烦,因此,需要进一步改进该敲除系统或找到另一种更好的替代方法。而CRISPR-Cas9敲除系统具有可供选择位点多、可同时编辑多个位点和识别域,载体构建更简单的特点,且属于无痕敲除,应用前景好。本研究中构建得到可在解淀粉芽孢杆菌中表达Cas9的敲除系统,说明该系统可以很好的发挥功能,但由于只设计了2个靶点基因,数量较少,结果表明sg RNA无活性,故需要进一步设计较多数量的sg RNA,来提高敲除的效率。
郭磊[10]（2015）在《嘧啶核苷产生菌的构建及发酵优化》文中进行了进一步梳理嘧啶核苷包括尿苷和胞苷,它们是RNA的组成成分,在一切生物体的生命活动及代谢过程中均占有重要地位。近年来,它们被用作生产抗病毒抗肿瘤药物的中间体,如碘苷（IDUR）、溴苷（BUDR）、氟苷（FUDR）,三磷酸胞苷（CTP）、阿糖胞苷（Ara-CR）、环胞苷（Cyclo C）、胞二磷胆碱（CDP-Choline）等,发挥出重大的医药价值。利用微生物发酵法生产嘧啶核苷具有诸多优势,但国内尚无应用于工业化生产的高产菌株。本文基于代谢工程理论对菌种的选育进行了研究,并采用统计学方法对发酵培养基进行了优化,最终使菌株嘧啶核苷积累量得以大幅提升,为工业化生产提供了借鉴和指导。以野生型枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168菌株为出发菌株,通过PCR技术扩增其基因组上胞苷脱氨酶编码基因cdd的上下游各约500 bp的同源臂,通过重叠PCR拼接后,与载体pKS1连接,构建出重组质粒pKS1 △cdd。将该质粒电转化入168菌株,利用质粒的温敏特性,通过同源重组敲除了cdd基因,阻断了胞苷向下代谢为尿苷的代谢流,构建出菌株Bacillus subtilis PYR1。该菌株具备积累两种嘧啶核苷的可能,为下一步菌种选育打下了基础。通过与天津大学化工学院代谢工程室合作,以菌株PYR1为受体菌株,构建了一系列的基因工程菌株。利用摇瓶发酵对这些菌株进行产苷性能测试,并考察每个关键基因的改造对菌株产苷的影响。结果主要如下：homm基因和pyrR基因的敲除使菌株对于嘧啶核苷的积累从无到有,但有较多副产物尿嘧啶的积累；p咖基因和nupC基因的敲除进一步提高了嘧啶核苷的积累量,尿苷产量提高了1.43倍,胞苷产量提高了0.27倍,且副产物尿嘧啶的积累量降低了46.9%；野生型和突变型prs基因的过表达均对菌株产嘧啶核苷具有正影响,虽然胞苷积累量提升幅度不大,但尿苷积累量分别提高了31.93%和74.79%,后者效果优于前者,此外,副产物尿嘧啶积累量极少；pyrAB基因的定点突变增大了嘧啶合成通路,尿苷产量提高了76.44%,胞苷产量提高了16.22%。这些工作也明确了后续菌种选育的任务和方向。通过对发酵结果各项参数的比较,筛选出一株性能良好的菌株PYR5,以此为出发菌株,进行下一步的工作。以尿苷产量为响应值,用响应面法对菌株PYR5产嘧啶核苷的发酵培养基进行了优化。首先,通过PB实验确定了对产苷影响显着的三个因素：酵母粉、豆粕水解液和谷氨酸钠。然后,利用最陡爬坡实验逼近响应面分析的最佳区域；最后,通过中心复合实验和响应面分析确定了三个显着因素的最佳浓度：酵母粉25.6g/L,谷氨酸钠25.2 g/L,豆粕水解液40.9 mL/L,此时尿苷产量的预测值为13.76g/L。通过模型验证实验发现,尿苷的实际产量为13.52g/L,与模型预测值非常接近,并且比初始培养基提高了164.1%；胞苷产量为0.78g/L,提高了73.33%。此外,在优化的培养条件下,菌体生物量、葡萄糖消耗量、葡萄糖转化率及单位菌体产苷量均大幅度提升,说明此条件更适于菌体的生长及产苷。
二、嘧啶核苷类物质乳清酸产生菌的选育（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、嘧啶核苷类物质乳清酸产生菌的选育（论文提纲范文）
（1）中国被毛孢高产核苷菌株的选育及关键酶表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 冬虫夏草菌中国被毛孢研究进展 |
| 1.3 原生质体技术研究进展 |
| 1.4 菌株选育 |
| 1.4.1 ARTP诱变 |
| 1.4.2 EMS诱变 |
| 1.4.3 复合诱变 |
| 1.5 中国被毛孢代谢途径 |
| 1.5.1 中国被毛孢代谢途径研究进展 |
| 1.5.2 核苷代谢途径 |
| 1.6 本课题的选题背景与意义 |
| 1.6.1 立题背景和意义 |
| 1.6.2 本文主要研究内容 |
| 第二章 中国被毛孢原生质体的制备与再生 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 主要药品与试剂 |
| 2.2.4 培养基及溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 中国被毛孢ZJB18002的培养 |
| 2.3.2 中国被毛孢ZJB18002原生质体制备 |
| 2.3.3 原生质体形成过程及活力检测 |
| 2.3.4 原生质体再生 |
| 2.3.5 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 中国被毛孢ZJB18002原生质体制备影响因素 |
| 2.4.2 原生质体形成过程及活力的检测 |
| 2.4.3 中国被毛孢ZJB18002原生质体再生影响因素 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 中国被毛孢Hirsrtella sinensis ZJB18002 原生质体的诱变 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 出发菌株 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 主要药品与试剂 |
| 3.2.4 培养基与溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 分析方法 |
| 3.3.2 原生质体的制备 |
| 3.3.3 ARTP诱变 |
| 3.3.4 EMS诱变 |
| 3.3.6 突变株的生理生化鉴定 |
| 3.3.7 突变株的遗传学鉴定 |
| 3.3.8 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 中国被毛孢 Hirsrtella sinensis ZJB18002 深层发酵曲线 |
| 3.4.2 ARTP诱变 |
| 3.4.3 EMS诱变 |
| 3.4.4 复合诱变突变株稳定性实验 |
| 3.4.5 突变株的生理生化和遗传学鉴定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 突变菌株核苷代谢途径中关键酶的差异表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验菌株 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 主要药品与试剂 |
| 4.2.4 培养基与溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 总RNA提取 |
| 4.3.2 RNA质量检测 |
| 4.3.3 RNA反转录获得c DNA |
| 4.3.4 关键酶基因验证 |
| 4.3.5 实时荧光定量PCR |
| 4.3.6 实验数据分析 |
| 4.3.7 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 RNA的提取及质量检测结果 |
| 4.4.2 关键酶基因的挖掘 |
| 4.4.3 关键酶基因的异源表达 |
| 4.4.4 核苷代谢途径中关键酶基因表达分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 3 发明专利 |
| 学位论文数据集 |
（2）微生物体内游离胞嘧啶的检测及胞苷单磷酸水解酶的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 生物体中的胞嘧啶 |
| 1.1.1 胞嘧啶及其类似物的简介 |
| 1.1.2 生物体内胞嘧啶的生成方式 |
| 1.2 生物体内游离的碱基 |
| 1.2.1 游离碱基的生成方式 |
| 1.2.2 生物体内游离的胞嘧啶 |
| 1.3 生物体内的核苷酸 |
| 1.3.1 核酸及核苷酸简介 |
| 1.3.2 生物体内核苷酸的合成及分解代谢 |
| 1.3.3 CMP及 dCMP的合成及分解代谢 |
| 1.4 胞嘧啶作为核苷类抗生素合成的前体 |
| 1.4.1 核苷类抗生素简介 |
| 1.4.2 几种代表性核苷类抗生素简介及研究进展 |
| 1.4.3 核苷类抗生素中的胞嘧啶前体 |
| 1.5 研究的内容及目的 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要仪器及型号 |
| 2.1.5 培养基及化学试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种培养及保藏 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 链霉菌总DNA少量提取(Vazyme公司细菌DNA提取试剂盒) |
| 2.2.4 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.5 DNA酶切、回收与连接 |
| 2.2.6 大肠杆菌钙转感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 大肠杆菌电转感受态细胞的制备 |
| 2.2.8 大肠杆菌的钙转化法 |
| 2.2.9 大肠杆菌的电转化法 |
| 2.2.10 大肠杆菌与链霉菌的接合转移 |
| 2.2.11 基因置换突变株的筛选与确认 |
| 2.2.12 杀稻瘟菌素的液体发酵及发酵液纯化 |
| 2.2.13 发酵液中BS及其衍生物的高效液相色谱法(HPLC)分析 |
| 2.2.14 无细胞内溶物(CFE)的制备 |
| 2.2.15 CFE进一步处理用于检测胞嘧啶含量 |
| 2.2.16 LC-MS检测游离胞嘧啶 |
| 2.2.17 饱和硫酸铵沉淀无细胞抽提物活性组分 |
| 2.2.18 蛋白质LC-MS/MS鉴定 |
| 2.2.19 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.20 链霉菌中基因过表达 |
| 2.2.21 生物信息学分析 |
| 第三章 变铅青链霉菌体内游离胞嘧啶的发现及检测 |
| 3.1 WJ2?blsM(ZLN1)菌株的构建结果 |
| 3.2 Streptomyces lividans1326、WJ2及ZLN1 菌株发酵结果与分析 |
| 3.3 游离胞嘧啶LC-MS检测方法的建立 |
| 3.4 Streptomyces lividans CFE样品中游离胞嘧啶的检测结果 |
| 3.5 对其它几种菌体CFE中游离胞嘧啶的检测 |
| 3.6 本章总结与讨论 |
| 3.6.1 变铅青链霉菌体内游离胞嘧啶的来源及产生方式 |
| 3.6.2 变铅青链霉菌、金黄色葡萄球菌等细菌中产生游离胞嘧啶的可能原因 |
| 第四章 胞苷单磷酸水解酶的寻找 |
| 4.1 四种链霉菌的CFE水解活性实验 |
| 4.2 在S.lividans1326 中追踪水解活性组分 |
| 4.3 LC-MS/MS数据分析潜在CMP水解酶 |
| 4.4 变铅青链霉菌中的假定蛋白体内体外功能验证 |
| 4.5 天蓝色链霉菌中假定蛋白的分析 |
| 4.6 假定蛋白在变铅青链霉菌中过表达的准备工作 |
| 4.7 本章总结与讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要工作总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（3）常压室温等离子体诱变技术结合CRISPR/Cas9系统选育胞苷高产菌株的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胞苷性质及用途 |
| 1.2 胞苷的工业生产现状 |
| 1.3 胞苷生产菌种育种研究进展 |
| 1.4 胞苷合成途径及育种策略 |
| 1.5 育种技术 |
| 1.6 主要研究内容与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 应用常压室温等离子体诱变技术选育组氨酸营养缺陷型突变株 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 应用CRISPR/Cas9系统构建cdd基因缺失突变株 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 应用CRISPR/Cas9系统构建poxB基因缺失突变株 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 重组菌株发酵产胞苷能力研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及论文发表情况 |
（4）过表达pyrP基因与NupC基因对大肠杆菌发酵分泌胞苷的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胞苷 |
| 1.2 胞苷生产菌种选育的研究进展 |
| 1.3 微生物细胞胞苷转运与分泌的研究进展 |
| 1.4 大肠杆菌中胞苷的合成和分解途径 |
| 1.5 pyrP基因编码的尿嘧啶通透酶对胞苷分泌的影响 |
| 1.6 NupC基因编码的核苷转运蛋白对核苷分泌的影响 |
| 1.7 主要研究内容与意义 |
| 第二章 pyrP基因过表达载体的构建及其对胞苷发酵的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 NupC基因过表达载体的构建及其对胞苷发酵的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 pyrP基因和NupC基因串联表达载体的构建及其对胞苷发酵的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及论文发表情况 |
（5）乳清酸合成工艺研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 维生素概述 |
| 1.2 乳清酸概述 |
| 1.2.1 乳清酸简介 |
| 1.2.2 乳清酸来源 |
| 1.2.3 乳清酸与维生素的关系 |
| 1.2.4 乳清酸分析方法发展 |
| 1.3 乳清酸应用 |
| 1.3.1 乳清酸在医学上的应用 |
| 1.3.2 乳清酸衍生物在医学上的应用 |
| 1.3.3 其他领域应用 |
| 1.4 乳清酸的代谢以及代谢病 |
| 1.4.1 乳清酸代谢 |
| 1.4.2 乳清酸代谢病 |
| 1.5 乳清酸的获得方法 |
| 1.5.1 浓缩提取 |
| 1.5.2 生物合成 |
| 1.5.3 化学合成 |
| 1.6 合成路线选择 |
| 1.7 研究内容及课题意义 |
| 1.7.1 原工艺存在的问题及研究内容 |
| 1.7.1.1 存在的问题 |
| 1.7.1.2 研究内容 |
| 1.7.2 课题意义 |
| 第二章 实验部分 |
| 2.1 主要原料以及试剂 |
| 2.2 主要实验仪器与设备 |
| 2.3 定性和定量分析 |
| 2.3.1 定性分析 |
| 2.3.2 定量分析 |
| 2.4 典型操作 |
| 2.4.1 缩合反应 |
| 2.4.2 溴化环合 |
| 2.4.3 消除酸化 |
| 2.4.4 精制 |
| 第三章 马来酰脲合成工艺研究 |
| 3.1 反应机理分析 |
| 3.2 马来酰脲合成工艺优化 |
| 3.2.1 质子酸的种类的影响 |
| 3.2.2 对甲苯磺酸用量的影响 |
| 3.2.3 反应时间和温度的影响 |
| 3.2.4 马来酸酐与尿素摩尔比的影响 |
| 3.2.5 马来酰脲在溶剂乙酸中的流动性及稀释剂的选择 |
| 3.2.6 溶剂乙酸的套用 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 溴化环合反应工艺研究 |
| 4.1 溴化环合反应机理分析 |
| 4.2 溴化环合反应工艺优化 |
| 4.2.1 氢氧化钠用量的影响 |
| 4.2.2 水量的影响 |
| 4.2.3 摩尔比的影响 |
| 4.2.4 反应温度和时间的影响 |
| 4.2.4.1 反应进程跟踪 |
| 4.2.4.2 反应温度和时间 |
| 4.2.5 冰乙酸对溴化反应的影响 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 消除酸化反应工艺研究 |
| 5.1 反应机理分析 |
| 5.2 消除反应工艺优化 |
| 5.2.1 氢氧化钠浓度的影响 |
| 5.2.2 反应温度的影响 |
| 5.2.3 反应时间的影响 |
| 5.3 酸化过程的工艺优化 |
| 5.3.1 加酸方式和温度 |
| 5.3.1.1 乳清酸钠水溶液加到盐酸中 |
| 5.3.1.2 盐酸加到乳清酸钠水溶液中 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 溴化环合/消除酸化的“一锅法”尝试 |
| 6.1 “一锅法”反应优化 |
| 6.1.1 “一锅法”的实施方法 |
| 6.1.2 “一锅法”存在的问题 |
| 6.1.3 “一锅法”问题的解决 |
| 6.2 “一锅法”小结 |
| 第七章 精制过程工艺研究 |
| 7.1 精制过程工艺优化 |
| 7.1.1 碱种类的影响 |
| 7.1.2 氨水用量的影响 |
| 7.1.3 活性炭用量的影响 |
| 7.1.4 脱色时间的影响 |
| 7.1.5 水量的影响 |
| 7.2 小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 中间体及目标产物的表征 |
| 附录A.1 马来酰脲核磁谱图 |
| 附录A.2 溴化物核磁谱图 |
| 附录A.3 乳清酸核磁谱图 |
| 附录A.4 乳清酸红外谱图 |
| 附录A.5 马来酰脲紫外光谱 |
| 附录A.6 溴化物紫外光谱 |
| 附录A.7 马来酰脲液相谱图 |
| 附录A.8 溴化物液相谱图 |
| 附录A.9 乳清酸液相谱图 |
| 附录A.10 溴化物热重图 |
| 附录B 固含量计算方法 |
| 附录C 比移值Rf计算方法 |
| 攻读硕士学位期间取得的相关科研成果 |
| 致谢 |
（6）代谢工程改造大肠杆菌制备尿苷（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 尿苷简介 |
| 1.1.1 尿苷的理化性质 |
| 1.1.2 尿苷的用途 |
| 1.2 尿苷的生产方法 |
| 1.2.1 RNA水解法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 微生物发酵法 |
| 1.3 嘧啶核苷的生物合成途径和代谢调控机制 |
| 1.3.1 尿苷产生菌 |
| 1.3.2 嘧啶核苷的从头合成途径 |
| 1.3.3 嘧啶核苷的补救合成途径 |
| 1.3.4 嘧啶核苷代谢调控机制 |
| 1.3.5 尿嘧啶的合成 |
| 1.3.6 前体物氨甲酰磷酸的合成及变构调节 |
| 1.3.7 前体物天冬氨酸的合成 |
| 1.3.8 前体物5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的合成 |
| 1.4 尿苷生产菌的育种策略及育种实例 |
| 1.4.1 尿苷生产菌的育种策略 |
| 1.4.2 尿苷菌种的选育实例 |
| 1.5 代谢工程 |
| 1.6 立题背景及研究内容 |
| 1.6.1 立题背景 |
| 1.6.2 本论文的主要研究内容 |
| 1.6.3 本论文的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 主要溶液 |
| 2.1.7 抗生素 |
| 2.1.8 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的小剂量提取 |
| 2.2.2 DNA的纯化回收 |
| 2.2.3 大肠杆菌/枯草芽孢杆菌基因组提取 |
| 2.2.4 大肠杆菌化学转化法感受态制备及转化实验 |
| 2.2.5 大肠杆菌电转化法感受态制备及转化实验 |
| 2.2.6 PCR扩增 |
| 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.8 质粒构建 |
| 2.2.9 gRNA质粒构建 |
| 2.2.10 CRISPR/Cas9基因整合方法 |
| 2.2.11 发酵液中尿苷浓度检测 |
| 2.2.12 尿苷工程菌的培养条件 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 大肠杆菌尿苷合成途径重构 |
| 3.1.1 嘧啶核苷操纵子整合 |
| 3.1.2 UR1菌株的摇瓶发酵结果 |
| 3.2 阻断尿苷降解 |
| 3.2.1 udk基因的敲除 |
| 3.2.2 udp基因的敲除 |
| 3.2.3 rihA/B/C基因的敲除 |
| 3.2.4 五株菌的摇瓶发酵结果 |
| 3.3 提高尿苷前体物的供应 |
| 3.3.1 pyrAA/AB基因过表达菌株构建 |
| 3.3.2 thrA基因的敲除的构建 |
| 3.3.3 prsA基因的过表达的构建 |
| 3.3.4 UR3、UR4和UR5的摇瓶发酵结果 |
| 3.3.5 L发酵罐培养 |
| 4 结论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 论文的创新点 |
| 4.3 论文的不足之处 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（7）代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产尿苷的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 尿苷简介 |
| 1.1.1 结构及理化性质 |
| 1.1.2 用途 |
| 1.2 尿苷的生产方法 |
| 1.2.1 RNA水解法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 微生物发酵法 |
| 1.3 嘧啶核苷的合成途径及调节机制 |
| 1.3.1 尿苷产生菌 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌嘧啶核苷的补救合成途径 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌嘧啶核苷的从头合成途径 |
| 1.3.4 枯草芽孢杆菌嘧啶核苷的代谢调控机制 |
| 1.3.5 前体物氨甲酰磷酸的合成及调节机制 |
| 1.3.6 前体物5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的合成及调节机制 |
| 1.3.7 副产物乙偶姻的合成及调节机制 |
| 1.4 尿苷生产菌育种策略及育种实例 |
| 1.4.1 传统诱变育种策略及原理 |
| 1.4.2 基因工程育种策略 |
| 1.4.3 国外育种实例 |
| 1.4.4 国内育种实例 |
| 1.5 立题背景及研究内容 |
| 1.5.1 立题背景 |
| 1.5.2 本论文的研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液 |
| 2.1.6 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 枯草芽孢杆菌小量DNA的提取 |
| 2.2.2 目的片段的扩增 |
| 2.2.3 重叠PCR |
| 2.2.4 DNA的回收及纯化 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 枯草芽孢杆菌化转感受态制作方法 |
| 2.2.7 枯草芽孢杆菌基因的无痕修饰方法 |
| 2.2.8 菌种保藏 |
| 2.2.9 发酵产尿苷的培养方法及分析检测方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 出发菌株 B.subtilisF126发酵结果 |
| 3.2 B.subtilisF126prs~(nlv)基因的表达及发酵结果 |
| 3.2.1 B.subtilisF126-1菌株的构建 |
| 3.2.2 prs~(nlv)基因的表达对尿苷发酵的影响 |
| 3.3 减少乙偶姻积累的相关改造 |
| 3.3.1 B.subtilisF126-1△alsS菌株的构建及发酵结果 |
| 3.3.2 B.subtilisF126-1△alsD菌株的构建及发酵结果 |
| 3.3.3 B.subtilisF126-1(△nprE::pycA)菌株的构建及发酵结果 |
| 3.4 B.subtilisF126-1△udk菌株构建及发酵结果 |
| 3.4.1 F126-1△udk菌株的构建 |
| 3.4.2 F126-1UR4菌株发酵结果 |
| 3.5 B.subtilisF126-1△argF菌株构建及发酵结果 |
| 3.5.1 敲除片段的构建 |
| 3.5.2 重组菌的筛选及验证 |
| 3.5.3 F126-1UR5菌株发酵结果 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（8）常压室温等离子诱变结合高通量筛选选育尿苷产生菌（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 尿苷简介 |
| 1.1.1 尿苷结构及理化性质 |
| 1.1.2 尿苷的用途 |
| 1.1.3 尿苷的分析检测方法 |
| 1.2 尿苷的生产方法 |
| 1.2.1 RNA水解法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 微生物发酵法 |
| 1.3 尿苷的生物合成途径和代谢调控机制 |
| 1.3.1 尿苷产生菌 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌中嘧啶核苷的从头合成途径 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌中嘧啶核苷的补救合成途径 |
| 1.3.4 枯草芽孢杆菌中嘧啶核苷的代谢调控机制 |
| 1.3.5 氨甲酰磷酸合成酶 |
| 1.4 尿苷产生菌的育种策略和育种实例 |
| 1.4.1 尿苷产生菌的育种策略 |
| 1.4.2 产尿苷菌种的选育实例 |
| 1.5 常压室温等离子(ARTP)诱变简介 |
| 1.5.1 ARTP诱变的原理 |
| 1.5.2 ARTP诱变方法的显着特点 |
| 1.5.3 ARTP的应用实例 |
| 1.6 高通量筛选技术在菌种选育中的应用 |
| 1.6.1 突变体库的建立 |
| 1.6.2 高通量培养 |
| 1.6.3 高通量分析检测技术 |
| 1.7 立题背景及研究内容 |
| 1.7.1 立题背景 |
| 1.7.2 本论文的研究目的和研究内容 |
| 1.7.3 本论文的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液 |
| 2.1.6 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ARTP诱变方法 |
| 2.2.2 高通量筛选尿苷酸结构类似物抗性突变株的方法 |
| 2.2.3 发酵生产尿苷的培养方法及分析检测方法 |
| 2.2.4 枯草芽孢杆菌基因组DNA的小量提取 |
| 2.2.5 目的基因的扩增 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.7 DNA的回收纯化 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 常压室温等离子诱变及高通量筛选方法的建立 |
| 3.1.1 出发菌株TD131生长曲线的绘制 |
| 3.1.2 ARTP对出发菌株TD131的致死率曲线的绘制 |
| 3.1.3 高通量快速检测尿苷浓度方法的建立 |
| 3.1.4 96孔板培养方法的确立 |
| 3.2 ARTP诱变结合高通量筛选选育尿苷高产菌 |
| 3.2.1 抗2-TU突变株(2-TU~r mutants)的筛选 |
| 3.2.2 抗6-AU突变株(6-AU~r mutants)的筛选 |
| 3.2.3 抗5-FU突变株(5-FU~r mutants)的筛选 |
| 3.2.4 筛选小结 |
| 3.3 所筛菌株的遗传稳定性检测 |
| 3.4 所筛菌株在5L罐上的发酵性能检测 |
| 3.5 所筛菌株嘧啶核苷操纵子的测序结果 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（9）解淀粉芽孢杆菌胞苷代谢途径分析与高效基因敲除系统构建的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胞苷的生产方法 |
| 1.2 胞苷生产菌种选育的研究进展 |
| 1.3 解淀粉芽孢杆菌的研究及应用概述 |
| 1.4 基因敲除技术 |
| 1.5 CRISPR-Cas介导的基因编辑工具 |
| 1.6 本课题研究的内容及意义 |
| 第二章 解淀粉芽孢杆菌胞苷合成代谢网络分析及育种策略 |
| 2.1 解淀粉芽孢杆菌胞苷生物合成途径 |
| 2.2 解淀粉芽孢杆菌胞苷合成代谢网络分析 |
| 2.3 解淀粉芽孢杆菌通过嘧啶操纵子结构分析 |
| 2.4 胞苷生产菌的菌种选育思路 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 以pyrR基因为敲除靶点的自杀质粒pKS1-pyrR的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 解淀粉芽孢杆菌CRISPR-Cas9敲除体系的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 CRISPR-Cas9敲除载体转化与Cas9蛋白表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及论文发表情况 |
（10）嘧啶核苷产生菌的构建及发酵优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 嘧啶核苷概述 |
| 1.1.1 结构及理化性质 |
| 1.1.2 用途 |
| 1.1.3 测定方法 |
| 1.2 嘧啶核苷的生产方法 |
| 1.2.1 RNA水解法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 微生物发酵法 |
| 1.3 嘧啶核苷的生物合成及代谢调节机制 |
| 1.3.1 枯草芽孢杆菌中嘧啶核苷的从头合成途径 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌中嘧啶核苷的补救合成途径 |
| 1.3.3 pyrR编码的阻遏蛋白介导的操纵子转录弱化调控 |
| 1.3.4 氨甲酰磷酸合成酶的变构调节 |
| 1.3.5 pyrG基因的转录弱化调控 |
| 1.3.6 UMP激酶 |
| 1.3.7 5’-核苷酸酶 |
| 1.4 发酵培养基优化策略 |
| 1.5 嘧啶核苷产生菌的育种策略及育种实例 |
| 1.5.1 育种策略 |
| 1.5.2 育种实例 |
| 1.6 立题背景及研究内容 |
| 1.6.1 立题背景 |
| 1.6.2 本论文主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液 |
| 2.1.6 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 枯草芽孢杆菌基因组DNA的小量提取 |
| 2.2.2 质粒DNA的小量提取 |
| 2.2.3 目的基因的扩增 |
| 2.2.4 DNA的酶切 |
| 2.2.5 DNA的连接 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.7 DNA的回收纯化 |
| 2.2.8 大肠杆菌化转感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.9 枯草芽孢杆菌电转感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.10 枯草芽孢杆菌发酵生产嘧啶核苷的培养方法及分析检测方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 Bacillus subtilis 168菌株cdd基因的敲除 |
| 3.1.1 同源臂的扩增 |
| 3.1.2 重组质粒pKS1△cdd的构建 |
| 3.1.3 cdd基因缺失突变株的构建 |
| 3.1.4 小结与讨论 |
| 3.2 嘧啶核苷基因工程菌的摇瓶发酵 |
| 3.2.1 hom和pyrR基因的敲除对菌株产苷的影响 |
| 3.2.2 pdp和nupC基因的敲除对菌株产苷的影响 |
| 3.2.3 野生型及突变型prs基因的过表达对菌株产苷的影响 |
| 3.2.4 pyrAB基因的定点突变对菌株产苷的影响 |
| 3.2.5 小结与讨论 |
| 3.3 响应面法优化发酵培养基 |
| 3.3.1 PB(Plackett-Burman)设计筛选影响产苷的显着因素 |
| 3.3.2 最陡爬坡实验寻找响应面分析中心点 |
| 3.3.3 利用CCD进行响应面分析 |
| 3.3.4 模型的验证 |
| 3.3.5 小结与讨论 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 研究生期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
四、嘧啶核苷类物质乳清酸产生菌的选育（论文参考文献）
- [1]中国被毛孢高产核苷菌株的选育及关键酶表达分析[D]. 徐哲文. 浙江工业大学, 2020(02)
- [2]微生物体内游离胞嘧啶的检测及胞苷单磷酸水解酶的相关研究[D]. 张丽娜. 上海交通大学, 2020(01)
- [3]常压室温等离子体诱变技术结合CRISPR/Cas9系统选育胞苷高产菌株的研究[D]. 王茹. 宁夏大学, 2020(03)
- [4]过表达pyrP基因与NupC基因对大肠杆菌发酵分泌胞苷的影响[D]. 马若霜. 宁夏大学, 2019(02)
- [5]乳清酸合成工艺研究[D]. 郝柿田. 河北工业大学, 2019(06)
- [6]代谢工程改造大肠杆菌制备尿苷[D]. 李国梁. 天津科技大学, 2018(04)
- [7]代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产尿苷的研究[D]. 袁辉. 天津科技大学, 2017(02)
- [8]常压室温等离子诱变结合高通量筛选选育尿苷产生菌[D]. 吴鹤云. 天津科技大学, 2016(07)
- [9]解淀粉芽孢杆菌胞苷代谢途径分析与高效基因敲除系统构建的研究[D]. 吴庆. 宁夏大学, 2016(02)
- [10]嘧啶核苷产生菌的构建及发酵优化[D]. 郭磊. 天津科技大学, 2015(02)