一、基因工程小鼠的命名法（论文文献综述）
金玉环[1]（2021）在《新疆荒漠环境典型短命植物小鼠耳芥（Arabidopsis pumila）快速生长与耐逆性机制》文中进行了进一步梳理近年来气候变化导致极端天气增多,全球人口不断增长给农业生产带来了前所未有的挑战,粮食安全是国家安全的重要基础。作物遗传改良能够促进粮食和营养安全,已经成为科学家关注的重要问题之一,但目前作物育种策略缺少足够的效率,还难以满足短期或长期的粮食生产需求,需要将传统育种、现代生物技术、基因组学研究与“speed breeding”（加速育种）相结合加速作物改良进程,帮助我们应对100亿人口粮食需求的挑战。基因组学能最大限度地发挥资源的有效利用、多样性、粮食产量和安全方面的作用,但需要在基因组和农艺性状水平上对尽可能多的种质资源进行鉴定,从而发掘和鉴定更多优良的基因资源将来应用于作物遗传改良。边际土地是保障我国粮食安全的战略后备耕地资源,我国新疆有3075.2万亩的边际土地,盐碱、沙性和干旱是主要的障碍因素。短命植物在新疆边际土地中广泛分布,起着防风固沙、保持水土、改善微生境、保护周边农田免受沙害等起着重要作用,因此对新疆尤其早春农业生物和生态环境的保护作出了重要贡献。开展短命植物适应环境的分子水平机理研究,为更好的合理利用和保护短命植物资源提供科学依据和理论支持,对未来作物育种、边缘土地的开发利用等有着重要的意义。小鼠耳芥（Arabidopsis pumila）是生长在古尔班通古特沙漠南缘荒漠地带的十字花科植物,表现出快速开花结果、结实量大、光合效率高和耐盐抗寒的特点,蕴藏着丰富的抗性基因资源。本论文研究以小鼠耳芥为研究材料,从生理与细胞水平、分子生物学角度等建立生物学研究体系,结合RNA-seq技术等层面探索其适应特殊生境的机制及抗性基因挖掘和育种利用价值。本论文研究主要研究内容和结果如下:1.小鼠耳芥组织培养与遗传转化体系的建立首先开展了组织培养实验,以幼嫩的根、下胚轴、叶片和叶柄为外植体,有效地在诱导培养基上诱导出愈伤组织和多个不定芽。诱导培养基为添加0.5 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤和0.1 mg/L萘乙酸的MS培养基。在同一培养基上,幼根、下胚轴、叶片和叶柄均可诱导愈伤组织,其中,幼根诱导率最高。进一步以生长4周龄幼苗的叶片和叶柄为外植体,以小鼠耳芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase 1）基因P5CS1为目的基因,潮霉素B为筛选抗生素,采用外植体预培养、感染、共培养等程序,研究了农杆菌GV3101介导的遗传转化方法。结果表明小鼠耳芥幼根、下胚轴、叶片和叶柄四种外植体均可以诱导形成愈伤和不定芽,其中,根外植体的愈伤组织诱导率最高,而下胚轴的愈伤组织诱导率最低。对叶片和叶柄进行农杆菌侵染,发现侵染所需最适宜的农杆菌浓度与侵染时间均不同,但在适宜浓度的农杆菌侵染下,都可以形成愈伤和不定芽。进一步运用花序侵染法对小鼠耳芥花序进行农杆菌侵染发现,在一定时间范围内适当延长侵染时间,可提高农杆菌的转化效率,当花序侵染时间为30 s时,筛选效率可以达到0.67%。2.筛选合适的内参基因合适的内参基因是实时荧光定量PCR（qRT-PCR）精确分析基因表达的重要前提,本研究鉴定了ACT1、ACT2、ALDH、EF1B、GAPDH、HAF1、LOS1、UBC35、UBQ9和UEP共10个候选内参基因,选择编码钾离子吸收渗透酶的KUP9作为验证基因。对小鼠耳芥进行了干旱、热激、冷和盐四种非生物胁迫,分别在0、3、6、12、24和48 h取样,以及七个不同的组织:根、下胚轴、子叶、莲座叶、茎、花和长角果,提取所有样品的RNA进行qRT-PCR试验。实验数据利用ge Norm、Norm Finder、Bestkeeper和Ref Finder 4个软件对10个内参基因的表达稳定性进行分析。综合排名表明:（1）不同组织中,合适的内参基因是ACT1和GAPDH;（2）10%PEG6000处理下,合适的内参基因是HAF1和UEP;（3）250 m M Na Cl胁迫处理,合适的内参基因是GAPDH和ACT1;（4）低温（4℃）胁迫处理,合适的内参基因是GAPDH和UBC35;（5）在高温（40℃）胁迫处理,合适的内参基因的是GAPDH和UBQ9。综合来看GAPDH和UBQ9是所有样本中最合适的内参基因组合。KUP9基因的表达特征进一步验证了筛选出的合适内参基因的稳定性,说明筛选的内参基因适合于基因表达的标准化。3.不同生长发育时期的RNA-seq分析小鼠耳芥在早春萌发以后迅速生长,统计自然生境下小鼠耳芥整个生长周期的表型变化。结果发现,萌发后一个月内株高和叶片数增加最明显,特别在抽薹期（Growth Stage 1,GS1）、始花期（GS2）、结荚期1（GS3）、结荚期2（GS4）、结荚期3（GS5）这5个时期表现出快速生长发育。半个月内形成幼苗到成苗的转变,从营养生长到开花结果、以及果荚增长的形态变化。接着选取GS1、GS2、GS3、GS4和GS5共5个生长时期的叶片开展RNA-seq分析。构建15个文库,测序产生694,576,138条raw reads和660,395,266条clean reads,总测序量达到99.06 G;相关系数和主成分分析发现,GS1与GS2这两个时期差异不显着,并且差异基因个数最少,其余组间差异非常显着。五个生长发育时期共鉴出29,994个差异表达基因。GO和KEGG富集分析,结果发现大多差异基因富集在光合作用、核糖体、生理节律、α-亚麻酸的新陈代谢、氧化磷酸化、类黄酮生物合成和芥子油苷生物合成等通路。其中GS3与GS2,GS4与GS3,GS4与GS4时期相比,生理节律相关的差异表达基因个数分别为24、27和24个;CO、GI和FT等15个光周期开花通路相关基因差异表达变化非常明显。此外,GO富集分析发现KT/HAK/KUP基因家族在整个结荚期明显富集,暗示它们在小鼠耳芥的生长发育调控中起着重要作用。4.钾离子转运蛋白KT/HAK/KUP基因家族的全基因组鉴定与分析利用小鼠耳芥全基因组序列鉴定出26个KUP基因,并从琴叶拟南芥（Arabidopsis lyrata）、叶芽鼠耳芥（Arabidopsis helleri）、盐芥（Eutrema salsugineum）和亚麻荠（Camelina sativa）等4种十字花科植物中分别鉴定了14、14、16和40个KUP基因,系统进化分析表明123个KUP基因分为4个亚组。物种内共线性分析表明小鼠耳芥KUP的复制基因以全基因组复制（WGD）/片段重复方式为主,纯化选择是该家族基因进化的主要动力。利用15个组织的RNA-seq数据分析表明,超过1/3的基因成员在幼根中高表达,其次是种子和果柄组织。5个不同生长时期的RNA-seq数据分析表明,很多KUP成员参与植株快速生长,在结荚期（GS4和GS5）明显上调表达,表明该家族成员可能在植株增高和发育调控过程中起到非常重要的作用。qRT-PCR分析ApKUP基因响应逆境胁迫的表达特征,结果表明:（1）ApKUP基因表达明显响应高盐（250 m M Na Cl）、干旱（10%PEG6000）、低温（4℃）和高温（40℃）胁迫,表现出复杂的变化特征;（2）缺钾时,除Ap HAK5、ApKUP1.2和ApKUP6.1上调表达,其余ApKUP基因成员下调表达;（3）50μmo/L的茉莉酸甲酯（Me JA）和1μmo/L的脱落酸（ABA）显着影响ApKUP家族在根中的表达水平;（4）1μmo/L甲基紫精（MV）胁迫显着影响ApKUP在根和子叶中的表达水平。胁迫表达结果表明,ApKUP基因的表达积极响应非生物胁迫,但是不同复制基因对之间存在表达差异,说明KUP基因在进化中具有功能上的保守和分化。综合起来,本研究建立了小鼠耳芥遗传转化方法,筛选出了用于qRT-PCR实验的内参基因;以RNA-seq为基础挖掘了小鼠耳芥转录水平上参与生长调控的差异表达基因及代谢通路,如光合作用和生理节律,以及多个耐逆相关基因,如P5CS和KUP基因家族成员。发现这些基因在生长发育过程中快速响应逆境胁迫而上调表达,可能是赋予小鼠耳芥适应新疆荒漠环境快速开花成熟的适应性机制。本研究建立的研究系统为突破边际土地的改良工程体系与农作物育种技术体系提供理论参考,挖掘的基因资源可用于植物的抗性基因工程育种,为加快作物育种策略提供理论基础,为研究和开发更多短命植物资源提供思路,将来为新疆农业生物环境的改良和作物的遗传改良做出贡献。
阮可悦[2]（2021）在《伪狂犬病毒基因组Tn5转座突变库的构建及其功能研究》文中研究表明伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种猪（主要传染源和自然贮存宿主）、牛、羊及其他多种动物以发热、（除猪以外的动物）奇痒为主要症状的急性传染病。其病原伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）属于疱疹病毒科,α-疱疹病毒亚科,病毒基因组含有70个基因,全长约143kb,GC碱基含量高达74%。目前对PRV基因组和一些重要基因的分子生物学已经有了一定的认识,但是庞大的病毒基因组中仍然有许多基因亟待深入研究。为了系统全面地分析PRV基因组功能,在本实验室构建的PRV JS-2012株感染性克隆p BAC-JS2012基础上,在体外将Tn5转座子转座入p BAC-JS2012中,并将转座后的克隆质粒电转入细菌中,挑取单克隆菌落,建立JS-2012株基因组的随机突变库。提取转座突变克隆质粒,通过测序分析确定转座突变位点。将突变克隆质粒转染Vero细胞,拯救突变病毒并分析突变病毒的生长特性。本研究通过体外转座技术结合抗性筛选获得了4000个JS-2012株基因组突变克隆。随机提取其中312个突变克隆的质粒并对其转座子的插入位点进行分析,已鉴定出249个重组质粒中转座子的插入位置,另有40个测序双峰结果我们推测有两个及以上的转座子插入到病毒基因组中。已鉴定突变位点的249个质粒结果表明,转座子以随机均匀的方式插入病毒基因组中,包括59个具有不同功能的基因和非编码序列区。将确定转座子插入位点的重组质粒转染Vero细胞后拯救病毒,共获得169个不同突变位点的病毒,覆盖46个基因。根据拯救病毒的结果,我们将PRV病毒基因分为三大类:20个必需基因、16个非必需基因、12个对病毒复制起重要作用的非必需基因。此外,我们发现UL14、UL13、UL42、UL41、UL9等基因突变病毒在Vero细胞上的病毒扩增速率变慢;US6（g D）基因突变株转染细胞后出现病变,但突变病毒不能继续传代等。在拯救的突变病毒中,我们发现UL9基因突变病毒在Vero细胞上可以稳定传代并且呈现大面积合胞体特征性病变,这与以往报道的HSV-1中UL9基因是必需基因的结果是不同的,因此本研究针对UL9突变株从体外生长特性和对小鼠的致病力两个方面分析了UL9突变病毒的生物学特性,结果表明,相较于亲本毒,UL9突变株在体外的增殖速度显着降低且失去对小鼠的致死能力。接种小鼠血清的PRV g B ELISA结果表明,UL9突变株可刺激机体产生抗体免疫反应。综上所述,本文利用Tn5转座子构建了PRV基因组突变体库,筛选到59个病毒基因的突变株,确定了48个病毒基因在PRV复制中的作用,制备了UL9多克隆抗体并分析了UL9突变株的生物学特性。这深化了对PRV基因功能认识,表明了不同基因插入突变后的功能有无缺失,且对于构建大片段DNA病毒的突变体库、推进病毒功能基因组学的研究、筛选病毒毒力及调控宿主免疫相关基因具有重要意义。
黄一帆[3]（2021）在《人类衍生细胞综合糖基化谱图 ——以HEK293为模式细胞的糖链预测研究》文中研究表明糖类与核酸、蛋白质、脂质并称为四大生物大分子。人体内糖基化修饰广泛参与包括信号传导在内的各项生理活动。糖类物质的代谢与受精过程、细胞分化、组织发育、免疫作用、神经系统的形成和细胞癌变等生命现象息息相关。细胞糖链结构的探索研究对理解糖链相关的生物代谢过程具有重要意义。与蛋白质和核酸相比,糖链结构复杂多变,这为糖链结构的鉴定增加难度。虽然此前预测糖链结构的相关研究降低了糖链鉴定的难度。然而这些研究仍然存在一些局限性,例如目前对于糖链结构预测的研究只停留于评估特定的糖基化修饰通路,如N-糖基化,缺乏对于整个细胞内错综复杂的糖基化修饰的全局预测。此外这类研究并未应用于人体细胞的糖基化水平分析。因此亟需开发一种更简便的分析工具,用于人体细胞糖链结构系统性的预测研究。近年来高通量测序（RNA-seq）技术逐渐成熟,利用基因转录数据进行代谢水平的预测成为可能。为了解决糖链分析研究领域的难题,本研究以HEK293为模式细胞,整合转录信息到糖基化代谢通路,将糖基化过程可视化,并探索利用转录信息预测糖链结构的新方法。本研究的目的是开发一种简单易懂的糖基化代谢通路可视化工具,构建鸟瞰式的评估体系,综合预测人类衍生细胞中糖基化基因转录水平差异对糖链结构的影响。主要研究结论如下:（1）本研究基于最新的文献报道收录951个糖基化相关基因,根据糖基化基因涉及的生物学功能分为30类,并绘制19类糖基化代谢谱图。进一步开发并构建了自动化绘图网络工具。该工具整合糖基化基因表达谱到代谢通路图中,使用箭头样式表示相关基因参与糖基化反应的详细信息,实现对糖链代谢过程的可视化,直观描述具体糖链结构的合成潜力。利用该分析工具发现HEK293细胞糖基化代谢通路图中的糖链结构与已报道的细胞糖基化能力基本一致。（2）在HEK293细胞的质谱和凝集素染色鉴定中,证实HEK293细胞能够完成多种糖基化修饰。在末端修饰糖链表位的研究中,证实代谢通路上转录丰度过低的糖基转移酶基因对糖链结构起到决定性作用。在O-糖合成途径相关的研究中发现预测结果高度拟合质谱鉴定的糖链结构种类,能够准确预测糖链合成的潜力。对人类衍生型细胞的糖基化基因表达数据库和已报道的糖链鉴定结果进一步分析,发现当预测阈值TPM为1时,本研究的预测工具能够广泛应用于人类衍生型细胞的糖链预测工作。（3）本研究使用凝集素染色技术对40株N-糖链合成缺陷的敲除细胞系组成的细胞库进行检测,证实凝集素染色分析能够捕捉到敲除细胞表面糖链结构的变化。研究发现表达高甘露糖型N-糖链的敲除细胞系表面的糖链表现出高度聚类,而且末端修饰结构中只有聚乳糖胺修饰异常上调。对其中7种具有代表性的N-糖合成相关基因缺陷型细胞系的质谱分析发现,生产高甘露糖型N-糖链的细胞系T-KO和MGAT1-KO的糖脂组分发生显着改变。通过对转录组数据的分析,发现T-KO中多个糖基化基因受到转录调控,并找到了T-KO细胞中表型发生改变的潜在原因:神经酰胺合成酶基因（CERS1）、透明质酸合成酶2基因（HAS2）、N-乙酰葡糖胺差向异构酶基因（RENBP）等转录水平显着上调。基于上述发现,本研究使用瞬时荧光定量PCR（RT-q PCR）验证了T-KO细胞中上述基因的转录上调。在随后的深入研究中发现,CERS1基因转录水平的上调增加了对应脂质底物的合成;HAS2的转录水平上调增强了细胞向胞外释放透明质酸的能力;RENBP转录水平的上调促进了Glc NAc转化为Man NAc的异构作用。结合T-KO细胞中N-糖链末端不能被修饰这一特征,本研究发现由于糖核苷酸底物UDP-Glc NAc不能被N-糖链利用而积累导致细胞压力。细胞通过适应性转录调控机制,上调HAS2、CERS1和RENBP等基因的转录水平,从而改变糖核苷酸底物的消耗途径,降低细胞内UDPGlc NAc或Glc NAc含量。（4）本研究将人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas,HPA）数据库中肝脏和小肠的转录组信息输入到糖基化代谢通路可视化工具中,证实了由于大量关键的糖基转移酶转录量低,糖基化过程受到限制。因此,肝脏细胞内O-糖种类较单一,以核心1结构及唾液酸修饰的结构为主。然而,在粘蛋白表达能力强的消化功能相关的器官小肠内,绝大多数糖基转移酶的高度表达是O-糖链结构种类丰富多样的主要原因。在37种人类组织器官O-糖相关基因的表达谱分析发现,在功能类似的器官中,如消化器官的转录模式趋近而聚类,揭示了O-糖链合成中关键糖基化酶蛋白的高度表达对消化道相关器官中O-糖链结构丰富度和复杂度的贡献。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas Program,TCGA）数据库和基因型组织表达数据库（The Genotype-Tissue Expression project,GTEx）中人类结肠样本的转录组测序数据的分析中,成功地预测出癌变过程中糖基化修饰水平的改变。本研究工作收录了涉及糖基化的基因,通过代谢谱图描绘人类细胞糖基化过程中的详细信息,证明了转录组信息能够用于糖链结构的预测。同时转录分析能够敏锐地捕捉到细胞内受到转录调控的糖基化基因,对细胞内糖链组分发生的改变作出解释。此外本研究的网络工具可用于人类衍生型细胞的糖基化水平的预测,一方面揭示细胞分化过程中糖基化基因表达谱的改变,从而形成与器官功能相适应的糖基化差异;另一方面能够预测如癌变等病理过程前后的糖链结构变化。这一研究有望在未来为疾病的治疗和生物标记物的发现提供新思路。
杨菊[4]（2020）在《原位GPR17二聚结构模型解析和功能分析》文中提出800多个G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors）构成了重要的膜蛋白受体家族。GPCRs几乎参与所有生理过程的调节。30%以上的药物是以GPCR作为靶点。GPCRs的典型特征是具有七个跨膜螺旋（TM1-TM7）,并具有高度保守的三级结构。实验证据表明,GPCRs可以形成二聚体和高阶寡聚体。目前,人们普遍接受C类GPCRs可以形成二聚体并且以二聚或寡聚的形式发挥其功能,但A类GPCRs形成二聚结构的分子机制和功能相关性还有待进步一确定。C类GPCRs通常具有较大的胞外N末端结构域,能够通过N末端形成二聚。与C类GPCRs不同的是,A类GPCRs的N末端相对较短且通常无结构。研究表明,很多A类GPCRs在细胞膜中存在二聚和寡聚。一些重组表达的A类GPCR已获得了二聚的晶体结构。但这些结构并不一定代表它们在生理条件下的四级排列。多种实验方法已用于研究GPCRs的二聚体结构以及如何在细胞膜中二聚化。生物化学的方只能对GPCRs二聚和寡聚进行简单的定性研究。相比之下,使用荧光的方法,不仅可以获得结构的信息,而且能够用于原位细胞环境的研究。荧光的方法方主要是基于能量转移技术（RET）。在众多能量转移技术中,FLIM-FRET通过测量荧光寿命来计算FRET效率,不受蛋白表达量的影响,且对供体发射渗漏、光漂白、受体直接激发等因素不敏感。因此,提供了荧光团之间更精确的距离信息。GPR17属于A类GPCRs,与肾脏、心脏和脑缺血性损伤疾病密切相关。尿嘧啶核苷酸（例如UDP-glucose）可以激活GPR17,从而抑制腺苷酸环化酶并激活磷脂酶C（PLC）。而且,UDP-glucose的长时间刺激可能下调GPR17的信号,与ERK1/2激活和GPR17受体的内化有关。为了评估GPR17是否形成二聚以及如何形成二聚。本论文首先通过His tag pull-down和Western发现天然组织和转染的细胞中GPR17都能形成二聚。然后,基于FLIM-FRET获得了细胞水平的GPR17分子间的距离信息,结果表明两个GPR17分子采取特定的排列方式形成同源二聚体。进一步结合理论计算和分子动力学模拟表征了 GPR17二聚体的结构。结构计算和实验分析确定了二聚界面主要涉及到TM5。TM5上的F229是GPR17二聚界面的关键氨基酸。两个分子之间的F229的相互作用与二聚形成密切相关。将F229位氨基酸突变成Ala或Cys时,能强制GPR17形成单体或二聚,但受体的表达量基本不变。功能分析显示,单体和二聚形式的GPR17具有不同的生物学功能。当229位Phe突变成Ala,GPR17形成单体后,激动剂刺激不能激活ERK1/2,受体也不能内化。相反,229位Phe突变成Cys,两个GPR17分子之间的Cys形成二硫键,使GPR17能形成同源二聚。同源二聚状态的GPR17,与野生型GPR17生物学功能一样,激动剂刺激能导致细胞内钙升高、ERK1/2激活和受体内化。在GPCRs的胞外loop引入标记,通过FLIM-FRET获得多对分子间的距离。以获得的分子间距离作为约束,通过建模获得GPCRs在原位细胞膜中的同源二聚结构。可以预想,这种方法可以用于表征细胞中其他重要膜蛋白的相互作用。很多GPCRs,通过生化或荧光的方法检测可能存在同源二聚或异源二聚,但是还没有原子分辨率的结构,可以使用该方法研究他们的同源/异源二聚体结构以及如何在细胞膜中二聚化。
袭恒豫[5]（2020）在《绿色气球菌噬菌体AVP与其裂解酶的生物学特性及对小鼠乳腺炎模型的实验性治疗》文中进行了进一步梳理绿色气球菌（Aerococcus viridans）为革兰氏阳性球菌,是一种重要的人畜共患病原菌,在环境中普遍存在,可以引起人和动物的多种感染甚至死亡。在兽医临床上,绿色气球菌可引起猪的脑膜炎、肺炎、尿路感染和关节炎等,此外,该菌还可引起牛临床和亚临床乳腺炎。但由于该菌与肠球菌和链球菌的形态及生化特征很相似,所以前期绿色气球菌多被误判为这两种细菌。近年来,由于鉴定方法的完善,越来越多的绿色气球菌被分离鉴定,且由于抗生素的长期不规范使用导致耐药菌株的不断出现,使该菌引起感染的治疗难度不断加大。噬菌体能够特异性的感染并杀死细菌,因此可作为细菌（特别是耐药性细菌）感染治疗的候选药物。噬菌体疗法是一种十分有前景的可以辅助甚至替代抗生素的候选疗法。目前,绿色气球菌感染的控制仍是以抗生素为主,尚未见其噬菌体及其用于感染治疗的相关报道。本研究首先从临床发病的猪场及奶牛场等分离并鉴定了14株绿色气球菌。以绿色气球菌AV-X1作为宿主菌,从污水中分离到首个感染绿色气球菌的噬菌体,并按照标准命名法将其命名为vBAviMAVP（简称AVP）。对其基本生物学特性做进一步研究:噬菌体AVP可在BHI固体双层平板上形成小而透亮的噬菌斑;透射电镜下呈等距、二十面体的头部和可收缩的尾部,表明该噬菌体属于肌尾噬菌体家族的一员;一步生长曲线显示噬菌体AVP的隐蔽期为10 min,潜伏期为15 min,爆发量大小约为139 PFU/cell;温度和pH值稳定性实验也表明该噬菌体具有较好的温度和pH耐受性;通过空斑法测得的裂解谱显示噬菌体AVP可以裂解现有14株气球菌中的8株。对噬菌体的全基因组进行测定和分析,表明噬菌体AVP的遗传物质为双链DNA,基因组全长为133 806 bp,G+C含量为34.51%。共165个假定开放阅读框,其中无任何已知的溶原、毒力或抗生素抗性相关基因,这为噬菌体AVP作为抗菌制剂提供了可能。通过与数据库中已知序列的比对和分析,确定ORF96为编码噬菌体AVP的裂解酶基因,并对裂解酶AVPL进行原核表达与纯化。体外活性测定表明AVPL在巴氏消毒的牛奶中有较好的杀菌活性。进一步对其3D结构和关键作用位点进行预测,以裂解酶LysGH15的Amidase结构域为模板预测得到了置信度为100%的裂解酶AVPL催化域的3D结构。根据预测的结构,对其可能的关键作用位点99E、159H和160V逐一进行定点突变为丙氨酸,后两个位点突变后AVPL的活性完全丧失,而99E位点突变后对其活性未造成影响,这说明159H和160V位点是裂解酶AVPL催化活性的关键作用位点。本文成功建立绿色气球菌感染引起的小鼠乳腺炎模型,对裂解酶AVPL和噬菌体AVP的体内治疗效果进行评价。结果表明,在乳腺内攻菌4小时后,每个乳腺给予单剂量5×106 PFU的噬菌体,即可起到有效的治疗效果,乳腺中的菌落数量减少,乳腺组织病理变化减轻,炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及髓过氧化物酶（MPO）活性也明显低于PBS处理组。同时,每个乳腺单次给予5×107 PFU的噬菌体24小时后,乳腺组织无明显病理变化或炎症反应,表明噬菌体AVP在体内应用时具有良好的安全性。而裂解酶治疗仅降低了乳腺中的菌载量,炎症反应并未得到减轻。综上所述,本研究分离并系统鉴定了国内外首株感染绿色气球菌的噬菌体,对其裂解酶进行了重组表达,并将其用于小鼠乳腺炎模型的实验性治疗,为利用噬菌体预防和控制耐药性绿色气球菌感染提供新的途径。
王淇[6]（2020）在《Cry1Ab13-1抗虫基因在玉米中的遗传转化及抗虫性鉴定》文中认为玉米是我国最重要的粮食作物和工业原料之一,我国对玉米的需求量也在与日俱增。因此提高玉米产量是当务之急,但玉米虫害问题一直是制约着玉米产量提高的重要因素,每年都会对我国玉米产量造成巨大影响,尤其以玉米螟所造成的损失特别严重。利用化学药剂防治虫害存在着污染环境,破坏生态系统等方面的缺陷,无法做到从根本上解决虫害问题。因此利用转基因技术创制新的抗虫玉米自交系和培育新品种就显得十分重要。本实验利用Cry1Ab13-1原核表达载体,通过无缝克隆技术,构建以抗除草剂基因Bar为筛选标记的真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1。以玉米自交系349、349052、349045、349049、90493、S3002、MJ-1、H299、W107、W108、宝A、宝B、宝C、宝D、宝E和郑58为受体自交系,采用花粉管通道法和超声波花粉介导法将含有真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1的质粒导入玉米受体中,对T1代转基因植株进行PCR初步检测,收获阳性植株果穗,在第二年种植T2代植株并进行常规PCR、Southern杂交、荧光定量PCR检测和室内外抗虫性鉴定,进一步培育成新的抗虫玉米自交系,其试验结果如下:1.从Cry1Ab13-1的原核表达载体上克隆得到Cry1Ab13-1基因并通过无缝克隆技术将Cry1Ab13-1基因连接到真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1上,成功构建以抗除草剂基因Bar基因为筛选标记的真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1。2.利用花粉管通道法以及超声波花粉介导法将真核植物表达载体PCAMBIA3301-Cry1Ab13-1导入16个受体玉米自交系中。在第二年种植,并对T1代进行除草剂筛选,检测植株约28800株,共筛选出159株,存活率0.552%。花粉管通道法获得T1代转基因阳性植株20株,转化率为7.5%,超声波花粉介导法获得T1代转基因阳性植株4株,转化率为5%。3.以Cry1Ab13-1基因作为探针,对T2代阳性株系进行Southern杂交检测,8个株系样品有阳性条带,其中LMA-1-1和LMA-6-2为多拷贝,其余为单拷贝且呈不规则的分布。证明Cry1Ab13-1基因已成功的整合在玉米基因组的不同部位。4.对Southern杂交检测为阳性的8个株系的苗期根茎叶部位进行荧光定量检测,Cry1Ab13-1基因的表达量在根系中表达量最大的株系是LMA-12-1,在茎中表达量最大的株系是LMA-1-2,在叶片中表达量最大的株系是LMA-6-4。不同的阳性株系之间,同一部位外源基因表达量不同,同一株系的不同部位表达量也不相同。5.室内抗玉米螟鉴定结果表明:喂食LMA-1-1和LMA-1-2两株系玉米叶片的玉米螟存活率与体重增长速度明显低于对照组LMA-1-CK;喂食LMA-6-1、LMA-6-2、LMA-6-3和LMA-6-4玉米叶片的玉米螟存活率明显低于LMA-6-CK的存活率;除LMA-6-2组外,其他3组玉米螟的体重增长速度明显低于对照组,其中LMA-6-1和LMA-6-4组的玉米螟体重基本不变。证明转Cry1Ab13-1基因的6个株系玉米具有抗玉米螟性,玉米螟在取食转Cry1Ab13-1基因的玉米后生长受抑制甚至死亡。6.室内抗黏虫鉴定结果表明:LMA-6-4组、LMA-9-1组和LMA-12-1组中未发现黏虫死亡,但在48小时内各试验组黏虫的体重增长的平均速度明显低于对照组。证明转Cry1Ab13-1基因的LMA-6-4、LMA-9-1和LMA-12-1株系玉米具有抗黏虫性,黏虫明显不愿意取食转Cry1Ab13-1基因的玉米。7.室外抗玉米螟鉴定结果表明:株系LMA-1-1的抗性水平为抗,LMA-1-2的抗性水平为高抗,而对照组LMA-1-CK的抗性水平为中抗;株系LMA-6-1、LMA-6-2、LMA-6-3、LMA-6-4中,除株系LMA-6-3的抗性水平为抗,其他均达到高抗,对照组LMA-6-CK抗性水平为中抗。各转化株系对玉米螟的抗性与对照组相比均明显提高,各转化株系抗性不同,且室内抗玉米螟性鉴定结果与田间抗玉米螟性鉴定结果基本一致。证明转Cry1Ab13-1基因的玉米抗虫性明显提高,具有良好的抗虫性。8.转Cry1Ab13-1基因的8个玉米株系LMA-1-1,LMA-1-2,LMA-6-1,LMA-6-2,LMA-6-3,LMA-6-4,LMA-9-1,LMA-12-1的抗虫性均明显提高,表现出优良的抗虫性。
胡佳[7]（2020）在《FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究》文中提出产肠毒素性大肠杆菌ETEC作为细菌性腹泻的主要病原菌,具有传播范围广、致病性强等特点,给畜牧业带来了巨大损失。ETEC的危害性源自于自身菌毛黏附素的定植功能以及肠毒素的毒害作用,本研究以致病菌ETEC本身作为菌株构建的宿主,利用Lpp’Omp A表面展示系统,将另一种类的黏附素展示到ETEC细胞表面,实现双黏附素共展示表达,并对其生物学特性及黏附保护作用进行评估,以期构建一种双重黏附能力的肠毒性大肠杆菌,为相应的ETEC疫苗或相关黏附抗原提供菌株基础。具体研究内容及相关结果如下:本试验构建了pQE-30-GFP报告质粒,通过对不同重组菌相对荧光强度的测定及显色所需时间的对比,筛选得到了含有Fan C黏附素的良好表达宿主菌BE311。为了增加宿主菌的黏附素黏附表达活性,本试验扩增了来自于E.coli K88黏附素基因fae G,利用over-lap PCR方法构建表面展示质粒p QE-30-Lpp’Omp A-Fae G-TC,将构建的质粒转化到宿主菌BE311中,通过阳性克隆的筛选及四半胱氨酸（TC）-双砷系统对特异性标记的Fae G-TC表达产物的鉴定,证实外源的K88黏附素被成功展示在BE311菌体表面;对重组菌进行生长特性测定和诱导表达的结果表明,外源蛋白的表达未给菌株带来生长压力,fae G在经IPTG诱导后,能够稳定表达。在疏水性实验及IPEC-J2细胞黏附实验中,重组菌B311-fae G分别表现出了更好的体外疏水性和对上皮细胞的特异性黏附能力。为了进一步探讨重组菌的在动物肠道中对病原性大肠杆菌的竞争拮抗能力,本试验在实验室原有的基础上,构建了两种特异性荧光标记的ETEC菌株,分别是红色荧光的E.coli K99-m Cherry与绿色荧光的E.coli K88ab-GFP,通过这两种标记的复合病原菌的联合攻毒,发现在攻毒后第5天,能够显着地增加大鼠炎性因子相关基因和蛋白的上调表达。以该攻毒模型为基础,本试验特异性比较了单黏附素Fan C（源自于野生菌株BE311）与双黏附素FanC-FaeG（来源于重组菌株BE311-Fae G）对攻毒大鼠的病原菌拮抗作用,即发酵制备并诱导表达得到相应的大肠杆菌菌体,调整菌悬液浓度为109 CFU/m L,采用辐照的方式处死后,分别添加到大鼠饮水中预饲5天,然后利用109 CFU的复合标记菌株进行灌胃攻毒,分别测定不同处理下的大鼠生长性能及胃肠道分段和粪便中的标记的E coli数量。结果表明,FanC-FaeG组与阴性对照组的大鼠在生长性能方面无显着性差异（P>0.05）;攻毒后的12 h,在十二指肠、空肠及回肠中E coli数量:FanC-FaeG组<Fan C组<阳性对照;攻毒24 h时,粪便中FanC-FaeG组<Fan C组<阳性对照。因此,相较于单黏附素组,重组菌的双黏附特性能够更为显着地减少病原菌标记菌株在小肠内的特异性黏附,有效缓解攻毒后大鼠受到的病原菌侵袭,起到健康保护效果。综上所述,本研究构建了一株FanC-FaeG双黏附素共展示表达ETEC菌株,该菌株能够稳定高效表达外源K88黏附素,并具有强于单黏附素野生菌的黏附能力,在大鼠小肠内能够优先占据特异性结合位点,从而抑制病原菌的黏附,起到肠道保护作用,为疫苗开发或肠道保护制剂的研究提供了多抗原菌株基础。
曹愿,岳秉飞,柳全明,范昌发[8]（2020）在《大小鼠模型命名方法与规则简介》文中研究指明近年来,随着生命科学以及生物医药工程技术的迅猛发展、基因编辑技术的突破,建立了越来越多的大小鼠模型动物,并广泛应用于基础研究中,如肿瘤学、传染病学、免疫等的研究。模型动物资源总量不断增加,模型动物命名不规范统一,给模型动物管理、国际交流和知识产权的保护带来一些困扰。本文以美国JAX实验室命名规则为基础,较详细的介绍了常见的模型动物（如大鼠、小鼠）的命名方法,并对不同类型模型的命名方法进行了举例说明,以期建立符合国际规范、便于国际交流的模型动物命名方法。
李剑勇[9]（2019）在《昆虫嗅觉受体膜蛋白的鉴定以及结构功能研究》文中研究表明在漫长的进化历程中,昆虫拥有了敏锐的嗅觉系统,以帮助它们进行觅食、交配、躲避天敌和寻找宿主等。蚊虫就是依靠嗅觉来寻找人类或者其它哺乳动物作为宿主来吸血,以完成交配后的产卵。在吸血的过程中会传播一系列病原体及疾病,比如疟疾、登革热、黄热病毒、西尼罗病毒、丝虫病和寨卡病毒等。本文以中华按蚊和果蝇为样本,重点分析嗅觉相关器官、离子型受体（IR）、嗅觉受体（OR）以及嗅觉信号通路分子机制。中华按蚊作为我国疟疾的主要传播昆虫,其嗅觉分子机制尚不明确。本文用扫描电子显微镜观察和统计中华按蚊触角上的嗅觉感受器种类、形态、分布和数量。发现我国中华按蚊拥有四种嗅觉感受器:毛形感受器、腔锥形感受器、锥形感受器和刺形感受器,它们形态各异,数量差异较大,在触角上的分布不同。昆虫对胺和乳酸的识别并不是依靠传统的OR,而是新型的嗅觉感知受体IR,而中华按蚊的IR研究尚显欠缺。通过冈比亚按蚊和果蝇已知IR同源序列比对,本文筛选出了35个中华按蚊IR基因,在系统进化上既体现出保守性也表现出多样性。其中,有7个IR表达于成年中华按蚊雌蚊触角上,这些IR具有保守的结构域,且呈现出不同的吸血前后差异性表达,它们可能调控蚊虫对宿主的定位。这些发现尚属首次。IR和OR均为昆虫嗅觉系统重要的受体蛋白,既承担着不同的任务又协同作用,但这类膜蛋白的活性表达仍是难题。通过筛选四种表达系统:大肠杆菌表达系统、昆虫—杆状病毒表达系统、大肠杆菌无细胞表达系统和小麦胚无细胞表达系统,联合表面活性剂、重力亲和层析、排阻色谱层析和离子交换层析法,建立了完备的活性膜蛋白OR42a和伴侣蛋白ORCO制备平台,并证明其兼容性。不仅促进了昆虫嗅觉机制的解析,也为膜蛋白研究提供新的思路。对OR42a和ORCO进行了二维结构鉴定,两者均主要由α螺旋组成,占比分别约71%和66%。由此推测,α螺旋对OR识别配体功能的维持至关重要。同时,在OR42a和ORCO中发现了20%左右的卷曲结构,这可能有利于保持膜蛋白的活性构象。基于正确的构象,首次在体外对OR42a和ORCO进行配体结合能力分析。发现OR42a和ORCO的复合物可以成功响应配体气味分子乙酸丙酯,而单独的OR42a或者ORCO不能引发配体响应,证实了OR型二聚体门控离子通道结构功效。酯类是人类皮肤表面挥发性气味之一,了解酯类在蚊虫和果蝇中的嗅觉识别机制,有助于蚊虫防治和进一步了解昆虫行为。
林琳[10]（2019）在《GⅡ.4型人诺如病毒在人肠道类组织中的增殖及转录组研究》文中研究指明人诺如病毒（Human Norovirus,HuNoV）是急性胃肠炎的主要病原体。自1972年首次被发现以来,HuNoV已在全球范围内引起广泛流行。尽管HuNoV的流行病学研究取得了巨大成功,然而关于HuNoV的致病机制及宿主抗病毒免疫反应的研究目前仍进展缓慢,究其原因就是因为缺乏体外细胞培养体系或合适的动物模型,因此构建新型的适宜于HuNoV增殖的体外培养体系将为研究HuNoV的致病机制及病毒与宿主互作的研究提供重要研究平台。三维细胞培养体系能够改变以往的细胞平面生长的局限性,能够让细胞立体生长与分化,最大程度上模拟出机体内组织结构及微环境。目前常见的细胞三维培养方法有气液界面培养法、基于支架的发酵罐旋转培养法、类组织培养法等。类组织培养依托机体组织在体分离的原代细胞、通过人工调控培养基及添加因子的种类培养出能够体外重构出机体组织结构,这一研究平台让目前不能体外培养的HuNoV、C组鼻病毒等重要致病性病原体的体外培养成为可能。因此本文首先通过搭建人肠道类组织的体外培养体系,进而研究不同基因型的HuNoV在人肠道类组织中的增殖能力,最后通过转录组学确定GⅡ.4型HuNoV感染人肠道类组织后宿主基因转录水平上的变化,分析GⅡ.4型HuNoV与人肠道类组织互作的主要通路和调控分子;具体研究内容如下:第一部分:人肠道类组织体外培养系统的建立通过临床获取手术后的新鲜成人空肠组织标本,分离出肠隐窝,接种于基质胶（Matrigel）中,优化调节不同信号通路外源可控因子（Wnt-3A、R-Spondin、Noggin、EGF等）的浓度,实现体外成人人肠道类组织的增殖与传代培养,形态学和免疫荧光鉴定肠隐窝干细胞的增殖和肠道类组织的形成及分化后的细胞类型。结果显示肠道类组织内的细胞与人体内肠道组织的结构形态十分类似,可见类组织细胞有极性;透射电镜显示肠道类组织的顶端绒毛朝向腔体,细胞与细胞之间存在完整的紧密连接,同时还可以观察到典型的杯状细胞的囊泡小体聚集在细胞核上方,以及内分泌细胞中富含激素的小泡聚集在细胞核下方;人肠道类组织经处理为单层细胞后加入分化培养液,撤掉可导致肠道干细胞不分化的Wnt-3A和等因子,在免疫荧光显微镜下可见分化后的单层细胞中有被PE染色的杯状细胞分散显示。随着时间的推移,细胞类型逐渐增多,逐渐分化出杯状细胞、肠细胞等各种肠道细胞类型。第二部分:GⅡ.4型HuNoV在人肠道类组织中增殖及转录组研究分别选取GⅡ.4、GⅡ.3、GⅡ.17型HuNoV阳性的儿童和成人急性胃肠炎患者标本接种人人肠道类组织单层细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒增殖情况。结果显示GⅡ.4型HuNoV在人肠道类组织中有稳定的扩增,且随着时间的推移扩增倍数逐渐增加,在接种后72小时达到高峰;儿童患者来源的GⅡ.4型HuNoV在肠道类组织单层细胞中扩增倍数约19倍（220,871拷贝/孔）显着高于成人患者来源的GⅡ.4型HuNoV（6.09倍）;儿童患者来源的GⅡ.3型和GⅡ.17型HuNoV在人肠道类组织单层细胞中增殖效率分别为2.55倍和11.52倍,明显低于GⅡ.4型HuNoV;在胆汁替代物甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）存在的条件下,GⅡ.17型HuNoV扩增倍数可提高到11.53倍。选取了两例不同空肠组织提供者的标本培养的人肠道类组织,分别感染同一儿童患者的GⅡ.4型HuNoV 阳性标本,利用已建立的Real-time qPCR方法检测病毒感染情况,并利用高通量测序技术对GⅡ.4型HuNoV感染前、后不同时间段（感染前0h及感染后1 h和72 h）的小肠类组织进行了转录组研究,筛选获得显着性差异表达基因。以0h作为对照组,共计5376个基因发生差异转录,其中49%基因表达上调,多数与免疫相关,如干扰素（interferon,IFN）和干扰素诱导基因（RIG-I,MDA5,IRF4,IFN Ⅲ和IFNR）等。差异表达下调的基因占51%,主要涉及到生长和代谢相关的基因,如胰岛素样生长因子,泛素结合酶等。GO生物功能富集分析表明GⅡ.4型HuNoV感染后对人肠道类组织中肠细胞的功能产生了明显的影响。根据KEGG数据库检索,本研究筛选到的差异表达基因富集到45个以上信号通路,主要为细胞凋亡、细胞周期、细胞结构、脂肪酸代谢及病毒感染后机体免疫应答相关的信号通路。尤其是Ⅲ型IFN基因,IFN-λ（IFN-λ 1/-2/-3）转录水平均发生了明显地上调,而Ⅰ和Ⅱ型IFN转录水平未发生明显改变,这一结果提示Ⅲ型IFN（IFN-λ）在HuNoV感染机体的早期可能发挥重要作用。此外,除了肿瘤坏死因子编码基因（TNF）表达稍微上调以外,其它与宿主凋亡相关基因在HuNoV感染后发生了下调,其中p53信号通路中的相关基因（CCNE1/2、CDK1/2、TP73、RRM2、APAF1、PPM1D 及 PMAIP1）在病毒感染后发生了微量或明显地下调。同时,细胞线粒体凋亡信号通路中可以介导细胞程序性死亡的一个重要调控因子-凋亡肽酶激活因子1（Apaf-1）的基因表达明显下调。另外,宿主抗凋亡成员Bcl-2基因的表达水平也发生了微量上调。这提示HuNoV感染宿主后通过下调凋亡相关基因和上调抗凋亡基因来抑制抑制宿主细胞凋亡发生,进而促进HuNoV的复制和增殖。本论文成功构建了人肠道类组织体外培养体系,实现了 GⅡ.4型HuNoV在人肠道类组织中的增殖;确定了 GⅡ.4型HuNoV感染人肠道类组织后的转录组情况,发现GⅡ.4型HuNoV通过调控宿主细胞代谢、抑制宿主细胞凋亡发生来促进GⅡ.4型HuNoV增殖,其中宿主细胞IFN-λ在抗HuNoV感染中起重要作用。本文研究结果将为深入阐明HuNoV感染致病及宿主抗HuNoV的天然免疫应答机制提供研究基础和科学参考。
二、基因工程小鼠的命名法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因工程小鼠的命名法（论文提纲范文）
（1）新疆荒漠环境典型短命植物小鼠耳芥（Arabidopsis pumila）快速生长与耐逆性机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 引言 |
| 2 国内外研究现状 |
| 2.1 我国粮食生产面临的主要问题 |
| 2.1.1 粮食生产和安全所面临的问题 |
| 2.1.2 未来我国提高粮食生产的方法 |
| 2.1.3 新疆农业生产的资源优势及面临的问题 |
| 2.1.4 农业生产与育种的“卡脖子”问题 |
| 2.2 新疆短命植物的研究进展 |
| 2.2.1 新疆短命植物资源 |
| 2.2.2 短命植物研究进展 |
| 2.3 植物应答环境的发育机制 |
| 2.3.1 植物的生长发育 |
| 2.3.2 钾离子对植物生长发育的影响 |
| 2.3.3 KT/HAK/KUP钾离子转运蛋白家族 |
| 2.3.4 植物响应盐胁迫的分子机制研究 |
| 2.4 小鼠耳芥研究进展 |
| 3 研究目的和意义 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 小鼠耳芥遗传转化体系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂和培养基配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠耳芥全基因组中鉴定出4 个ApP5CS基因 |
| 2.2 ApP5CS基因在小鼠耳芥不同组织中的表达特征 |
| 2.3 ApP5CS响应逆境胁迫的表达特征 |
| 2.4 ApP5CS1.1 基因的克隆和构建过表达载体 |
| 2.5 小鼠耳芥四种不同外植体的再生诱导 |
| 2.6 建立组织培养遗传转化体系 |
| 2.7 阳性植株鉴定和ApP5CS1.1 基因表达分析 |
| 2.8 小鼠耳芥花序侵染遗传转化方法的建立 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 小鼠耳芥基因表达分析内参基因的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 候选内参基因和靶基因的扩增特异性和扩增效率 |
| 2.2 候选内参基因的表达分析 |
| 2.3 候选内参基因表达稳定性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 小鼠耳芥不同生长发育时期的转录组测序 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 所用试剂 |
| 1.2 样品统计和收集 |
| 1.3 RNA-seq文库准备 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠耳芥快速生长时期的变化分析 |
| 2.2 转录组数据统计 |
| 2.3 转录组与参考基因组比对 |
| 2.4 基因表达定量 |
| 2.5 差异基因统计 |
| 2.6 差异基因富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 小鼠耳芥钾转运蛋白KT/HAK/KUP基因家族的鉴定及响应非生物胁迫的表达特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 小鼠耳芥KT/HAK/KUP基因家族同源序列搜索鉴定 |
| 1.2 系统进化分析 |
| 1.3 染色体位置和共线分析 |
| 1.4 基因结构和蛋白质保守结构域分析 |
| 1.5 不同组织转录组数据库 |
| 1.6 不同生长发育时期转录组数据库 |
| 1.7 盐胁迫转录组数据库 |
| 1.8 茉莉酸甲酯、脱落酸和甲基紫精胁迫处理和取样 |
| 1.9 缺钾、干旱和极端温度胁迫处理和取样 |
| 1.10 RNA提取、反转录和q RT分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 KT/HAK/KUP基因家族的鉴定及命名 |
| 2.2 系统进化分析 |
| 2.3 基因家族复制分析 |
| 2.4 基因结构、保守结构域和启动子分析 |
| 2.5 染色体定位和共线分析 |
| 2.6 ApKUP基因在不同组织中的表达分析 |
| 2.7 ApKUP基因在不同发育时期的表达分析 |
| 2.8 ApKUP基因在盐胁迫下的表达分析 |
| 2.9 ApKUP基因在MeJA(50μmo/L)胁迫下的表达分析 |
| 2.10 ApKUP基因在甲基紫精(MV,1 μmo/L)胁迫下的表达分析 |
| 2.11 ApKUP基因在ABA(1μmo/L)胁迫下的表达分析 |
| 2.12 ApKUP基因在10%PEG6000 胁迫下的表达分析 |
| 2.13 ApKUP基因在缺钾胁迫下的表达分析 |
| 2.14 ApKUP基因在高低温胁迫下的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 研究结论、创新点和展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（2）伪狂犬病毒基因组Tn5转座突变库的构建及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 伪狂犬病概述 |
| 1.1.1 伪狂犬病 |
| 1.1.2 伪狂犬病的简史及流行病学 |
| 1.1.3 伪狂犬病的跨物种传播 |
| 1.2 伪狂犬病病毒 |
| 1.2.1 病原学分类 |
| 1.2.2 病毒粒子结构 |
| 1.2.3 病毒基因组 |
| 1.3 疱疹病毒UL9基因的研究进展 |
| 1.4 中国伪狂犬病的诊断及防控现状 |
| 1.4.1 诊断方法 |
| 1.4.2 疫苗防控 |
| 1.5 转座子的简介及应用 |
| 1.5.1 转座子结构及机制 |
| 1.5.2 Tn5转座子的应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PRV基因突变体库的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株、质粒、细胞及实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 其他试剂配制方法 |
| 2.1.4 引物设计 |
| 2.1.5 体外转座 |
| 2.1.6 PRV突变体库的构建 |
| 2.1.7 转座子插入位点的鉴定 |
| 2.1.8 突变病毒的拯救及鉴定 |
| 2.1.9 突变病毒的体外生长特性 |
| 2.1.10 突变病毒对小鼠的致病力分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 转座子的插入位点鉴定 |
| 2.2.2 转座子在PRV基因组的分布情况 |
| 2.2.3 PRV基因组分类 |
| 2.2.4 突变病毒遗传稳定性鉴定 |
| 2.2.5 突变病毒的体外增殖特性 |
| 2.2.6 突变病毒感染小鼠的致病力分析 |
| 2.2.7 感染后存活小鼠血清中gB抗体水平 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 伪狂犬病毒UL9基因突变株的生物学特性分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂耗材 |
| 3.1.2 其他试剂配制方法 |
| 3.1.3 引物设计 |
| 3.1.4 UL9基因多克隆抗体的制备 |
| 3.1.5 UL9基因突变株的鉴定 |
| 3.1.6 UL9基因突变株体外生长特性分析 |
| 3.1.7 小鼠致病力分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pCold I-UL9原核表达载体构建 |
| 3.2.2 UL9截短蛋白的表达 |
| 3.2.3 UL9多克隆抗体的IFA鉴定 |
| 3.2.4 UL9基因突变株转座子插入位点的鉴定 |
| 3.2.5 间接免疫荧光和Western blot检测 |
| 3.2.6 vPRV-Tn5-UL9的体外生长特性 |
| 3.2.7 UL9基因突变株的小鼠致病性实验 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）人类衍生细胞综合糖基化谱图 ——以HEK293为模式细胞的糖链预测研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 细胞中的糖链 |
| 1.2.1 糖链的生物代谢过程 |
| 1.2.2 糖链的生物学功能 |
| 1.2.3 生物医药糖蛋白 |
| 1.2.4 N-糖基化修饰过程 |
| 1.2.5 O-糖基化修饰过程 |
| 1.2.6 糖脂 |
| 1.2.7 糖链Glc NAc末端修饰 |
| 1.2.8 SLC35C1与GDP-Fuc转运蛋白 |
| 1.2.9 HAS2 与透明质酸 |
| 1.3 鉴定糖链结构的常用方法 |
| 1.3.1 基于质谱技术的糖组学 |
| 1.3.2 基于凝集素染色技术的糖组学 |
| 1.3.3 糖链结构分析常用方法的评估 |
| 1.4 糖链研究相关的数据库工具及其标准 |
| 1.4.1 CAZy数据库 |
| 1.4.2 细胞代谢途径数据库 |
| 1.4.3 糖链符号命名法标准 |
| 1.5 哺乳动物细胞生产糖链结构的预测 |
| 1.6 细胞转录组测序技术 |
| 1.7 人类肾胚细胞HEK293 |
| 1.8 预测系统的统计学评估分析 |
| 1.8.1 二元分类器与混淆矩阵 |
| 1.8.2 ROC曲线 |
| 1.8.3 约登指数 |
| 1.8.4 F1 分数 |
| 1.9 立题依据及研究意义 |
| 1.10 本论文主要的研究内容 |
| 第二章 构建自动化绘制糖基化代谢通路网络工具 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 糖基化基因与涉及的代谢通路的信息来源 |
| 2.2.2 糖基化代谢通路图的绘制和处理 |
| 2.2.3 网络工具的搭建 |
| 2.2.4 转录丰度相关算法规定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 糖基化相关基因分类和收录 |
| 2.3.2 糖基化代谢通路途径的可视化绘制及转录信息的整合 |
| 2.3.3 网络工具的使用 |
| 2.3.4 HEK293 细胞糖基化代谢途径的可视化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 对模式细胞HEK293 糖链预测的研究分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 细胞培养的材料与方法 |
| 3.2.2 质谱实验的材料与方法 |
| 3.2.3 凝集素染色的材料与方法 |
| 3.2.4 转录组分析 |
| 3.2.5 糖基化代谢反应数学模型的建立 |
| 3.2.6 大肠杆菌培养基配制 |
| 3.2.7 构建质粒相关的试剂配制 |
| 3.2.8 大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞的制备 |
| 3.2.9 敲除质粒构建通用步骤 |
| 3.2.10 CRISPR-Cas9 系统在HEK293 细胞中进行基因敲除 |
| 3.2.11 重组质粒构建的通用步骤 |
| 3.2.12 稳定整合c DNA到 HEK293 细胞 |
| 3.2.13 流式细胞术检测抗体结合的HEK293 细胞 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 质谱技术鉴定HEK293 细胞中糖链组分 |
| 3.3.2 基于凝集素染色糖组学鉴定HEK293 细胞中糖链组分 |
| 3.3.3 基因编辑操纵糖链结构的合成表达 |
| 3.3.4 HEK293 细胞中质谱鉴定的粘蛋白型O-糖链 |
| 3.3.5 粘蛋白型O-糖链生物合成途径预测的评估 |
| 3.3.6 预测系统最佳阈值的确定 |
| 3.3.7 O-糖链代谢通路的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 HEK293 细胞中高甘露糖型N-糖链调控的新发现 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞培养主要试剂、材料、仪器 |
| 4.2.2 质粒的构建 |
| 4.2.3 基因敲除 |
| 4.2.4 基因敲除细胞系及靶位信息 |
| 4.2.5 凝集素染色分析 |
| 4.2.6 质谱分析 |
| 4.2.7 聚类热图分析 |
| 4.2.8 转录水平分析 |
| 4.2.9 抑制剂处理 |
| 4.2.10 实时荧光定量PCR分析(RT-q PCR) |
| 4.2.11 测定HEK293 细胞分泌的透明质酸含量 |
| 4.2.12 液相色谱检测糖核苷酸 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 涉及N-糖链合成途径的基因缺陷的细胞库的分析 |
| 4.3.2 涉及N-糖链合成基因敲除的细胞系质谱组学分析 |
| 4.3.3 T-KO细胞中乳糖胺结构组分相对于野生型细胞上升 |
| 4.3.4 甘露糖苷酶-Ⅰ敲除细胞与野生型HEK293 细胞的转录组水平分析 |
| 4.3.5 敲除B3GNT5 基因验证N-糖链对糖脂组分的影响。 |
| 4.3.6 T-KO调控基因应对Glc NAc底物累积压力 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 GlycoMaple分析人类组织细胞糖基化水平 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 网络自动绘图工具可视化人类衍生细胞糖基化代谢途径 |
| 5.3.2 应用组织细胞的糖基化水平预测 |
| 5.3.3 使用GlycoMaple预测结肠癌变导致的糖链变化 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
（4）原位GPR17二聚结构模型解析和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 G蛋白偶联受体简介 |
| 1.1.1 G蛋白偶联受体的分类 |
| 1.1.2 G蛋白偶联受体的结构 |
| 1.1.3 G蛋白偶联受体的激活和功能 |
| 1.1.4 G蛋白偶联受体的配体 |
| 1.1.5 G蛋白偶联受体的寡聚 |
| 1.1.6 G蛋白偶联受体17 |
| 1.2 膜蛋白相互作用研究方法 |
| 1.2.1 生物化学方法 |
| 1.2.2 荧光光谱方法 |
| 1.2.3 生物物理方法 |
| 1.2.4 计算方法 |
| 1.3 FLIM-FRET |
| 1.3.1 荧光基本知识 |
| 1.3.2 荧光寿命 |
| 1.3.3 荧光寿命成像技术 |
| 1.3.4 荧光共振能量转移 |
| 1.3.5 荧光寿命成像-荧光共振能量转移 |
| 1.4 本论文研究的目标与任务 |
| 第2章 细胞水平GPR17同源二聚结构的解析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试剂、耗材和仪器 |
| 2.2.2 基本生化和细胞实验方法 |
| 2.2.3 生化实验方法检测膜蛋白二聚 |
| 2.2.4 多位点荧光标记GPCR |
| 2.2.5 FLIM-FRET的测量 |
| 2.2.6 二聚结构建模 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 生化实验方法检测GPP17二聚结果 |
| 2.3.2 多位点荧光标记GPCRs结果 |
| 2.3.3 FLIM-FRET测量结果 |
| 2.3.4 二聚结构建模结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 GPR17能形成同源二聚和高阶寡聚 |
| 2.4.2 Split-GFP能有效对GPR17进行多位点荧光标记 |
| 2.4.3 两个GPR17分子采取特定的排列方式形成同源二聚体 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 GPR17同源二聚功能的分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试剂、耗材和仪器 |
| 3.2.2 突变结构验证 |
| 3.2.3 突变体FLIM-FRET测量 |
| 3.2.4 细胞水平cAMP水平的检测 |
| 3.2.5 细胞内钙变化的检测 |
| 3.2.6 ERK1/2激活的检测 |
| 3.2.7 GPR17内化的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GPR17突变结构表达检测结果 |
| 3.3.2 细胞水平cAMP水平的检测结果 |
| 3.3.3 细胞内钙变化的检测结果 |
| 3.3.4 ERK1/2激活的检测结果 |
| 3.3.5 GPR17内化的检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 TM5上的F229是GPR17形成同源二聚体的关键氨基酸 |
| 3.4.2 氨基酸的突变可以强制GPCR形成单体或二聚 |
| 3.4.3 GPR17单体和二聚均能抑制cAMP形成 |
| 3.4.4 GPR17二聚介导了UDP-glucose刺激引起的Gαq信号通路的改变 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A: 激光共聚焦显微成像 |
| 附录B: 本课题使用的质粒和引物 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）绿色气球菌噬菌体AVP与其裂解酶的生物学特性及对小鼠乳腺炎模型的实验性治疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 绿色气球菌的研究进展 |
| 1.1 绿色气球菌的概述 |
| 1.2 绿色气球菌引起的感染 |
| 1.2.1 感染性心内膜炎 |
| 1.2.2 菌血症 |
| 1.2.3 尿路感染 |
| 1.3 绿色气球菌的耐药性 |
| 1.4 绿色气球菌在动物中的感染现状 |
| 第2章 噬菌体的研究进展 |
| 2.1 噬菌体概述 |
| 2.2 噬菌体作为抗菌生物制剂的应用 |
| 2.2.1 噬菌体在医学临床中的应用 |
| 2.2.2 噬菌体在农业生产中的应用 |
| 2.2.3 噬菌体在食品安全防控中的应用 |
| 2.2.4 噬菌体疗法的限制与缺点 |
| 第3章 噬菌体裂解酶的研究进展 |
| 3.1 裂解酶概述 |
| 3.2 裂解酶的应用 |
| 3.3 裂解酶的免疫原性与抗性 |
| 3.4 裂解酶应用面临的挑战 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 动物源性绿色气球菌及其噬菌体的分离鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.1.4 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绿色气球菌的分离与鉴定 |
| （1） 菌株的分离和纯化 |
| （2） 绿色气球菌的鉴定 |
| 1.2.2 绿色气球菌噬菌体的分离与纯化 |
| 1.2.3 绿色气球菌噬菌体的一般生物学特性 |
| （1） 噬菌体AVP的透射电镜观察 |
| （2） 噬菌体核酸类型鉴定 |
| （3） 噬菌体裂解谱的测定 |
| （4） 最佳感染复数（MOI）测定 |
| （5） 一步生长曲线 |
| （6） pH值及温度稳定性 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 绿色气球菌的分离鉴定 |
| 1.3.1.1 绿色气球菌的分离与纯化 |
| 1.3.1.2 绿色气球菌的鉴定 |
| 1.3.2 噬菌体AVP的分离、纯化及一般生物学特性 |
| 1.3.2.1 噬菌体AVP的分离与纯化 |
| 1.3.2.2 噬菌体AVP的一般生物学特性 |
| （1） 透射电镜下噬菌体AVP 的形态 |
| （2） 噬菌体AVP的核酸类型 |
| （3） 噬菌体AVP的裂解谱 |
| （4） AVP的最佳MOI |
| （5） AVP的一步生长曲线 |
| （6） AVP的稳定性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 噬菌体AVP的全基因组序列测定和分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株及噬菌体 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 噬菌体AVP的扩增和浓缩 |
| 2.2.2 噬菌体AVP的核酸提取和测序 |
| 2.2.3 噬菌体AVP全基因组的比对分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 噬菌体AVP的扩增和浓缩 |
| 2.3.2 噬菌体AVP核酸的提取 |
| 2.3.3 噬菌体AVP的基因组分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 重组裂解酶AVPL的原核表达及其体外活性测定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 主要菌株和质粒 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.1.6 主要菌株 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 裂解酶AVPL载体的构建、表达及纯化 |
| 3.2.1.1 AVPL载体的构建 |
| 3.2.1.2 AVPL的原核表达 |
| 3.2.1.3 AVPL的纯化 |
| 3.2.2 AVPL对宿主菌AV-X1的杀菌活性测定 |
| 3.2.3 宿主菌对AVPL的体外抗性 |
| 3.2.4 AVPL在牛奶中的杀菌活性 |
| 3.2.5 AVPL的3D结构的预测和关键作用位点的分析 |
| 3.2.5.1 AVPL的3D结构的预测 |
| 3.2.5.2 AVPL催化区关键作用位点的分析 |
| 3.2.5.3 突变体蛋白杀菌活性测定 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 AVPL的原核表达与纯化 |
| 3.3.2 AVPL的体外杀菌活性 |
| 3.3.3 宿主菌对AVPL的体外抗性测定 |
| 3.3.4 AVPL在牛奶中的活性 |
| 3.3.5 AVPL的3D结构的预测 |
| 3.3.6 AVPL的关键作用位点的分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 裂解酶及噬菌体对乳腺炎小鼠模型的实验治疗 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 主要菌株 |
| 4.1.5 实验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 小鼠乳腺炎模型的建立 |
| 4.2.2 AVPL对小鼠乳腺炎的治疗 |
| 4.2.3 AVP对小鼠乳腺炎的治疗 |
| 4.2.4 治疗效果评价 |
| 4.2.4.1 乳腺组织的菌载量和噬菌体含量变化检测 |
| 4.2.4.2 乳腺组织的病理学分析 |
| 4.2.4.3 MPO活性检测及炎性细胞因子测定 |
| 4.2.5 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 小鼠乳腺炎模型的建立 |
| 4.3.2 AVPL的体内杀菌活性 |
| 4.3.3 AVP的体内杀菌活性 |
| 4.3.3.1 乳腺中的菌载量 |
| 4.3.3.2 乳腺中的噬菌体含量变化 |
| 4.3.3.3 乳腺组织的病理学观察 |
| 4.3.3.4 乳腺组织中MPO活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 及在学期间所取得的科研成果 |
| 作者简介 ： |
| 攻读硕士期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
（6）Cry1Ab13-1抗虫基因在玉米中的遗传转化及抗虫性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 虫害对玉米的影响 |
| 1.2 Bt基因 |
| 1.3 玉米的遗传转化 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 构建真核植物表达载体 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Cry1Ab13-1基因在玉米中的遗传转化和分子生物学鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 转Cry1Ab13-1基因玉米的室内外抗虫检定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的危害 |
| 1.2 ETEC的毒力因子及致病机制 |
| 1.2.1 致病机制 |
| 1.2.2 黏附素 |
| 1.2.3 肠毒素 |
| 1.3 产肠毒素性大肠杆菌的防治 |
| 1.4 大肠杆菌表面展示的研究进展 |
| 1.4.1 基于外膜蛋白的展示系统 |
| 1.4.2 基于细菌表面附属物的展示系统 |
| 1.4.3 基于自转运蛋白的展示系统 |
| 1.5 研究内容及意义 |
| 第二章 ETEC表达宿主的筛选及黏附素双展示菌株的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和载体 |
| 2.2.2 试剂、工具酶及培养基 |
| 2.2.3 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 ETEC表达宿主的筛选 |
| 2.3.1.1 基于GFP的原核表达载体的构建 |
| 2.3.1.2 GFP转入不同大肠杆菌宿主 |
| 2.3.1.3 最佳表达宿主的菌株背景鉴定 |
| 2.3.2 应用表面展示技术构建双黏附素共表达ETEC菌株 |
| 2.3.2.1 重组质粒p QE-30-Lpp’Omp A-Fae G的构建 |
| 2.3.2.2 双黏附素重组大肠杆菌的建立 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 绿色荧光蛋白GFP的 PCR扩增结果 |
| 2.4.2 p QE-30-GFP的阳性克隆鉴定结果 |
| 2.4.3 重组质粒在ETEC及工程菌中的表达 |
| 2.4.4 不同宿主菌表达GFP的相对荧光值测定 |
| 2.4.5 BE311的菌株种属鉴定结果 |
| 2.4.6 BE311毒力因子的检测 |
| 2.4.7 表面展示体系相关基因的PCR的扩增结果 |
| 2.4.8 重组质粒的双酶切验证结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组菌株的黏附素表达及黏附特性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞 |
| 3.2.2 试剂及培养基 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 双砷-四半胱氨酸系统特异性检测 |
| 3.3.2 重组菌株生长特性研究 |
| 3.3.3 重组菌的诱导表达 |
| 3.3.4 重组菌表面疏水性测定 |
| 3.3.5 重组菌对猪小肠上皮细胞IPEC-J2的黏附研究 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 重组菌BE311-Fae G-TC的荧光显微镜观察 |
| 3.4.2 重组菌BE311-Fae G与野生菌BE311 的生长曲线比较 |
| 3.4.3 重组菌BE311-Fae G的黏附素诱导表达 |
| 3.4.4 重组菌BE311-Fae G与野生株的疏水性比较 |
| 3.4.5 重组菌BE311-Fae G对 IPEC-J2 细胞的黏附 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组菌株对ETEC体内拮抗模型的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株、载体及实验动物 |
| 4.2.2 试剂及培养基 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 E.coli K99-m Cherry-CRISPR/Cas的改造 |
| 4.3.2 实验设计 |
| 4.3.3 肠道的取样处理方法 |
| 4.3.4 ETEC标记菌株的检测方法 |
| 4.3.5 数据处理与统计分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 E.coli K99-m Cherry-p QE30 的抗性检测 |
| 4.4.2 E.coli K99-m Cherry-p QE30与E.coli K99-m Cherry-CRISPR/Cas的比较 |
| 4.4.3 E.coli K99-m Cherry-p QE30 的稳定性检测 |
| 4.4.4 荧光体系下E.coli K99-m Cherry-p QE30 活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 4.4.5 大鼠肠道内回收标记菌株的可视化区分 |
| 4.4.6 大鼠肠道内标记菌株的回收统计结果 |
| 4.4.7 ETEC攻毒后大鼠肠道内炎症因子的基因表达水平测定 |
| 4.4.8 ETEC攻毒后大鼠肠道内炎症因子的蛋白浓度测定结果 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 FanC-FaeG双展示重组ETEC菌株在大鼠体内对攻毒菌株侵染的保护性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株和动物 |
| 5.2.2 试剂及培养基 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 菌株准备 |
| 5.3.2 动物实验方法 |
| 5.3.3 肠道和粪便的取样处理方法 |
| 5.3.4 数据处理与统计分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 攻毒后对大鼠生长性能的影响 |
| 5.4.2 攻毒后大鼠的脾脏、肝脏变化 |
| 5.4.3 攻毒后大鼠粪便中标记菌株的回收统计 |
| 5.4.4 攻毒后大鼠各肠段中标记菌株的回收统计 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）大小鼠模型命名方法与规则简介（论文提纲范文）
| 1 命名体系 |
| 1.1 近交系和远交系 |
| 1.2 自发突变或诱导突变 |
| 1.3 转基因模型 |
| 1.4 基因敲除/敲入模型 |
| 1.5 其他类型模型 |
| 2 基因编辑鼠的一般简写方式 |
| 2.1 基因敲除 |
| 2.2 基因敲入 |
| 2.3 转基因 |
| 2.4 条件性敲除 |
| 3 不同类型的模型命名举例 |
| 4 总结 |
（9）昆虫嗅觉受体膜蛋白的鉴定以及结构功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 昆虫嗅觉 |
| 1.1.1 昆虫嗅觉概述 |
| 1.1.2 昆虫嗅觉器官 |
| 1.1.3 昆虫嗅觉分子机制 |
| 1.1.4 昆虫嗅觉对气味的识别谱 |
| 1.1.5 昆虫嗅觉系统的进化 |
| 1.1.6 昆虫嗅觉神经中枢 |
| 1.2 蚊虫嗅觉 |
| 1.2.1 蚊虫嗅觉在繁殖中的作用 |
| 1.2.2 蚊虫嗅觉相关蛋白质 |
| 1.3 蚊虫的吸血行为 |
| 1.3.1 蚊虫选择吸血宿主 |
| 1.3.2 影响蚊虫选择宿主的外源因素 |
| 1.3.3 影响蚊虫选择宿主的内源因素 |
| 1.3.4 蚊虫的吸血行为和疾病的传播 |
| 1.4 果蝇嗅觉 |
| 1.4.1 果蝇嗅觉系统概述 |
| 1.4.2 果蝇OR的功能 |
| 1.4.3 果蝇OR的表达模式 |
| 1.4.4 果蝇嗅觉神经通路 |
| 1.5 本文选题依据与研究内容 |
| 第二章 中华按蚊离子型受体的鉴定 |
| 2.1 中华按蚊的饲养 |
| 2.1.1 基本条件 |
| 2.1.2 Ⅰ~Ⅱ龄幼虫 |
| 2.1.3 Ⅲ~Ⅳ龄幼虫 |
| 2.1.4 化蛹 |
| 2.1.5 成蚊 |
| 2.2 中华按蚊触角的超显微结构 |
| 2.2.1 扫描电镜样品制备 |
| 2.2.2 雌蚊触觉器官超微结构 |
| 2.2.3 雌蚊触角感受器超微结构 |
| 2.3 中华按蚊离子型嗅觉受体的鉴定 |
| 2.3.1 序列比对和筛选 |
| 2.3.2 中华按蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊IR进化关系 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 中华按蚊离子型受体在吸血前后的表达差异 |
| 3.1 离子型受体在中华按蚊雌蚊触角上的表达 |
| 3.1.1 雌蚊触角收集 |
| 3.1.2 RNA提取以及cDNA制备 |
| 3.1.3 PCR筛选表达于雌蚊触角的离子型受体 |
| 3.2 雌蚊触角离子型受体结构域分析 |
| 3.3 离子型受体在中华按蚊吸血前后的表达差异 |
| 3.3.1 中华按蚊吸血前后触角收集 |
| 3.3.2 引物设计 |
| 3.3.3 实时定量PCR |
| 3.4 中华按蚊离子型受体AsIR75k和 AsIR140 的鉴定 |
| 3.4.1 AsIR75k和 AsIR140 序列分析 |
| 3.4.2 AsIR75k和 AsIR140 分子进化分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 嗅觉受体膜蛋白的制备 |
| 4.1 膜蛋白表达体系的筛选和优化 |
| 4.1.1 大肠杆菌表达体系 |
| 4.1.2 昆虫-杆状病毒表达体系 |
| 4.1.3 小麦胚无细胞体系 |
| 4.1.4 大肠杆菌无细胞体系 |
| 4.2 大肠杆菌无细胞系统表达条件的优化 |
| 4.2.1 表达模板 |
| 4.2.2 表达温度 |
| 4.2.3 表面活性剂 |
| 4.3 大肠杆菌无细胞表达系统的兼容性 |
| 4.3.1 AtRGS1 表达模板 |
| 4.3.2 AtRGS1 的表面活性剂筛选 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 嗅觉受体膜蛋白的纯化以及结构功能研究 |
| 5.1 膜蛋白OR42a的纯化 |
| 5.1.1 亲和层析纯化OR42a |
| 5.1.2 亲和层析联合排阻色谱法纯化OR42a |
| 5.2 膜蛋白ORCO的纯化 |
| 5.2.1 亲和层析纯化ORCO |
| 5.2.2 SEC联合CEC纯化ORCO |
| 5.3 膜蛋白OR42a和 ORCO结构预测 |
| 5.3.1 RaptorX预测结构 |
| 5.3.2 Phyre预测结构 |
| 5.4 膜蛋白OR42a和 ORCO结构的实验测定 |
| 5.4.1 样品制备和测定 |
| 5.4.2 结构鉴定 |
| 5.5 膜蛋白功能的测定 |
| 5.5.1 石英晶体微天平检测配体结合 |
| 5.5.2 微热电泳仪检测配体结合 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附录A 35个中华按蚊离子型受体氨基酸序列 |
| 附录B 询问文件黑腹果蝇和冈比亚按蚊离子型受体ID |
| 附录C 果蝇嗅觉受体DNA和氨基酸序列 |
| 附录D 常用英文缩写 |
| 附录E 物种拉丁文及中文名称列表 |
（10）GⅡ.4型人诺如病毒在人肠道类组织中的增殖及转录组研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 人诺如病毒概述 |
| 1.1 HuNoV分子结构及流行病学特征 |
| 1.2 HuNoV的复制突变与重组 |
| 1.3 HuNoV的流行病学特征 |
| 1.4 HuNoV的传播与临床特征 |
| 2. HuNoV的体外培养 |
| 2.1 肠道三维类组织培养 |
| 2.2 人体肠道基本结构 |
| 2.3 肠道类组织培养体系的原理 |
| 2.4 肠道干细胞自我更新的信号通路 |
| 3. 诺如病毒与宿主互作的基础研究 |
| 3.1 诺如病毒感染与宿主抗病毒天然免疫应答 |
| 3.2 诺如病毒蛋白功能研究 |
| 4. 本文关注的科学问题 |
| 第一部分 人小肠类组织体外培养系统的建立 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、人肠道组织的获得 |
| 二、肠道类组织的形成 |
| 三、肠道类组织的电镜鉴定 |
| 四、肠道类组织的细胞类型鉴定 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GⅡ.4型HuNoV在人肠道类组织中增殖及转录组研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1 胆汁替代物GCDCA对GⅡ.4型HuNoV在人肠道类组织单层细胞中增殖的影响 |
| 2 不同GⅡ.4型HuNoV变异株在人肠道类组织单层细胞中增殖能力比较 |
| 3 GⅡ.4型HuNoV毒株不同时间点感染同一人肠道类组织单层细胞 |
| 4 GⅡ.17型HuNoV在不同供体人肠道类组织单层细胞中的增殖程度 |
| 5 GCDCA对GⅡ.17型HuNoV在人肠道类组织单层细胞中增殖效果比较 |
| 6 GⅡ.3型HuNoV在人肠道类组织单层细胞中的增殖结果 |
| 7 GCDCA对GⅡ.3型HuNoV在人肠道类组织单层细胞中增殖效果比较 |
| 8 GⅡ.3型和GⅡ.17型HuNoV在人肠道类组织单层细胞中加入GCDCA后增殖程度的比较 |
| 9 GⅡ.4型HuNoV在人肠道类组织单层细胞中增殖的荧光检测 |
| 10 RNA质检 |
| 11 测序数据前期处理结果 |
| 12 测序数据过滤 |
| 13 参考基因组比对 |
| 14 基因表达量分析 |
| 15 测序饱和度分析 |
| 16 样品间的相关性分析 |
| 17 样品基因表达谱的总体变化 |
| 18 差异基因的GO分析 |
| 19 差异表达基因的KEGG信号通路分析 |
| 20 病毒感染与细胞免疫和死亡相关的差异基因表达 |
| 21 病毒感染后组织细胞基因表达模式的分析 |
| 22 差异表达基因转录因子TF编码能力预测 |
| 23 Real-time qPCR验证感染后基因转录水平 |
| 24 Real-time qPCR验证IFNs和ISGs基因转录水平 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本文仍需要进一步解决的科学问题 |
| 综述 应用人类肠道类组织开展病毒研究 |
| 1. 肠道类组织的命名与定义 |
| 2. 肠道类组织/类器官的培养 |
| 3. 肠道类组织/类器官是体外研究肠道的病毒感染的模型 |
| 4. 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、基因工程小鼠的命名法（论文参考文献）
- [1]新疆荒漠环境典型短命植物小鼠耳芥（Arabidopsis pumila）快速生长与耐逆性机制[D]. 金玉环. 石河子大学, 2021(01)
- [2]伪狂犬病毒基因组Tn5转座突变库的构建及其功能研究[D]. 阮可悦. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]人类衍生细胞综合糖基化谱图 ——以HEK293为模式细胞的糖链预测研究[D]. 黄一帆. 江南大学, 2021(01)
- [4]原位GPR17二聚结构模型解析和功能分析[D]. 杨菊. 中国科学院大学(中国科学院精密测量科学与技术创新研究院), 2020(01)
- [5]绿色气球菌噬菌体AVP与其裂解酶的生物学特性及对小鼠乳腺炎模型的实验性治疗[D]. 袭恒豫. 吉林大学, 2020(08)
- [6]Cry1Ab13-1抗虫基因在玉米中的遗传转化及抗虫性鉴定[D]. 王淇. 吉林农业大学, 2020(03)
- [7]FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究[D]. 胡佳. 中南民族大学, 2020(08)
- [8]大小鼠模型命名方法与规则简介[J]. 曹愿,岳秉飞,柳全明,范昌发. 中国比较医学杂志, 2020(04)
- [9]昆虫嗅觉受体膜蛋白的鉴定以及结构功能研究[D]. 李剑勇. 国防科技大学, 2019(01)
- [10]GⅡ.4型人诺如病毒在人肠道类组织中的增殖及转录组研究[D]. 林琳. 中国疾病预防控制中心, 2019(02)