一、T-DNA转移研究进展（论文文献综述）
刘维妙[1]（2021）在《芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究》文中进行了进一步梳理花粉发育和授粉受精过程是开花植物完成有性生殖的重要环节。花粉发育异常会影响其功能的正常完成,进而影响后代的繁衍。授粉受精过程的顺利进行离不开花粉管正常的萌发和伸长。花粉管的萌发通常起始于成熟花粉粒的内壁。在花粉管快速伸长的过程中尤其需要细胞壁的快速扩展,众多细胞壁合成和重塑蛋白都参与其中。植物扩展蛋白（expansins,EXP）是一类重要的细胞壁重塑蛋白,可以与细胞壁的多糖组分结合,通过破坏细胞壁组分之间的非共价键引起植物细胞壁的松弛,促进植物细胞的生长。扩展蛋白基因家族被细分为四个亚家族,分别是EXPA（expansin A subfamily,扩展蛋白A亚家族）、EXPB（expansin B subfamily,扩展蛋白B亚家族）、EXLA（expansin like A subfamily,扩展蛋白类A亚家族）和EXLB（expansin like B subfamily,扩展蛋白类B亚家族）。虽然近年来扩展蛋白基因的功能被广泛研究,但是有关扩展蛋白基因在植物生殖发育阶段的功能以及有关EXPA和EXPB亚家族基因协调作用都还鲜有报道。本文以白菜‘矮脚黄’（Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis cv.Aijiaohuang）核雄性不育两用系ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’和黑芥（B.nigra cv.Z1411-02）以及甘蓝（B.oleracea cv.Jingfeng 1）为材料,对芸薹属三个二倍体基本种的扩展蛋白基因家族进行鉴定、进化和表达分析,明确三个基本种扩展蛋白基因家族的进化特征,为探究扩展蛋白基因在花粉和花粉管发育过程中的功能提供相关基础;由基因家族分析筛选到两个在白菜花粉发育后期和花粉管中高表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9,通过人工microRNA技术研究BrEXPB4和BrEXPB9在白菜花粉和花粉管发育中的功能;采用CRISPR/Cas9技术和过表达技术对两者在模式植物拟南芥中的同源基因AtEXPB5进行生物学功能的分析,并对与其在花粉和花粉管发育阶段具有冗余功能的AtEXPA4进行验证;通过酵母单杂交和双荧光素酶实验对AtEXPB5和BrEXPB4/9可能参与的转录调控路径进行研究。取得的主要结果与结论如下:（1）通过三步分析法,鉴定了芸薹属三个基本种（白菜、甘蓝和黑芥）的扩展蛋白基因家族,并经与模式植物拟南芥的系统发育、基因结构和理化特性的比较分析对它们的扩张模式和进化细节进行了研究,发现经过独立的进化,扩展蛋白基因家族在这三个基本种中的相似性较多,而分歧较少。通过比较启动子和编码序列的差异,发现在拟南芥和三个基本种的直系同源物之间存在显着正相关性。随后的表达分析表明这三个物种的扩展蛋白基因家族中存在广泛的功能差异,特别是在生殖发育过程中筛选到两个在白菜花粉和花粉管发育阶段强烈表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9。（2）通过烟草和洋葱瞬时表达体系进行亚细胞定位的结果表明,BrEXPB4和BrEXPB9都定位在细胞壁上,这与它们都具有信号肽结构的预测结果一致。通过荧光定量PCR和GUS基因报告系统进行的时空表达分析表明,BrEXPB4和BrEXPB9的表达模式也很相似,都是从单核花粉后期开始表达,并随着花粉的发育,表达量逐步升高,并且可以一直持续到花粉管中。（3）采用人工microRNA技术分别和同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9的表达,进而对它们的生物学功能进行鉴定。当它们被单独抑制时,对植株的生长发育并没有造成明显的影响。然而当它们的表达被同时抑制时,却造成约50%的花粉败育,并不能正常萌发。对败育花粉的细致观察显示,花粉的败育起始于单核花粉晚期,进一步使小孢子细胞质和花粉内壁降解,最终造成花粉败育和萌发异常。（4）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPB5定位在细胞壁上,并且其编码基因在成熟花粉粒和花粉管中强烈表达。然而,无论是敲除AtEXPB5还是过表达AtEXPB5都未对拟南芥的生长发育造成显着影响。结合前人相关电子表达谱的研究,发现仅有AtEXPA4在生殖发育阶段与AtEXPB5具有相似的表达模式。构建了AtEXPA4的敲除和过表达材料,并通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5的双突变体,观察发现在双突变体中,花粉管伸长的速度显着减缓,并且无论是AtEXPB5还是AtEXPA4都可以恢复双突变体花粉管伸长减缓的表型,说明AtEXPA4和AtEXPB5冗余地参与了花粉管的发育。（5）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPA4定位在细胞壁上,其编码基因不仅在生殖发育阶段表达,也在拟南芥的根中优势表达。主根长度和根分生区的测量结果表明,AtEXPA4对于主根的生长具有促进作用。（6）通过酵母单杂交和双荧光素酶实验表明,AtEXPB5的表达可由AtTDF1和AtAMS共同激活,而这一调控途径在白菜中并不保守。这说明AtEXPB5和BrEXPB4/9的生物学功能产生分化,并且参与不同的转录调控路径。BrEXPB4/9及其同源基因AtEXPB5在表达模式、功能和调控网络上显示出巨大差异说明在进化过程中,同源基因物也会产生功能和调控的变化。
何冬[2]（2021）在《影响水稻穗退化基因RBH1的克隆与功能分析及穗发育基因的定位》文中研究指明水稻是重要的粮食作物和植物基因组学研究的模式植物,发掘影响水稻穗发育的基因对解析穗形态建成具有重要的意义。水稻穗发育是受多基因调控的复杂生物学过程,而且是影响水稻产量的关键因素之一。本研究通过筛选T-DNA插入突变体库,鉴定了一个控制顶端穗发育的重要基因RBH1（Rice panicle Bale Head 1）,RBH1基因突变导致穗发育退化。遗传学和生化分析表明RBH1基因编码果胶裂解酶,介导了分生组织细胞活性氧的清除。为了发掘更多控制穗发育的关键基因,通过筛选EMS突变体共鉴定了10份穗突变体。采用Mutmap方法对其中的部分材料进行了基因初定位。本研究主要工作包括以下方面:1.RBH1基因的克隆和功能分析1.1 RBH1基因的克隆与表达模式分析本研究鉴定了2份RBH1基因的突变体,分别命名为rbh1-1和rbh1-2,它们表现为类似的突变缺陷,以rbh1-1为材料,开展详细研究。rbh1-1呈现出顶端穗缺陷,且部分顶端穗退化为细丝状。相比于野生型（wild type,WT）,rbh1-1二次枝梗数及每穗粒数均显着减少。在花器官原基形成时期,rbh1-1表现为明显的雄蕊雌蕊缺陷,穗生长速率明显降低,说明RBH1可能在穗发育阶段发挥功能。通过TAIL-PCR技术证实rbh1-1突变体中T-DNA元件插入在水稻10号染色体LOC＿Os10g31910基因内,LOC＿Os10g31910基因注释为果胶裂解酶。互补测验结果表明rbh1-1突变体背景的转基因阳性植株恢复野生表型。这一结果说明,LOC＿Os10g31910基因的突变导致了rbh1-1突变体穗退化的突变表型,LOC＿Os10g31910即为本研究中的RBH1基因。qRT-PCR结果表明RBH1是一个组成型表达的基因,在各组织中均有表达。原位杂交结果表明RBH1 m RNA在幼穗发育中逐渐积累,并且在小花原基形成时期达到峰值。1.2 RBH1基因的功能分析RBH1蛋白与百脉根Lj NPL蛋白及拟南芥中的PMR6蛋白序列相似而且包含相同的功能结构域。体外酶活实验证明RBH1原核诱导蛋白具有分解果胶的能力。免疫染色技术结果显示在rbh1-1穗组织中,果胶类物质含量明显高于野生型,说明野生型植株体内的RBH1蛋白具有降解果胶的功能。二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）染色结果确定,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）在rbh1-1突变体中过度累积;基因表达分析显示rbh1-1突变体中ROS清除相关基因出现明显上调表达。说明RBH1基因突变会导致ROS积累水平显着增加。使用不同浓度的H2O2作为外源施加的ROS处理中花11号（ZH11）愈伤组织,其中2 m M H2O2能够高效促进愈伤组织的分化。与之对应ZH11愈伤组织经过10 m M和20 m M H2O2的处理后分化水平明显降低。这些结果说明ROS水平的高低影响细胞分化,适宜的ROS浓度才能保障细胞的正常分化。RBH1基因可能通过影响细胞ROS水平进而调控穗形态建成中的细胞分化。2.水稻穗发育基因的定位基于课题组前期创制的EMS突变体库,鉴定了10份穗突变体。本研究通过Mutmap技术对5份穗突变材料进行基因定位,初步获得4份穗突变体的候选基因。其中F13基因位于2号染色体,编码一个含AP2结构域的功能蛋白,f13突变体出现严重的穗发育缺陷并最终表现为极端矮化。ricexp公共数据库（https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/index.html）表达谱的数据表明F13在穗发育过程中特异表达。f13突变体中F13蛋白翻译提前终止,引起F13蛋白结构改变。这些结果说明F13基因突变可能导致f13突变体的穗发育缺陷和极端矮化的表型。综合本论文研究结果,通过T-DNA标签法克隆了影响水稻穗退化的功能基因RBH1,RBH1编码一个果胶裂解酶。该基因参与了水稻幼穗分化过程中细胞活性氧的平衡,影响穗形态建成。同时,利用Mutmap技术初步定位了4个穗形态建成的候选基因,为后续穗发育研究积累了遗传资源。
王慧杰[3]（2021）在《三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究》文中进行了进一步梳理水稻遗传转化技术已成为水稻分子生物学研究不可或缺的研究技术。农杆菌介导法是水稻遗传转化的主流方法,但农杆菌介导法转化水稻具有很强的基因型依赖性,一些顽拗型水稻品种的遗传转化仍然较为困难。本研究以粳稻品种日本晴,籼稻品种明恢86、9311作为遗传转化材料,探究了不同筛选标记基因、不同培养条件、两个胚形态建成基因和三元载体系统对水稻遗传转化效率的影响,建立了一种用于水稻遗传转化的三元载体系统。主要研究结果如下:以日本晴和明恢86成熟胚作为遗传转化材料,探究不同筛选标记基因Hpt、Bar对遗传转化效率的影响。结果显示,Hpt基因在两个品种中的筛选效率均优于Bar基因,且前者遗传转化周期明显短于后者。以明恢86成熟胚为遗传转化材料,探究形态调节基因BBM和WUS2对籼稻成胚效率和遗传转化效率的影响,但最终结果表明本实验中构建的含形态调节基因的载体与普通载体的遗传转化效率无明显差异。以日本晴成熟胚为遗传转化材料,比较含有相同目的基因RFP的双T-DNA载体（单质粒双T-DNA）和三元载体（双质粒双T-DNA）的转化效率。结果表明,目的基因的转化效率在双T-DNA载体系统中高于三元载体系统。而在三元载体系统中,p VS1相较于RK2更加适合作为辅助质粒的复制子。以明恢86、9311成熟胚为遗传转化材料,比较不同培养条件下籼稻遗传转化效率。结果显示,在预分化阶段之前,共培养、恢复、筛选等阶段共28天的连续黑暗培养更加适用于籼稻遗传转化。四种三元载体系统转化明恢86、9311成熟胚愈伤组织。结果表明,三元载体系统引入额外的毒力基因vir提高了农杆菌侵染效率。相较于双元载体,三元载体有效提高了明恢86的遗传转化效率。在9311中,三元载体转化效率仍是不高,最高转化率仅为2.6%,仍需进一步完善。
阿茹娜[4]（2021）在《山茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的鉴定》文中提出茶树（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）是我国重要的经济作物之一,炭疽病是茶树上的重要病害,广泛发生于我国各大产茶地区,给茶叶的质量和产量都带来一定的危害。侵染茶树的炭疽菌种类较多,山茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae是其中的优势种,发病范围较为广泛。本研究构建了山茶刺盘孢菌的突变体库,筛选出致病性缺陷菌株,并对相关基因进行了敲除,为探究山茶刺盘孢菌的致病机制奠定了基础。取得的主要研究结果如下:1、本论文采用农杆菌介导的遗传转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）构建了容量为1312的山茶刺盘孢菌T-DNA插入突变体库,随机挑选部分转化子进行PCR验证,结果皆为阳性。2、对突变体库中400个突变体进行致病性检验,筛选出一株致病性降低的突变体。3、通过TAIL-PCR扩增插入位点的侧翼序列,通过生物信息学分析证明插入突变位点靠近编码依赖于α-酮戊二酸的黄嘌呤双加氧酶的基因CcxanA。4、针对CcxanA基因构建了敲除载体并转入农杆菌,通过ATMT方法在山茶刺盘孢菌中对该基因进行定向敲除,并通过抗性筛选和PCR验证,得到了敲除突变体ΔCcxanA。该突变体生长后期较野生型产生更多黑色菌丝,生长速率与野生型相比无显着差异。突变体产孢量较野生型显着降低,分生孢子形态较野生型更长。5、致病性验证结果表明,CcxanA基因的缺失会使山茶刺盘孢菌的致病性显着降低,说明CcxanA基因可能与山茶刺盘孢菌的致病相关。6、通过验证ΔCcxanA对胁迫的响应发现,在Na Cl浓度为5%时,对ΔCcxanA的抑制率较野生型有显着差异。在不同浓度下ΔCcxanA对H2O2的敏感性都显着高于野生型。说明CcxanA基因可能与山茶刺盘孢菌对H2O2的敏感性相关。本研究表明,CcxanA基因可能与山茶刺盘孢菌的生长形态、致病性以及活性氧抗性相关。
孙琳[5]（2021）在《CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建》文中研究说明棉花既是一种重要的纤维作物,也是重要的油料作物。由于棉花生育期较长,从播种到收获期间生长发育的各个时期都会受到多种虫害的影响,因此虫害已经成为影响棉花产量和纤维品质的重要因素之一。棉花作为世界上四大转基因作物之一,Bt棉的应用在一定程度上控制了鳞翅目害虫带来的影响,但导致刺吸式等非Bt基因靶标害虫危害的日益加重逐步成为危害棉花的主要害虫,迫使杀虫剂大量喷施,造成多种害虫对农药的抗性随之进化,这不仅增加了棉花种植成本而且破坏生态环境。另一方面随着Bt棉种植区域的扩大和种植时间的不断延长,害虫对Bt棉的抗性也随之增强,其带来的风险也不容忽视。因此目前需要开发新的策略应用于棉花抗虫研究。鉴定棉花内源抗虫基因用于抗虫育种,可以有效补充Bt棉在抗虫应用中的不足。而开发一种高效、可靠的基因功能分析策略是进行棉花功能基因组学研究的重要方向。CRISPR/Cas9系统现已成为一种强大而有效的基因编辑工具。本课题组已经在棉花中成功构建的高效、精确的适用于棉花的CRISPR/Cas9基因组编辑系统使得大规模构建基因编辑突变体材料成为可能。本研究介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统的高效筛选棉花内源抗虫相关基因突变体库构建的方法,为棉花功能基因组学和育种方向研究提供了高效的新策略。主要取得了以下研究结果:1.sgRNA设计与载体文库构建本研究从之前的转录组和代谢组学分析中选择了528个差异基因,通过全基因组比对筛选到968个高特异性的sgRNA靶向502个基因。通过混合引物池的方法经一次引物设计、PCR扩增和载体克隆,只需花费构建一个载体的时间就可以快速构建大规模载体文库。2.棉花基因组编辑突变体库创建及目的基因识别利用农杆菌介导的遗传转化和组织培养过程,共获得达5000多个独立的胚性愈伤组织,获得2000多独立的基因编辑T0棉花植株。本研究使用基于条形码的高通量测序技术对T0植株的目的基因进行测序分析。我们对1380个T0植株和576份愈伤组织检测了sgRNAs并鉴定了其序列,共鉴定出555条靶向412个基因的不同sgRNA序列,已检测突变体材料的基因覆盖率达82.07%。3.高效的编辑率和遗传率通过高通量测序,软件分析和人工筛选,共获得369个有效T0代基因组编辑数据。结果显示T0代发生有效编辑比例达97.29%,其中,75.61%材料表现出高效的突变率,编辑率超过80%,编辑类型以短片的插入缺失为主。棉花基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。4.低脱靶风险通过高通量测序对9个潜在的脱靶位点进行了检测,结果中没有发现有任何脱靶效应产生,进一步证实CRISPR/Cas9系统在棉花基因组编辑中发生脱靶概率低,具有很高的特异性。5.高效的表型鉴定率在对200个株系的T1和T2代昆虫生物测定中发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状（本研究是针对抗虫性状）构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略。6.抗虫相关候选基因通过抗虫鉴定发现GhMLP423、GhDML1、GhZAT10等基因的突变材料表现出一致的抗性改变表型。本研究所鉴定得到的候选基因在植物抵抗生物和非生物胁迫方面都发挥了十分重要的作用。通过初步验证发现GhMLP423可能参与棉花抗虫相关JA信号路径传导。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了一个同时使用近千个sgRNA针对植物基因组上数百个基因的混合载体文库,并快速生成一个用于表型筛选的高覆盖度的突变库,并鉴定到一些抗虫相关候选基因。该技术为棉花功能基因组学研究提供了坚实的基础。本研究方法也适用于其他基因组复杂的多倍体植物,对其他作物研究具有一定的参考价值。
田文辉[6]（2021）在《棉花黄萎病菌糖转运蛋白基因Vdght2敲除突变体构建及功能初步分析》文中指出棉花黄萎病是一种对棉花产量和纤维质量造成极大危害的维管束系统性病害,主要致病菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）,该病原真菌不同菌系以及不同生理小种之间的致病力差异很大,造成黄萎病的防治很难取得突破性的进展。糖分是病原体从寄主获取碳和能量以供生长和繁殖最主要的物质来源,植物病原菌侵染后植物糖外排能力增强,糖水平的升高会导致植物细胞局部渗透压的增高,影响植物的正常生长,而前期转录组研究发现大丽轮枝菌对糖的耐受力与其致病力呈正比。因此,通过分子生物学技术筛选影响大丽轮枝菌致病力相关的基因,为大丽轮枝菌致病机理及相关基因的研究奠定基础,为将来制定棉花黄萎病的有效防治措施具有重要意义。大丽轮枝菌糖转运能力可能与其致病力具有相关性,本研究将探索相关糖转运蛋白基因对大丽轮枝菌浸染力的生物学功能的影响,为大丽轮枝菌的侵染机制提供新的思路。前期研究已从新疆石河子棉田分离得到了高、中、低三种不同致病力的大丽轮枝菌菌系VDSHZ-9、VDSHZ-5、VDSHZ-4,本研究利用六种碳源的诱导培养,并通过转录组数据基因表达量差异分析及基本功能预测,筛选出可能与致病力相关的高亲和力葡萄糖蛋白转运基因Vdght2。为了研究Vdght2基因在大丽轮枝菌致病过程中的作用,利用基因敲除技术构建了基因敲除表达载体,并成功获得Δ4-Vdght2和Δ9-Vdght2突变菌株,通过观察突变菌株的培养表型,分析Vdght2的基因功能。本研究获得的实验结果及具体结论如下:（1）根据6种不同浓度单一碳源中培养的大丽轮枝菌VDSHZ-4、5、9表型观察和生长速率分析,大丽轮枝菌在碳源浓度为5%时对碳源的利用率最大,其中最适于大丽轮枝菌生长的碳源是蔗糖和葡萄糖。说明在病原菌通过调节糖转运相关蛋白的转录水平,改变植物感病部位的糖向外转运时,其中起主要作用的糖很可能是葡萄糖。（2）转录组数据分析VDSHZ-4与VDSHZ-9菌株的差异表达基因,从上调基因中选取四个可能的致病相关糖转运基因,进行六种碳源诱导后转录水平的q RT-PCR检测,结果显示,葡萄糖作为碳源时四个基因的表达量最高;VDSHZ-4与VDSHZ-9中差异表达的基因Vdght2在四个基因中表达量最高,并且与多种致病菌中的ght糖转运蛋白氨基酸序列含有较高的同源性。（3）通过融合PCR和巢式PCR技术直接连接目的基因融合片段,并使用Gateway技术将其整合到含有致死基因的载体p GKO2-Gateway上,利用ATMT方法将重组质粒转化大丽轮枝菌,采用反向筛选技术筛选后鉴定,最终得到两株Vdght2基因敲除突变菌株Δ4-Vdght2和Δ9-Vdght2。（4）对野生型菌株VDSHZ-4及VDSHZ-9和基因敲除突变菌株Δ4-Vdght2及Δ9-Vdght2在生长表型方面进行比较分析,结果显示,四株大丽轮枝菌的菌落直径生长速度相似,但突变体Δ4-Vdght2和Δ9-Vdght2的菌丝含量、产孢量显着减少,而菌丝和孢子的形成在大丽轮枝菌的致病过程具有重要作用,能够直接影响其致病力。（5）通过野生型菌株VDSHZ-4和VDSHZ-9及基因敲除突变菌株Δ4-Vdght2和Δ9-Vdght2在不同碳源培养基中的生物学性状观测显示,Δ4-Vdght2与其野生型菌株VDSHZ-4的生长速率十分相似,推测主要原因为VDSHZ-4回补能力较强;但Vdght2基因的敲除影响了VDSHZ-9对各个碳源的利用率,尤其是蔗糖,由此可以得知Vdght2基因参与了调控大丽轮枝菌对碳源利用的调控。上述结果初步表明,Vdght2基因主要影响大丽轮枝菌气生菌丝及分生孢子的形成,会影响大丽轮枝菌的致病力,该基因参与调控糖转运过程,Vdght2基因可能参与棉花黄萎病菌大丽轮枝菌与植物互作过程中的营养争夺,增强自身的侵染能力,提升大丽轮枝菌的致病力。后续将开展大丽轮枝菌糖转运蛋白与棉花互作中,诱导棉花自身免疫力的研究。
骆颖[7]（2021）在《CDC73调控拟南芥营养生长阶段转变的分子机制研究》文中进行了进一步梳理植物生命周期依次可分为4个阶段:胚胎期、幼年期、成年期和生殖生长期。其中,幼年期向成年期的转变被称为营养生长阶段转变。本研究以模式植物拟南芥为研究材料,研究营养生长阶段转变的分子机制。研究植物营养生长阶段转变具有重要的理论和应用意义,因为该过程决定植物生物量、调控次生代谢产物合成、分蘖数、生物与非生物逆境胁迫、不定根发生等一系列重要的经济和农艺性状,对于增加作物产量,提高作物品质具有重要指导意义。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼年向成年阶段转变过程中,叶片下表皮毛的出现、叶形变狭长、叶片边缘锯齿增多等性状常常作为拟南芥从幼年向成年转变的形态学指标。本课题利用候选基因方法,研究Paf1（Polymerase-ssociated factor 1）复合物组分CDC73（Cell Division Cycle 73）在调控拟南芥营养生长阶段转变中的功能。相较于酵母与动物的研究,植物CDC73仅仅有关其参与调控拟南芥开花这一报道,其是否参与调控拟南芥营养生长阶段转变还未知。在短日照下,我们分析了CDC73 T-DNA插入缺失突变体（cdc73）以及过表达植株表型,同时利用分子生物学和遗传学方法,研究了CDC73调控拟南芥营养生长阶段转变的分子机制,并得到以下结论:1.拟南芥cdc73缺失突变体表现出幼年向成年阶段转变提前,说明CDC73抑制幼年向成年阶段转变。同野生型相比,cdc73下表皮毛出现提前,相同叶位叶片锯齿增多,叶型更为狭长,缺刻更明显。但过表达CDC73对营养生长阶段转变表型没有显着影响。其他组分的缺失突变体没有表现出相关的营养生长阶段转变表型,表明该复合物其他组分可能不参与拟南芥营养生长阶段转变;2.对CDC73转录水平报告基因株系p CDC73::GUS的GUS染色结果显示:CDC73主要在拟南芥茎尖分生组织及下胚轴的上端表达;3.基因表达定量结果表明:与野生型相比,mi R156在突变体里显着下调,其前体pri-miRNA156A、pri-miRNA156C的表达量也显着降低,其下游基因miRNA172则显着上调。这暗示了CDC73通过调控mi R156A/C位点的表达来参与到miRNA156-SPL途径;4.酵母双杂交结果显示:CDC73与组蛋白H3K4me3甲基转移酶ATXR7之间不存在物理互作。遗传分析结果表明:CDC73与ATXR7作用在相同的遗传途径上;综合以上结果,我们认为,Paf1复合物组分CDC73主要促进pri-miRNA156A和pri-miRNA156C转录,进而上调mi R156来延迟植物营养生长阶段转变。至于CDC73如何在转录水平促进pri-miRNA156A和pri-miRNA156C转录还有待于进一步研究。
张月[8]（2021）在《星星草（Puccinellia tenuiflora）遗传转化体系的建立》文中进行了进一步梳理土壤盐碱化严重影响农业生产力。星星草（Puccinellia tenuiflora）是我国东北松嫩平原广泛分布的优良天然牧草,具有较强的耐盐碱能力,可作为盐碱地治理的先锋植物。对星星草盐碱胁迫应答的生理生态学、蛋白质组学、分子生物学等方面的研究已有一定报道;2020年,星星草全基因组序列测序完成,为解析星星草耐盐碱机制奠定了基础。然而,目前仍缺乏高效的星星草再生与遗传转化体系。本研究以星星草种子为外植体,分析了外植体、基础培养基对愈伤组织诱导的影响,以及植物激素配比与不定芽诱导率的关系,优化了星星草再生体系。继而,利用pANIC 6B质粒和农杆菌EHA105,优化了转化条件、共培养时间、潮霉素筛选压等条件对转化效率与抗性芽产生的影响。主要研究结果如下:（1）优化了星星草愈伤组织再生体系。使用含有4 mg·l-1 2,4-D的MS培养基对星星草种子、叶片、茎段进行愈伤组织诱导,确定了最适外植体为种子。对MS培养基和N6培养基中种子形成的愈伤组织诱导率进行了比较,结果表明MS为最适培养基。同时,对植物激素配比的分析表明,2 mg·l-1 KT与0.5 mg·l-1 6-BA结合使用对不定芽的诱导率最高（30%）;不定芽在不含外源植物激素的1/2 MS培养基中可生出根系。此外,再生植株经7天炼苗处理后,移栽至无菌混合土中易成活。（2）建立了星星草遗传转化体系。转化条件为愈伤组织浸泡在农杆菌侵染液中真空和超声处理,共培养3天,潮霉素筛选压为10 mg·l-1;转化后的愈伤组织在筛选培养基中可分化出最多的抗性芽,转化效率高达18.6%。
李俊香[9]（2019）在《甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定及农杆菌介导的遗传转化体系建立》文中认为甜瓜（Cucumis melo L.）是我国最重要的葫芦科作物之一,栽培广泛,具有重要的经济价值。为害甜瓜的病害多达数十种,其中真菌病害最为普遍,侵染的真菌种类也较多,而且仍然存在新突发病害。本文鉴定一种甜瓜叶斑病,研究该病菌的生物学特性,筛选针对该病菌的杀菌剂,以期指导该病害的防控;同时应用农杆菌介导方法,创建该病菌的突变体库,为致病基因研究奠定基础。取得的主要研究结果如下:1、甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定2015年10月在我国广西武鸣甜瓜主要种植区进行病害调查时发现一种叶斑病。将病样分离病原真菌,通过形态学观察、多基因鉴定和致病性试验鉴定病原菌。在PDA平板上,病原菌菌落圆形,中间墨绿色,边缘浅褐色,气生菌丝茂盛。分生孢子呈圆柱形或倒棍棒形,单生或串生,直立或稍微弯曲,具0-13个隔膜,大小为3.1-6.4×14-138.9μm。通过克隆并测定该菌的4个保守序列ITS1,2、ITS4,5、ACT和TUB2,说明该菌为多主棒孢。甜瓜叶片上分离纯化的病原菌回接到甜瓜幼苗,表现出与病害调查时田间相似的症状并再次分离到同一病原菌。该菌通常危害植物叶片引起叶斑病,寄主广泛。接种该病原菌的西瓜（Citrullus lanatus）和黄瓜（Cucumis sativus L.）幼苗及离体叶片也可以发病。病原菌菌丝生长的适宜碳源是可溶性淀粉和葡萄糖,适宜氮源是KNO3、NaNO3和蛋白胨,适宜温度是25-29°C,适宜pH是6-9。适宜分生孢子萌发的碳源是蔗糖和葡萄糖,pH是5-8。2、甜瓜棒孢叶斑病菌杀菌剂筛选为筛选甜瓜棒孢叶斑病菌的高效杀菌剂,在室内采用菌丝生长速率法测定22种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-SY和Cc-12菌株菌丝生长的抑制能力。结果表明,50%咪鲜胺锰盐WP对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-SY和Cc-12菌株的EC50都最小,病菌对它的敏感性最高,抑菌效果最好;30%苯醚甲环唑SC、40%氟硅唑EC和80%福美双WG对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-12菌株的EC50均小于5μg/mL,抑菌效果较好,但在Cc-SY菌株上抑菌效果减弱。在试验浓度下,2个甜瓜棒孢叶斑病菌供试菌株对25%嘧菌酯SC、75%百菌清WP和90%多菌灵WG都非常不敏感,说明这3种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病的防控不能起到有效作用。3、甜瓜棒孢叶斑病菌全基因组测序对多主棒孢甜瓜分离物Cc-12菌株进行了全基因组测序,获得了大小为44 M的基因组序列。以模式真菌的分化时间作为校正时间,估算C.cassiicola的分化时间为82.5 Mya。细胞降解酶是真菌成功侵染并定殖寄主的重要因子,注释结果显示葡萄糖苷水解酶有351个。4、农杆菌介导的多主棒孢遗传转化本研究利用ATMT转化技术,将T-DNA随机插入到甜瓜棒孢叶斑病菌基因组中,获得了具有潮霉素抗性的甜瓜棒孢叶斑病菌T-DNA插入突变体,初步建立了稳定高效的根癌农杆菌介导的甜瓜棒孢叶斑病菌遗传转化体系。同时,优化转化效率的影响因素,转化效率可以达到每106个分生孢子转化获得102-148个转化子。这为获得致病突变体材料提供潜在可能,为深入研究多主棒孢菌的致病机制奠定基础。突变体分子鉴定检测到潮霉素磷酸转移酶基因片段特异条带,Southern blot杂交结果表明T-DNA是随机整合到Cc-12菌株基因组中的,突变体单拷贝比例为90%。表型变异突变体对其进行致病性试验。筛选出3株无致病力突变体（CT0001,CT0022和CT0013）,1株致病力严重减弱突变体（CT0005）。利用TAIL-PCR技术和多主棒孢的基因组数据,进一步获得了这4株单拷贝插入低致病力突变体T-DNA的侧翼序列。这些结果为进一步鉴定致病相关基因奠定了基础。
胡颖[10]（2019）在《拟南芥胚胎发育中TOM40基因的生物学功能研究》文中认为双受精是被子植物发育的标志性事件,在双子叶植物的双受精过程中一个精细胞与卵细胞融合形成合子,经过一系列的细胞分裂与分化发育为胚胎直至形成种子;另一个精子与中央细胞融合形成胚乳,其间经历了合胞体和细胞化阶段,它为胚胎发育提供营养,直至发育晚期降解并消失。早期胚胎发生形成了植物基本组织的前体,在过去数十年中,科学家们对拟南芥胚胎发育的机制进行了深入研究,发现其胚胎发生和模式建成的过程是高度程序化的,这些事件被一个精确而复杂的基因表达网络所调控,一系列基因参与了拟南芥胚胎发育和模式建成的过程。线粒体外膜转运酶（Translocase of the Outer Membrane,TOM）将细胞质中合成的蛋白前体转运进入线粒体中,起到门户通道的作用。前人对不同物种中TOM40蛋白的生物学功能进行了研究,结果表明该蛋白在酵母中的表达水平与氧离子的释放相关,在人类细胞中TOM40还被证实与衰老和疾病相关。然而在模式植物拟南芥中,关于TOM40的生物学功能仍然知之甚少。因此,本研究以拟南芥tom40的两个突变体为材料,利用生物信息学、分子生物学、细胞生物学、遗传学等技术手段,研究发现AtTOM40基因的突变引起线粒体结构紊乱,导致胚胎发育异常,最终引起种子败育。同时,还利用酵母双杂交技术对拟南芥TOM复合体各亚基之间的相互作用关系进行了研究,为阐明TOM40在拟南芥中的作用机制提供了实验依据和新的信息,具有重要的理论意义。本研究获得的主要结果如下:1、首先利用生物信息学软件CLUSTALX（版本1.83）、MEGA4、SwissPdbViewer 4.01和PyMOL 1.7,以及在线数据库http://www.arabidopsis.org、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov、http://swissmodel.expasy.org/、http://swissmodel.expasy.org、https://www.ebi.ac.uk/interpro/sequencesearch和http://ibs.biocuckoo.org,从氨基酸序列、进化关系分析、三维模建、结构域预测等方面对不同物种的TOM40蛋白进行了生物信息学分析,发现TOM40蛋白在不同真核生物中的氨基酸结构和序列比较保守,AtTOM40蛋白含有19个β-链片段结构域和2个α-螺旋结构,与油菜的同源性最高。以酵母TOM40为模板对双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻中TOM40的三维结构进行同源建模,三个物种中的TOM40蛋白主体结构基本重合,均含有19个β-链片段结构域的桶状蛋白,其中拟南芥和水稻的蛋白结构中含有2个α-螺旋结构。进一步对不同物种的TOM40蛋白进行结构预测,结果显示TOM40是一类真核生物中的孔状蛋白,在不同物种中该蛋白均存在一个孔状结构域,其大小从308个（拟南芥）氨基酸至387个（酵母）氨基酸不等,推测这个保守的孔状结构域的功能在于协助未折叠的多肽链运输进入线粒体。上述结果表明TOM40是一类较为保守的蛋白,在生物体中行使着基本的生物学功能。2、从拟南芥突变体库ABRC（Arabidopsis biological resource center）（http://abrc.osu.edu/）中购买了TOM40的两个T-DNA插入突变体SALK128170（tom40-1/+）和CS873594（tom40-2/+）,并对其进行了鉴定和分析。利用三引物法对上述两个突变体的T-DNA侧翼序列进行鉴定,发现tom40-1突变体的T-DNA位于AtTOM40基因的第二个外显子上,tom40-2突变体的T-DNA位于AtTOM40基因的第七个外显子上。随后对两个突变体进行筛选和鉴定,发现其均为杂合突变体,无法获得纯合后代,同时两个突变体的雌、雄配子体发育不受影响,但在成熟角果中会出现异常的白化种子并最终死亡,两个突变体中的种子败育率分别为24.92%和25.04%,表明AtTOM40基因的突变导致胚胎隐性纯合致死。回复实验证实两个突变体的胚胎致死表型均可以被完全回复,表明AtTOM40基因的突变是造成败育的直接原因。3、对两个突变体进行胚珠透明观察发现,从心形期胚胎开始两个突变体中的胚胎发育出现异常,不能分化出正常的子叶和顶端分生组织等器官原基,类似球形时期的胚胎。对两个突变体中胚体的高度和宽度进行测量,结果表明胚体的体积会随着发育的进程而增大,但最终会发育停滞。对野生型和两个突变体的胚胎发育进程进行统计,结果表明随着发育的进程,两个突变体中类似球形胚的占比越来越高,其最终比例分别为24.39%和24.49%,与败育率相当。对tom40-1突变体中胚乳观察的结果表明,胚乳可以正常游离核分裂和细胞化。以上结果证实AtTOM40基因的突变会引起胚胎发育异常并最终败育,AtTOM40基因在拟南芥胚胎发育过程中起着重要作用。4、利用荧光实时定量PCR技术对AtTOM40基因的转录水平表达进行了检测,结果表明该基因在根、茎、叶、花、花序、授粉后1/3/5/7天的角果以及萌发后7天和14天的幼苗中都有表达,其中在成熟的花、花序和授粉后1天的角果中表达量较高。将AtTOM40启动子与GUS蛋白融合表达并检测GUS信号,结果显示在成熟叶片、毛状体、萌发7天的幼苗和花序中GUS信号较强,尤其是在成熟胚胎的子叶中表达强烈,但在花药、花丝、柱头等生殖器官中的GUS信号则较弱,甚至检测不到,推测AtTOM40基因参与了拟南芥营养生长和胚胎发育及器官原基分化,但不参与雌雄配子体的发育。进一步利用原位杂交技术研究了AtTOM40基因转录本在拟南芥胚胎中的表达模式,结果在不同时期的胚胎、胚乳游离核以及子叶中均检测到该基因的表达,表明AtTOM40基因参与了拟南芥胚胎和胚乳的发育过程。5、将AtTOM40启动子与GFP蛋白进行融合表达,同时对叶肉原生质体用Mitotracker Red染色。利用激光共聚焦扫描显微镜观察转基因植株叶肉原生质体中GFP荧光定位与Mitotracker染色,结果表明叶肉原生质体中的AtTOM40蛋白与线粒体荧光存在共定位现象,显示该蛋白为线粒体蛋白。利用超薄切片和透射电镜观察的技术对线粒体超微结构进行观察,结果发现tom40-1突变体胚胎细胞中的线粒体嵴结构无法正常形成。上述结果证实了AtTOM40基因在拟南芥中定位于线粒体,该基因编码的是一个线粒体蛋白,与生物信息学的预测结果相符。同时,该基因的突变会影响胚胎细胞的线粒体结构,表明该基因参与了线粒体的生物发生,从而影响拟南芥的胚胎发育。6、为了进一步研究AtTOM40基因的生物学功能,本研究还利用荧光实时定量PCR技术,以授粉后6天（DAP,Day after pollination）野生型种子和tom40-1突变体中白化种子为材料,对19个拟南芥线粒体外膜蛋白相关基因的表达情况进行了检测。结果发现14个基因表达发生了显着变化,证明AtTOM40基因的突变在转录水平上影响了线粒体外膜的功能,从而影响了线粒体的生物发生。对19个拟南芥胚胎发育和模式建成相关基因的表达水平也进行了检测,结果发现18个基因的表达均发生了显着变化,表明AtTOM40基因的突变导致胚胎发育和模式建成在转录水平发生变化。根据上述结果可以推测,AtTOM40基因的突变通过影响线粒体外膜功能从而影响拟南芥胚胎细胞的正常发育。7.利用酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid）检测了拟南芥TOM40亚基与TOM复合体其他亚基之间的互作关系,结果发现TOM40能与TOM5和TOM9存在相互作用,TOM5与TOM7-1、TOM7-2、TOM9和TOM40都存在相互作用;TOM6与TOM7-1存在相互作用;TOM7-1与TOM7-2存在相互作用;TOM9与TOM7-1和TOM40存在相互作用。根据此实验结果绘制了拟南芥TOM复合体各亚基之间的互作关系示意图,为揭示TOM复合体在线粒体外膜蛋白转运过程中的作用机制提供信息。
二、T-DNA转移研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、T-DNA转移研究进展（论文提纲范文）
（1）芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物扩展蛋白基因家族的研究进展 |
| 1.1.1 扩展蛋白的结构特点和起源 |
| 1.1.1.1 扩展蛋白的结构特点 |
| 1.1.1.2 扩展蛋白基因的起源 |
| 1.1.2 不同植物扩展蛋白基因家族成员的比较 |
| 1.1.3 进化过程中扩展蛋白基因亚家族的基因结构和结构域较保守 |
| 1.1.4 扩展蛋白基因在染色体上广泛分布 |
| 1.1.5 染色体片段重复是扩展蛋白基因家族主要扩张模式 |
| 1.1.6 扩展蛋白基因在不同植物组织中的表达丰度不同 |
| 1.2 扩展蛋白在植物生长发育中的作用 |
| 1.2.1 扩展蛋白基因在植物营养生长中的功能 |
| 1.2.1.1 种子萌发 |
| 1.2.1.2 根的生长发育 |
| 1.2.1.3 叶片的生长发育 |
| 1.2.2 扩展蛋白基因在植物生殖生长中的功能和调控 |
| 1.2.2.1 花粉管发育 |
| 1.2.2.2 果实成熟软化 |
| 1.3 花粉内壁的发育和调控 |
| 1.3.1 花粉壁的形成 |
| 1.3.2 花粉内壁发育的调控 |
| 1.3.2.1 参与拟南芥花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.3.2.2 参与水稻花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.4 花粉管的发育和调控 |
| 1.4.1 花粉管壁的组成和发育 |
| 1.4.2 细胞壁组分对花粉管生长的影响 |
| 1.4.2.1 果胶合成 |
| 1.4.2.2 纤维素合成 |
| 1.4.3 花粉管生长过程中细胞壁的重塑 |
| 1.4.3.1 细胞壁扩展蛋白和糖苷酶水解蛋白 |
| 1.4.3.2 阿拉伯半乳糖蛋白 |
| 1.4.3.3 果胶甲酯酶和果胶乙酰化酶 |
| 1.4.4 花粉管细胞壁结构蛋白的信号通路 |
| 1.4.4.1 细胞壁结构蛋白LRXs |
| 1.4.4.2 快速碱化因子家族RALFs |
| 1.4.4.3 类受体激酶CrRLK1Ls——ANX1/2和BUPS1/2 |
| 2 芸薹属三个基本种扩展蛋白基因家族的鉴定和进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 2.1.2 扩展蛋白家族成员的鉴定和理化性质预测 |
| 2.1.3 扩展蛋白家族成员系统发育遗传树的构建与结构分析 |
| 2.1.4 扩展蛋白家族基因的染色体分布、共线性和保留率分析 |
| 2.1.5 扩展蛋白家族基因编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.1.6 扩展蛋白家族基因的表达分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的鉴定 |
| 2.2.2 扩展蛋白基因的系统发育、基因结构和功能域分析 |
| 2.2.3 扩展蛋白基因的染色体分布、复制机制和保留比例 |
| 2.2.4 扩展蛋白基因的编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.2.5 扩展蛋白家族成员的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 全基因组三倍化后芸薹属三个基本种的扩展蛋白基因家族规模 |
| 2.3.2 芸薹属三个基本种中EXLB亚家族在进化上最为保守 |
| 2.3.3 启动子的变异与扩展蛋白基因的编码序列进化密切相关 |
| 2.3.4 扩展蛋白基因在白菜生殖发育中可能扮演重要的角色 |
| 3 白菜扩展蛋白基因BrEXPB4和BrEXPB9 的表达模式和功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 3.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 3.1.3 总RNA 的提取(试剂盒法)与cDNA 的合成 |
| 3.1.4 BrEXPB4和BrEXPB9 的基因编码序列和启动子序列的扩增 |
| 3.1.5 氨基酸序列的特征分析 |
| 3.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 3.1.7 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS融合表达载体的构建 |
| 3.1.8 BrEXPB4::eGFP和 BrEXPB9::eGFP融合表达载体的构建 |
| 3.1.9 人工microRNA(amiRNA)载体的构建 |
| 3.1.9.1 amiRNA序列的设计与合成 |
| 3.1.9.2 p35S::ami REXPB4/9、p35S::amiREXPB4和p35S::ami REXPB9 载体的构建 |
| 3.1.10 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体的遗传转化 |
| 3.1.10.1 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体浸花法转化野生型拟南芥 |
| 3.1.10.2 阳性转基因拟南芥植株的筛选 |
| 3.1.10.3 阳性植株组织的GUS染色观察 |
| 3.1.11 BrEXPB4和BrEXPB9 的亚细胞定位 |
| 3.1.11.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.11.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.12 利用抽真空浸花法将amiRNA载体转化‘油青四九’菜心 |
| 3.1.13 菜心阳性转基因植株的筛选鉴定 |
| 3.1.13.1 转基因菜心基因组DNA的提取 |
| 3.1.13.2 利用PCR对转基因菜心植株进行初次筛选 |
| 3.1.13.3 利用qRT-PCR对转基因菜心植株进行再次筛选 |
| 3.1.14 阳性转基因菜心植株的表型观察 |
| 3.1.14.1 植株的形态学观察和角果长度的统计 |
| 3.1.14.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 3.1.14.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 3.1.14.4 花粉的半薄切片和透射电镜观察 |
| 3.1.14.5 花粉的体内萌发 |
| 3.1.14.6 花粉的体外萌发 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 成功扩增‘油青四九’菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的编码序列和启动子序列 |
| 3.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在成熟花粉粒和花粉管中表达 |
| 3.2.2.1 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在‘Bcajh97-01’的花序、三核花粉期以及授粉受精后优势表达 |
| 3.2.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 从单核晚期花粉中起始表达并持续到花粉管中 |
| 3.2.3 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.4 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.5 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达造成花粉和花粉管的发育异常 |
| 3.2.5.1 利用amiRNA技术实现对菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的表达抑制 |
| 3.2.5.2 抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达不会影响菜心的营养生长和花器官形态 |
| 3.2.5.3 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达导致花粉败育以及花粉萌发和伸长异常 |
| 3.2.5.4 BrEXPB4/9~(KD)的花粉败育发生在单核花粉晚期,导致花粉内容物含量降低并伴随异常的内壁沉积 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BrEXPB4和BrEXPB9 具有相似的表达模式和亚细胞定位 |
| 3.3.2 BrEXPB4和BrEXPB9 冗余地参与白菜花粉发育和花粉管萌发 |
| 3.3.3 BrEXPB4和BrEXPB9 通过调控花粉内壁的沉积影响花粉管的萌发 |
| 4 拟南芥EXPA4和EXPB5 的表达模式和功能鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 4.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 4.1.3 总RNA 的提取与cDNA 的合成 |
| 4.1.3.1 Trizol法提取总RNA |
| 4.1.3.2 cDNA的合成 |
| 4.1.4 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列的扩增 |
| 4.1.5 氨基酸序列的特征分析和启动子顺式作用元件分析 |
| 4.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 4.1.7 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS融合表达载体的构建 |
| 4.1.8 AtEXPA4::eGFP和 AtEXPB5::eGFP融合表达载体的构建 |
| 4.1.9 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除载体的构建 |
| 4.1.9.1 AtEXPA4和AtEXPB5 sgRNA的设计合成及中间载体的构建 |
| 4.1.9.2 构建以proYAO启动子驱动Cas9 表达的CRISPR/Cas9 载体 |
| 4.1.10 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5 的构建 |
| 4.1.11 利用浸花法将各载体转化野生型拟南芥以及T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.11.1 通过浸花法对拟南芥进行遗传转化 |
| 4.1.11.2 T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.12 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS植株的筛选和观察 |
| 4.1.13 AtEXPA4和AtEXPB5 的亚细胞定位 |
| 4.1.13.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.13.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.14 敲除植株的筛选鉴定 |
| 4.1.14.1 通过PCR检测敲除植株的T-DNA插入情况 |
| 4.1.14.2 敲除植株的基因编辑检测 |
| 4.1.14.3 敲除纯合植株的筛选 |
| 4.1.15 双突变体atexpa4expb5 的获得和F_2代基因分离比的统计 |
| 4.1.16 利用PCR和 qRT-PCR对过表达植株进行筛选和鉴定 |
| 4.1.17 双突变体atexpa4expb5 的回补实验 |
| 4.1.17.1 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5对atexpa4expb5 的遗传转化 |
| 4.1.17.2 利用PCR和 qRT-PCR对回补植株进行筛选 |
| 4.1.18 敲除、过表达以及回补植株的表型观察 |
| 4.1.18.1 植株的形态学观察 |
| 4.1.18.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 4.1.18.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 4.1.18.4 花粉的体内萌发 |
| 4.1.18.5 主根长度和根尖分生区长度的测量与统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列 |
| 4.2.2 AtEXPA4和AtEXPB5 的表达分析 |
| 4.2.3 AtEXPA4和AtEXPB5 定位在细胞壁上 |
| 4.2.4 AtEXPA4和AtEXPB5 突变体、过表达以及回补植株的获得 |
| 4.2.4.1 atexpa4和atexpb5株系T-DNA插入和基因编辑类型的统计 |
| 4.2.4.2 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除植株的脱靶检测 |
| 4.2.4.3 通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5 双突变体atexpa4expab5 |
| 4.2.4.4 导入过表达载体使野生型拟南芥和atexpa4expab5 中相应基因的表达量升高 |
| 4.2.5 AtEXPA4和AtEXPB5 的同时突变使花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变和过量表达对植株形态和花粉发育未观察到显着影响 |
| 4.2.5.2 双突变体atexpa4expab5 的花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.3 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变对花粉的竞争力和配子传递无明显影响 |
| 4.2.6 AtEXPA4或AtEXPB5 都可以恢复atexpa4expab5 花粉管的伸长速度 |
| 4.2.7 AtEXPA4 促进主根的伸长 |
| 4.2.8 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.2.9 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 AtEXPA4和AtEXPB5 冗余地参与花粉管的发育 |
| 4.3.2 AtEXPA4 参与主根的生长发育 |
| 4.3.3 AtEXPA4和AtEXPB5 可能在MYB转录因子的调控下参与花粉管的发育 |
| 5 AtEXPA4和AtEXPB5 与其白菜中的同源基因的功能分化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 5.1.2 转录因子TDF1、AMS和 MYB结合位点的分析 |
| 5.1.3 酵母单杂交实验 |
| 5.1.3.1 TFs-AD和 proBrEXPB4A-E-AbAi、proBrEXPB9A-C-Ab Ai、pAtEXPB5A-Ab Ai载体的构建 |
| 5.1.3.2 线性化启动子载体并转化Y1H感受态细胞 |
| 5.1.3.3 检测转录因子对目的基因的调控作用 |
| 5.1.4 双荧光素酶实验 |
| 5.1.4.1 报告器载体proBrEXPB4-LUC、proBrEXPB9-LUC、pAtEXPB5A-LUC和效应器载体TFs-SK的构建 |
| 5.1.4.2 效应器和报告器质粒电击法转化农杆菌GV3101(MP90)感受态细胞 |
| 5.1.4.3 效应器和报告器载体瞬时转化烟草叶片并检测荧光强度 |
| 5.1.5 qRT-PCR分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 TDF1和AMS对白菜EXPB4/9 和拟南芥EXPB5 的转录激活分析 |
| 5.2.2 其他转录因子与BrEXPB4和BrEXPB9 的启动子结合分析 |
| 5.2.3 BrEXPA11/19/22 的表达模式及其在BrEXPB4/9~(KD)中的表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 AtEXPB5 与其在白菜中的同源基因BrEXPB4和BrEXPB9 产生功能分化 |
| 5.3.2 AtEXPB5和BrEXPB4/9 参与不同的调控路径 |
| 5.3.3 白菜扩展蛋白基因家族在进化过程中产生功能分化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的论文 |
（2）影响水稻穗退化基因RBH1的克隆与功能分析及穗发育基因的定位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 水稻穗的结构 |
| 1.3 水稻穗的发育 |
| 1.4 水稻穗发育调控基因的重要研究进展 |
| 1.4.1 水稻穗分生组织活性的调控 |
| 1.4.2 水稻穗枝梗发育的调控 |
| 1.4.3 水稻小穗分化的调控 |
| 1.5 水稻穗退化的调控机理研究现状 |
| 1.6 植物果胶物质的合成代谢研究进展 |
| 1.6.1 果胶的功能和种类 |
| 1.6.2 果胶的合成 |
| 1.6.3 果胶的代谢 |
| 1.7 水稻基因定位技术的现状 |
| 1.7.1 水稻突变体库的创制 |
| 1.7.2 Mutmap技术定位基因 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 质粒载体和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 水稻叶片小样DNA的抽提及PCR阳性检测 |
| 2.2.2 突变家系的表型与T-DNA插入的共分离分析 |
| 2.2.3 水稻各组织总RNA抽提及浓度测定 |
| 2.2.4 反转录和定量PCR |
| 2.2.5 载体的构建及遗传转化方法 |
| 2.2.6 水稻幼穗扫描电镜样品制备及电镜观察 |
| 2.2.7 酶活测定 |
| 2.2.8 免疫组化检测水稻果胶含量 |
| 2.2.9 Mutmap群体构建 |
| 2.2.10 SDS法水稻DNA大样小抽 |
| 2.2.11 稀穗突变体基因型鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RBH1 基因的克隆和功能分析 |
| 3.1.1 rbh1-1 突变表型的鉴定 |
| 3.1.2 rbh1-1 突变体T-DNA阳性检测 |
| 3.1.3 rbh1-1 突变体穗退化表型与T-DNA元件的共分离检测 |
| 3.1.4 rbh1-1 等位突变体的鉴定 |
| 3.1.5 rbh1-1 突变体的功能互补实验 |
| 3.1.6 rbh1-1 突变体的穗发育表型观察 |
| 3.1.7 rbh1-1 突变体顶端穗透射电镜观察 |
| 3.1.8 RBH1 基因表达模式分析 |
| 3.1.9 RBH1 基因超量表达 |
| 3.1.10 RBH1 蛋白序列分析 |
| 3.1.11 RBH1 蛋白表达及酶活验证 |
| 3.1.12 rbh1-1 突变体内果胶含量检测 |
| 3.1.13 RBH1 基因突变引起ROS水平的变化 |
| 3.1.14 ROS介导的细胞分化活性 |
| 3.2 水稻穗突变体的鉴定 |
| 3.2.1 穗突变体的鉴定 |
| 3.2.2 穗突变体自交F2 群体的构建及基因组大样抽提 |
| 3.2.3 A437 突变体的基因定位 |
| 3.2.4 A564 突变体的基因定位 |
| 3.2.5 C265 稀穗材料的基因定位 |
| 3.2.6 F13 稀穗材料的基因定位 |
| 3.2.7 F13 穗突变体的农艺性状考察 |
| 3.2.8 F13 穗突变体候选基因的功能分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RBH1 突变导致明显的顶端穗缺陷 |
| 4.2 RBH1 编码参与果胶降解的果胶裂解酶 |
| 4.3 ROS积累水平的变化对于植物发育的调控 |
| 4.4 ROS可能与激素协同调控穗发育 |
| 4.5 Mutmap技术进行基因定位的优势与不足 |
| 4.6 基于EMS诱变的Mutmap在生产育种中的潜在应用价值 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
（3）三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 农杆菌侵染机制 |
| 1.2 农杆菌介导水稻遗传转化研究进展 |
| 1.3 影响农杆菌转化水稻的几个关键因素 |
| 1.3.1 基因型 |
| 1.3.2 外植体 |
| 1.3.3 外源添加物 |
| 1.3.4 筛选标记 |
| 1.3.5 农杆菌菌株及载体系统 |
| 1.4 三元载体系统 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 受体植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.2 化学试剂与酶类 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌DH5α感受态制备及转化 |
| 2.3.2 农杆菌感受态的制备及转化 |
| 2.3.3 农杆菌Ti质粒的提取 |
| 2.3.4 质粒DNA酶切 |
| 2.3.5 DNA片段回收 |
| 2.3.6 PCR反应及产物电泳检测 |
| 2.3.7 连接反应 |
| 2.3.8 水稻遗传转化与筛选 |
| 2.3.9 水稻DNA的提取 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 水稻LAZY1基因敲除载体p1300Cas9-lazy1的构建 |
| 3.2 Bar基因为筛选标记的载体构建 |
| 3.3 形态调节基因载体的构建 |
| 3.4 双T-DNA与三元载体的构建 |
| 3.5 三元载体系统载体构建 |
| 3.6 不同筛选标记对水稻遗传转化的影响 |
| 3.7 形态调节基因的籼稻遗传转化 |
| 3.8 双T-DNA位于同一载体和不同载体的遗传转化效率比较 |
| 3.9 不同培养条件下的籼稻遗传转化 |
| 3.10 三元载体系统的籼稻遗传转化 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 水稻遗传转化效率的提升 |
| 4.2 三元载体系统中的辅助质粒 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）山茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 茶树病害的研究现状 |
| 1.1.1 茶树炭疽病病原菌及生物学特性 |
| 1.1.2 茶树炭疽病的发生及危害 |
| 1.1.3 茶树炭疽病的防治 |
| 1.2 炭疽菌致病相关机制研究进展 |
| 1.3 根癌农杆菌介导的遗传转化及TAIL-PCR |
| 1.3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化 |
| 1.3.2 热不对称PCR |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验质粒载体 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 根癌农杆菌AGL-1 感受态的制备及转化 |
| 2.2.2 根癌农杆菌介导的遗传转化 |
| 2.2.3 DNA的提取 |
| 2.2.4 致病性分析 |
| 2.2.5 TAIL-PCR |
| 2.2.6 载体构建 |
| 2.2.7 生物学特性研究 |
| 2.2.8 生物信息学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 山茶刺盘孢菌T-DNA插入突变体库的构建 |
| 3.1.1 山茶刺盘孢菌转化子的分子验证 |
| 3.1.2 山茶刺盘孢菌突变体库的遗传稳定性 |
| 3.2 山茶刺盘孢菌突变体致病性验证 |
| 3.3 突变株T-DNA插入位点侧翼序列的克隆 |
| 3.4 致病相关基因的生物信息学分析 |
| 3.5 敲除载体的构建 |
| 3.6 敲除突变体的PCR验证 |
| 3.7 敲除突变体的形态及生长速率分析 |
| 3.8 敲除突变体的致病性分析 |
| 3.9 敲除突变体对逆境的响应 |
| 3.9.1 敲除突变体盐胁迫分析 |
| 3.9.2 敲除突变体活性氧胁迫分析 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章:文献综述 |
| 1.1 中国棉花生产概况 |
| 1.2 棉花基因组研究进展 |
| 1.3 棉花功能基因组学研究 |
| 1.4 植物应对草食性昆虫的内源防御系统 |
| 1.5 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.5.1 形态抗虫育种阶段 |
| 1.5.2 生化抗虫育种阶段 |
| 1.5.3 棉花抗虫基因工程育种阶段 |
| 1.5.3.1 Bt毒蛋白的发现以及作用机理 |
| 1.5.3.2 Bt转基因棉花研究进展 |
| 1.6 植物突变体创建方法 |
| 1.6.1 自发变异 |
| 1.6.2 物理诱变 |
| 1.6.3 化学诱变 |
| 1.6.4 分子生物学方法 |
| 1.7 基因编辑技术研究进展 |
| 1.7.1 ZFN基因编辑系统 |
| 1.7.2 TALEN基因编辑系统 |
| 1.7.3 CRISPR基因组编辑系统 |
| 1.7.3.1 CRISPR/Cas9 技术原理 |
| 1.7.3.2 CRISPR/Cas9 脱靶效应研究 |
| 1.8 CRISPR/Cas9 系统在作物育种中的应用 |
| 1.8.1 高产育种研究 |
| 1.8.2 品质育种研究 |
| 1.8.3 抗性育种研究 |
| 1.8.4 不育系研究 |
| 1.9 基因编辑检测方法 |
| 1.10 CRISPR/Cas9 技术的局限性 |
| 1.11 植物变体库研究进展 |
| 1.11.1 理化诱变突变体库 |
| 1.11.2 插入突变体库 |
| 1.11.3 基因编辑突变体库 |
| 1.12 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.12.1 本研究的目的与意义 |
| 1.12.2 本研究的技术路线 |
| 第二章:实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 基因编辑载体 |
| 2.1.3 供试的昆虫材料 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sgRNA及引物设计 |
| 2.2.2 GO靶基因功能富集分析 |
| 2.2.3 混合基因组编辑载体文库构建 |
| 2.2.3.1 载体充分酶切控制空载率 |
| 2.2.3.2 混合载体文库构建 |
| 2.2.4 棉花DNA提取 |
| 2.2.5 棉花遗传转化 |
| 2.2.6 Barcode设计和高通量测序检测分析基因编辑目标序列 |
| 2.2.7 基因组编辑检测 |
| 2.2.8 抗虫鉴定 |
| 2.2.8.1 蚜虫及棉铃虫繁殖培养 |
| 2.2.8.2 武汉温室蚜虫抗性表型筛选 |
| 2.2.8.3 海南温室咀嚼式害虫极端表型筛选 |
| 2.2.8.4 室内棉铃虫抗虫验证 |
| 第三章:结果与分析 |
| 3.1 目的基因sgRNA设计及GO富集分析 |
| 3.2 sgRNAs混合载体文库的构建与评估 |
| 3.3 棉花基因编辑突变体材料的获取 |
| 3.4 基于条形码的高通量测序技术检测T0 植株sgRNA信息 |
| 3.5 利用高通量测序方法检测基因组编辑效率 |
| 3.6 高效的棉花T0 代突变体基因组编辑效率 |
| 3.7 棉花T0 单株的编辑概况 |
| 3.8 棉花基因组编辑在后代中的遗传率 |
| 3.9 棉花基因编辑后代材料抗虫表型鉴定 |
| 3.9.1 温室蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.2 T2 代材料蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.3 海南温室咀嚼时害虫危害表型鉴定 |
| 3.10 GhMLP423 基因虫害表型验证 |
| 3.10.1 超表达和基因编辑材料筛选 |
| 3.10.2 棉铃虫饲喂实验 |
| 3.10.3 棉铃虫取食偏好性验证 |
| 3.10.4 JA-Ile相关检测 |
| 3.11 脱靶分析 |
| 第四章:讨论 |
| 4.1 利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统创建陆地棉突变体库的必要性 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统在棉花基因组中高效的编辑及遗传规律 |
| 4.3 CRISPR/Cas9 在陆地棉基因组编辑系统的高特异性 |
| 4.4 棉花基因编辑工具的优化与展望 |
| 4.5 植物在非生物和生物胁迫的响应中可能涉及复杂而重叠的信号网络 |
| 4.6 CRISPR/Cas9 基因组编辑植物相比于转基因植物在育种上的优越性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 混合载体文库构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 棉花RNA提取(天根试剂盒法) |
| 附录5 RNA反转录 |
| 附录6 Real-time |
| 附录7 棉铃虫饲喂 |
| 附表 |
| 附表1 502 个目的基因ID |
| 附表2 968个sgRNA靶标序列 |
| 附表3 barcoded引物序列 |
| 附表4 潜在脱靶位点检测引物序列 |
| 已发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（6）棉花黄萎病菌糖转运蛋白基因Vdght2敲除突变体构建及功能初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花黄萎病的发生与危害 |
| 1.2 棉花黄萎病 |
| 1.2.1 棉花黄萎病的病状 |
| 1.2.2 棉花黄萎病的致病过程 |
| 1.2.3 大丽轮枝菌的毒力机制 |
| 1.3 棉花黄萎病的防治 |
| 1.4 大丽轮枝菌糖转运研究进展 |
| 1.4.1 糖转运在病原菌中的作用 |
| 1.4.2 葡萄糖转运蛋白基因 |
| 1.5 大丽轮枝菌基因功能的研究 |
| 1.5.1 基于Gateway技术的基因敲除 |
| 1.5.2 农杆菌介导真菌的遗传转化 |
| 1.5.3 基因敲除转化子的筛选 |
| 1.6 研究的目的意义及技术路线 |
| 1.6.1 研究的目的意义 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 棉花黄萎病菌糖转运相关基因的筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株 |
| 2.1.2 试验相关培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 3 株菌株在六种碳源不同浓度培养基上的生物学性状 |
| 2.2.2 3 株菌株在六种碳源不同浓度培养后的菌丝含量测定 |
| 2.2.3 转录组分析 |
| 2.2.4 3 株菌株在六种碳源培养后的基因表达量差异分析 |
| 2.2.5 候选基因的基本特性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 3 株菌株在六种碳源不同浓度培养基上的生物学性状 |
| 2.3.2 3 株菌株在六种碳源不同浓度诱导培养后对菌丝生长的影响 |
| 2.3.3 转录组分析 |
| 2.3.4 不同碳源对3 株菌株相关基因表达的影响 |
| 2.3.5 候选基因的基本特性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Vdght2 基因缺失突变体的获得 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验菌株与质粒 |
| 3.1.2 试验相关培养基 |
| 3.1.3 试验相关抗生素 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 大丽轮枝菌基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 构建Vdght2 基因同源重组片段 |
| 3.2.3 构建基因敲除载体 |
| 3.2.4 转化大肠杆菌并鉴定 |
| 3.2.5 提取重组质粒提取并测序 |
| 3.2.6 重组质粒转化农杆菌 |
| 3.2.7 农杆菌介导大丽轮枝菌的遗传转化 |
| 3.2.8 Vdght2 基因敲除转化子的鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Vdght2 基因同源重组片段的构建 |
| 3.3.2 敲除质粒的构建及鉴定 |
| 3.3.3 农杆菌介导大丽轮枝菌的遗传转化 |
| 3.3.4 Vdght2 基因敲除突变体的分子验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 突变体Δ4-Vdght2和Δ9-Vdght2 的生物学性状 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验菌株 |
| 4.1.2 试验相关培养基 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 菌落形态观察及生长速度测定 |
| 4.2.2 产孢能力及菌丝含量的测定 |
| 4.2.3 不同碳源培养基上生长速度的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 菌落形态观察及生长速度测定 |
| 4.3.2 产孢能力及菌丝含量 |
| 4.3.3 不同碳源培养基上生长速率的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（7）CDC73调控拟南芥营养生长阶段转变的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物营养生长阶段转变的研究进展 |
| 1.1.1 植物营养生长阶段转变 |
| 1.1.2 miR156-SPLs途径调控营养生长阶段转变 |
| 1.1.3 miR156-SPL途径的上游调控因子 |
| 1.1.4 研究营养生长阶段转变的重要意义 |
| 1.2 Paf1复合物的功能研究 |
| 1.2.1 Paf1复合物介导RNA聚合酶Ⅱ的结合 |
| 1.2.2 Paf1复合物在组蛋白修饰中的作用 |
| 1.2.3 Paf1复合物参与RNA3'末端形成 |
| 1.2.4 Paf1复合物在酵母中的研究进展 |
| 1.2.5 Paf1复合物在人类中的研究进展 |
| 1.2.6 Paf1复合物在植物中的研究进展 |
| 1.2.7 展望 |
| 1.3 本课题的研究意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试剂及配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 拟南芥种植及管理 |
| 2.2.2 植物基因组的提取 |
| 2.2.3 T-DNA插入纯合突变体的鉴定 |
| 2.2.4 表型考察 |
| 2.2.5 植物RNA的提取、逆转 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.2.7 载体的构建 |
| 2.2.8 农杆菌介导转化拟南芥 |
| 2.2.9 转基因阳性植株筛选 |
| 2.2.10 单拷贝纯合植株筛选 |
| 2.2.11 拟南芥双突材料的构建及纯合筛选 |
| 2.2.12 LUC荧光强度检测 |
| 2.2.13 GUS染色 |
| 2.2.14 质粒大提及浓缩 |
| 2.2.15 酵母双杂 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Paf1c组分CDC73缺失促进营养生长阶段转变提前 |
| 3.2 CDC73的表达分布情况 |
| 3.3 CDC73通过miR156-SPL途径调控营养生长阶段转变 |
| 3.4 CDC73与甲基转移酶ATXR7处于同一条通路 |
| 4 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）星星草（Puccinellia tenuiflora）遗传转化体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 星星草研究进展 |
| 1.1.1 引言 |
| 1.1.2 星星草概述 |
| 1.1.3 星星草的形态特征 |
| 1.1.4 星星草的生长条件 |
| 1.1.5 星星草的主要价值 |
| 1.1.6 星星草盐碱应答机制的研究进展 |
| 1.1.7 星星草全基因组序列研究进展 |
| 1.2 禾本科作物遗传转化研究进展 |
| 1.2.1 农杆菌概述 |
| 1.2.2 农杆菌转化法的原理 |
| 1.2.3 影响农杆菌介导遗传转化的主要因素 |
| 1.2.4 禾本科作物遗传转化研究进展 |
| 1.2.5 禾本科作物遗传转化存在的问题 |
| 1.3 建立星星草遗传转化体系的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要培养基的配制 |
| 2.1.5 激素、抗生素母液、GUS染液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 星星草再生体系的建立方法 |
| 2.2.2 星星草遗传转化体系的建立方法 |
| 2.2.3 影响农杆菌转化效率的因素 |
| 2.2.4 分子生物学检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 星星草再生体系的建立 |
| 3.1.1 星星草愈伤组织诱导外植体类型及基础培养基的确定 |
| 3.1.2 星星草愈伤组织诱导不定芽最优培养基的确定 |
| 3.2 星星草遗传转化体系的建立 |
| 3.2.1 潮霉素筛选压的确定 |
| 3.2.2 最适农杆菌转化条件及共培养天数的确定 |
| 3.2.3 农杆菌介导的遗传转化及植株再生 |
| 3.3 分子生物学检测 |
| 3.3.1 转基因星星草GUS基因的PCR检测 |
| 3.3.2 GUS表达的组织化学检测 |
| 3.3.3 转基因星星草叶片中GUS基因实时荧光定量PCR |
| 4 讨论 |
| 4.1 星星草再生体系及遗传转化体系建立的特异性 |
| 4.2 星星草遗传转化体系中植物受体的选择 |
| 4.3 星星草遗传转化体系中转化条件及共培养时间的选择 |
| 4.4 星星草遗传转化体系中乙酰丁香酮浓度的选择 |
| 4.5 星星草遗传转化体系中抑菌剂浓度的选择 |
| 4.6 星星草遗传转化体系中筛选剂及筛选压的选择 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定及农杆菌介导的遗传转化体系建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 多主棒孢的研究进展 |
| 1.1.1 多主棒孢的分类地位和特征 |
| 1.1.2 多主棒孢的寄主范围及危害 |
| 1.1.3 多主棒孢叶斑病的防治 |
| 1.2 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化研究进展 |
| 1.2.1 ATMT技术在真菌上的应用与发展 |
| 1.2.2 根癌农杆菌及其介导的真菌遗传转化 |
| 1.2.3 ATMT相对于其他转化技术的优点 |
| 1.2.4 ATMT技术在真菌中的研究趋势 |
| 1.2.5 ATMT技术存在的问题和局限 |
| 1.2.6 ATMT技术的未来及在真菌中的进一步应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试菌株 |
| 2.2.2 试验试剂 |
| 2.2.3 供试培养基 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 试验方法 |
| 2.2.5.1 甜瓜棒孢叶斑病的标本采集 |
| 2.2.5.2 病原菌的分离及纯化 |
| 2.2.5.3 病原菌菌落形态观察 |
| 2.2.5.4 病原菌分生孢子形态观察 |
| 2.2.5.5 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取 |
| 2.2.5.6 DNA提取质量和浓度检测 |
| 2.2.5.7 甜瓜棒孢叶斑病菌的分子鉴定 |
| 2.2.5.8 甜瓜棒孢叶斑病菌致病性测定 |
| 2.2.5.9 温度对菌丝生长的影响 |
| 2.2.5.10 pH对菌丝生长的影响 |
| 2.2.5.11 碳源对菌丝生长的影响 |
| 2.2.5.12 氮源对菌丝生长的影响 |
| 2.2.5.13 病原菌分生孢子的萌发规律和方式 |
| 2.2.5.14 pH对孢子萌发的影响 |
| 2.2.5.15 碳源对孢子萌发的影响 |
| 2.2.5.16 培养基种类对产孢的影响 |
| 2.2.5.17 不同杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌的室内毒力测定 |
| 2.2.5.18 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 甜瓜棒孢叶斑病的田间症状 |
| 2.3.2 甜瓜棒孢叶斑病菌菌落形态 |
| 2.3.3 甜瓜棒孢叶斑病菌显微形态 |
| 2.3.4 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取质量和浓度 |
| 2.3.5 甜瓜棒孢叶斑病菌分子鉴定 |
| 2.3.6 甜瓜棒孢叶斑病菌致病性测定 |
| 2.3.7 温度对Cc-12 菌株生长的影响 |
| 2.3.8 pH对 Cc-12 菌株生长的影响 |
| 2.3.9 碳源对Cc-12 菌株生长的影响 |
| 2.3.10 氮源对Cc-12 菌株生长的影响 |
| 2.3.11 Cc-12 菌株分生孢子萌发规律和特点 |
| 2.3.12 pH对孢子萌发的影响 |
| 2.3.13 碳源对孢子萌发的影响 |
| 2.3.14 培养基种类对产孢的影响 |
| 2.3.15 22种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-SY菌株的室内毒力比较 |
| 2.3.16 22种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-12 菌株的室内毒力比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 甜瓜棒孢叶斑病菌全基因组测序 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.2.1 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取 |
| 3.2.2.2 建库测序和组装 |
| 3.2.2.3 基因组注释 |
| 3.2.2.4 比较基因组分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 基因组测序及组装 |
| 3.3.1.1 二代数据量统计 |
| 3.3.1.2 17-mer分析及基因组大小估计 |
| 3.3.1.3 三代组装数据量统计 |
| 3.3.1.4 基因组组装结果 |
| 3.3.1.5 线粒体组装结果 |
| 3.3.1.6 基因组组装评估 |
| 3.3.1.7 单碱基深度统计图 |
| 3.3.1.8 GC含量及深度分布分析 |
| 3.3.2 基因组注释 |
| 3.3.2.1 重复序列注释 |
| 3.3.2.2 基因注释 |
| 3.3.3 基因功能注释 |
| 3.3.3.1 KEGG数据库注释 |
| 3.3.3.2 GO数据库注释 |
| 3.3.3.3 Swiss-Prot数据库注释 |
| 3.3.3.4 NR数据库注释 |
| 3.3.3.5 eggNOG数据库注释 |
| 3.3.3.6 KOG数据库注释 |
| 3.3.4 非编码RNA注释 |
| 3.3.5 比较基因组分析 |
| 3.3.5.1 基因家族鉴定 |
| 3.3.5.2 系统发育分析 |
| 5.3.5.3 分化时间估算 |
| 3.3.5.4 基因家族扩张和收缩分析 |
| 3.3.5.5 基因组共线性分析 |
| 3.3.6 病原真菌致病性研究 |
| 3.3.6.1 病原与宿主互作(PHI)数据库注释 |
| 3.3.6.2 碳水化合物注释 |
| 3.3.6.3 细胞色素P450 数据库(CYPs)注释 |
| 3.3.6.4 分泌蛋白预测 |
| 3.3.6.5 转运蛋白注释 |
| 3.3.6.6 转录因子注释 |
| 3.3.6.7 次级代谢产物注释 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 根癌农杆菌介导的甜瓜棒孢叶斑病菌遗传转化体系的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株及质粒 |
| 4.2.2 供试培养基 |
| 4.2.3 试剂及耗材 |
| 4.2.4 主要仪器设备 |
| 4.2.5 试验方法 |
| 4.2.5.1 质粒提取 |
| 4.2.5.2 质粒转入大肠杆菌 |
| 4.2.5.3 质粒转入农杆菌 |
| 4.2.5.4 Cc-12 菌株对潮霉素的敏感性 |
| 4.2.5.5 Cef抑制农杆菌正常生长的浓度筛选 |
| 4.2.5.6 Tim抑制农杆菌正常生长的浓度筛选 |
| 4.2.5.7 Cc-12 菌株对抗生素的敏感性 |
| 4.2.5.8 分生孢子的制备 |
| 4.2.5.9 根癌农杆菌细胞的制备 |
| 4.2.5.10 根癌农杆菌与多主棒孢菌共培养 |
| 4.2.5.11 转化子筛选 |
| 4.2.5.12 pH对转化效率的影响 |
| 4.2.5.13 共培养温度对转化效率的影响 |
| 4.2.5.14 共培养时间对转化效率的影响 |
| 4.2.5.15 根癌农杆菌浓度对转化效率的影响 |
| 4.2.5.16 Ca~(2+)浓度对转化效率的影响 |
| 4.2.5.17 Cc-12 转化子基因组DNA的提取 |
| 4.2.5.18 Cc-12 转化子的PCR鉴定 |
| 4.2.5.19 Southern blot检测突变体的T-DNA插入拷贝数 |
| 4.2.5.20 Cc-12 转化子的遗传稳定性分析 |
| 4.2.5.21 表型变异突变体筛选 |
| 4.2.5.22 致病性变异突变体筛选 |
| 4.2.5.23 热不对称PCR |
| 4.2.5.24 重组质粒的筛选 |
| 4.2.5.25 转化子完整T-DNA的扩增 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 质粒提取 |
| 4.3.2 质粒转入农杆菌 |
| 4.3.3 Cc-12 菌株对潮霉素的敏感性 |
| 4.3.4 抑制农杆菌正常生长的Cef浓度筛选 |
| 4.3.5 抑制农杆菌正常生长的Tim浓度筛选 |
| 4.3.6 Cc-12 菌株对抗生素的敏感性 |
| 4.3.7 根癌农杆菌介导的甜瓜棒孢叶斑病菌遗传转化 |
| 4.3.8 Cc-12 转化子的PCR检测 |
| 4.3.9 Southern blot检测Cc-12 转化子的T-DNA插入拷贝数 |
| 4.3.10 Cc-12 转化子的遗传稳定性 |
| 4.3.11 甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-12 菌株转化子菌落形态特征比较 |
| 4.3.12 表型变异突变体致病性测定 |
| 4.3.13 致病性变异突变体Southern blot杂交分析 |
| 4.3.14 T-DNA插入侧翼序列扩增 |
| 4.3.15 T-DNA插入侧翼序列分析 |
| 4.3.16 转化子完整T-DNA的扩增 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 部分代表性转化菌株的菌落形态 |
| 附录Ⅱ 表型变异突变体致病性测定(使用孢子) |
| 附录Ⅲ 表型变异突变体致病性测定(使用菌块) |
| 附录Ⅳ 作者简介 |
| 致谢 |
（10）拟南芥胚胎发育中TOM40基因的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 拟南芥胚胎发育的研究进展 |
| 1.1.1 胚胎发育过程 |
| 1.1.2 胚胎模式建成及分子机理研究 |
| 1.1.3 胚乳的发育 |
| 1.2 线粒体蛋白运输机制的研究进展 |
| 1.2.1 线粒体蛋白的转运 |
| 1.2.2 线粒体外膜转运酶(TOM)复合体 |
| 1.3 TOM40的研究进展 |
| 1.3.1 TOM40的结构特征 |
| 1.3.2 TOM40的组装与转运机制 |
| 1.3.3 TOM40的生物学功能 |
| 1.3.4 植物线粒体外膜蛋白 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 拟南芥TOM40的生物信息学分析及突变体鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 植物材料与种植 |
| 2.2.3 AtTOM40基因突变体的鉴定与败育率统计 |
| 2.2.4 突变体自交和杂交后代的分离比统计 |
| 2.2.5 胚珠透明和胚胎发育过程的观察 |
| 2.2.6 胚乳细胞的自发荧光观察 |
| 2.2.7 回复载体的构建 |
| 2.2.8 拟南芥浸花法转基因及阳性植株的鉴定 |
| 2.2.9 本章所用引物 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 TOM40蛋白序列的生物信息学分析 |
| 2.3.2 突变体tom40-1和tom40-2均为杂合突变体 |
| 2.3.3 突变体tom40-1和tom40-2的T-DNA插入位点鉴定 |
| 2.3.4 AtTOM40的纯合突变导致种子败育 |
| 2.3.5 AtTOM40基因的突变影响胚胎发育 |
| 2.3.6 tom40-1/+和tom40-2/+的胚胎败育表型能被回复 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 拟南芥TOM40基因的表达模式及亚细胞定位研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料与种植 |
| 3.2.2 生物信息数据库中AtTOM40基因的表达分析 |
| 3.2.3 荧光定量PCR分析 |
| 3.2.4 AtTOM40基因启动子与GUS融合表达分析 |
| 3.2.5 原位杂交技术 |
| 3.2.6 AtTOM40基因启动子与GFP融合表达的观察 |
| 3.2.7 超薄切片制样及透射电镜观察 |
| 3.2.8 本章所用引物 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AtTOM40基因在生物信息学数据库中的表达预测 |
| 3.3.2 AtTOM40基因在转录水平的检测结果与分析 |
| 3.3.3 AtTOM40::GUS的组织表达模式具有特异性 |
| 3.3.4 AtTOM40基因的原位杂交分析 |
| 3.3.5 AtTOM40基因编码的蛋白定位于线粒体 |
| 3.3.6 AtTOM40基因的突变影响胚胎细胞线粒体的超微结构 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 拟南芥TOM40基因的生物学功能研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料与种植 |
| 4.2.2 胚珠材料的收集和保藏 |
| 4.2.3 胚珠总RNA的提取及反转录 |
| 4.2.4 荧光定量PCR检测 |
| 4.2.5 酵母双杂交技术 |
| 4.2.6 本章所用引物 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 纯合tom40-1突变体中线粒体外膜蛋白的功能受到干扰 |
| 4.3.2 纯合tom40-1突变体胚胎的模式建成紊乱 |
| 4.3.3 AtTOM40与TOM复合体中其他亚基间的互作关系 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 总讨论 |
| 5.1 拟南芥TOM40是一个保守的线粒体外膜蛋白 |
| 5.2 拟南芥TOM40对于线粒体的生物发生至关重要 |
| 5.3 拟南芥TOM40通过维持线粒体外膜功能参与胚胎发育及形态建成 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、T-DNA转移研究进展（论文参考文献）
- [1]芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究[D]. 刘维妙. 浙江大学, 2021(01)
- [2]影响水稻穗退化基因RBH1的克隆与功能分析及穗发育基因的定位[D]. 何冬. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究[D]. 王慧杰. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]山茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的鉴定[D]. 阿茹娜. 吉林大学, 2021(01)
- [5]CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建[D]. 孙琳. 华中农业大学, 2021(02)
- [6]棉花黄萎病菌糖转运蛋白基因Vdght2敲除突变体构建及功能初步分析[D]. 田文辉. 石河子大学, 2021(02)
- [7]CDC73调控拟南芥营养生长阶段转变的分子机制研究[D]. 骆颖. 吉林大学, 2021(01)
- [8]星星草（Puccinellia tenuiflora）遗传转化体系的建立[D]. 张月. 东北林业大学, 2021(08)
- [9]甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定及农杆菌介导的遗传转化体系建立[D]. 李俊香. 华中农业大学, 2019
- [10]拟南芥胚胎发育中TOM40基因的生物学功能研究[D]. 胡颖. 武汉大学, 2019(06)