一、HBV感染与hTERT基因表达在肝细胞癌组织中的相关性研究（论文文献综述）
石怡[1]（2021）在《PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究》文中指出肝细胞癌（HCC）的恶性程度高,发病率高且存活率低,是全球范围内与癌症相关的死亡的主要原因之一。但是,肝癌发生的背后机制尚不是非常清楚。大量研究表明竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络在许多人类癌症的多种生物学过程中发挥关键作用。因此筛选ceRNA调控网络并研究其作用机制,对HCC的诊断和预后具有重要意义。在本研究中,利用生物信息学筛选出与磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）相关的ceRNA调控网络。通过相关性分析、Cox回归分析鉴定出HCC临床预后模型,并且利用免疫组化实验进行验证。运用甲基化分析和免疫浸润分析探讨预后模型在肝癌的发生和发展过程中的分子机制,为肝癌发生机制研究提供了新的方向和策略。具体研究内容如下:1.从TCGA数据库获得mRNA,lncRNA和miRNA的表达谱。总共在HCC样品和邻近的正常样品中筛选出3371个DElncRNA,422个DEmiRNA和8294个DEmRNA,而在PTENhigh和PTENlow表达的HCC样品之间鉴定出860个DElncRNA,54个DEmiRNA和1871个DEmRNA。然后,通过计算机分析将总共5个DElncRNA,4个DEmiRNA和372个DEmRNA纳入InRNA-miRNA-mRNA三重调控网络。此外,利用Cytoscape插件cytohubba,基于得分>2,筛选出三重调控网络中的十三个关键RNA。最后,通过生物信息学分析获得了与肝癌预后有关的DLEU2L-hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99a-5p-TAOK1过度表达的ceRNA网络。2.通过相关性分析在ceRNA调控网络中鉴定了DLEU2L/TAOK1轴,并且利用Cox回归分析表明DLEU2L/TAOK1轴可能是肝癌临床应用中潜在的预后模型。运用GEO数据库和免疫组化实验对预后模型DLEU2L/TAOK1轴中的TAOK1进一步数据分析和实验验证,结果发现相比于正常组织,TAOK1在肝癌组织中高表达,与前面分析结果一致。3.甲基化分析表明DLEU2L/TAOK1轴异常上调可能是由于甲基化不足引起的。免疫浸润分析表明,DLEU2L/TAOK1轴可能对肿瘤免疫微环境的变化和肝癌的发展有影响。当前的研究构建了基于ceRNA的DLEU2L/TAOK1轴,可能是与HCC诊断和预后相关的新型重要预后因素。
孙新锋[2]（2021）在《芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究》文中进行了进一步梳理背景:原发性肝癌是一个全球性的健康问题,其中90%为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,是第二位致死性肿瘤,5年生存率仅为18%,HCC早期可选择肝移植、手术切除或射频消融等根治性治疗,中晚期化疗栓塞/放射栓塞和全身系统治疗是仅存的治疗方法。和大多数肿瘤一样,HCC中存在干性癌细胞,即癌干细胞（cancer stem cell,CSC）,是具有无限增殖和分化潜能的一类特殊细胞群,特别是在HCC的复发转移过程中起着关键作用。癌干细胞标志物是一种特异性的信号分子或蛋白质受体,是利用其鉴定癌干细胞最简单的方法。很多研究表明癌干细胞表面标记物是影响HCC固有耐药性和侵袭转移能力以及调节其干性的关键因素。随着对癌干细胞的深入研究,越来越多的癌干细胞标记物被发现,在体内成瘤实验中确证过,常见的有EpCAM、CD133、CD44及SOX4等癌干细胞表面蛋白,这些标记物在上皮癌变过程中具有一定的促进作用,它的活化和显着表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。最近研究表明,HCC癌干细胞的存在是影响临床疗效导致HCC患者死亡的主要原因之一。中医药是中华民族传统文化与智慧的结晶,具有毒副反应少、多组分、治疗靶点多、减毒增效等特点,能够优化HCC治疗早已形成共识,导师在传承的基础上,创新和发展传统中医宏观气血辨证论治思想,对芪术抗癌方治疗HCC宏观和微观物质基础进行了一系列研究,本方以由黄芪、莪术、炒白术、柴胡、白芍、鸡内金及炙甘草等药物组成。前期临床研观察发现,该方可显着提高HCC患者临床疗效,明显改善生存质量、减少肿瘤的复发和转移并提高患者的生存率。进一步研究发现该方能阻止癌细胞转移、诱导HepG2细胞凋亡、p53蛋白表达及p21细胞周期调控等;并通过调节JNKs信号通路促进HepG2细胞凋亡、阻止裸鼠HCC转移,及逆转TGF-β诱导的肝癌细胞EMT和干性特征减少癌细胞迁移等。故系统深入研究HCC癌干细胞的侵袭转移机制以及寻求新的治疗方法,是提高疗效、改善预后及延长生存率的关键环节。通过对癌干细胞的起源、生物学特征及作用和机制初步的阐述,进一步研究HCC转移和复发机制,探讨中药阻止HCC进展的疗效机制具有重要意义。目的:芪术抗癌方可能会影响癌细胞干性标志物表达从而影响HCC复发和转移;据此,本研究拟在导师前期工作基础上,（1）通过对HCC患者外周血淋巴细胞（PBMC）进行癌干性标志物高通量测序以验证主要干性相关标志物基因及SOX4的表达;（2）建立芪术抗癌方处理HepG2细胞损伤模型,验证芪术抗癌方对肝癌细胞株干性标志物表达的影响。（3）建立肝癌原位小鼠动物模型,验证芪术抗癌方对干性标志EpCAM、CD133、CD44表达和对SOX4基因表达的影响。本研究结果,有望在肿瘤干性标志物方面初步阐释芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效作用机制,为中药抗癌制剂的研发和广泛的临床应用提供理论和实验依据。方法:第一部分:收集正常对照人群、HCC患者血液标本,通过PBMC高通量测序及蛋白芯片表达,研究不同分期分级HCC患者之间干性标志及SOX4表达差异,并与正常对照人群进行对比分析。1.经医院伦理委员会批准依据我国《原发性肝癌诊疗规范》（2017年版）选择确诊为肝细胞癌患者,共80例,其中年龄在30岁至70岁之间,平均年龄51.2岁。根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期,80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;为了进一步区分HCC组癌干性基因表达,我们选取了正常对照组,随机入组50例正常人群作为对照组,同时对入组进行统计学分析。2.对入组者进行外周血单个核细胞（PBMC）提取A.使用量约5ml的EDTA抗凝真空采血管进行血液采集,上下颠倒与抗凝剂混合均匀后放入4℃冰箱保存,并在2小时内完成PBMC提取。B.对入组标本进行RNA提取与检测,包括Trizol法提RNA,Thermo试剂盒法进行细胞裂解、RNA萃取、RNA清洗、Elute RNA、RNA检测,对文库构建与质控,库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina 测序。C.数据对比分析:采用Subread软件中的FeatureCounts工具对基因进行表达水平的定量,FeatureCounts主要使用-Q 10-B-C参数,分别过滤掉比对质量值低于10的reads,非成对比对上的reads,比对到基因组多个区域的reads。3.随机抽取36例肝癌患者和对照组血浆标本进行蛋白数据进行分析,包括原始数据归一化,差异蛋白筛选,差异蛋白聚类等基础分析。第二部分:芪术抗癌方体外、体内实验研究1.芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达影响的体外肝癌细胞研究通过体外实验,观察芪术抗癌方是否影响TGF-β1诱导的肝癌细胞干性标志物表达。利用TGF-β1诱导Huh7细胞干性表达,加入芪术抗癌方浸提液共培养,Western blot检测癌细胞干性相关蛋白表达水平,验证芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达的影响。2.芪术抗癌方对癌细胞干性标志及SOX4基因表达影响的体内肝癌动物模型研究2.1肝癌原位模型造模小鼠肝包膜下种植SMMC7721-luc制备肝癌模型,4周后进行活体成像仪查看荧光情况来确认小鼠是否造模成功。2.2分组用耳标法将30只肝癌模型小鼠和5只空白小鼠进行编号,然后将肝癌模型小鼠随机等量分为5组（肝癌模型组、索拉非尼组、芪术抗癌低剂量、中剂量、高剂量组）。空白小鼠则做为对照组。2.3取材给药30天后用安乐处死小鼠,剪开小鼠腹部皮肤2cm,分离肌肉,取出小鼠肝脏、拍照。然后肝脏和肿瘤备用。2.4 HE染色及免疫组织化学染色2.5 PCR定量检测根据实验说明书从肝脏肿瘤组织中提取的总RNA,以RNA为模板,按照说明书配制逆转录反应体系,总体积为20μl,37℃,60min;98℃,10min,合成cDNA第一链,并收集备用;加入特定引物,在PCR反应条件下:94℃ 2min,94℃ 20s,58℃ 20s,72℃ 20s,40循环。PCR产物的特异性通过熔解曲线分析证实。基因表达相对定量与ΔΔCt方法实现（Ct值）。2.6肝癌组织标本进行Western Blot和免疫组化检测。结果:第一部分:收集健康对照组、肝细胞癌患者血液标本,通过PBMC基因测序及蛋白芯片表达,对比健康对照组与HCC、HCC不同分期组之间干性标志物基因、蛋白及SOX4基因表达。本研究中对纳入的80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;同时纳入50例健康人群作为对照组。通过采用RNA-Seq对HCC患者和正常健康对照组外周血淋巴细胞（PBMC）进行高通量测序,及生物信息学方法分析,发现在HCC患者和健康对照者验证队列中,使用qRT-PCR对9个干性基因表达进行验证对比发现,在两者组人群中都存在 CD13、CD24、CD44、CD47、EPCAM、CD133、SOX2、SOX4、CD90等基因表达,并且以CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4表达更显着。对HCC巴塞罗那分期0-B期和C-D期,进一步进行RNA-Seq测序结果分层分析比较,发现在9个癌干性基因表达中,CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4、EpCAM在两组中亦均明显表达,同时发现C-D级较0-B期HCC患者CD133基因表达更为显着,而EpCAM表达0-B期较C-D期患者基因表达有较为明显的表达,同时我们还发现在两组患者中具有同等水平的SOX4的表达。HCC患者和对照组的干性基因表达聚类图进一步分析发现,SOX4基因在HCC组呈现明显的高表达,同样HCC患者PBMC中CD24、CD47、CD13基因表达和健康对照组比较存在显着差异。通过HCC患者血浆蛋白芯片检测,发现HCC患者存在CD44、EpCAM基因高表达。本研究部分,通过RNA-seq技术及血浆芯片蛋白检测技术,确证人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关。第二部分:通过体外、体内实验观察芪术抗癌方对癌干细胞中CD133、CD44、EpCAM及SOX4表达的影响,初步探讨在癌干细胞方面中医药治疗肝癌的作用。1.芪术抗癌方对Huh7肝癌细胞干性标志表达的影响我们体外研究发现,通过对TGF-β1诱导的癌细胞干性标志基因蛋白表达发现,芪术抗癌方干预Huh7肝癌细胞后,能抑制EpCAM和CD133表达,表明该中药复方可以在体外通过抑制癌细胞中EpCAM和CD133干性表达而阻止HCC进展。2.芪术抗癌方对肝癌动物模型癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响EpCAM、CD133、CD44、SOX4等细胞表面蛋白的活化和高表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。我们已对HCC患者PBMC进行了高通量测序研究,发现EpCAM、CD133、CD44、SOX4等干性相关基因,在HCC患者PBMC中表达,及体外实验亦证实了芪术抗癌方可以抑制部分干性标志及SOX4基因表达。由此,我们进行了进一步体内实验研究,验证芪术抗癌方对HCC癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响,初步探索芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效机制。我们对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色研究分析,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉菲尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方可以通过影响癌细胞干性标志物表达从而阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关。结论:在本研究中,首先通过对临床HCC患者PBMC进行RNA-seq及血浆芯片蛋白检测研究,发现了人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关,而中医药可能通过调节SOX4基因影响干性标志表达。其次,通过体外实验研究发现芪术抗癌方可影响Huh7肝癌细胞中CD133、CD44、EpCAM干性标志表达。最后,我们通过对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色分析研究,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉非尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方在体内外实验中能通过影响癌细胞干性标志物表达阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关,为芪术抗癌方进一步深入的疗效机制研究提供了较好的临床及试验证据,为中医药在HCC治疗的临床广泛应用提供了研究依据。
王正[3]（2021）在《肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究》文中指出肝细胞癌（hepatocellular carcinoma、HCC）是全球最多见的恶性肿瘤之一,恶性水平高,发展迅猛。我国是HCC的高发区,目前占世界的55%。由于乙型肝炎病毒的长期感染,我国多半病人在慢性肝炎,肝硬化后发展成HCC。HCC具备起病隐匿、早期诊断困难、预后差、进展快等特点。HCC的死亡率是肿瘤的第二位。因此,探求一种新的有效的生物标志物对HCC的诊断、预后和治疗具有重大意义。层出不穷的证据表明免疫系统在癌症发生和发展过程中起决定性作用。免疫细胞不仅调节机体的抗肿瘤免疫,并且也对肿瘤细胞增殖和转移等病理变化起到重要的调控作用。免疫治疗近年来越发受到重视,特别是随着CTLA-4（细胞毒T淋巴细胞相关抗原4）和PD-1（程序性死亡受体1）抗体取得良好的临床效果。例如,作为抗PD-1单克隆抗体Nivolumab（纳武利尤单抗）可以通过干扰信号通路阻断PD-1,恢复机体的抗癌免疫反应。免疫治疗可为HCC提供一种安全、有效、有前途的治疗方式。但肝脏的免疫耐受性和肿瘤本身的异质性仍然是主要问题。探求新的影响预后以及免疫治疗的免疫靶基因具有特别重要的价值。国内外对免疫相关基因的研究还很局限。尽管HCC研究中测序技术及芯片技术不断提高,仍然有大量HCC中差异表达免疫相关基因的功能调控分子机制不清楚。到目前为止,仍没有筛选到可以用于临床的诊断、预后或治疗靶标的免疫相关基因。DCK（Deoxycytidine kinase,脱氧胞苷激酶）属于DCK/DGK家族,是几种脱氧核苷及其类似物磷酸化所必需的。DCK也是脱氧核糖核苷挽救的关键酶,是脱氧核糖核酸修复过程中的关键酶,对维持正常的DNA代谢具有重要意义。目前研究表明DCK缺乏与对抗病毒和抗癌化疗药物的耐药性有关。同时有研究报道,DCK在乳腺癌、宫颈癌、食管癌等肿瘤的发生发展中起到重要作用。我们通过生物信息分析学分析发现DCK在HCC中高表达,并且与HCC患者生存相关,DCK的异常高表达提示患者预后不良。然而,DCK在HCC中的具体作用机制尚未报道,有待于进一步探讨。目前,关于免疫相关基因在HCC中的研究尚处于起步阶段,探索和发现新的免疫相关基因及其特异性调控机制,可为研究HCC的发病机制提供新的理论依据,同时为发现新的治疗靶点提供理论基础。本文以此为出发点,研究内容如下:一,以TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas,癌症和肿瘤基因组图谱）和 ImmPort 数据库（The Immunology Database and Analysis Portal,免疫学数据库和分析门户）为基础,利用生物信息学分析筛选出HCC组织及癌旁组织间的差异表达免疫相关基因,进一步挖掘对HCC患者具备预后价值的免疫相关基因。二,多个公开数据库明确肝癌中DCK的表达情况,分析DCK和HCC免疫微环境的关系,检测乙肝相关肝癌及癌旁组织样本中DCK表达,并分析DCK与临床病理参数的关系。三,通过沉默人肝癌细胞系中DCK表达,研究DCK对肝癌细胞系各种恶性生物学行为的影响;通过裸鼠成瘤实验评价DCK对肝癌细胞HepG2体内成瘤能力的影响;初步探讨DCK调控HCC发生进展的分子机制。第一部分 肝细胞癌候选免疫相关基因的筛选目的:以TCGA数据库和ImmPort数据库为基础,利用生物信息学分析筛选出HCC组织及癌旁组织间的差异表达免疫相关基因,进一步挖掘对HCC患者具有预后价值的免疫相关基因,并确定在HCC发生发展过程中起关键作用的免疫相关基因。方法:1.应用TCGA数据库、ImmPort数据库筛选HCC组织中差异表达的免疫相关基因。下载TCGA数据库中的HCC患者的基因表达数据及临床数据,在ImmPort数据库中下载1811个免疫相关基因。在R软件中用Wilcoxon检验法检测HCC组织和癌旁组织中差异表达的免疫相关基因,评估差异表达免疫相关基因的潜在生物学功能。2.筛选与生存相关的差异表达免疫相关基因。只对随访时间少于2000天的HCC患者进行生存分析。在R软件中分别利用单因素Cox分析和Kaplan-Meier生存分析方法查找生存相关的差异表达免疫相关基因,P值小于0.01作为筛选条件,使用两种方法查找后,保留共同存在的有预后价值的差异表达免疫相关基因。3.独立预后因子的筛选。将上一步得到的每一个基因和临床数据（年龄、分级、病理分期、T分期等）一起进行多因素Cox分析,P值小于0.01作为筛选条件,筛选出独立预后免疫相关基因。4.预测分析调控HCC独立预后免疫相关基因的转录因子。为了研究免疫相关基因的调控机制,我们提取了顺反组癌症数据库（Cistromecancer）里的 318 个转录因子（Transcriptionfactors,TFs）进行后续研究。利用TCGA中数据找出差异表达的转录因子,对它们进行生存分析。然后使用R中的cor.test函数得到生存相关的转录因子与独立预后免疫相关基因的相关性。过滤标准为相关系数大于0.5,P值小于0.05。Cytoscape软件用于构建和可视化调控网络。结果:1.HCC组织中差异表达的免疫相关基因结果。从TCGA数据库中下载374例HCC和50例癌旁组织预处理的RNA-Seq-FPKM数据进行下一步分析。HCC组织与癌旁组织相比共有329个免疫相关基因（267个上调,62个下调）差异表达。通过GO和KEGG分析进一步分析了329个差异表达的免疫相关基因的生物学功能。2.筛选与生存相关的差异表达免疫相关基因结果。我们利用差异分析得到的329个差异表达的免疫相关基因进行生存分析。通过原始数据发现随访时间少于2000天的HCC患者共337例。应用单因素Cox分析对337例HCC组织中329个差异免疫相关基因的表达进行检测,共发现64个生存相关的免疫相关基因。采用Kaplan-Meier生存分析方法得到58个生存相关的免疫相关基因。应用韦恩图找到32个共同存在的生存相关的免疫相关基因,均为高风险基因。3.独立预后免疫相关基因筛选结果。将上述得到的32个免疫相关基因进行独立预后分析,得到12个免疫相关基因可以作为独立预后基因。其中,DCK在多种恶性肿瘤中异常表达并参与肿瘤的起始和进展。然而DCK在HCC中的具体作用机制尚未阐明,有待于进一步探讨。4.转录因子与独立预后免疫相关基因的调控网络构建。HCC组织中与癌旁组织相比,共有117个转录因子（108个上调,9个下调）差异表达。应用单因素Cox分析和Kaplan-Meier生存分析方法得到27个生存相关的转录因子。根据过滤标准,共鉴定出25个生存相关的转录因子和9个独立预后免疫相关基因,以建立网络。其中,HCFC1调节了大多数独立预后免疫相关基因。我们预测DCK最重要的上游转录因子是HCFC1。结论:1.通过对TCGA和ImmPort数据库分析,得到HCC 12个差异表达的免疫相关基因与预后密切相关并且可以独立预测预后。其中DCK在HCC中的生物学作用尚未明确,可能是HCC的关键免疫相关基因。2.预测出25个转录因子可以调控一个或多个免疫相关基因,其中HCFC1在HCC中有重要的调控作用,初步明确了 HCFC1是DCK最重要的上游调控转录因子。第二部分 DCK在肝癌中的表达及与乙肝相关肝癌患者病理参数的相关分析目的:多个公开数据库明确肝癌中DCK的表达情况。探讨DCK和HCC免疫微环境的关系,预测HCC中DCK调控的相关通路。检测乙肝相关肝癌组织中DCK的表达,研究DCK表达与乙肝相关肝癌患者临床病理参数的关系。检测人不同的肝癌细胞系（HepG2,SKHEP1）和正常肝细胞HL-7702中DCK mRNA和蛋白的表达水平。方法:1.通过oncomine数据库、GEPIA网站和ICGC数据库,查询DCK在肝癌组织及对应正常组织中的表达情况。2.利用 TIMER 网站（Tumor Immune Estimation Resource,肿瘤免疫评估资源）调查TCGAHCC患者DCK与HCC免疫微环境的关系;通过GSEA方法预测HCC中DCK调控的相关通路。3.通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测53例乙肝相关肝癌肿瘤组织及癌旁组织样本中DCK表达量,分析DCK与临床病理参数的关系。4.实时荧光定量PCR和Western blot分别检测了人不同的肝癌细胞系（HepG2,SKHEP1）和正常肝细胞HL-7702中DCK的表达水平。结果:1.多个数据库结果均显示,DCK在肝癌组织较正常组织高表达。2.DCK表达与HCC免疫微环境中CD4+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞、B细胞、巨噬细胞和CD8+T细胞均正相关。DCK可用于评估肿瘤组织中免疫细胞浸润的水平。GSEA显示DCK可以正调控多种通路进而影响HCC的发生发展,包括WNT信号通路,ERBB信号通路等。3.实时荧光定量PCR检测显示,乙肝相关肝癌患者肝癌组织中DCK表达水平较癌旁组织显着升高。DCK的表达与年龄、性别无关,但与肿瘤大小、Edmondson分级、微血管侵犯相关。4.HepG2,SKHEP1中DCK的mRNA和蛋白表达水平均高于正常肝细胞HL-7702。结论:DCK在肝癌组织中呈高表达。DCK表达水平与HCC免疫微环境中免疫细胞正相关,提示DCK可以反映HCC免疫微环境的状况。DCK在乙肝相关肝癌患者癌组织中高表达,且与多种临床病理参数相关。HepG2,SKHEP1中DCK mRNA和蛋白均高表达,可用于后续实验。第三部分 DCK对肝癌细胞恶性生物学行为的影响目的:通过沉默肝癌细胞HepG2,SKHEP1中的DCK表达,检测DCK对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭等恶性生物学行为的影响,然后经过裸鼠成瘤实验进一步验证;初步探讨DCK促进HCC发生进展的分子机制。方法:应用siRNA技术（small interfering RNA,小干扰RNA）沉默DCK在肝癌细胞系中的表达,采用qRT-PCR和Western blot筛选出干扰效率最高的序列。利用CCK-8增殖实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、流式细胞技术检验DCK基因低表达后肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力。裸鼠皮下注射DCK沉默组（siRNA-DCK组）和阴性对照组siRNA（NC组）的肝癌细胞HepG2。4周后处死裸鼠,剥离肿瘤并称量。利用Western blot、细胞免疫荧光检测了肝癌细胞中干扰DCK后,对WNT信号通路主要蛋白水平（Wnt-1,β-catenin,c-myc）的影响。结果:成功筛选出1条siRNA用于后续实验。CCK-8实验发现沉默表达DCK的肝癌细胞系HepG2和SKHEP1的增殖能力显着减弱。细胞划痕实验及Transwell侵袭实验显示沉默表达DCK的肝癌细胞HepG2和SKHEP1细胞的迁移和侵袭能力显着减弱。流式分析显示DCK下调可促进肝癌细胞的凋亡。动物实验结果表明,DCK沉默组肿瘤生长速度缓慢,质量及体积明显减小。抑制DCK表达后WNT信号通路主要蛋白表达降低,这提示DCK异常活化WNT信号通路,使关键信号分子Wnt-1,β-catenin,c-myc表达增加,促进肝癌的恶性进程。结论:体外实验中,沉默DCK基因抑制肝癌细胞HepG2和SKHEP1的增殖、迁移和侵袭能力、促进肝癌细胞的凋亡。动物实验表明,沉默DCK对裸鼠成瘤能力具有显着的抑制作用。DCK可能通过激活WNT信号通路影响肝癌的恶性生物学行为。DCK有望作为HCC患者治疗新的靶标。
王婧雯[4]（2021）在《MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究》文中研究指明第一部分慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究研究背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）持续的感染是世界性的公共卫生问题,全球至少有2.57亿人有慢性HBV感染。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）会对肝脏造成损伤,随着疾病的发展会导致肝硬化甚至是肝癌,因此对CHB进行及时有效的治疗显得尤为重要。Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）是治疗CHB的一线药物。Ⅰ型IFN与细胞膜表面的Ⅰ型干扰素受体（type Ⅰ interferon receptor,IFNAR）的亚基IFNAR1和IFNAR2结合,形成异二聚体配体受体复合物,激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子1（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 1,JAK/STAT1）信号通路,产生抗病毒蛋白发挥抗病毒作用。Ⅰ型IFN还可以通过STAT1使MDM2转录下调来诱导p53蛋白的稳定以发挥抗病毒的作用。STAT1既是Ⅰ型IFN信号转导所必需的,同时也可以负调控鼠双微体2（mouse double minute-2,MDM2）,p53的降解和反式激活受到MDM2调控,抑制了 p53的表达作用。JAK/STAT1途径激活后,STAT1表达升高抑制了 MDM2的表达,p53表达增加增强了 Ⅰ型IFN抗病毒信号并促进HBV病毒感染细胞的凋亡,抑制HBV在细胞中的复制,发挥p53的先天抗病毒免疫作用。表观遗传学中有一类是DNA甲基化,是一种对DNA的化学修饰。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶作用下获得甲基基团,进而在不改变DNA序列的情况下影响基因表达。氧化应激是机体氧化状态和抗氧化状态的动态平衡被打破,更倾向于氧化状态。有研究指出氧化应激会引起表观遗传学改变,这可能与CHB的发生和发展有关。现在尚未有关于CHB患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态及与氧化应激关系的研究。研究目的1.明确 CHB 患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs 中 IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。2.明确CHB患者和HCs的PBMCs中IFNAR mRNA和MDM2 mRNA表达水平。3.研究CHB患者PBMCs中的INFAR启动子甲基化对MDM2 mRNA相对表达量的影响。4.研究CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化与氧化应激之间的关系。研究方法本研究共纳入169例研究对象,其中CHB患者148例,HCs 21例,于2014年1月到2016年10月在山东大学齐鲁医院肝病科入组。CHB的纳入标准按照 2009 年美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的《乙型肝炎指南》,乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阳性时间至少6个月。甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）被用来检测 PBMCs 中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测 IFNAR mRNA 及 MDM2 mRNA 的相对表达量。酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血浆中丙二醛（malondialdehyde,MDA）和谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平。统计分析采用 SPSS 22.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 5.0 软件（San Diego,CA,USA）。连续变量的组间差异比较使用Mann-Whitney U检验。使用卡方检验来比较分类变量的组间差异。变量间的相关性使用的是Spearman等级相关检验。当p<0.05时,认为差异具有统计学的意义。研究结果1.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化的频率明显低于HCs（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p<0.001）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 启动子甲基化频率与HCs相比无明显差异（p>0.05）。2.CHB患者PBMCs中IFNAR mRNA表达量相较于HCs明显升高（IFNAR1:p=0.031;IFNAR2:p=0.027）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 mRNA 表达量与HCs相比无明显差异（p>0.05）。3.CHB患者中IFNAR启动子甲基化组IFNAR mRNA表达量相较于非甲基化组明显降低（IFNAR1:p=0.023;IFNAR2:p=0.044）。4.CHB患者中存在IFANR启动子甲基化的患者,其MDM2 mRNA相对表达量是明显高于IFNAR启动子非甲基化组中患者的相对表达量（IFNAR1:p=0.001,IFNAR2:p=0.008）。5.CHB患者血浆中的MDA是明显高于HCs,而GSH是低于HCs（MDA:p<0.001;GSH:p<0.001）。在CHB患者中IFNAR启动子甲基化组的MDA是明显高于非甲基化组（IFNAR1:p=0.018;IFNAR2:p=0.041）,GSH则是明显低于非甲基化组的（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p=0.029）。研究结论1.CHB患者PBMCs中IFNAR启动子是存在甲基化异常的,同时IFNAR启动子甲基化的频率是低于HCs。CHB患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的水平与HCs相比是没有差异的。2.CHB患者PBMCs中的IFNAR发生甲基化后,导致IFNAR mRNA相对表达量降低并伴有MDM2 mRNA表达量升高,提示IFNAR甲基化可能影响MDM2 mRNA的表达,两者可能共同影响Ⅰ型IFN抗病毒的效果。3.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化可能是与氧化应激有关系的,这或许为CHB中氧化应激诱导的表观遗传调控提供了新见解。第二部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究研究背景原发性肝癌中大约有90%是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。HCC是世界上最常见的癌症之一,其发病率在癌症的发病率中排第五位,在癌症死亡率中排第三位。在中国每年因肝癌死亡的约有38.3万人,约占到全球肝癌死亡人数的51%。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染、酒精性肝病、慢性丙型肝炎病毒感染及非酒精性脂肪性肝炎等是导致HCC发生的主要的危险因素。在中国,慢性乙型肝炎病毒感染导致的乙肝相关HCC最为常见。虽然现在的医疗技术不断发展、诊断水平得以提高、影像学检查手段更加完善,但由于HCC通常起病隐匿,发现时一般已处于中晚期,而手术切除和肝移植适用于治疗早期发现的HCC,大部分HCC患者会错过治疗的最佳时机。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）是最常用于诊断HCC的标志物,但是大约40%的HCC患者血清中AFP的水平并不升高,因此寻找更加灵敏且无创的生物标志物显得尤为重要。肿瘤发生发展的重要原因之一是DNA甲基化,虽然DNA的序列没有发生改变但是对基因表达的影响是可遗传的。DNA甲基化对基因表达非常重要,同时也会对细胞产生不良后果。DNA甲基化包括DNA高甲基化和DNA低甲基化,两者都是常见的表观遗传学特征。目前关于DNA低甲基化对机体产生的影响很少有研究。在大多数情况下,DNA低甲基化是指与“正常”甲基化水平相比有所降低,如和正常细胞或者组织进行比较,与基因表达的增加有关。DNA低甲基化在肿瘤中较为常见,如肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌等。基因的低甲基化可作为诊断肿瘤的生物标志物。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）可以对p53肿瘤抑制因子进行负调控,可以泛素化降解p53,也可以结合p53的转录激活域以调节p53的表达。通常情况下,MDM2与p53之间存在可以自我调节的负反馈回路,以确保它们之间的动态平衡。然而,在肿瘤中该负反馈环通常被破坏。尤其是MDM2的过表达与多种肿瘤有关,如肉瘤、肝癌和胃癌。无论p53处于何种状态,过表达的癌蛋白MDM2不仅与p53结合并负调控p53,而且还有助于HCC的发生和进展。但是目前关于乙肝相关HCC患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中 MDM2 启动子甲基化状态以及诊断价值尚未有研究。研究目的本研究的主要目的是探讨乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态,以及对乙肝相关HCC的诊断价值。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的患者,包括100例乙肝HCC患者,31例肝硬化（liver cirrhosis,LC）患者以及37例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者,入组时间为2016年6月至2018年2月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发表的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且要求乙肝表面抗原阳性大于6个月。LC患者的入组条件根据《2015年日本胃肠病学会肝硬化循证医学临床实践指南》。2018年,AASLD中《慢性乙型肝炎的预防、诊断、治疗更新:AASLD 2018乙型肝炎指南》作为CHB患者的筛选标准。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA 的 相对表达量。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）、GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）和 MedCalc 软件（MedCalc,Ostend,Belgium）。使用Mann-Whitney U检验或者Kruskal-Wallis H检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。通过二分类logistic回归分析寻找影响MDM2启动子甲基化状态的危险因素。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理特征的相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。通过受试者工作特征曲线下面积（the area under the receiver operating characteristic curve,AUC）来评估MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合应用对于提高乙肝相关HCC诊断的价值。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.CHB患者中,PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率为72.97%（27/37）,在LC患者中的为64.52%（20/31）,在乙肝相关HCC患者中的为30.00%（30/100）。发现,乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化频率低于CHB（p=0.000）和LC（p=0.001）患者。MDM2启动子甲基化频率在CHB和LC患者是没有统计学差异的（p>0.05）。2.在乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的状态是与远处转移（p=0.040）、TNM 分期（p=0.035）及 BCLC 分期（p=0.044）有明显相关,而与性别、年龄、AFP、血管侵犯、淋巴结转移、肿瘤数量、肿瘤大小之间无相关性（p>0.05）。通过二分类logistic回归分析,结果显示各临床病理特征均不是MDM2启动子甲基化的危险因素（p>0.05）。3.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2 mRNA相对表达量明显高于LC（p=0.010）和 CHB（p=0.003）患者,CHB 和 LC 患者之间 MDM2 mRNA 相对表达水平是没有统计学差异的（p>0.05）。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.024）。4.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2 mRNA相对表达水平是与HBV DNA（p=0.009）、谷丙转氨酶（p=0.016）、谷草转氨酶（p=0.024）有显着相关性的,但是与总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间没有相关性（p>0.05）。5.区分乙肝相关HCC和CHB患者时,PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.756;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.639;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.715。区分乙肝相关HCC与LC患者时,MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.735;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.634;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.673。可见PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。研究结论乙肝相关HCC患者PMBCs中MDM2启动子低甲基化,并且PBMCs中MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。第三部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究研究背景肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种世界范围的发病率高和死亡率高的原发性肝癌。HCC的病因包括肝炎病毒感染（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒）、饮酒、代谢性肝病（尤其是非酒精性脂肪肝）。在中国,感染了慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）导致的乙肝相关HCC更为普遍。DNA低甲基化会导致癌基因的激活,是癌症发生和发展的主要危险因素。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）作为癌基因,在乙肝相关HCC患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中存在MDM2启动子低甲基化且MDM2表达量升高,但是导致MDM2启动子低甲基化的原因并不清楚。许多研究表明,氧化应激会导致基因表观遗传学的改变,其中就包括DNA甲基化状态的改变。氧化应激是机体氧化和抗氧化之间的动态平衡被打破,更倾向于氧化。通过对血浆中氧化剂和抗氧化剂的定量检测及检测相关代谢产物的代谢组学来评估氧化应激。代谢组学被定义为“对内源性代谢物的详尽分析”,已经在寻找疾病生物标志物、探讨癌症发生发展机制中得到广泛应用。代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的补充,能更好的反映生物系统的病理生理状态的变化。目前关于乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子低甲基化和氧化应激的关系尚且没有研究。研究目的1.明确乙肝相关HCC患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和氧化应激的关系。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的117例乙肝相关HCC患者,和招募的26例HCs,入组时间为2016年6月至2019年8月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且乙肝表面抗原阳性大于6个月。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA的相对表达量。血浆中氧化参数丙二醛（malondialdehyde,MDA）和抗氧化参数超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）使用酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）。使用Mann-Whitney U检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理参数相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。选取研究对象中的36例乙肝相关HCC患者和11例HCs,通过超高液相色谱-质谱（ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS）检测血浆中代谢物改变。代谢组学得到的数据通过SIMCA软件（V16.0.2,Umea,Sweden）进行处理,分别获得了主成分分析（principal component analysis,PCA）以及正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）。差异代谢物的筛选标准为OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度（variable importance for the projection,VIP）>1,p<0.05,组间物质定量比值（fold change）>2 或<0.5。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率是明显低于HCs（p<0.001）。对于乙肝相关HCC患者,MDM2启动子甲基化的状态是与TNM分期相关的（p=0.037）,但与性别、年龄、AFP、肿瘤数量、肿瘤大小、血管之间无明显相关性。2.在乙肝相关HCC患者中MDM2 mRNA表达量明显高于HCs（p<0.001）。通过分析发现,乙肝相关HCC患者MDM2 mRNA水平与HBV DNA（p=0.017）和 ALT（p=0.018）以及 AST（p=0.034）表现为正相关,但与 TBIL（p=0.072）、ALB（p=0.596）和PT（p=0.762）没有相关性。并且,在乙肝相关HCC患者中MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.027）。3.乙肝相关HCC患者血浆中氧化剂MDA水平明显高于HCs（p<0.001）,抗氧化剂SOD和GSH水平明显低于HCs（SOD:p=0.009;GSH:p=0.040）。同时,在乙肝相关HCC患者中,MDM2启动子非甲基化组氧化剂MDA水平明显高于甲基化组（p=0.027）,而抗氧化剂SOD和GSH水平低于甲基化组（SOD:p<0.001;GSH:p=0.017）。4.乙肝相关HCC患者血浆中代谢物的改变和HCs存在显着差异,差异代谢物共有216种。其中正离子模式中检测到的差异代谢物包含了 144种,上调的差异代谢物包含了 88种,下调的差异代谢物包含了 56种;负离子模式中检测到的差异代谢物包含了 72种,上调的差异代谢物包含了 51种,下调的差异代谢物包含了 21种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,胆汁酸,脂肪酸类,磷脂,糖类,有机酸类和有机杂环化合物及其他类化合物。5.乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组的差异代谢物是有明显区别的,差异代谢物包含了 81种。正离子模式包含有52种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有33种,降低的差异代谢物有19种;负离子模式中包含有29种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有19种,降低的差异代谢物有10种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,脂肪酸类,磷脂,胆汁酸,有机酸和其他类化合物。并且我们发现,在MDM2启动子甲基化组具有抗氧化作用的代谢物消退素D1、亮氨酸等明显高于MDM2启动子非甲基化组（p<0.05）,同时可以提供甲基的S-腺苷甲硫氨酸水平明显高于非甲基化组（p=0.029）,而与氧化损伤有关的代谢物吲哚硫酸盐、硫酸对甲酚等明显低于非甲基化组（p<0.05）。6.乙肝相关HCC患者和HCs血浆差异代谢物相比,发现主要涉及到了精氨酸和脯氨酸的代谢、精氨酸和鸟氨酸的代谢、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢、氮代谢。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组血浆差异代谢物相比,发现差异代谢物主要涉及到半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、组氨酸的代谢、戊糖和葡糖醛酸的相互转化、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢。其中半胱氨酸和甲硫氨酸代谢是与乙肝相关HCC患者的MDM2启动子甲基化组和非甲基化组差异代谢物相关性最显着的代谢通路。研究结论1.MDM2启动子甲基化频率在乙肝相关HCC患者的PBMCs中是明显低于HCs。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子低甲基化状态与氧化应激有关,半胱氨酸和甲硫氨酸代谢可能在其中发挥重要作用。
朱晓燃[5]（2021）在《清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响》文中研究指明背景与目的清肝化瘀颗粒是基于姚树坤教授结合中医理论与多年临证经验总结的清肝化瘀方,经完善优化后的现代制剂技术制备而成的颗粒制剂（课题来源于“十二五”“重大新药创制”科技重大专项和北京市科委G20 工程创新研究）,以清热解毒、破瘀散结、健脾益气为治则治法,可针对大多数肝癌患者的证型。前期临床研究与基础实验证实,清肝化瘀方对缓解肝癌患者临床症状、改善生存质量、延长生存期以及提高免疫功能方面具有显着作用,并可以通过多靶点分子,多信号通路对肝癌的多种细胞生物学行为进行调节,深入开发研究价值。苦参是本研究清肝化瘀颗粒的君药之一,其提取物苦参碱单体明确,药理作用广泛,也是清肝化瘀颗粒的主要组分。因此本研究的目的是观察清肝化瘀颗粒对原发性肝癌（Primary liver carcinoma）大鼠的治疗作用,评价其药效学,通过体内凋亡实验和体外细胞实验,初步探究其靶点及作用机制,为临床推广提供理论依据。方法:SPF级雄性6周龄大鼠192只,适应性饲养5天后,造模组（n=180）采用改良后的造模方法,使用二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）诱导肝癌,空白组（n=12）给予等体积生理盐水,取材观察肝脏成癌率>80%时开始干预。将造模组大鼠162只（除去死亡3只和观察不同时间成癌率15只）随机分为模型组、清肝化瘀颗粒低剂量组、清肝化瘀颗粒高剂量组、清肝化瘀颗粒高剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组,每组各27只。清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组分别灌胃清肝化瘀颗粒0.47g/kg、0.93g/kg、1.86g/kg,肝复乐组灌胃肝复乐胶囊0.94g/kg,模型组以10ml/kg灌胃等体积生理盐水,氟尿嘧啶组给予氟尿嘧啶注射液20mg/kg腹腔注射,连续给药8周,于末次给药后每组随机选取6只解剖取材。观察指标包括:造模情况及各组大鼠肝脏大体情况、生存期、肝指数、脾指数及肝脏病理组织变化;丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase,AST）、总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、γ-谷氨酰转肽酶（Glutamyl transpeptidase,GGT）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、α-L-岩藻糖苷酶（Alpha-L-fucosidase,AFU）等肝功能指标;肝癌特异性标志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）;通过流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群;原位末端转移酶标记技术（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）法检测肝癌组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测肝癌组织中Caspase-3的表达。选择清肝化瘀颗粒主要成分苦参碱进行体外细胞实验,用CCK8法（cell counting kit-8）检测苦参碱对人肝癌细胞HepG2细胞的增殖抑制作用,筛选出IC50;定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction,QPCR）检测苦参碱对 HepG2 细胞中 Bax、Bcl-2、P53、Beclinl的基因表达的影响。结果1 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠的治疗作用1.1 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肝脏大体、肝脾指数及生存期的作用①肝脏表面癌结节数:与模型组比较,清肝化瘀颗粒中剂量组、高剂量组和氟尿嘧啶组肝脏表面癌结节数均显着降低。②肝、脾指数:与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量组、中剂量组和高剂量组、肝复乐组及氟尿嘧啶组的大鼠肝指数均显着降低,且清肝化瘀颗粒低剂量组和氟尿嘧啶组的脾指数亦显着降低。③生存期:给药干预8周后,上述各组 PLC 大鼠的存活率分别为 47.62%、52.38%、71.43%、66.67%、52.38%和 85.71%,中位生存期分别为55d、59d、66d、71d、58d和73d。与模型组相比,清肝化瘀颗粒中、高剂量组和氟尿嘧啶组生存期显着延长;与肝复乐组比较,清肝化瘀颗粒高剂量组的生存期显着延长。1.2 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肿瘤标志物AFP的下调作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组大鼠的AFP水平均显着下降;随着清肝化瘀颗粒组给药剂量的增加,AFP水平呈递减趋势,且清肝化瘀颗粒高剂量组与低剂量组间差异显着。1.3 清肝化瘀颗粒缓解PLC大鼠肝损伤,改善其肝功能的作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒高剂量组、氟尿嘧啶组可显着下调AST水平,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组和氟尿嘧啶组均可显着下调血清GGT、AFU、TBIL水平,清肝化瘀颗粒中剂量、高剂量组和氟尿嘧啶组亦可显着下调ALP水平。1.4 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠外周血T淋巴细胞的调节作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组的CD4+细胞数显着上升,CD8+细胞数显着下降,CD4+/CD8+的比率显着升高。2清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肝癌细胞凋亡的影响与模型组相比,清肝化瘀颗粒组的PLC大鼠发生肝癌凋亡的肝癌细胞数量和比例明显增加,Caspase-3在清肝化瘀颗粒剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组显着表达,且清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组间Caspase-3的表达差异显着。3苦参碱对人肝癌细胞HepG2细胞增殖抑制的影响①苦参碱对HepG2细胞活性的影响苦参碱干预24-72小时,HepG2细胞活性显着下降,且苦参碱对肝癌细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性。给药24h、48h、72h后,IC50分别为2.116mg/mL、0.989mg/mL和 1.121mg/mL。②苦参碱以0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL干预HepG2细胞48h,与对照组比较,HepG2细胞Beclin1的表达水平显着下降,且呈浓度依赖性,Bcl-2的表达水平呈不同程度的下降,1.5mg/mL苦参碱可显着下调Bcl-2的表达水平,Bax和P53的表达水平较对照组均有不同程度上升。结论:清热解毒、破瘀散结、健脾益气的清肝化瘀颗粒可有效达到对PLC大鼠的治疗作用,显着延长生存期,其机制可能与通过上调Caspase-3的表达诱导肝癌细胞凋亡起到抗肝癌作用有关。体外实验中清肝化瘀颗粒主要成分苦参碱可通过下调Bcl-2、Beclin1的表达,上调Bax、P53的表达,抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,调控细胞自噬。
张桂冀[6]（2021）在《囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究》文中研究指明背景:原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全球癌症发病第六位,死亡率居全球癌症死亡第四位,而中国肝癌新发病例和死亡病例数约占全球总数的50%以上[1]。在癌症总体发病率和死亡率呈下降趋势的情况下,肝癌的发病率仍以每年2%-3%的增速增长[2]。肝炎病毒感染、过量摄入酒精,黄曲霉毒素等是肝癌发生的高危因素。我国肝癌患者中,约90%为慢性乙型肝炎病毒（Chronic Hepatitis B virus,CHB）感染,因此HBV感染仍是我国肝癌最主要的病因。由于肝癌恶性程度高、较早发生转移,5年生存率在5%-30%之间。目前肝细胞癌的治疗仍是一个医学难题,尤其是对于没有显着血管浸润,局部淋巴结或远端转移的早期肝细胞肝癌病人。因此,深入研究肝细胞肝癌发生发展过程中的具体分子事件,有望为肝癌的早期诊断和治疗提供理论依据以及新的治疗策略。在肝癌的发病过程中往往伴随肝细胞炎症,纤维化和肝细胞异常再生,增生性结节形成过程中遗传变异不断积累,为发育异常的细胞提供增殖、侵袭和生存优势,最终导致肝癌的发生[3]。基因突变及其表达调控的改变与HCC的发生发展有着重要联系,高通量的下一代测序技术解析了HCC的突变图谱,目前已报道的与人类肝癌发生密切相关的驱动基因主要包括TERT、TP53、CTNNB1、NRAS、ARID1A和AXIN1等,对于鉴定HCC中具有抑癌或促癌功能的癌症驱动基因起到了极大的推动作用（表1）。TERT启动子区突变,HBV病毒基因组插入TERT启动子区,染色体易位和基因扩增等导致端粒酶激活是最常见的遗传变异,其突变频率达60%[4]。在30%-50%的HCC样本中发现了编码β-catenin的基因CTNNB1的突变,以及Wnt通路抑制剂AXIN1或APC失活,导致Wnt-β-catenin信号通路激活[5]。其他如TP53,RB1,PTEN,CCNA2,CCNE1,ARID1A基因突变或遗传变异等导致肝癌细胞周期调控异常。ARID1A,ARID2,KMT2家族基因突变引起表观修饰的改变[6,7]。FGF3,FGF4和FGF19基因扩增,TSC1,TSC2和PTEN的失活突变激活AKT-m TOR-MAPK信号通路。NFE2L2,KEAP1突变激活氧化应激途径[8,9]。此外,CCND1,FGF19,VEGFA,MYC和MET基因扩增导致多种致癌信号途径（包括受体酪氨酸激酶）的激活[10]。总体而言,每个HCC患者约含有50个基因组异常改变,其中约20%-25%的HCC患者含有一种以上的致癌突变。根据不同的转录图谱和组织学表型,特定的驱动基因突变可以对HCC进行分子分型[11-13]。由于肝癌的高度异质性,目前仍有必要深入研究HCC发病过程中的相关驱动事件,进一步阐明其在HCC发生发展过程中的作用及具体分子机制。课题组前期对临床HBV相关肝细胞癌队列进行了全外显子测序（whole-exome sequencing,WES）和转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）。通过聚类算法分析,筛选出四个枢纽基因:VPS35,SH3BP4,PPP1R12C和PNO1,与肝癌中已报道的致癌突变存在重叠的功能簇,提示其在肿瘤中的恶性生物学行为,有可能成为新的肿瘤相关基因。通过细胞功能学实验我们发现过表达VPS35在体外显着促进肝癌细胞增殖。囊泡蛋白分选相关蛋白35（Vacuolar Protein Sorting-Associated Protein 35,VPS35）是retromer复合物的关键组分。VPS35的C端与VPS29结合,N端与VPS26结合形成异源三聚体,即货物识别复合物（Cargo recognition complex,CRC）,主要功能是识别并结合细胞内的货物蛋白。CRC复合物与分选连接蛋白（Sorting nexin,SNX）形成的异二聚体一起,构成retromer复合物。最初在酵母中发现retromer复合物介导羧肽酶受体从内体转运至高尔基体[14]。Retromer作为内体蛋白分选机制的重要组成成分,介导货物蛋白从内体转运至高尔基体或直接从内体转运至细胞膜表面（图1）,其功能异常参与神经退行性疾病的发病。通过介导细胞膜上多种货物蛋白的分选,retromer复合物的功能与细胞内重要的生理过程如溶酶体起源、自噬、信号受体的调节和细胞扩散等密切相关。此外,retromer通过调控信号受体的转运和回收,参与了细胞内信号通路的调控,如β2-肾上腺素能受体（β2-adrenergic receptor,β2-AR）[15],甲状旁腺素受体（Parathyroid hormone receptor,PTHR）[16-18]和干扰素受体2（Interferon receptor 2,IFNAR2）[19]等。VPS35与N-Ras相互作用,促进黑素瘤细胞的增殖,沉默VPS35下调丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号,抑制黑素瘤细胞增殖[20,21]。目前VPS35在肝细胞癌和癌旁组织中的表达水平及其在肝癌发生发展过程中的作用和具体机制尚未见相关文献报道。课题组前期通过对临床肝癌组织和癌旁组织进行WES和RNA-Seq测序,通过图表聚类算法筛选枢纽基因,这些枢纽基因可能在HCC中发挥关键作用,因此可能成为功能研究的候选基因。联合细胞功能学鉴定我们筛选出潜在的肝癌驱动相关新基因VPS35,在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中对VPS35基因进行深度挖掘,分析其在肝癌中的致癌作用和调控的关键信号通路。在体内外实验中,我们首先明确了VPS35在临床肝癌样本中的表达水平,证实过表达VPS35促进肝癌细胞增殖,进一步对VPS35敲除的肝癌细胞进行RNA-Seq测序,研究其发挥促癌效应的具体分子机制。本研究在临床HCC队列中鉴定了潜在的HCC候选基因,对于retromer复合物在肿瘤发生发展中的作用提供了新的见解,有望为临床肝癌个性化防治策略提供新的思路。实验方法:1.鉴定潜在的肝癌驱动基因。首先通过图表聚类算法筛选可能在HCC中发挥关键作用的枢纽基因。然后通过细胞功能学验证筛选出潜在的肝癌驱动基因VPS35。利用TCGA数据库资料对VPS35基因进行深度挖掘,分析其在肝细胞癌中的致癌作用和调控的关键信号途径。进一步明确VPS35在肝癌组织中的表达情况。通过TCGA数据库分析VPS35在肝癌组织中的表达及与预后的关系。采用Real-time PCR,Western blot和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）的方法检测VPS35在临床肝癌和癌旁组织中的表达情况。通过Western blot,Real-time PCR实验以及分析TCGA数据库资料从HBV感染、转录因子调控和DNA甲基化三个方面探讨VPS35在肝癌组织中表达上调的机制。2.通过体外细胞功能学实验观察VPS35对肝癌细胞系增殖能力和细胞周期的影响。利用Ad Easy腺病毒载体系统构建过表达VPS35的重组腺病毒表达载体,获得过表达VPS35的肝癌细胞模型;利用CRISPR/Cas9技术构建VPS35特异性敲除的肝癌细胞模型。通过MTS实验、克隆形成实验和Ed U细胞增殖检测观察VPS35对肝癌细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术和Western blot实验观察VPS35对肝癌细胞的细胞周期的调控作用;在裸鼠皮下移植瘤模型中观察VPS35基因敲除对肿瘤生长的影响:皮下注射VPS35敲除的肝癌细胞,观察VPS35敲除对肿瘤生长速度、大小的调控,通过Ki67染色观察肿瘤内细胞增殖能力变化,验证体外实验结果。3.检测VPS35对PI3K/AKT信号通路的调控。对VPS35敲除的肝癌细胞和对照Parental细胞进行转录组测序,对差异表达基因进行通路富集分析,发现这些差异基因主要富集在溶酶体和PI3K/AKT信号通路。通过Real-time PCR在m RNA水平验证VPS35过表达和基因敲除对PI3K/AKT和RAS信号通路相关分子的调控。采用Western blot在蛋白水平验证VPS35过表达和基因敲除对AKT信号活化的影响。采用AKT抑制剂MK2206处理后,通过MTS和克隆形成实验观察MK2206对肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术和Western blot实验观察MK2206对肝癌细胞周期的影响。在裸鼠原位移植瘤模型中观察过表达VPS35对PI3K/AKT信号通路的调控:肝脏原位注射VPS35过表达的肝癌细胞,设置MK2206处理组,观察过表达VPS35对肿瘤生长速度、大小的调控,通过Western blot和IHC染色观察肿瘤内细胞增殖能力的变化,观察MK2206是否可以逆转VPS35的致癌效应,验证体外实验结果。4.探索VPS35激活PI3K/AKT信号的具体机制。通过TCGA数据库HCC队列资料进行相关性分析,发现VPS35表达与RTK家族成员（FGFR3,FGFR3,和NTRK1）呈正相关。通过流式细胞术,Western blot和免疫荧光实验检测VPS35敲除后细胞膜上RTKs表达水平。进一步在VPS35敲除肝癌细胞中重新过表达VPS35,通过Western blot和免疫荧光实验观察回复VPS35是否可以调控细胞膜上FGFR3的表达。结果:1.运用图表聚类算法对发生转录的238个突变等位基因进行蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络分析和基因本体论（Gene ontology,GO）分析,挖掘潜在的肝癌相关新基因。联合MTS和克隆形成实验在体外进行验证,我们筛选出肝癌相关新基因VPS35。通过TCGA数据库分析发现VPS35在肝癌组织中的表达显着上调（P<0.05）。Real-time PCR、Western blot和免疫组化染色检测结果显示与癌旁组织相比,肿瘤组织中VPS35表达水平明显上调。VPS35在肝癌组织中表达上调的机制探讨:HBV感染对VPS35表达水平无明显影响;两个重要的转录因子TBP和TCF3与VPS35的表达成正相关,Real-time PCR实验提示肿瘤组织中TBP和VPS35均表达上调,TCF3表达水平无明显变化;Meth HC DNA甲基化数据库分析显示肝癌组织内（n=204）VPS35启动子甲基化水平显着降低（P=0.037）,因此,基于转录水平和表观修饰的调控可能均参与了VPS35在肝癌组织中的高表达。VPS35与PI3K/AKT信号通路相关基因的体细胞突变互相协同,如FGFR3（P=0.05）。在TCGA数据库中,体细胞VPS35突变或表达上调均与肝癌预后不良相关,提示VPS35在肝癌中的恶性生物学效应。2.VPS35过表达显着促进肝癌细胞增殖能力和肝癌细胞周期G1/S期转换和细胞周期进程;而敲除VPS35显着抑制肝癌细胞增殖,肝癌细胞周期阻滞于G1期。裸鼠皮下移植瘤实验显示VPS35基因敲除显着抑制肿瘤生长。3.RNA-Seq结果显示差异基因主要富集在PI3K/AKT信号通路中,Real-time PCR和Western blot实验验证了过表达VPS35激活RAS和PI3K/AKT信号,VPS35敲除抑制PI3K/AKT信号活化。AKT抑制剂MK2206在体内外可逆转VPS35促肝癌细胞生长和细胞周期进程效应。4.VPS35敲除后肝癌细胞FGFR3染色阳性的细胞百分比显着减少,细胞膜成分中FGFR3表达显着下调。而在VPS35敲除细胞中过表达VPS35可以回复细胞膜上FGFR3的表达水平,提示FGFR3在细胞内的回收增多和（或）溶酶体降解减少,从而激活下游PI3K/AKT信号,促进肝癌细胞增殖。结论:课题组前期通过对临床肝癌组织和匹配的癌旁硬化组织进行WES和RNA-Seq测序,通过图表聚类算法和细胞功能学验证,我们鉴定了一个潜在的肝癌驱动候选基因VPS35。VPS35在肝癌组织的表达明显高于癌旁组织,体内外实验中均证明VPS35通过促进肝癌细胞周期G1/S期转换促进肝癌细胞增殖。研究其机制发现:VPS35作为retromer复合物的关键组分,通过介导细胞膜表面FGFR3受体的循环,激活下游PI3K/AKT信号,促进肝癌细胞G1期到S期转换和细胞周期进程,促进肝癌细胞增殖;而AKT抑制剂MK2206可逆转VPS35的致癌效应。本课题阐释了VPS35通过激活PI3K/AKT信号促进肝癌增殖的具体分子机制,对于retromer复合物在肿瘤发生发展中的作用提供了新的见解,有望为临床肝癌个性化防治策略提供新的思路。
王晴[7]（2021）在《SIRT1在乙型肝炎病毒蛋白X（HBx）促进肝细胞癌发生发展中的作用及其机制研究》文中研究指明背景:肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一,慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染与HCC的发展密切相关。乙肝相关性肝癌的发病机制尚未完全清楚,但有证据表明,病毒蛋白HBx可通过参与宿主基因转录、细胞信号转导以及细胞周期和凋亡等过程,促进乙肝相关性肝癌的发生发展。但HBx促进乙肝相关性肝癌的分子机制尚未完全阐明。因此,探究HBx在乙肝相关性肝癌中的作用机制十分必要。Sirtuin 1（SIRT1）作为Sirtuin家族的一员,被证实可促进HBV的复制;同时多项研究发现SIRT1还可以促进HCC的增殖和转移。但SIRT1是否可以与病毒蛋白HBx相互作用进而促进HCC发生发展尚不清楚。深入探究SIRT1在乙肝相关性肝癌中的作用以及SIRT1和HBx之间的潜在关联,有利于解析乙肝相关性肝癌的作用机制,为乙肝相关性肝癌的治疗提供理论依据。目的:探讨SIRT1在乙肝相关性肝癌中的表达水平,进一步分析HBx与SIRT1之间的相互调控关系,最后充分解析SIRT1/HBx调控乙肝相关性肝癌的分子机制,为乙肝相关肝癌的治疗提供新的思路。方法:1.明确SIRT1与乙肝相关性肝癌转移的关系:收集10例乙肝相关性肝癌患者的肝组织,根据肿瘤是否转移将其分为两组。分别采用real-time PCR和Western blot检测组织中SIRT1的mRNA和蛋白质水平;Western blot法检测组织中上皮-间充质转化相关标志物（E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白）的蛋白质水平。2.探讨SIRT1与HBV的关系:利用real-time PCR和Western blot检测HBV表达的肝癌细胞中SIRT1的mRNA和蛋白质水平。3.探究SIRT1与病毒蛋白的关系:将HBx、HBc、HBs和HBp过表达质粒瞬时转染至肝癌细胞Huh-7中,real-time PCR和Western blot检测细胞中SIRT1的mRNA和蛋白质水平;在表达HBx的肝癌细胞Huh-7和HepG2中过表达及沉默SIRT1后,Western blot检测细胞中HBx的蛋白质水平。4.阐明SIRT1在HBx诱导的肝癌中的功能作用:在Hep AD38及表达HBx的肝癌细胞Huh-7和HepG2中过表达及沉默SIRT1,利用Western blot、细胞增殖实验、伤口愈合实验和转移侵袭实验等检测SIRT1对HBx诱导的肝癌增殖、迁移和侵袭的影响。5.评估SIRT1抑制剂烟酰胺的抗肿瘤作用:MTT法检测烟酰胺在Hep AD38、HepG2及Huh-7细胞中的毒性作用;细胞增殖实验、伤口愈合实验分析烟酰胺对表达HBx的肝癌细胞Huh-7和HepG2增殖和迁移的影响。结果:1.SIRT1与乙肝相关性肝癌的转移密切相关:与非转移组患者相比,转移组患者的肿瘤肝组织中SIRT1的表达明显增加;同时上皮标志物E-钙粘蛋白的表达减少而间充质标志物N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达增加。2.HBV可上调SIRT1的表达:与对照组相比,HBV表达的肝癌细胞中SIRT1的mRNA和蛋白质水平均明显升高。3.SIRT1与HBx之间存在正向调节关系:过表达HBx可以增加SIRT1的mRNA和蛋白质水平;过表达SIRT1可以增加HBx的蛋白水平。4.HBx通过调节SIRT1促进HCC发生发展:功能学研究显示,过表达SIRT1可显着增强Hep AD38及表达HBx的肝癌细胞HepG2和Huh-7的增殖、迁移和侵袭,沉默SIRT1时则相反。5.SIRT1抑制剂烟酰胺具有抗肿瘤作用:烟酰胺在Hep AD38、HepG2和Huh-7细胞中的CC50分别为58.3m M、52.9m M和55.7m M;烟酰胺可呈剂量依赖性的抑制表达HBx的肝癌细胞的增殖及迁移。结论:本研究证实了SIRT1在乙肝相关性肝癌中表达水平明显升高,阐明了SIRT1可促进HBx诱导的肝癌的增殖以及转移侵袭。
赵鑫[8]（2021）在《基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究》文中研究说明肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的肝脏恶性肿瘤之一,其中乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）的感染是HCC的主要病因。目前HCC占我国所有新发癌症病例的第五位,所有癌症致死性疾病的第二位,严重危害着人类健康。HCC的早期诊断、综合及个体化治疗、治疗后监测复发及远处转移,是提高肝癌诊断率及治愈率的重要手段。MiRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内具有多种重要的调节作用,与细胞生长、代谢、凋亡、肿瘤发生、肿瘤细胞侵袭性以及肿瘤治疗等方面存在密切关系。迄今为止,许多研究证实了miRNA在多种恶性肿瘤中的异常表达,如乳腺癌、脑癌、大肠癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌等。在肝癌中,miRNA可作为诊断标记物miRNA辅助临床肝癌诊治,同时也通过多种细胞信号通路影响肝癌发生发展。自噬（Autophagy）作为细胞的一种自我保护机制,与肿瘤发生息息相关。由于自噬与细胞代谢、蛋白质和细胞器周转、细胞生存等密切相关,所以自噬在肿瘤中的作用呈现动态及多样性变化,具有高度的复杂性。MiRNA如何调节自噬过程至今尚未明确,持续发现的调节自噬新的miRNA提示我们,miRNA作为重要分子可通过靶向调控自噬相关基因的表达,影响自噬的过程,调节疾病进展,因此值得进一步探索异常表达的miRNA调控自噬与疾病进展的关系。本研究通过公共数据库筛选与肝癌自噬相关的miRNA,并分析它们的临床意义;在肝癌细胞系,通过缺氧诱导自噬,收集各组细胞进行miRNA和mRNA测序,根据转录组测序数据分析不同肝癌细胞中自噬相关miRNA及其可能作用机制;并初步确定参与肝癌自噬的关键miRNA及其靶基因;稳定过表达/抑制miRNA后检测自噬活性,观察自噬现象,检测miRNA下游信号通路基因变化,为miRNA在HCC诊断、治疗及随访提供理论及实验基础。第一部分:基于TCGA数据库机器学习法研究miRNA作为肝癌诊断生物标志物的价值目的:筛选潜在的HCC诊断生物标志物,初步确定具有诊断潜力的miRNA。方法:根据癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas database,T CGA）数据库,通过随机森林算法初步确定最具诊断价值的差异表达的miRNA。建立分类模型以区分患有肝细胞癌的患者和正常个体,然后在差异表达的miRNA和mRNA之间构建调控网络。使用GSE63046数据集来验证鉴定出的差异表达miRNA的表达,同时进行差异表达miRNA的诊断和预后分析。结果:1.总共发现14个差异表达的miRNA（均上调）和2,982个差异表达的mRNA（1,989个上调和993下调）,其中hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p和hsa-miR-182-5p被认为可能是肝细胞癌诊断生物标志物;2.这五个miRNA靶向的mRNA包括SFRP1,EDNRB,NR4A3,FHL2,NKX3-1,IL6ST,FOXO1。“胆汁酸的生物合成和胆固醇代谢”通路是这些靶标mRNA最富集的信号通路;3.初步确定的五个miRNA的验证与GSE63046数据集验证结果一致;4.Hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-10b-3p可能对肝细胞癌患者预后具有重要的价值。小结:1.5个差异表达的miRNA可以被视为肝细胞癌患者的诊断生物标志物。2.5个miRNA靶向的mRNA（包括SFRP1,EDNRB,NR4A3,FHL2,NKX3-1,IL6ST和FOXO1）差异表达水平可能与肝细胞癌的发生有关。第二部分:MiRNA作为肝癌诊断生物学标志物的体外验证研究目的:肝癌差异表达miRNA的临床体外验证。方法:留取7例肝细胞癌肝癌组织及癌旁2cm癌旁组织,应用RT-q PCR方法定量分析肝癌差异表达miRNA（hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p、hsa-miR-182-5p）组织水平。结果:7名HCC患者中5个差异表达的miRNA的表达水平全部上调,并且hsa-miR-224-5p上调最为显着,与第一部分的生物信息学分析结果一致。小结:1.5个差异表达的miRNA可以被视为肝细胞癌患者的诊断生物标志物2.肝组织样本miRNA水平与公共数据集研究结果一致。第三部分:基于转录组测序进行肝癌自噬相关的机制研究目的:探索肝癌自噬相关新分子,进一步阐明其在调控自噬影响肝癌中进展的作用机制。方法:本部分首先建立缺氧诱导的细胞自噬模型,通过电子显微镜观察自噬泡的数量。Western Blot和Transwell实验分析自噬相关蛋白表达水平和细胞侵袭力。转录组测序分析对照组和低氧组肝癌细胞差异表达的mRNA和miRNA。建立miRNA-mRNA相互作用网络和miRNA靶向的基因的功能富集分析探索缺氧诱导肝癌自噬的潜在机制。结果:1.我们发现缺氧可能通过诱导自噬促进肝癌细胞的侵袭;2.与正常对照组相比,诱导HCCLM3自噬组和SMMC-7721自噬组中共鉴定出407个共享mRNA和57个共享miRNA。此外,278个mRNA属于癌症自噬特异性mRNA,24个miRNA被鉴定为癌自噬特异性miRNA。小结:1.基于miRNA-mRNA相互作用网络获得了19种高度表达的miRNA。2.Hsa-miR-483-5p,hsa-miR-4739,has-miR-214-3p和has-miR-296-5p可能是与肝癌自噬相关的潜在分子标记物。结论:1.Hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p和hsa-miR-182-5p可能是肝细胞癌诊断标志物。2.临床组织样本证实上述miRNA可能是临床肝癌诊断标记物。3.细胞水平探索发现,hsa-miR-483-5p,hsa-miR-4739,has-miR-214-3p和has-miR-296-5p可能是与肝癌自噬相关的重要分子。4.筛选肝癌及肝癌自噬相关miRNA有助于了解肝癌自噬的潜在分子机制,同时为临床诊断、监测预后提供新的治疗靶点。
原琳[9]（2021）在《慢性HBV感染疾病进展过程中肝细胞LATS1表达及启动子甲基化水平研究》文中研究表明目的:据世界卫生组织报道,全球约2.57亿人为乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染者,每年约有88.7万人死于肝硬化、肝细胞癌、肝衰竭等与HBV感染相关的疾病。HBV可以逃避宿主免疫,难以根治,持续的HBV感染导致的肝细胞反复炎症坏死、纤维化形成,是肝硬化、肝癌等肝脏疾病发生的重要原因。在我国约85%的原发性肝癌患者存在HBV感染,多数患者经历了肝炎-肝纤维化（肝硬化）-肝细胞癌的疾病进展模式,其中机制复杂,尚未完全阐明。Large tumor suppressor kinase 1（LATS1）是Hippo信号通路的核心组件,通过抑制转录辅激活因子Yes associated protein（YAP）的生物学作用,调节细胞增殖与凋亡之间的动态平衡,抑制组织和器官过度增殖。而Hippo信号通路失活,YAP过度活化,已被证实与包括肝癌在内的多种肿瘤形成密切相关。目前还有研究显示,YAP可以调控肝星状细胞活化,从而影响肝纤维化进展或逆转。这些都提示我们LATS1作为YAP的上游调控因子可能在慢性HBV感染后肝脏炎症修复、肝纤维化进展、以及肝细胞癌发生过程中起重要作用,但目前尚缺乏相关研究。DNA甲基化是重要的表观遗传学方式之一,与肿瘤等疾病进展相关,最近有研究显示HBV可通过增加DNA-甲基转移酶等方式诱导抑癌基因高甲基化低表达,与肝癌形成有关。已有研究显示LATS1作为具有潜力的抑癌因子在某些肝癌细胞系中呈现高甲基化低表达状态,但在HBV感染后肝炎-肝纤维化（肝硬化）-肝细胞癌这一疾病进展过程LATS1启动子甲基化状态及表达水平如何,目前尚不清楚。本研究的目的:1.研究慢性HBV感染后不同疾病状态下LATS1的表达水平和变化规律。2.研究LATS1的表达水平在慢性HBV感染后疾病进展过程中的临床意义。3.研究LATS1启动子甲基化水平是否为慢性HBV感染后疾病不同状态下LATS1表达变化的调控机制。研究方法:1.研究对象和分组:113例就诊于中国医科大学附属盛京医院感染科的慢性HBV感染者,行肝脏穿刺术,并经Metavir评分系统评价肝组织炎症及纤维化程度;73例于中国医科大学附属盛京医院普外科接受手术治疗的HBV相关肝细胞癌患者。在纳入的慢性HBV感染者中肝纤维化F0级24例,F1级23例,F2级22例,F3级23例,F4级（包括肝硬化）21例。F0-1级纤维化认定为低纤维化组,F2级为中纤维组,F3-4为高纤维化组,其中22例在数年后进行了第二次肝脏穿刺术,纤维化程度较前进展或减轻。73例肝细胞癌患者中有54例存在乙肝肝硬化基础,其中5例具有未发生肝癌时肝硬化阶段的组织标本。2.应用免疫组化和蛋白印迹（western blot）的方法检测肝纤维化组织中LATS1、YAP和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,分析它们之间的相关性。分析肝细胞LATS1、细胞核YAP与肝纤维化程度之间的相关性。分析LATS1与慢性HBV感染者临床病理指标之间相关性。实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）的方法检测不同程度肝纤维化组织中LATS1基因m RNA的相对表达。3.应用免疫组化的方法检测HBV相关肝细胞癌、癌旁组织以及肝硬化组织LATS1表达,分析肝硬化进展为肝细胞癌过程中LATS1的变化规律。分析癌组织LATS1表达与肝细胞癌患者临床病理指标之间的相关性。q RT-PCR的方法检测LATS1基因m RNA在肝细胞癌和癌旁组织中的相对表达。应用受试者工作曲线评价肝硬化组织LATS1表达水平对肝细胞癌的诊断价值。4.应用甲基化特异性PCR（MSPCR）的方法定性分析25例F0-4级肝纤维化组织,30例肝细胞癌及癌旁组织细胞中LATS1启动子甲基化状态,亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）方法定量分析LATS1启动子甲基化水平。分析LATS1启动子甲基化状态与LATS1表达水平之间的相关性。分析癌组织及癌旁组织LATS1甲基化状态与肝细胞癌患者临床病理指标之间的相关性。5.应用western blot方法和MSPCR方法筛选出Hep G2,Hep3B,Huh7,PLC/PRF/5肝癌细胞系和HL-7702肝细胞系中LATS1启动子高甲基化低表达的细胞系,给予5-氮杂胞苷去甲基化处理,72小时后用MSPCR方法检测LATS1启动子甲基化状态,western blot方法检测LATS1、YAP、磷酸化YAP（p-YAP）的表达变化,研究LATS1启动子甲基化对LATS1表达和Hippo通路的影响。结果:1.肝组织LATS1免疫组化评分:F0级10.01±1.71,F1级9.34±1.97,F2级8.01±1.82,F3级6.51±1.74,F4级（包括肝硬化）5.83±1.52,LATS1的表达水平随肝纤维化程度加重而减低,p<0.001。LATS1基因m RNA水平也随纤维化程度加重而减低,p=0.001;2.肝组织中LATS1表达与肝纤维化程度独立负相关（OR=0.501;p=0.006;95%Cl 0.307-0.820）,与HBV-DNA定量独立正相关（OR=3.823;p=0.004;95%Cl1.540-9.492）;肝组织LATS1表达水平低与HBe Ag阴转独立相关（OR=0.162;p=0.009;95%Cl 0.041-0.632）;3.肝细胞核YAP表达免疫组化评分:低纤维化组（F0-1级）0.8±0.67,中纤维化组（F2级）1.99±0.67,高纤维化组（F3-4级）2.81±0.57,肝细胞核中YAP表达水平随纤维化程度加重而增多p<0.001;4.10例肝纤维化自然进展加重的患者中,9例在纤维化加重后LATS1表达减少,10例核YAP表达全部增多。12例抗病毒治疗后纤维化减轻的患者中,有7例纤维化减轻后LATS1表达增加,9例核YAP表达减少;5.肝纤维化程度相同的前提下,LATS1低表达者血清中有更高的III型胶原蛋白和透明质酸表达;肝脏中LATS1表达低者,p-YAP表达低,α-SMA表达高。6.5例由乙肝肝硬化进展为肝细胞癌的患者,肝硬化组织LATS1表达水平明显低于癌变后癌旁肝硬化组织（p=0.003）,高于癌组织（p=0.016）。26例乙肝肝硬化病例与54例有肝硬化基础的肝细胞癌病例比较,肝硬化组织LATS1表达水平明显低于癌旁肝硬化组织（p<0.001）,高于癌组织（p=0.033）。7.肝硬化组织LATS1表达水平联合血清甲胎蛋白（AFP）对肝细胞癌具有更好预测价值:AUC=0.884（0.810,0.958）,诊断敏感度77.80%,特异度可以96.2%。8.73例HBV相关肝细胞癌组织LATS1的免疫组化评分为4.90±2.31,癌旁组织为8.68±2.37,癌组织中LATS1的表达显着低于癌旁组织（p<0.001）。癌组织中LATS1基因m RNA的表达也显着低于癌旁组织（p<0.001）。肝癌组织中LATS1的表达与肝细胞癌分化程度正相关,与血清AFP水平负相关;9.MSPCR定性分析LATS1基因启动子甲基化状态,30例肝细胞癌组织中有22例（73.33%）为甲基化,而30例癌旁组织中有11例（36.67%）为甲基化,肝癌组织LATS1启动子甲基化程度显着高于癌旁组织（p=0.009）。不同程度肝纤维化组织LATS1启动子甲基化程度无明显差别;10.33例LATS1启动子甲基化的样本中有25例LATS1低表达,8例高表达;而27例非甲基化的样本中有仅3例低表达,24例高表达,LATS1启动子区域甲基化状态与LATS1的表达负相关,p<0.001;11.在发生肝癌早期复发的11个病例中有8例（72.73%）癌旁组织LATS1启动子发生甲基化;而未出现早期复发的19个病例中仅3例（15.79%）LATS1启动子甲基化,癌旁组织甲基化状态与肝细胞癌术后早期复发相关,p=0.004;12.BSP定量分析LATS1启动子甲基化程度,癌旁组织甲基化程度明显低于癌组织,未出现早期复发的癌旁组织甲基化程度明显低于出现早期复发的癌旁组织,p<0.001;13.5-氮杂胞苷去甲基化处理LATS1高甲基化低表达的Hep-3B和Hep-G2细胞系,LATS1基因启动子去甲基化后LATS1的表达上调,p-YAP表达上调。结论:1.慢性HBV感染疾病进展过程中,LATS1表达水平随肝纤维化加重呈下降趋势;肝硬化发生肝细胞癌后,肝细胞癌组织LATS1表达水平较肝硬化组织下降,而癌旁肝硬化组织LATS1表达水平则较肝硬化组织升高;肝细胞癌组织的LATS1表达水平明显低于癌旁组织。2.肝细胞内LATS1表达低,Hippo信号通路活性受抑制,与肝纤维化正在进展相关。3.肝硬化组织LATS1高表达具有一定预测肝细胞癌的价值;癌旁组织LATS1启动子异常高甲基化状态预示肝癌早期复发。4.肝细胞癌及癌旁组织中,LATS1启动子甲基化程度与LATS1表达水平负相关,LATS1启动子甲基化状态可能调控肝细胞癌及癌旁组织LATS1的表达。
马宁[10]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中提出第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
二、HBV感染与hTERT基因表达在肝细胞癌组织中的相关性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV感染与hTERT基因表达在肝细胞癌组织中的相关性研究（论文提纲范文）
（1）PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略名词对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的流行病学 |
| 1.1.1 肝癌的监测 |
| 1.1.2 肝癌的诊断 |
| 1.1.3 肝癌的发病率和死亡率 |
| 1.1.4 肝癌的生存率 |
| 1.1.5 肝癌的风险因素 |
| 1.2 竞争性内源性RNA(ceRNA)在肝细胞癌中的新兴作用 |
| 1.2.1 非编码RNA的特征 |
| 1.2.2 非编码RNA的在癌症中的作用 |
| 1.2.3 ceRNA假说的概述和组成 |
| 1.3 lncRNA介导的ceRNET通过调节HCC中的信号传导途径发挥功能 |
| 1.3.1 NF-κB信号通路 |
| 1.3.2 PI3K/AKT信号通路 |
| 1.3.3 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.3.4 TGF-β信号通路 |
| 1.3.5 JAKs/STAT信号通路 |
| 1.4 lncRNA介导的ceRNET在肝细胞癌中的临床应用 |
| 1.4.1 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌早期检测和诊断 |
| 1.4.2 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌预后和复发 |
| 1.4.3 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌靶向治疗和用药 |
| 1.5 本课题的研究意义、研究内容和创新点 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 创新点 |
| 第二章 在肝癌中构建与PTEN相关的ceRNA调控网络 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验数据与方法 |
| 2.2.1 数据准备与处理 |
| 2.2.2 差异表达基因的筛选 |
| 2.2.3 肝癌ceRNA网络的建立 |
| 2.2.4 功能富集分析 |
| 2.2.5 肝癌生存分析 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 验证肝癌中PTEN过表达的抑癌作用及预后价值 |
| 2.3.2 鉴定差异表达的基因(DEmRNA,DElncRNA和 DEmiRNA) |
| 2.3.3 lnRNA-miRNA-mRNA三重调控网络的构建 |
| 2.3.4 ceRNA网络的构建和验证 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 在肝癌患者中DLEU2L/TAOK1轴的识别及临床相关性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验数据与方法 |
| 3.2.1 相关性分析 |
| 3.2.2 建立特定的肝癌预后模型 |
| 3.2.3 验证TAOK1在HCC中的异常表达 |
| 3.2.4 统计分析 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 预后模型的初建立 |
| 3.3.2 DLEU2L/TAOK1轴在肝癌患者中的临床意义 |
| 3.3.3 TAOK1 异常高表达的验证 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 肝癌预后模型DLEU2L/TAOK1的免疫组化分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验数据与方法 |
| 4.2.1 肝癌样本收集 |
| 4.2.2 主要耗材及试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 TAOK1蛋白在Alb-Cmyc自发成瘤小鼠肝癌组织和正常小鼠肝组织中的表达 |
| 4.3.2 TAOK1蛋白在人肝癌和相应癌旁组织中的表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 预后模型DLEU2L/TAOK1轴参与肝癌分子机制的初步探讨 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验数据与方法 |
| 5.2.1 数据准备与处理 |
| 5.2.2 TAOK1的甲基化及表达分析 |
| 5.2.3 TAOK1的免疫浸润水平及表达分析 |
| 5.2.4 统计分析 |
| 5.3 研究结果 |
| 5.3.1 TAOK1异常过表达与基因组学的关系 |
| 5.3.2 TAOK1基因甲基化与表达的关系 |
| 5.3.3 肝癌免疫浸润与TAOK1表达的关系 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（2）芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肝癌研究概况 |
| 一、肝癌流行病学现况 |
| 二、肝癌病因研究 |
| 三、肝癌发病机制 |
| 四、肝癌的治疗现状 |
| 五、肝癌发生发展与肝癌干细胞的关系 |
| 六、肝癌干细胞与上皮间质转化(EMT) |
| 第二节 肝癌中医药基础理论的形成和发展及芪术抗癌方研究概况 |
| 一、肝癌的渊源及病因病机 |
| 二、肝癌辨证治疗 |
| 三、芪术抗癌方中医气血辨证治疗肝癌的理论依据 |
| 四、芪术抗癌方临床疗效、机制及微观物质基础研究 |
| 第二章 芪术抗癌方对肝癌干细胞的影响 |
| 第一节 临床研究 |
| 一、资料与方法 |
| 二. 数据分析结果 |
| 三、结论 |
| 第二节 体外、体内实验研究 |
| 一、芪术抗癌方对癌细胞的干性表达体外研究 |
| 二、芪术抗癌方对癌细胞干性表达体内研究 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文和参与课题情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（3）肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 肝细胞癌候选免疫相关基因的筛选 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 附图表 |
| 第二部分 DCK在肝癌中的表达及与乙肝相关肝癌患者病理参数的相关分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 附图表 |
| 第三部分 DCK对肝癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 附图 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表的目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（4）MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（5）清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述 肝癌的分子发病机制及中医药抑制肝癌的作用机制研究进展 |
| 1 肝癌的流行病学现状 |
| 2 肝癌的分子发病机制 |
| 3 中医药抗肝癌的作用机制 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠的治疗作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肝癌细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 清肝化瘀颗粒主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中英缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 筛选潜在的肝癌相关基因 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 VPS35促进肝细胞癌增殖 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 VPS35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 VPS35通过促进细胞膜上FGFR3受体的分选和转运激活下游PI3K/AKT信号 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Rettromer复合物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表论文,申请课题和专利,参加会议及获奖情况 |
（7）SIRT1在乙型肝炎病毒蛋白X（HBx）促进肝细胞癌发生发展中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SIRT1 对乙肝相关性肝癌转移的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 SIRT1在乙肝相关性肝癌中的表达水平 |
| 2.2 SIRT1对乙肝相关性肝癌转移的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HBV/HBx对SIRT1表达的调控作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV对SIRT1表达的调控作用 |
| 2.2 HBx对SIRT1表达的调控作用 |
| 2.3 SIRT1对HBx表达的调控作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SIRT1对HBx诱导的肝细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达SIRT1对HBx诱导的肝细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 2.2 沉默SIRT1对HBx诱导的肝细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 SIRT1抑制剂烟酰胺的抗肿瘤效应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 烟酰胺的细胞毒性检测 |
| 2.2 烟酰胺对HBx诱导的肝细胞癌增殖的影响 |
| 2.3 烟酰胺对HBx诱导的肝细胞癌迁移的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBx在肝细胞癌转移侵袭中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（8）基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 基于TCGA数据库机器学习法研究miRNA作为肝癌诊断生物标志物的价值 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiRNA作为肝癌诊断生物学标志物的体外验证研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于转录组测序进行肝癌自噬相关的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 MicroRNA与肝细胞癌的相关研究及进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）慢性HBV感染疾病进展过程中肝细胞LATS1表达及启动子甲基化水平研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:LATS1 在慢性HBV感染肝纤维化进展中表达变化及临床意义研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象和分组 |
| 2.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 S-P免疫组织化学染色方法 |
| 2.3.2 组织RNA提取 |
| 2.3.3 RNA反转录成cDNA |
| 2.3.4 实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.3.5 Westem blot |
| 2.4 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同肝纤维化程度肝组织细胞中LATS1的表达水平 |
| 3.2 肝细胞LATS1表达水平与慢性HBV感染者临床病理学指标之间的相关性 |
| 3.3 不同纤维化程度肝组织细胞中Hippo信号通路的活性 |
| 3.4 肝细胞中LATS1表达水平与肝纤维化进展之间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:LATS1在乙肝肝硬化、HBV相关肝细胞癌和癌旁组织中表达变化及临床意义研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象和分组 |
| 2.2 主要试剂和仪器均同第一部分 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 S-P免疫组织化学染色方法 |
| 2.3.2 组织RNA提取(采取Trizol法提取组织总RNA) |
| 2.3.3 RNA反转录成cDNA |
| 2.3.4 实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.4 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 LATS1在乙肝肝硬化进展为肝细胞癌过程中的表达变化 |
| 3.2 LATS1在HBV相关肝细胞癌和癌旁组织中的表达情况 |
| 3.3 LATS1表达与HBV相关肝细胞癌患者临床病理学指标的相关性 |
| 3.4 乙肝肝硬化组织LATS1表达水平对肝细胞癌的诊断价值研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:慢性HBV感染疾病进展过程中LATS1启动子甲基化状态对LATS1表达水平影响的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象和分组 |
| 2.1.1 标本和患者 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 提取组织DNA(柱式法) |
| 2.3.2 DNA亚硫酸氢盐修饰 |
| 2.3.3 甲基化特异性PCR(MSPCR) |
| 2.3.4 亚硫酸氢盐测序(Bisulfite Sequencing PCR,BSP) |
| 2.3.5 细胞培养和5-氮杂胞苷处理细胞系后LATS1甲基化状态及蛋白表达水平的检测 |
| 2.4 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同肝纤维化组织LATS1启动子甲基化状态 |
| 3.2 HBV相关肝细胞癌及癌旁组织LATS1启动子甲基化状态 |
| 3.3 LATS1启动子甲基化状态与LATS1表达的相关性 |
| 3.4 LATS1启动子甲基化状态与HBV相关肝细胞癌患者临床病理学指标之间的相关性 |
| 3.5 亚硫酸氢盐测序(BSP)定量分析LATS1启动子甲基化水平 |
| 3.6 肝癌细胞系及肝细胞系中LATS1 的表达水平及启动子区域甲基化状态 |
| 3.7 5-氮杂胞苷对LATS1 启动子甲基化状态及LATS1 表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 Hippo信号通路在肝癌形成中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、HBV感染与hTERT基因表达在肝细胞癌组织中的相关性研究（论文参考文献）
- [1]PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究[D]. 石怡. 湖南工业大学, 2021(02)
- [2]芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究[D]. 孙新锋. 广州中医药大学, 2021(02)
- [3]肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究[D]. 王正. 山东大学, 2021(11)
- [4]MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究[D]. 王婧雯. 山东大学, 2021(12)
- [5]清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响[D]. 朱晓燃. 北京中医药大学, 2021
- [6]囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究[D]. 张桂冀. 重庆医科大学, 2021(01)
- [7]SIRT1在乙型肝炎病毒蛋白X（HBx）促进肝细胞癌发生发展中的作用及其机制研究[D]. 王晴. 重庆医科大学, 2021(01)
- [8]基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究[D]. 赵鑫. 河北医科大学, 2021(02)
- [9]慢性HBV感染疾病进展过程中肝细胞LATS1表达及启动子甲基化水平研究[D]. 原琳. 中国医科大学, 2021(02)
- [10]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)