一、感染HaSNPV棉铃虫幼虫的组织病理和免疫组化研究（论文文献综述）
马光皇[1]（2021）在《枣瘿蚊图尔病毒2 ELISA检测方法的建立与应用》文中研究说明枣瘿蚊图尔病毒2a（Dasineura jujubifolia toursvirus 2a,DjTV-2a）属于囊泡病毒科图尔病毒属,目前已知宿主为红枣害虫—枣瘿蚊（Dasineura jujubifolia）。自新疆部分地区大面积进行红枣种植以来,枣瘿蚊时枣园的重要害虫之一,为害株率高达100%,严重的可影响树势和红枣产量,枣瘿蚊图尔病毒有可能是枣瘿蚊防控手段之一,但我们对该病毒知之甚少。而建立枣瘿蚊图尔病毒的检测方法,有助于对枣瘿蚊的影响和致病特性,开展主要研究内容如下:1.DjTV-2a衣壳蛋白序列生物信息学分析于NCBI网站下载DjTV-2a衣壳蛋白序列,使用软件分析氨基酸序列的理化性质,进行信号肽预测扩膜结构域预测;DNAStar软件的Protean功能对氨基酸序列进行二级结构预测、疏水亲水性分析等,得到适合作为抗原表位的氨基酸序列作为合成抗原。结果表明:枣瘿蚊图尔病毒衣壳蛋白的氨基酸序列含有449个氨基酸,经过生物信息学分析得知,此段氨基酸序列不存在信号肽结构和跨膜结构域;为疏水蛋白;表面可及性及可塑性分析,确定柔韧性较强易结合抗体的位置,筛选出三条氨基酸序列经作为备选合成抗原,并确定一条作为合成抗原氨基酸序列。2.DjTV-2a ELISA检测方法的建立根据生物信息学分析结果挑选一条作为合成抗原,由公司进行抗原的人工合成,合成抗原与佐剂混合乳化对新西兰雌性白兔进行动物免疫,经过4次动物免疫,采血检测抗血清效价,使用间接ELISA法对抗血清和抗体效价进行测定,结果表明:历时8周4次的动物免疫,终放血后经过间接ELISA测定抗血清效价达到1:128K;间接ELISA检测抗体效价达到1:512K,纯化后抗体最终抗体蛋白浓度为0.618 mg/ml。3.DjTV-2a时空分布研究利用间接ELISA检测,对枣瘿蚊样本进行处理后,确定其临界值,并对不同时期及地域的采集样本进行检测,确定枣瘿蚊图尔病毒2a的发生情况。结果表明:对20份枣瘿蚊阴性血清进行ELISA检测,统计学分析得出间接ELISA的临界值是0.275,建立被测样本OD450值大于0.3为阳性样本的标准;所检测样本中塔里木大学校园内所检测样本453头,阳性率10.15%;阿拉尔市十二团十三连所检测样本200头,阳性率4.16%;新和县所检测样本144头,阳性率2.08%;哈密市检测样本144头,阳性率1.38%;甘肃张掖检测样本144头,阳性率1.38%;对另一批塔大校园内不同月份采集的虫样进行检测,5月份阳性率0.00%;6月份检测样本100头,阳性率1.00%;7月份所检测样本400头,阳性率10.50%。4.感染DjTV-2a的枣瘿蚊幼虫石蜡切片观察为探究枣瘿蚊图尔病毒对枣瘿蚊的致病特性,将检测幼虫个体一分为二对,其中头胸部或腹部进行ELISA检测,选择呈阴性和阳性样本的腹部或头胸部制作石蜡切片,经过HE染色观察其组织结构变化。结果表明:正常体枣瘿蚊具有完整的体态结构和特征,其表皮褶皱,有斑点凸起;外表皮均匀散布着褶皱和凸起,组织厚度均一,表皮与内部组织黏连保持着完好的结构。感染后表皮粗糙、无特征,表皮与内部组织也已经完全脱离,并不粘连,肌肉组织被破坏,内部组织消解。
林旺[2]（2020）在《微囊藻毒素-LR对斑马鱼非特异性免疫功能的影响及其机制》文中研究说明近几十年来,有害蓝藻水华的频繁发生已成为世界范围内不容忽视的环境问题。微囊藻毒素（MCs）主要由微囊藻属蓝藻细菌产生,是最常提及的能够威胁水质,水生生物乃至人类健康的环肽毒素。在已鉴定出的200多种MCs异构体中,微囊藻毒素-LR（MC-LR）是最常见,最具毒性且被广泛研究的一种异构体。大量证据表明,MC-LR主要在肝脏中积累并发挥肝毒性作用。近年来,MC-LR对免疫系统功能的潜在影响,特别是对炎症反应的影响已成为热门话题。本研究以模式生物斑马鱼（Danio rerio）作为研究对象,研究了不同环境浓度MC-LR慢性暴露对于脾脏病理损伤、血清免疫参数和脾脏非特异性免疫相关基因转录水平的变化。然后,通过转录组学和TLR/MyD88信号通路中关键基因的转录水平以及脾脏中MyD88的蛋白表达和免疫组化结果分析,揭示了环境浓度MC-LR引起的慢性炎症反应的分子机制。最后,通过跨代暴露实验探讨MC-LR免疫毒性作用的跨代传递方式和机制。本研究的结果对于全面了解环境浓度MC-LR暴露后诱导的炎症反应和非特异性免疫功能的影响提供了重要的实验证据。主要结果如下:1.在慢性暴露试验中,将雄性斑马鱼暴露于0、0.3、1、3、10和30μg/L MC-LR30 d。在低浓度组（0.3、1和3μg/L）中,斑马鱼脾脏出现炎症反应,包括黑色素巨噬细胞中心的形成和巨噬细胞伪足的增加,血清补体C3水平的显着升高以及非特异性免疫相关基因（c3b、lyz、il1β、tnfα、ifnγ）表达的上调。然而,高浓度的MC-LR（10和30μg/L）会导致脾脏巨噬细胞和淋巴细胞发生变性,血清补体C3水平显着降低以及非特异性免疫基因表达出现显着下调。该研究发现表明,慢性暴露于MC-LR对鱼类先天免疫系统具有双向调控作用,即低浓度MC-LR暴露会诱发炎症激活,而高浓度MC-LR暴露导致免疫抑制。2.将雄性斑马鱼暴露于0、0.4、2和10μg/L MC-LR 30 d。研究结果表明,MCLR会导致脾脏出现炎性变化,包括黑色素巨噬细胞中心的形成,血清中TNFα和IL1β的水平显着升高以及MyD88依赖的Toll样受体（TLR/MyD88）信号通路基因（tlr4a、myd88、erk2、p38a、il1β、tnfα）表达量的显着升高。免疫组化和蛋白质印迹结果进一步验证了较高的MC-LR浓度暴露会增强MyD88的表达信号。此外,10μg/L MC-LR暴露会导致血清补体C3含量和脾脏c3b转录水平显着降低,表明鱼类非特异性免疫功能受到抑制。该研究发现揭示,环境浓度MC-LR慢性暴露可能会通过TLR/MyD88信号通路引发慢性炎症反应,随后在斑马鱼中导致免疫功能紊乱,这也提醒我们需要更加关注长期环境浓度MC-LR暴露所产生的免疫毒性。3.在跨代研究中,将成年雌雄斑马鱼分别暴露于0、0.4、2和10μg/L MC-LR60 d。暴露期结束时让雌雄配对并产卵,将F1代胚胎置于不含MC-LR的清水中或者含有与亲本暴露浓度相同的MC-LR水体中直到受精后第5天（5 dpf）。结果显示,在F0代性腺和F1代胚胎中都检测到MC-LR的存在,这表明MC-LR可以通过化学传递的方式直接从F0代转移到F1代。同时,MC-LR对F0代成鱼的生殖毒性影响（性激素分泌,性腺发育和生殖能力）也会导致F1代仔鱼发育异常,提示MC-LR也能够通过干扰亲本生殖功能发挥跨代毒性作用。进一步,在清水组和持续MC-LR暴露组的F1代中发现抗氧化基因（cat、mn-sod、gpx1a）的下调和先天免疫相关基因（tlr4a、myd88、tnfα、il1β）的上调以及促炎性细胞因子（TNFα、IL1β、IL6）含量的升高,表明亲本MC-LR暴露抑制了F1代仔鱼的抗氧化功能并通过TLR/MyD88信号通路诱发了炎症反应,最终导致子代免疫机能的下降。此外,通过比较两种不同处理条件下的F1代仔鱼,与清水组相比,持续暴露于MC-LR中会导致更高程度的炎症反应。
赵莹[3]（2020）在《烟芽夜蛾囊泡病毒3h株六个结构蛋白的鉴定与特征分析》文中研究指明
王永峰[4]（2020）在《一种诱导的高蛋白血症无脊椎动物疾病模型及其病理影响研究》文中研究说明高蛋白血症是一种循环血液系统蛋白质含量异常升高的重大代谢疾病,临床多见于肝硬化、多发性骨髓瘤、血管肉瘤病、代谢性酸中毒、肾病,以及腹膜炎、慢性淋巴瘤、腹腔脓肿和线虫感染等疾病的并发症。由于临床很难区分高蛋白血症与原发疾病或感染对机体的影响,已有的报道仅限于对血液理化性质影响等基础数据收集,以及比较高蛋白血症与低蛋白血症、高血糖和高脂血症等常见代谢疾病的基础数据差异,缺乏对相关病理机制的研究。目前为止,还没有可靠的高蛋白血症疾病动物模型与建模方法,高蛋白血症的发病机制与临床治疗方法研究、治疗药物开发一直停滞不前。因此,亟需开发出可靠的高蛋白血症动物模型和建模方法。为此,本文在本研究室已有的研究基础上,利用中国特色的无脊椎模式动物家蚕,重建了高蛋白血症动物模型,调查了高血浆蛋白浓度（PPC）对血液代谢以及血液系统先天免疫的影响,评估了高PPC对代谢和解毒组织脂肪体的重塑发育的损害及影响机制,并进一步研究了高PPC对生殖毒性这一机体长期影响的调控机制。主要研究结果如下:（1）高蛋白血症疾病模型的重建基于研究室已有的工作基础,通过封堵家蚕成熟幼虫的吐丝孔,阻止丝腺中的丝蛋白质向体外分泌,进一步利用变态发育过程中丝腺的退化解离过程,使丝腺内的大量丝蛋白质快速释放到循环系统,导致血浆蛋白浓度（PPC）水平极速升高,并持续高于对照家蚕7倍以内,构建出致死率从0%至100%可控的不同程度的家蚕高蛋白血症疾病模型。高PPC导致家蚕变态发育过程中化蛹变态异常,重症模型最终全部死亡。血液生化检测结果表明,模型组家蚕的PPC逐渐升高,但血糖、血清甘油三酯和血清总胆固醇浓度无统计意义的显着变化。表明重建了无原发症影响、PPC水平可控的高蛋白血症家蚕模型（AM）。（2）高血浆蛋白浓度对血淋巴代谢的影响血淋巴代谢组学分析结果显示,高PPC引起显着变化的差异代谢物主要富集在氨基酸代谢通路,包括丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等。代谢通路整合分析发现,糖酵解途径、脂质代谢、TCA循环以及尿素循环等代谢途径也发生了显着的变化。其中氨基酸代谢出现整体上调的现象,多种重要的氨基酸,如色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺等都显着升高。糖代谢也出现了上调,但脂质代谢和TCA循环出现了下调的现象,尿素循环产生的尿素含量也显着降低。显示高PPC促进了氨基酸代谢,但却降低了机体整体的代谢水平。（3）高血浆蛋白浓度影响家蚕血液系统先天免疫代谢和解毒组织脂肪体的转录组学免疫分析结果显示,GO分析和KEGG分析发现高PPC导致了参与先天免疫应答的抗菌肽（AMPs）,及其调控NF-κB信号途径相关的基因转录水平发生了显着变化。进一步血浆抗菌活性实验结果表明,高PPC提高了血淋巴对E.coli的抗菌活性,但却抑制了对S.aureus的抗菌活性。高PPC诱导血细胞和脂肪体中6种类型的AMPs基因m RNA水平显着上调,其中血细胞中的defensin基因m RNA水平在建模处理后192 h比CK组升高了2300倍。而AMPs的上调表达,则是受到NF-κB信号中Toll途径和Imd途径的调控。高PPC导致血淋巴中循环血细胞的类型出现显着变化,其中承担免疫功能的颗粒细胞在血细胞总数中的比例升高了1倍左右。高PPC还通过抑制酚氧化酶原PPO1、PPO2的m RNA表达,进而抑制了PO活性,降低血淋巴的黑化免疫作用。（4）高血浆蛋白浓度影响代谢组织脂肪体的重塑发育以代谢和解毒组织脂肪体（FB）为对象,以幼虫化蛹变态过程脂肪体形态和功能重塑发育为靶标的调查结果显示,高PPC阻碍了FB的重塑再生发育过程,重塑过程延迟了48 h以上。致病机制研究结果显示,高PPC通过减弱内分泌激素的作用,减弱FB组织的细胞自噬和凋亡作用,阻止变态发育期FB重塑再生;同时高PPC诱发了FB组织氧化应激压力增大、氨基酸转化功能紊乱。建模处理后补充内分泌蜕皮激素的活性物质20-羟基蜕皮酮,能够有效拯救高PPC诱导的FB组织受阻的重塑再生过程,并且蜕皮激素作用信号途径相关基因Bm Ec R和Bm E74A、组织解离相关酶基因Bm Cat B和细胞自噬凋亡信号途径相关基因Bm Atg6、Bm Atg8和Bm Dronc的m RNA水平均有一定程度的恢复（5）高血浆蛋白浓度对生殖发育的影响高PPC对家蚕具有深远意义的生殖发育的影响的调查结果显示,高PPC显着降低了雌性家蚕产卵的数量和质量。进一步研究表明,高PPC抑制了雄性精巢和雌性卵巢的发育,包括生殖腺系数降低、发育延迟。同时,生精囊体外培养实验结果表明,雄性生殖腺经历过高蛋白血淋巴环境后,即使脱离了高PPC环境,高PPC对后期生精囊的发育依然有显着不良影响,并对家蚕生殖腺具有毒性累积和毒性滞后效应。致病机制研究结果显示,高PPC抑制了FB中卵黄蛋白原（Vg）的合成,并通过降低20-羟基蜕皮酮受体Ec R和E74信号作用途径,阻碍了Vg的转运;同时高PPC诱导了雌性卵巢组织的细胞自噬和凋亡作用,降低了Vg受体Vg R的表达,阻碍了卵黄蛋白的吸收,进而影响了卵巢的发育。
杨丽玉[5]（2020）在《单核细胞增生李斯特菌棉铃虫感染模型的建立、膜囊泡的制备及功能探究》文中研究说明单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,以下简称Lm）是一种人畜共患的革兰氏阳性致病菌,可以穿透人体的三大屏障——胎盘屏障、血脑屏障和肠道屏障,进而造成人体感染,死亡率达20%-30%。为深入解析Lm的致病机制及其与宿主之间的相互关系,本实验以Lm为对象,进行了以下两部分研究:（一）单核细胞增生李斯特菌棉铃虫感染模型的建立;（二）单核细胞增生李斯特菌膜囊泡的制备及功能探究。一、单核细胞增生李斯特菌棉铃虫感染模型的建立该部分利用棉铃虫幼虫作为探究Lm致病能力的昆虫模型,以期为进一步研究Lm与宿主之间的相互作用机制奠定基础。实验结果如下:首先,将5株不同毒力的Lm菌株分别腹腔微量注入4龄棉铃虫幼虫体内,随后统计幼虫的死亡率并计算菌株的半数致死量（LD50）,观测幼虫中肠细胞的病理变化,测定虫体内的载菌量。以上5株Lm菌株为:野生株（EGDe,中毒）、PrfA缺失株（EGDeΔprfA,弱毒）、PrfA组成型高表达株（EGDeΔprfA+pERL3-prfA*,高毒）、携带空载质粒的野生株（EGDe+pERL3,中毒）以及PrfA质粒高拷贝回复株（EGDeΔprfA+pERL3-prfA,高毒）。结果显示Lm不仅能成功侵染棉铃虫幼虫并可致其死亡,且其半数致死量以及对棉铃虫中肠细胞的损伤程度均与菌株毒力正相关。其次,通过检测棉铃虫在感染Lm后体内血细胞数量及包囊作用的变化,以及虫体内免疫相关基因在感染前后的表达水平差异,探究棉铃虫对不同毒力Lm菌株感染的免疫应答。结果显示高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*对棉铃虫幼虫免疫系统的影响最为强烈,不仅使其血细胞数量减少了 71%,同时显着抑制了血细胞的包囊作用,相较而言弱毒株EGDeΔprfA感染的棉铃虫血细胞仅减少27%,且对棉铃虫血细胞的包囊基本无抑制作用;另外RT-qPCR结果也显示感染了高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的棉铃虫的HaCTL1以及HaPGRP-A的转录水平显着上调,且显着高于包括EGDeΔprfA+pERL3-prfA在内的其他Lm感染的棉铃虫,然而感染了弱毒株EGDeΔprfA的棉铃虫的相关基因转录表达尽管有上调但上调量并不显着。以上结果暗示了不同毒力Lm侵染棉铃虫幼虫后均可激活棉铃虫体内的天然免疫系统,且毒性越高的菌株对棉铃虫本身的伤害更大,引起的免疫反应也更强烈。除此之外,还检测了不同毒力Lm菌株在棉铃虫体内的溶血活性水平以及相应虫体的谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）的活性高低,探究Lm对棉铃虫的毒性与棉铃虫自身解毒作用之间的关系。结果显示高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*对棉铃虫幼虫的致病性最强,同时一定程度上抑制了虫体内解毒酶的活性,可能延长了毒力因子在体内存留时间及在体内的运输,使菌株发挥其毒效。二、单核细胞增生李斯特菌膜囊泡的制备及功能探究该研究部分以Lm野生菌株EGDe及其毒力突变株（EGDeΔprfA、EGDeΔprfA+pERL3-prfA*）为对象,利用超滤浓缩法和Optiprep密度梯度离心法提取Lm的MVs,并对两种方法提取的MVs的产率进行比较。通过测定不同MVs对菌株生物被膜的影响,以及不同MVs的溶血活性和对棉铃虫的感染毒性,探索其生物活性,以期为深入解析革兰氏阳性菌MVs的生理功能奠定基础,同时也为Lm致病机制的研究提供一些新的思路,现将以上研究结果报告如下:首先,通过上述两种方法提取了不同毒力Lm产生的膜囊泡（MVs）:EGDe-MVs、ΔprfA-MVs以及prfA*-MVs。结果显示两种方法提取的Lm膜囊泡中EGDe-MVs的产率最高,ΔprfA-MVs次之,而prfA*-MVs的产率最低。另外,不同毒力的Lm均可向外分泌直径20-200 nm的MVs,且MVs的形态结构与菌株的毒力无明显关系。比较这两种方法,发现Optiprep密度梯度离心法提取的Lm-MVs的产率高、电镜观测效果好,但该方法操作相对复杂,耗时较长。相比之下,超滤浓缩法的提取效果虽然不及前者,但胜在其经济省时,同时考虑到实验室仪器设备有限,因此我们在本研究过程中主要采用超滤浓缩法提取。其次,将经过超滤浓缩法提取的MVs进行了 SDS-PAGE和银染,从而初步检测了 MVs的蛋白组成情况,与此同时我们还检测了不同Lm-MVs对细菌生物被膜形成的影响,比较了不同Lm-MVs的溶血活性和对棉铃虫幼虫的感染毒性,结果显示:（1）Lm-MVs不是仅含一种蛋白的单一组分,而是含有多种蛋白的复杂结构,且蛋白条带主要集中在50-70 kD。通过文献分析,其中58 kD和71 kD的蛋白分别可能为毒性蛋白李斯特菌溶血素LLO和内化素In1B;（2）MVs可以影响菌株生物被膜的形成,且具有一定的溶血活性,并能导致棉铃虫幼虫死亡或者降低其存活率和化蛹率,且其毒性与菌株本身毒性正相关。综上所述,我们认为棉铃虫幼虫（至少是4龄棉铃虫幼虫）适合作为研究Lm致病机制的宿主模型,且不同毒力的Lm能够诱发不同程度的免疫应答反应。由于Lm可致棉铃虫死亡,在此基础之上,我们考虑是否Lm分泌的MVs亦可能参与其致病进程,因此试图检测Lm-MVs的生物活性并尝试探讨其生物功能,发现不同毒力的Lm均可向外分泌直径20-200 nm的MVs,且MVs的形态结构与菌株的毒力无明显关系,但MVs可以影响菌株生物被膜的形成,同时它含有毒性蛋白组分,具有一定的溶血活性,并能导致棉铃虫幼虫死亡或者降低其存活率和化蛹率,且其毒性与菌株本身毒性正相关,这一定程度上验证了我们的猜想,由此我们初步认为Lm分泌的MVs极可能直接参与了 Lm对宿主的致病,并在细菌-细菌之间,以及细菌-宿主相互作用中扮演了重要角色。
谢佳[6]（2020）在《甲状旁腺激素类似受体（iPTHRs）及其配体对昆虫发育与表皮形成的影响及作用机制研究》文中提出神经肽类激素是一类进化上古老的内源性活性物质,其主要受体类型G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors,GPCRs）是细胞膜上最大的蛋白质超家族。它们介导的信号传导途径不仅广泛参与动物正常生长发育过程中的各种生命活动,而且还与多种疾病的发生、发展和治疗密切相关。因此,神经肽及GPCRs可作为重要的药物靶标,其相应的研究也一直位于医学新药研发、农业杀虫剂潜在靶标探索的前沿。由弥散神经内分泌系统分泌的甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）家族成员及其受体（parathyroid hormone receptors,PTHRs）在脊椎动物的钙和磷的调节、肾脏和骨骼的发育过程中发挥重要作用,人工合成的PTH也已在市面上获批用于骨质疏松症、甲状旁腺功能减退症等疾病的治疗。而在无脊椎动物中,对该信号系统的研究较少。本课题组和日本Tanaka课题组分别率先、相继在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、褐飞虱（Nilaparvata lugens）等代表性昆虫中发现了PTHRs的类似受体,命名为i PTHRs。然而,在昆虫等无脊椎动物中是否存在i PTHRs的内源性配体一直未见报道,i PTHRs仍以孤儿受体的形式存在。另外,本课题组早期对赤拟谷盗i PTHRs的功能研究发现,其干扰之后严重影响了昆虫蛹至成虫的蜕皮羽化过程及表皮形态建成,但具体作用机制尚不明确。基于以上背景,本研究主要以完全变态昆虫赤拟谷盗为实验材料,对其适应性进化机制进行分析,筛选鉴定其潜在的内源性配体并进行功能研究,同时利用组学测序对该信号系统的作用机制进行进一步的挖掘,另外,也在不完全变态昆虫褐飞虱中开展了对i PTHRs进行初步的结构和功能验证。通过上述实验,本研究试图为全面了解PTHRs/i PTHRs的进化、生理功能及作用机制提供新的线索,可望为害虫生物学防治中绿色杀虫剂的开发提供候选作用靶标,甚至为PTH信号系统影响人类钙磷代谢失调与骨质疏松、甲状旁腺功能减退症等疾病的发生和治疗提供参考。首先,本研究通过筛选更多类别无脊椎动物的i PTHR（含节肢动物蛛形纲、软体动物等类群）联合脊椎动物各纲代表性物种的PTHRs进行系统发生关系分析,并利用PAML（Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood）软件包中的Code ML程序对无脊椎动物的i PTHRs进行适应性进化分析,结果显示脊椎动物、无脊椎动物PTHRs/i PTHRs中发生了独立的复制和丢失事件,且无脊椎动物i PTHRs数目更多样化;无脊椎动物i PTHRs经历了选择压力,筛选出21个多位于胞外近膜端及跨膜结构域的正选择位点。由于正选择位点富集的部位为配体和受体结合的关键区域,暗示无脊椎动物中配体在序列上可能存在较大变异;其次,通过广泛搜集比对信息和利用Blast搜索筛选出昆虫i PTHRs的候选配体PXXXamide。赤拟谷盗的PXXXamide的蛋白质编码区域编码109个氨基酸,与脊椎动物PTH没有显着的序列同源性,但在节肢动物中比较保守;利用GPCR受配体鉴定系统对其与i PTHRs的关系进行鉴定,结果表明候选配体PXXXamide能显着激活i PTHRs表达细胞中钙离子关联的荧光信号,证明了PXXXamide的确是i PTHRs的内源性配体,命名为i PTH。利用实时荧光定量PCR和免疫组化对其进行时空表达分析,发现其在晚期蛹、中枢神经系统、肠呈现高表达,其中组织表达模式与受体i PTHRs一致。然而,利用RNA干扰技术对其进行功能分析,结果却表明i PTH干扰后对赤拟谷盗的生长发育没有影响,这与受体造成的畸形表型不一致;原因之一是可能在昆虫体内还存在另外的配体发挥作用,原因之二是结合免疫组化结果可知,干扰i PTH之后在中枢神经系统和肠组织中的大部分神经投射的阳性荧光信号已消失,但在一些神经肠内分泌细胞依旧保持着免疫阳性,可能这些仅存的i PTH即可保证机体的需要;再次,利用实时荧光定量PCR对该系统干扰后蜕皮激素合成与代谢、保幼激素合成与代谢及调控羽化相关基因的表达量进行检测,结果表明,i PTH信号系统在干扰之后,蜕皮激素合成通路中的关键酶基因CYP307A1、转录因子E74、Broad complex（Br-C）、FTZ-F1的表达量在i PTHRs干扰后均未发生改变;即使合成通路中的CYP315A1和CYP314A1表达量呈现轻微下调,并未造成干扰组3天蛹和5天蛹蜕皮激素含量的改变;保幼激素合成关键酶CYP15A1和JHAMT的表达量在i PTHRs干扰后显着上调;羽化相关神经肽CCAP、bursicon的受体CCAPRs、Rickets表达未受影响。这些结果表明了i PTHRs造成的蜕皮羽化失败并不是通过影响蜕皮激素合成与代谢、羽化相关调控基因造成的,而保幼激素的合成受到影响则可能是原因之一;另外,通过差异转录组学和相对定量蛋白质组学对i PTHRs干扰之后的下游调控网络进行分析,结果显示,在转录层面上,IB组与dsi PTHR1组、dsi PTHR2组分别鉴定出1231个、1683个差异表达基因,而dsi PTHR1组与dsi PTHR2组仅鉴定出14个差异表达基因。其中,i PTHRs在干扰后主要引起了能量与营养代谢（如异柠檬酸脱氢酶、ATP结合盒蛋白、果糖1,6-二磷酸酶）、表皮结构成分（几丁质合酶1、几丁质脱乙酰基酶、表皮蛋白若干家族成员）相关基因表达量改变,同时保幼激素代谢相关的保幼激素酯酶、保幼激素环氧水解酶表达量也明显上调;在蛋白层面上,IB组与dsi PTHR1组、dsi PTHR2组分别鉴定出34个、39个差异表达蛋白,而dsi PTHR1组与dsi PTHR2组鉴定出41个表达蛋白（主要由于dsi PTHR1组异常表达所致）。与转录组学测序一致的是,与对照组相比,干扰组的差异表达蛋白也集中在能量与营养代谢、表皮结构成分上,其中多个基因（如ATP合成酶亚基delta、肌钙蛋白亚基T、CPR18、CPAP1-H等）在转录、蛋白水平上均显示出下调趋势,表明了i PTHRs可能通过影响能量代谢影响赤拟谷盗的羽化行为,并造成表皮成分的合成异常;最后,通过对不完全变态昆虫褐飞虱i PTHRs的序列分析及RNA干扰功能验证,我们发现,其两个i PTHRs为物种内复制,序列相似性高达53.06%,这两个受体与赤拟谷盗i PTHR2更为接近,结合其它物种的i PTHRs多序列比对分析,表明i PTHR2可能是昆虫中的祖先基因;RNA干扰结果显示四龄若虫干扰i PTHR1和i PTHR2后部分个体蜕皮羽化失败,存活率分别降低至26.7%和55.5%,表明了i PTHRs在不完全变态昆虫褐飞虱的生长发育过程中也承担着至关重要的作用。
刘世火[7]（2020）在《桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及几丁质酶基因功能研究》文中进行了进一步梳理几丁质是昆虫表皮、中肠围食膜及气管的重要组成成分,几丁质酶（Chitinase,Cht,EC 3.2.1.14）是水解几丁质的一类内切酶。昆虫几丁质酶主要参与蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御等重要生理过程。通过调控几丁质的降解,有可能实现对昆虫生长发育,甚至是生命的控制。由于人类和其他高等动物不含几丁质,聚焦几丁质代谢通路发掘害虫防控新靶标相对安全。因此,昆虫几丁质代谢调控成为专一性新型杀虫剂研究的热点。桔小实蝇是一种世界范围内严重危害果蔬的农业害虫,世代发育历经卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,通过转录组测序和生物信息学分析,在鉴定桔小实蝇不同发育阶段转变前后重要功能基因的基础上,综合运用实时荧光定量PCR、RNAi、异源表达、Western Blot、免疫组化、超景深三维显微成像系统等技术和手段,克隆获得12个几丁质酶基因（包括7个Cht基因和5个IDGF基因）的c DNA序列,解析其时空表达模式;比较分析原核表达和真核表达获得的Bd Cht8重组蛋白的几丁质结合能力和催化活性;探究不同发育阶段特异性表达的几丁质酶基因在桔小实蝇生长发育中的功能。主要研究结果如下:1桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及Chts基因鉴定基于桔小实蝇卵末、1龄幼虫初、1龄幼虫末、2龄幼虫初、2龄幼虫末、3龄幼虫初、3龄幼虫末、白蛹、蛹末和成虫初共10个发育节点的30个样品,采用二代转录组测序技术,构建桔小实蝇发育阶段转变前后转录组数据库。共获得681.72Gb Clean data,各样品Clean data均不低于16.03 Gb,且Q30碱基百分比在94.32%及以上。各样品Clean data映射到桔小实蝇基因组序列上的比对效率从43.23%到72.67%不等。通过与基因组数据比对,共获得17,656个基因,其中已知基因和新基因分别为12,309和5,347个。将新基因序列与8个蛋白质序列库比对发现,有1,819个新基因获得注释信息。桔小实蝇不同发育阶段转变前后共有11,708个差异表达基因（differently expressed gene,DEG）。其中,在卵孵化、1龄幼虫蜕皮、2龄幼虫蜕皮、化蛹及羽化前后,分别鉴定获得2,132、952、1,062、2,301和1,333个DEGs。采用q RT-PCR技术检测基因表达量确认了转录组表达谱的可靠性。进一步分析发现,激素（20E和JH）和表皮（几丁质和表皮蛋白）相关通路的基因在桔小实蝇发育阶段转变前后呈现周期性表达模式。GO功能富集分析表明,几丁质相关GO功能类在桔小实蝇不同发育阶段转变过程中显着富集。在此基础上,克隆获得桔小实蝇12个Cht基因的c DNA序列,并解析了它们编码的蛋白的结构特征。所有12个Chts均具有几丁质催化结构域,部分蛋白拥有几丁质结合域。系统发育分析表明,桔小实蝇12个Chts聚类于8个Group,并分别与黑腹果蝇对应的Cht聚为一支,各节点自展值介于46%-100%,表明桔小实蝇Chts与黑腹果蝇具有较高的同源性。2桔小实蝇Chts基因的表达模式解析利用q RT-PCR,系统分析12个Chts在桔小实蝇不同发育阶段的表达模式。结果显示,Chts表达谱在不同发育阶段差异较大。在卵发育前期和中期,各有4个基因（前期:Bd Cht1、Bd Cht2、Bd Cht11和Bd IDGF4;中期:Bd Cht7、Bd Cht8、Bd Cht10和Bd IDGF6）高表达;3个基因（Bd Cht5、Bd IDGF2和Bd IDGF3）则从卵发育中期至后期持续高表达;卵发育后期仅Bd IDGF1具有较高表达水平。在幼虫发育过程中,7个基因（Bd Cht1、Bd Cht2和5个Bd IDGFs）持续高表达,2个基因（Bd Cht8和Bd Cht11）持续低表达。在化蛹过程中,3个基因（Bd Cht7、Bd Cht11和Bd IDGF1）的表达量较低,其余9个基因的表达量均较高;在蛹发育过程中,Bd Cht11和Bd IDGF1的m RNA水平较低,其余10个基因的m RNA水平均较高。在成虫发育过程中,9个基因（Bd Cht1、Bd Cht2、Bd Cht8、Bd Cht10及5个Bd IDGFs）持续高表达。系统解析12个Chts在桔小实蝇3龄幼虫不同组织（中肠、脂肪体、气管、体壁、马氏管和中枢神经系统）及5日龄雌、雄成虫不同组织（体壁、气管、中肠、脂肪体、马氏管、卵巢和精巢）的表达模式发现,12个Chts在桔小实蝇幼虫及成虫所测组织中均有表达,且表达水平差异较大。Bd IDGF4和Bd IDGF6在幼虫及成虫所测组织中均有较高m RNA水平,而Bd Cht5在所测组织中的表达量均较低。Bd Cht8在成虫中肠特异性高表达,表明该基因可能参与中肠围食膜形成及消解。Bd Cht1在卵巢中表达量较高,暗示该基因可能参与卵巢发育过程。桔小实蝇Chts响应温度胁迫、激素（20E和JH类似物）及药剂处理的表达模式解析发现,低温和高温胁迫时,Bd Cht7、Bd IDGF1和Bd IDGF4均呈现不同的响应模式;20E处理后,仅Bd Cht1和Bd IDGF6无响应,其余10个基因均有不同程度响应;烯虫酯处理后,仅Bd IDGF3无响应,其余11个基因均有不同程度响应;马拉硫磷处理后,仅Bd Cht5、Bd Cht10和Bd IDGF3无响应,其余9个基因均有不同程度响应。3桔小实蝇Bd Cht8重组蛋白酶学特性解析利用原核表达技术可表达并获得桔小实蝇BdCht8重组蛋白。由于重组蛋白以包涵体形式存在,无法在正常条件下纯化,故采用尿素使蛋白变性后获得可溶且纯度较高的重组蛋白。重组蛋白几丁质结合能力和酶活性检测结果表明,Bd Cht8蛋白能特异性结合固体几丁质,但无几丁质酶催化活性。进一步采用真核表达技术,利用Sf 9细胞系,表达并获得Bd Cht8重组蛋白。体外几丁质酶活性及几丁质结合能力测定结果表明,经真核表达的Bd Cht8重组蛋白具有几丁质内切酶活性和几丁二糖酶活性,对应的酶活力分别为60.38±1.79和200.99±10.41 Unit/m L。同时,经真核表达的Bd Cht8重组蛋白可以特异性结合几丁质。此外,阿洛氨菌素（50μg/m L）能显着抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率达16.27%。Gln NAc2-7（100μg/m L和500μg/m L）亦能显着抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率分别为14.28%和29.27%。同样的,Psammaplin A在中浓度（5μg/m L）和高浓度（50μg/m L）时均能显着抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率分别为19.48%和32.77%。4 Chts基因在桔小实蝇生长发育中的功能研究基于幼虫饲喂法和注射法构建了桔小实蝇RNAi技术体系。探究Bd Cht1、Bd Cht7和Bd Cht10在幼虫生长发育中的功能发现,摄入ds Bd Cht1 12 h和24 h后,与对照相比,1龄幼虫Bd Cht1表达量分别显着下调62.46%和19.93%,幼虫死亡率均显着高于对照,且致死幼虫存在气管断裂的表型。分别摄入ds Bd Cht7和ds Bd Cht10 24 h后,与对照相比,1龄幼虫Bd Cht7和Bd Cht10表达量分别显着下调25.07%和36.81%,幼虫死亡率均显着高于对照。分别饲喂20 mg/m L Gln NAc2-7和100μg/m L Psammaplin A抑制剂24 h后,与对照相比,幼虫死亡率分别显着升高31.66%和20.54%。对2龄幼虫注射ds Bd Cht10,于24 h后检测发现,Bd Cht10表达量显着下调85.38%,幼虫无法正常蜕皮导致死亡。采用注射法RNAi解析Bd Cht5、Bd Cht8和Bd Cht10在桔小实蝇末龄幼虫化蛹过程中的功能发现,注射si RNA-Bd Cht5 24 h后,3龄幼虫Bd Cht5表达量显着降低50.00%,且注射12 h和24 h后化蛹率均显着低于对照。进一步统计羽化率发现,处理组与对照无显着差异。注射ds Bd Cht10 24 h后,Bd Cht10表达量显着下调59.38%,且处理组幼虫在注射12、24、36和48 h后的化蛹率均显着低于对照,但羽化率与对照相比均无显着差异。在化蛹过程中探究Bd Cht8的功能时发现,无论采用ds RNA还是si RNA进行RNAi,均不能有效沉默该基因。利用注射法RNAi研究Bd Cht1和Bd Cht8在成虫器官发育中的功能发现,注射ds Bd Cht1后,Bd Cht1表达量显着下调,且成虫卵巢发育畸形,出现卵巢减小、卵瓣数量减少的表型。干扰Bd Cht8表达则导致雌成虫直肠膨大,出现卵巢几乎停止发育的表型。进一步利用抗体在成虫中肠组织中定位Bd Cht8,发现Bd Cht8分布于肠道细胞内和细胞间。综上所述,本学位论文研究结果不仅丰富了桔小实蝇生物信息学数据库,还明确了生长发育中起重要作用的激素（20E和JH）和表皮（几丁质和表皮蛋白）相关通路基因在桔小实蝇发育阶段转变前后的表达模式,阐明了Bd Cht1、Bd Cht5、Bd Cht7、Bd Cht8和Bd Cht10在桔小实蝇生长发育过程中的功能,为靶向几丁质酶的新型害虫控制剂的研发提供了理论基础。
臧小燕[8]（2020）在《两种棘球绦虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及其生物学活性研究》文中认为目的:1)克隆丝氨酸蛋白（Serine Proteases,SP）基因并通过原核表达系统表达SP;2)确定SP在两种棘球绦虫不同发育阶段的表达情况;3)测定自然蛋白囊液蛋白和重组蛋白SP的水解酶活性及对细胞趋化的影响。方法:1)PCR扩增获得EgSP和EmSP片段并测序;根据原核系统密码偏好性进行密码子优化并合成EgSP功能结构域部分的基因（SP1）和EmSP全长基因（SP2）,构建重组质粒pET30a-SP1和pET30a-SP2,NdeI/HindIII双酶切并测序,将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）菌株中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达蛋白的分子量和表达丰度;2)表达产物经亲和层析（Ni-IDA树脂）纯化,透析复性蛋白;3)重组SP免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并通过ELISA检测抗体效价,Western blotting检测重组抗原的免疫原性;4)通过qRT-PCR和Western blotting的方法确定SP在两种棘球绦虫不同发育阶段的表达情况;5)通过水解Z-Phe-Arg-AMC和Z-Arg-AMC检测蛋白的水解活性;6)通过细胞迁徙实验分析包虫SP对C5a趋化作用的影响。结果:1)通过生物信息学软件比较分析了EgSP和EmSP的基本特性,发现两者具有相同的分子质量、信号肽、跨膜区、空间结构及功能结构域,且38 KDa是含有胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白保守结构域;2)PCR扩增SP片段为1455 bp,测序鉴定正确后合成SP1和SP2基因,构建的重组质粒pET30a-SP1和pET30a-SP2酶切后电泳和测序表明阅读框架序列与设计一致。IPTG诱导表达蛋白主要以包涵体形式存在,表达蛋白的相对分子质量约为38×103和54×103,与预期值相符,且能被鼠抗His-Tag抗体识别。纯化蛋白可被囊型包虫病人和泡型包虫病人的血清识别;3)qRT-PCR结果显示丝氨酸蛋白酶在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达为生发层和成虫的表达量高于原头蚴（P<0.001）,但前两者之间无统计学差异。多房棘球绦虫包囊生发层细胞中的丝氨酸蛋白酶相比原头蚴表达减少（P<0.001）。Western blotting结果与qRT-PCR相符;4)pH能够影响蛋白水解Z-Phe-Arg-AMC和Z-Arg-AMC的活性,SP1在磷酸钠缓冲液中活性最高,其次为在Tris-HCl中,在乙酸钠溶液中几乎没有活性,不能水解Z-Phe-Arg-AMC/Z-Arg-AMC变为游离的AMC。SP2与SP1结果相似,在磷酸钠缓冲液中活性最高,其次为在Tris-HCl中,在乙酸钠溶液中活性最低。HCF在磷酸钠和Tris-HCl中的活性与SP1和SP2一致,但在乙酸钠中水解Z-Phe-Arg-AMC的能力明显高于Z-Arg-AMC;5)重组SP可以降低趋化因子C5a吸引细胞迁徙的能力。提取的天然蛋白也能够降低细胞的趋化,但作用不及SP作用明显。结论:本实验克隆的SP基因在原核中成功表达,且具有良好的反应原性和免疫原性,且在细粒棘球蚴成囊过程中高表达,在多房棘球蚴成泡过程中表达量降低。包虫SP具有丝氨酸蛋白酶水解活性,能够降低补体趋化作用,提示SP在两种棘球绦虫幼虫的差异表达以及SP在两种棘球绦虫中的活性可能是不同病理表型的关键调节蛋白。
杨丽玉,刘婵娟,杨诗怡,王菁妍,罗勤[9]（2019）在《棉铃虫作为单核细胞增生李斯特菌感染模型的初步研究》文中研究指明研究单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,简称Lm）对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的致病性,探讨棉铃虫作为Lm感染模型的可行性。用野生株EGDe（中毒）、PrfA缺失株（EGDeΔprfA,弱毒）和PrfA组成型高表达株（EGDeΔprfA+pERL3-prfA*,高毒）腹腔微量注射4龄棉铃虫幼虫,计算半数致死量(LD50)和虫体的载菌量,同时观测棉铃虫中肠细胞的病理变化以及血细胞包囊作用和数目。实验结果显示:①EGDe、EGDeΔprfA和EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的LD50分别为2.56×103 cfu/mL、1.98×106 cfu/mL和6.63×102 cfu/mL。②感染Lm后,EGDe和EGDeΔprfA+pERL3-prfA*在棉铃虫体内各部分的活菌数均有所上升,而EGDeΔprfA却显着下降。③中肠病理切片显示,Lm对棉铃虫幼虫中肠细胞的损伤程度与菌株的毒性高低正相关,并且随时间延长差异更为明显。④EGDeΔprfA+pERL3-prfA*对棉铃虫血细胞的包囊作用的抑制作用最强,而EGDeΔprfA基本无抑制作用。⑤感染Lm后,棉铃虫的血细胞数量先急剧上升随后减少。72 h时,感染EGDe、EGDeΔprfA和EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的血细胞减少量分别为45%、27%和71%。结果表明,Lm不仅能成功侵染棉铃虫幼虫并致其死亡,且其半数致死量、其对棉铃虫中肠细胞的损伤程度以及对血细胞包囊作用和数量的影响等均与细菌毒力高低有较好的关联性,表明棉铃虫幼虫（至少是4龄棉铃虫幼虫）适合作为研究Lm致病机制的昆虫模型。
尚小飞[10]（2019）在《四类天然产物的生物活性评价及作用机制研究》文中提出病虫害严重危害农业生产效益和可持续健康发展,造成巨大的经济损失。目前,化学药物仍是控制农业病虫害的主要方式,但其带来的药物残留、耐药性和再猖獗等问题给生态环境保护、公共卫生和食品安全造成潜在威胁。由于天然产物的高效、低毒和对环境友好等特点,从中发现天然源农用药物已成为新的研究热点,具有广阔的应用前景。在前期研究的基础上,本论文以立枯丝核菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等植物常见病原真菌及褐飞虱、东方粘虫等作物害虫和兔痒螨等动物外寄生虫为研究对象,对吲哚并喹啉类生物碱、简单苯丙素类化合物、醌类及香豆素类化合物等天然产物的杀菌、杀虫及杀螨生物活性进行研究,探讨其作用机理,以期发现安全、高效的先导化合物。1.吲哚并喹啉类生物碱杀菌活性评价及作用机理研究吲哚并喹啉类生物碱具有良好的抗菌和抗肿瘤活性,在前期对新白叶藤碱衍生物抗植物病原真菌活性研究基础上,对其母核结构的杀菌活性及作用机理进行进一步研究。以立枯丝核菌和稻瘟病菌为研究对象,对吲哚并喹啉类生物碱新白叶藤碱、白叶藤碱及异白叶藤碱的杀菌活性研究时发现,新白叶藤碱的杀菌活性较好;进一步研究表明,新白叶藤碱具有较广的杀菌谱,对立枯丝核菌毒力最强;应用蛋白组学、转录组学及基于表面等离子共振的分子捕捉技术和其它分子生物学技术对其杀菌作用机理研究表明,新白叶藤碱通过作用于线粒体复合酶III的Fe-S蛋白亚基显着抑制其酶活性,阻断电子传递链和能量代谢,进而造成菌丝死亡。同时,新白叶藤碱的杀菌活性也可能与细胞核功能的抑制有关。2.简单苯丙素类化合物生物活性评价及作用机理研究简单苯丙素类在植物中分布较为广泛,本文选取8种简单苯丙素类化合物,对其杀菌、杀虫、杀螨活性和作用机理进行研究。杀菌活性研究发现,简单苯丙素类化合物对植物病原菌具有一定的生长抑制活性,其中,大部分苯丙素类化合物对立枯丝核菌的毒力较强,对小麦赤霉病菌的毒力较弱。所测化合物中,异丁香酚的杀菌活性最好且杀菌谱较宽,浓度为50μg/mL时对油菜菌核病菌、立枯丝核菌及番茄灰霉病菌的抑制率分别为86.05%、78.67%和53.89%。杀虫活性研究发现,丁香酚对褐飞虱的杀虫活性最好,LC50为89.22μg/mL;乙酸丁香酚酯对东方粘虫的杀虫活性较好,与阳性对照药物川楝素相当。杀螨活性及作用机理研究发现,丁香酚具有良好的体外杀螨活性,且能有效治愈患螨病兔;应用转录组学和分子捕捉等分子生物学技术研究首次发现,丁香酚通过作用于螨虫线粒体呼吸链复合酶I链2的Phe198、Glu211和Lys288氨基酸残基抑制其酶活性,进而阻断电子传递链和能量产生,导致螨虫死亡,其对复合酶I链2的结合具有种属选择性,对昆虫更为敏感,毒性更大,但对哺乳动物较为安全。3.醌类化合物生物活性评价及作用机理初探醌类化合物是一类重要的植物次级代谢产物,本文中我们对其杀菌、杀虫及杀螨生物活性及可能的作用机理进行研究。杀菌活性及作用机理研究表明,大部分醌类化合物对植物病原菌具有较强毒力,其中蓝雪醌的杀菌活性最好且杀菌谱较广,对8种植物病原菌的EC50值为2.84-10.53μg/mL,优于阳性对照药物嘧菌酯;蓝雪醌处理立枯丝核菌后导致菌丝形态发生变化,细胞膜渗透性增加而引起内容物外流,线粒体肿胀且膜电位降低和活性氧簇发生富集,细胞核被破坏;蓝雪醌通过作用于立枯丝核菌的多个靶点而发挥其杀菌活性,对线粒体和细胞核的影响较为显着。杀虫及酶抑制活性研究发现,醌类化合物对褐飞虱的杀虫活性优于东方粘虫,其中,大黄素对褐飞虱和东方粘虫的杀虫活性最好,LC50分别为84.30μg/mL和548.74μg/mL;通过酶活性抑制实验对其杀虫机理研究初步发现,大黄素显着抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的活性,且激活细胞色素P450s的活性,杀虫机理可能与通过诱导激活P450s而增加昆虫对药物的敏感性、以及通过抑制GST活性阻断II相代谢系统有关,神经系统和运动功能障碍也是导致昆虫死亡的重要原因。杀螨及酶抑制活性研究发现,胡桃醌和蓝雪醌的体外杀螨活性最好,能有效治愈患螨病兔,且无皮肤刺激性;两个化合物的杀螨活性可能与螨虫的神经传导和运动功能的破坏等有关。细胞毒性研究表明,蓝雪醌和大黄素对人正常肝细胞具有潜在的毒性,且前者对角质形成细胞的毒性较大,其临床使用仍需进一步研究;胡桃醌的细胞毒性较弱。4.香豆素化合物生物活性评价及作用机理初探香豆素类化合物具有良好的抗肿瘤、抗炎、抗病毒和抗细菌等活性,本文中对香豆素类化合物的杀菌、杀虫及杀螨活性进行研究。杀菌活性及作用机理研究表明,在所测试的香豆素类化合物中,4-甲氧基香豆素对立枯丝核菌的杀菌活性最好,优于阳性对照药物嘧菌酯,其能引起立枯丝核菌细胞膜破坏和渗透性增加,导致内容物的外泄,同时降低线粒体膜电位并富集活性氧簇,引起菌丝死亡。4-甲氧基香豆素可能通过细胞膜和线粒体发挥作用而导致菌丝死亡。杀虫及酶抑制活性研究发现,6-甲氧基当归素的杀褐飞虱活性最好,LC50为122.7μg/mL,显着抑制AChE、GST活性和激活P450s活性,可作为I相代谢中P450诱导剂促使虫体对药物敏感,随后通过抑制虫体的解毒作用导致褐飞虱死亡;4-甲氧基香豆素对东方粘虫毒力较强。杀螨及细胞毒性研究发现,4-甲氧基香豆素的杀螨活性最好;4-甲氧基香豆素和6-甲氧基当归素对人正常肝细胞和角质形成细胞的毒性较弱或无毒性,IC50均大于100μg/mL。本研究中首次发现新白叶藤碱的杀菌活性,阐明了其杀菌作用机制;明确了简单苯丙素类、醌类及香豆素类化合物对植物病原菌、作物害虫及兔痒螨的毒力,发现丁香酚、大黄素、胡桃醌、蓝雪醌、6-甲氧基当归素、4-甲氧基香豆素等具有良好杀菌、杀虫和杀螨活性的化合物;初步研究了蓝雪醌、4-甲氧基香豆素的杀菌作用机理,探讨了大黄素、胡桃醌、蓝雪醌、6-甲氧基当归素和4-甲氧基香豆素的杀虫、杀螨作用方式,阐明了丁香酚杀螨作用靶点,为后续四类天然产物的研究利用提供基础数据。
二、感染HaSNPV棉铃虫幼虫的组织病理和免疫组化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、感染HaSNPV棉铃虫幼虫的组织病理和免疫组化研究（论文提纲范文）
（1）枣瘿蚊图尔病毒2 ELISA检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 枣瘿蚊的发生及危害简介 |
| 1.2 囊泡病毒概述 |
| 1.2.1 囊泡病毒起源 |
| 1.2.2 囊泡病毒分类 |
| 1.2.3 病毒颗粒形态 |
| 1.2.4 囊泡病毒分布 |
| 1.2.5 囊泡病毒在昆虫中的病理表现和致病特性 |
| 1.3 枣瘿蚊图尔病毒的检测方法 |
| 1.3.1 分子生物学检测 |
| 1.3.2 免疫学检测 |
| 1.4 研究内容及意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 第2章 枣瘿蚊图尔病毒2a衣壳蛋白基因生物信息学分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 DjTV-2a氨基酸序列获取 |
| 2.2.2 BLAST分析 |
| 2.2.3 理化性质和信号肽预测 |
| 2.2.4 二级结构预测 |
| 2.2.5 疏水、亲水性分析 |
| 2.2.6 表面可及性及可塑性 |
| 2.2.7 蛋白抗原性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 枣瘿蚊图尔病毒2a ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 抗原来源 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 药品及试剂 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗原处理 |
| 3.2.2 动物免疫 |
| 3.2.3 抗血清效价测定 |
| 3.2.4 抗血清的纯化 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 终放血后抗血清效价检测 |
| 3.3.2 抗体效价检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 枣瘿蚊图尔病毒2a时空分布研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试虫 |
| 4.1.2 药品及试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 样本处理 |
| 4.2.2 间接ELISA检测 |
| 4.2.3 临界值的确定 |
| 4.2.4 DjTV-2a时空分布检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 临界值的确定 |
| 4.3.2 ELISA检测方法的实际应用 |
| 4.3.3 枣瘿蚊图尔病毒不同时期感染率比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 感染枣瘿蚊图尔病毒2a枣瘿蚊幼虫石蜡切片观察 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试虫 |
| 5.1.2 药品及试剂 |
| 5.1.3 仪器和耗材 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 组织切片制作 |
| 5.2.2 HE染色 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.1.1 枣瘿蚊图尔病毒2a衣壳蛋白基因生物信息学分析 |
| 6.1.2 枣瘿蚊图尔病毒2a ELISA检测方法的建立 |
| 6.1.3 枣瘿蚊图尔病毒 2a 检测方法应用与区域检测 |
| 6.1.4 感染枣瘿蚊图尔病毒2a的枣瘿蚊幼虫石蜡切片观察 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）微囊藻毒素-LR对斑马鱼非特异性免疫功能的影响及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 微囊藻毒素概述 |
| 1.1.1 微囊藻毒素的来源、分子结构和理化特性 |
| 1.1.2 微囊藻毒素的多物种毒性特点 |
| 1.1.3 微囊藻毒素的多器官毒性特点 |
| 1.1.4 微囊藻毒素的致毒和解毒机制 |
| 1.2 鱼类免疫系统介绍 |
| 1.2.1 鱼类免疫组织和器官 |
| 1.2.1.1 胸腺 |
| 1.2.1.2 头肾 |
| 1.2.1.3 脾脏 |
| 1.2.1.4 粘膜相关淋巴组织 |
| 1.2.2 鱼类免疫细胞 |
| 1.2.2.1 淋巴细胞 |
| 1.2.2.2 吞噬细胞 |
| 1.2.3 鱼类免疫活性物质 |
| 1.2.3.1 非特异性免疫活性物质 |
| 1.2.3.2 特异性免疫活性物质 |
| 1.3 微囊藻毒素免疫毒性的研究进展 |
| 1.3.1 微囊藻毒素对鱼类免疫毒性的体外研究 |
| 1.3.2 微囊藻毒素对鱼类免疫毒性的体内研究 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 第二章 MC-LR对斑马鱼非特异性免疫的双向调控 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 MC-LR溶液的配置 |
| 2.2.3 斑马鱼养殖暴露 |
| 2.2.4 水中MC-LR的测定 |
| 2.2.5 样品采集 |
| 2.2.6 血清免疫指标的测定 |
| 2.2.7 光镜样品制备及观察 |
| 2.2.8 电镜样品制备及观察 |
| 2.2.9 基因表达的测定 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 脾脏系数 |
| 2.3.2 脾脏组织病理学变化 |
| 2.3.3 血清免疫指标 |
| 2.3.4 非特异性免疫基因表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 MC-LR对脾脏组织学影响 |
| 2.4.2 MC-LR对血清免疫指标的影响 |
| 2.4.3 MC-LR对脾脏非特异性免疫基因转录水平的影响 |
| 2.4.4 MC-LR引起的免疫毒性兴奋效应 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MC-LR经 TLR/MyD88 通路对斑马鱼造成慢性炎症反应 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 斑马鱼养殖暴露 |
| 3.2.3 样品采集 |
| 3.2.4 转录组分析 |
| 3.2.5 组织病理学和免疫组织化学观察 |
| 3.2.6 血清免疫参数分析 |
| 3.2.7 基因表达的测定 |
| 3.2.8 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.2.9 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 脾脏系数和组织病理损伤变化 |
| 3.3.2 转录组分析 |
| 3.3.3 脾脏TLR/MyD88 通路基因表达水平及血清细胞因子含量变化 |
| 3.3.4 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3.5 免疫组织化学观察 |
| 3.3.6 TUNEL细胞凋亡观察 |
| 3.3.7 血清补体C3 和脾脏c3b mRNA水平 |
| 3.3.8 相关性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 MC-LR对斑马鱼脾脏组织病理的影响 |
| 3.4.2 MC-LR对斑马鱼血清TNFα和 IL1β的影响 |
| 3.4.3 MC-LR对斑马鱼TLR/MyD88 通路基因表达影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 亲本MC-LR暴露干扰子代斑马鱼非特异性免疫功能 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 斑马鱼养殖暴露及胚胎收集暴露 |
| 4.2.3 累积产卵量测定 |
| 4.2.4 胚胎发育终点指标测定 |
| 4.2.5 精子活力测定 |
| 4.2.6 性腺、胚胎和暴露水体中MC-LR测定 |
| 4.2.7 性腺组织病理学观察 |
| 4.2.8 血浆中E2和T含量测定 |
| 4.2.9 F1代仔鱼中细胞因子含量测定 |
| 4.2.10 荧光定量PCR分析 |
| 4.2.11 蛋白免疫印迹分析 |
| 4.2.12 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 MC-LR含量测定 |
| 4.3.2 F0代斑马鱼性激素含量 |
| 4.3.3 F0代斑马鱼累积产卵量和精子活力 |
| 4.3.4 F0代斑马鱼性腺组织病理切片观察 |
| 4.3.5 F1代仔鱼发育毒性 |
| 4.3.6 F1代仔鱼抗氧化和非特异性免疫相关基因mRNA表达 |
| 4.3.7 F1代仔鱼蛋白免疫印迹分析 |
| 4.3.8 F1代免疫细胞因子含量 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 MC-LR从 F0 代向F1 代的传递 |
| 4.4.2 MC-LR对F1代仔鱼的跨代免疫毒性 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文总结及展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）一种诱导的高蛋白血症无脊椎动物疾病模型及其病理影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 代谢性疾病 |
| 1.1.1 常见的代谢性疾病 |
| 1.1.2 血液蛋白质/氨基酸代谢疾病 |
| 1.1.3 代谢性疾病对免疫的影响 |
| 1.1.4 代谢疾病对生殖发育的影响 |
| 1.1.5 代谢组学在代谢性疾病的应用 |
| 1.2 代谢疾病模型 |
| 1.2.1 疾病动物模型 |
| 1.2.2 实验动物替代 |
| 1.3 模式动物家蚕医学实验动物替代研究进展 |
| 1.3.1 家蚕作为实验动物替代的优势和特色 |
| 1.3.2 家蚕药物毒理模型 |
| 1.3.3 家蚕代谢疾病模型 |
| 2 论文研究思路 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 研究内容与方法 |
| 2.3 研究技术路线 |
| 第二章 高蛋白血症家蚕疾病模型的重建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 高血浆蛋白浓度家蚕建模方法 |
| 1.3 20-羟基蜕皮酮(20E)拯救实验 |
| 1.4 家蚕变态发育和生命力调查 |
| 1.5 血浆蛋白浓度(PPC)的测定 |
| 1.6 血液生化指标测定 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 高血浆蛋白浓度对血淋巴代谢组的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 样本准备 |
| 1.3 GC-MS/LC-MS测定 |
| 1.4 色谱-质谱条件 |
| 2 结果 |
| 2.1 建模处理后48H高蛋白血症对家蚕血淋巴代谢影响 |
| 2.2 建模处理后96H高蛋白血症对家蚕血淋巴代谢影响 |
| 2.3 高蛋白血症模型家蚕血淋巴差异代谢物KEGG通路分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 高蛋白血症模型家蚕血淋巴整体代谢途径变化 |
| 3.2 血浆蛋白浓度升高对家蚕有毒害作用 |
| 第四章 高血浆蛋白浓度对血液系统先天免疫的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 家蚕脂肪体和血淋巴的提取 |
| 1.3 家蚕脂肪体/血淋巴总RNA的提取 |
| 1.4 RNA反转录 |
| 1.5 基因表达分析 |
| 1.6 酚氧化酶活测定及黑化调查 |
| 1.7 血细胞吞噬作用实验 |
| 1.8 抗菌活性实验 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 高PPC影响家蚕先天免疫相关基因的表达 |
| 2.2 高PPC影响血淋巴的抗菌活性 |
| 2.3. 抗菌肽(AMPs)的表达受NF-κB信号调控 |
| 2.4 高PPC诱导家蚕血细胞吞噬作用变化 |
| 2.5 高PPC影响家蚕血淋巴的黑化作用 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 高PPC通过NF-κB信号途径调控家蚕先天免疫 |
| 3.2 高PPC抑制家蚕黑化作用 |
| 第五章 高血浆蛋白浓度对脂肪体重塑的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 脂肪体解离与重塑的形态观察 |
| 1.3 免疫组织化学 |
| 1.4 基因表达分析 |
| 1.5 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 高蛋白血症阻碍家蚕脂肪体重塑 |
| 2.2 外源性20E对高蛋白血症诱导的脂肪体重塑受阻的影响 |
| 2.3 外源20E对高蛋白血症家蚕脂肪体重塑相关基因转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 脂肪体重塑受抑制 |
| 3.2 内分泌激素拯救有效 |
| 4 结论 |
| 第六章 高血浆蛋白浓度对生殖发育的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 生殖调查 |
| 1.3 性腺发育的调查 |
| 1.4 精子发育调查 |
| 1.5 蛋白质免疫印迹(WESTERN BLOTTING) |
| 1.6 荧光定量PCR |
| 1.7 活性氧(ROS)染色 |
| 1.8 HE染色 |
| 1.9 TUNEL染色和MDC染色 |
| 2 结果 |
| 2.1 高蛋白血症影响了家蚕的生殖发育 |
| 2.2 高蛋白血症影响了雌性家蚕卵黄蛋白的合成与转运 |
| 2.3 高蛋白血症诱导家蚕性腺程序性死亡发生增加 |
| 3 讨论 |
| 3.1 高蛋白血症的生殖毒性表现出性别差异 |
| 3.2 高蛋白血症通过影响家蚕内分泌系统影响生殖发育 |
| 4 结论 |
| 第七章 综合结论 |
| 1 综合结论 |
| 2 论文创新点 |
| 3 后续研究展望与建议 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的科研项目及成果 |
| 资助项目 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）单核细胞增生李斯特菌棉铃虫感染模型的建立、膜囊泡的制备及功能探究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 单核细胞增生李斯特菌简介 |
| 1.2 单核细胞增生李斯特菌的致病机制 |
| 1.2.1 单核细胞增生李斯特菌在宿主细胞内的侵染机制 |
| 1.2.2 PrfA因子 |
| 1.3 单核细胞增生李斯特菌生物被膜简介 |
| 1.3.1 生物被膜简介 |
| 1.3.2 生物被膜的形成过程 |
| 1.3.3 影响生物被膜形成的因素 |
| 1.4 单核细胞增生李斯特菌主要感染模型的简介 |
| 1.4.1 小鼠 |
| 1.4.2 秀丽隐杆线虫 |
| 1.4.3 果蝇 |
| 1.4.4 大蜡螟 |
| 1.4.5 棉铃虫 |
| 1.5 膜囊泡的介绍及相关研究进展 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 单核细胞增生李斯特菌棉铃虫感染模型的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 棉铃虫、细菌及培养条件 |
| 2.1.2 主要实验试剂及配制 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 生长曲线及细菌菌落数和菌落大小的测定 |
| 2.3.2 细菌对棉铃虫幼虫的侵染实验 |
| 2.3.3 棉铃虫的死亡率及细菌半数致死量LD_(50)的测定 |
| 2.3.4 棉铃虫中肠病理切片的制备 |
| 2.3.5 棉铃虫体内细菌计数 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 毒力大小对Lm生长的影响 |
| 2.4.2 棉铃虫的死亡率及细菌半数致死量LD_(50)的测定结果 |
| 2.4.3 棉铃虫中肠病理切片的观察 |
| 2.4.4 棉铃虫体内载菌量的测定结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 棉铃虫对不同毒力单核细胞增生李斯特菌的免疫应答 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 棉铃虫、细菌及培养条件 |
| 3.1.2 实验试剂及配置 |
| 3.1.3 主要试验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 血细胞计数 |
| 3.2.2 体内包囊实验 |
| 3.2.3 血淋巴RNA的分离提取 |
| 3.2.4 实时定量PCR(RT-qPCR)检测棉铃虫免疫相关基因的转录水平 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 棉铃虫感染Lm后血细胞数量的变化 |
| 3.3.2 棉铃虫感染Lm后包囊作用的变化 |
| 3.3.3 RT-qPCR检测棉铃虫感染Lm后免疫相关基因的转录表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 不同毒力单核细胞增生李斯特菌对棉铃虫的致病性及棉铃虫自身的解毒作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 棉铃虫、细菌及培养条件 |
| 4.1.2 实验试剂及配置 |
| 4.1.3 主要试验仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 不同毒力单核细胞增生李斯特菌在棉铃虫体内的溶血活性测定 |
| 4.2.2 棉铃虫体内谷胱甘肽转移酶活性测定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 不同毒力单核细胞增生李斯特菌体内溶血活性比较 |
| 4.3.2 棉铃虫感染Lm后体内谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)的活性变化 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 单核细胞增生李斯特菌膜囊泡制备方法的建立 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 实验试剂及配制 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细菌培养 |
| 5.2.2 超滤浓缩法提取 |
| 5.2.3 Optiprep密度梯度离心法提取 |
| 5.2.4 BCA法测定膜囊泡的蛋白浓度并计算膜囊泡的产率 |
| 5.2.5 负染电镜 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 超滤浓缩法提取膜囊泡的蛋白浓度及产率 |
| 5.3.2 Optiprep密度梯度离心法提取膜囊泡的蛋白浓度及产率 |
| 5.3.3 超滤浓缩法提取膜囊泡的电镜结果 |
| 5.3.4 Optiprep密度梯度离心法提取囊泡的电镜结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 单核细胞增生李斯特菌膜囊泡的蛋白组成鉴定及功能探究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 不同毒力菌株产生的膜囊泡 |
| 6.1.2 实验试剂及配置 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 SDS-PAGE电泳及银染 |
| 6.2.2 不同毒力单核细胞增生李斯特菌的膜囊泡对细菌生物被膜形成的影响 |
| 6.2.3 膜囊泡的溶血活性检测 |
| 6.2.4 膜囊泡对棉铃虫幼虫体重、存活率和化蛹率以及幼虫发育时间的影响 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 不同毒力单核细胞增生李斯特菌膜囊泡蛋白组成的初步鉴定 |
| 6.3.2 不同毒力单核细胞增生李斯特菌膜囊泡对细菌生物被膜形成的影响 |
| 6.3.3 不同膜囊泡的溶血活性 |
| 6.3.4 膜囊泡对棉铃虫的毒性 |
| 6.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的毕业论文 |
| 致谢 |
（6）甲状旁腺激素类似受体（iPTHRs）及其配体对昆虫发育与表皮形成的影响及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词简表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 神经肽及其受体 |
| 1.2.1 神经肽的概念 |
| 1.2.2 神经肽受体 |
| 1.2.3 昆虫等无脊椎动物的神经肽与受体 |
| 1.3 甲状旁腺激素信号系统 |
| 1.3.1 脊椎动物的甲状旁腺激素信号系统 |
| 1.3.2 昆虫等无脊椎动物的甲状旁腺激素信号系统 |
| 1.4 昆虫的蜕皮羽化行为及表皮发育 |
| 1.4.1 昆虫的蜕皮与羽化行为 |
| 1.4.2 神经肽对昆虫蜕皮与羽化行为的调控及其它影响因素 |
| 1.4.3 昆虫的表皮形成与发育 |
| 1.5 多组学分析及其在昆虫学中的研究应用 |
| 1.5.1 转录组学分析及其在昆虫学中的应用 |
| 1.5.2 蛋白质组学分析及其在昆虫学中的应用 |
| 1.6 本实验的研究内容和目的意义 |
| 第二章 PTHRs/i PTHRs的适应性进化分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因序列的获取 |
| 2.2.2 序列整理 |
| 2.2.3 系统进化关系的构建 |
| 2.2.4 选择压力的分析 |
| 2.2.5 将正选择位点定位到蛋白质结构 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 代表性的后生动物PTHRs/i PTHRs的系统发生关系分析 |
| 2.3.2 枝位点模型检测到的无脊椎动物类群的正选择位点 |
| 2.3.3 正选择位点在蛋白质结构中的分布 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 i PTHRs的内源性配体i PTH的鉴定及其功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 筛选赤拟谷盗i PTHRs的潜在配体并进行生物信息学分析 |
| 3.3.2 候选配体PXXXamide的 c DNA全长克隆及序列比对 |
| 3.3.3 建立赤拟谷盗i PTHRs的细胞表达系 |
| 3.3.4 候选配体PXXXamide与 i PTHRs的结合实验 |
| 3.3.5 赤拟谷盗内源性配体iPTH的表达模式分析 |
| 3.3.6 赤拟谷盗内源性配体iPTH的功能分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 内源性配体的筛选与鉴定 |
| 3.4.2 PXXXamide在赤拟谷盗及代表性节肢动物中的序列比对 |
| 3.4.3 PXXXamide与赤拟谷盗i PTHRs的的配体-受体关系验证 |
| 3.4.4 赤拟谷盗i PTH的表达模式分析及其与i PTHR1 的共定位关系 |
| 3.4.5 赤拟谷盗内源性配体i PTH的 RNAi结果及原因分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 赤拟谷盗iPTH系统影响蜕皮及羽化的作用机制分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 赤拟谷盗iPTH系统对蜕皮激素合成通路的影响 |
| 4.3.2 赤拟谷盗iPTH系统对保幼激素合成通路的影响 |
| 4.3.3 赤拟谷盗iPTH系统对羽化相关基因的影响 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 赤拟谷盗iPTH系统对蜕皮激素合成通路的影响 |
| 4.4.2 赤拟谷盗iPTH系统对保幼激素合成通路的影响 |
| 4.4.3 赤拟谷盗iPTH系统对羽化行为调控关键基因的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 差异转录组学分析赤拟谷盗i PTHRs的下游信号通路 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 转录组学测序样品准备 |
| 5.3.2 转录组学测序的上机流程及后期分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 转录组学测序样品质量分析 |
| 5.4.2 转录组学测序数据质量评估 |
| 5.4.3 Clean Reads回帖参考基因组分析 |
| 5.4.4 基因表达水平分析 |
| 5.4.5 差异表达基因分析 |
| 5.4.6 差异表达基因GO富集分析 |
| 5.4.7 差异表达基因KEGG富集分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 相对定量蛋白质组学分析赤拟谷盗i PTHRs的下游信号通路 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 实验试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 蛋白质组学测序样品准备 |
| 6.3.2 蛋白质组学测序样品的上机流程及后期分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 蛋白质组学测序样品质量分析 |
| 6.4.2 蛋白质鉴定结果 |
| 6.4.3 差异表达蛋白质筛选 |
| 6.4.4 差异表达蛋白分析 |
| 6.4.5 差异表达蛋白的GO功能富集分析 |
| 6.4.6 差异表达蛋白的KEGG分析 |
| 6.4.7 基于GO与 KEGG富集的差异表达蛋白功能分析 |
| 6.4.8 差异表达蛋白的干扰表型分析 |
| 6.4.9 共同的差异表达蛋白和差异表达基因分析 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 i PTHRs在不完全变态昆虫褐飞虱中的功能初探 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验仪器 |
| 7.2.3 实验试剂 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 褐飞虱i PTHRs的结构分析及序列比对 |
| 7.3.2 褐飞虱i PTHRs对其生长发育的影响 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 褐飞虱i PTHRs的基因结构分析 |
| 7.4.2 褐飞虱i PTHRs与赤拟谷盗的i PTHRs的序列比对分析 |
| 7.4.3 褐飞虱i PTHRs对其生长发育的影响 |
| 7.5 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 附录 |
| 附录 A:Gene Bank数据库搜索中获取的i PTH序列Fasta文件 |
| 附录 B:转录组学分析中基于GO与 KEGG富集的差异表达基因分类 |
| 参考文献 |
| 在读期间已/待发表的学术论文及研究成果 |
| 已/待发表的学术论文 |
| 科研项目 |
| 致谢 |
（7）桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及几丁质酶基因功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 昆虫变态发育 |
| 2 几丁质 |
| 3 几丁质酶 |
| 4 几丁质酶及酶原基因功能研究的方法 |
| 5 学位论文研究的目的和意义 |
| 第二章 桔小实蝇发育阶段转变前后转录组文库构建及分析 |
| 第一节 桔小实蝇发育阶段转变前后转录组建库 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇发育阶段转变前后差异表达基因分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇发育阶段转变前后激素相关通路分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第四节 桔小实蝇发育阶段转变前后表皮相关通路分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第三章 桔小实蝇几丁质酶基因的鉴定及表达特性分析 |
| 第一节 桔小实蝇几丁质酶基因的鉴定及注释 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇几丁质酶基因在不同发育阶段的表达模式解析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇几丁质酶基因在幼虫及成虫不同组织的表达模式解析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第四节 桔小实蝇几丁质酶基因在不同应激条件下的表达特性 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第四章 桔小实蝇几丁质酶BdCht8重组蛋白酶学特性解析 |
| 第一节 桔小实蝇几丁质酶BdCht8原核表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇几丁质酶BdCht8真核表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第五章 桔小实蝇几丁质酶基因在生长发育中的功能研究 |
| 第一节 桔小实蝇BdCht1/7/10在幼虫生长发育中的功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇BdCht5/10在化蛹过程中的功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇BdCht1/8在成虫发育中的功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第六章 主要结果和结论、创新点及研究展望 |
| 1 主要结果和结论 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参研课题情况 |
| 致谢 |
（8）两种棘球绦虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 两种棘球绦虫丝氨酸蛋白的体外表达及阶段性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 SP酶活性鉴定及功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 常用试剂配置 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（9）棉铃虫作为单核细胞增生李斯特菌感染模型的初步研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和昆虫 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 不同毒力Lm生长曲线及生长形态的测定 |
| 1.2.2 棉铃虫半数致死量LD50的测定 |
| 1.2.3 棉铃虫中肠病理切片的制备和观察 |
| 1.2.4 单核细胞增生李斯特菌对棉铃虫血细胞包囊作用的影响 |
| 1.2.5 血细胞计数 |
| 1.2.6 棉铃虫全虫及体内不同部分(肠道、血淋巴、体液)载菌量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单核细胞增生李斯特菌的生长曲线及菌落大小 |
| 2.2 单核细胞增生李斯特菌对4龄棉铃虫幼虫的致病能力 |
| 2.2.1不同毒力单核细胞增生李斯特菌的半数致死量LD50及感染不同毒力单核细胞增生李斯特菌的棉铃虫的致死率 |
| 2.2.2 感染单核细胞增生李斯特菌后,棉铃虫全虫及体内不同部分(肠道、血淋巴、体液)的载菌量 |
| 2.2.3 不同毒力单核细胞增生李斯特菌对棉铃虫中肠组织的致病性 |
| 2.3 单核细胞增生李斯特菌对棉铃虫血细胞包囊作用和数量的影响 |
| 2.3.1 单核细胞增生李斯特菌对棉铃虫血细胞包囊作用的影响 |
| 2.3.2 棉铃虫血细胞数量变化 |
| 3 讨 论 |
（10）四类天然产物的生物活性评价及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 天然产物抗植物病原菌的研究进展 |
| 1.1.1 生物碱类 |
| 1.1.2 苯丙素类 |
| 1.1.3 醌类化合物 |
| 1.1.4 挥发油 |
| 1.1.5 萜类 |
| 1.1.6 黄酮类 |
| 1.1.7 其它化合物 |
| 1.2 天然产物抗植物害虫的研究进展 |
| 1.2.1 生物碱 |
| 1.2.2 苯丙素类 |
| 1.2.3 黄酮类 |
| 1.2.4 挥发油及萜烯类 |
| 1.2.5 其它化合物 |
| 1.3 天然产物抗动物螨虫的研究进展 |
| 1.4 源于天然产物的农药研究历程及进展 |
| 1.5 论文选题依据及意义 |
| 1.5.1 我国农业主要病虫害及目标病原的选择 |
| 1.5.2 药物作用机制研究主要技术及实验方法的选择 |
| 参考文献 |
| 第二章 吲哚并喹啉类生物碱杀菌活性评价及作用机理研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2.2 实验药品及植物病原菌 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 目标化合物的杀菌活性评价及杀菌谱的测定 |
| 2.3.2 基于组学技术的新白叶藤碱杀菌作用机理研究 |
| 2.3.3 新白叶藤碱杀菌作用机理验证 |
| 2.3.4 基于酶活性及分子捕捉技术的新白叶藤碱杀菌靶点研究 |
| 2.3.5 新白叶藤碱对立枯丝核菌细胞膜及细胞核的作用 |
| 2.3.6 新白叶藤碱对立枯丝核菌菌核抑制作用 |
| 2.4 实验结果及讨论 |
| 2.4.1 目标化合物的杀菌活性 |
| 2.4.2 新白叶藤碱杀菌活性评价及杀菌谱的测定 |
| 2.4.3 基于差异蛋白组学的新白叶藤碱杀菌作用机理研究 |
| 2.4.4 基于转录组学的新白叶藤碱杀菌作用机理研究 |
| 2.4.5 新白叶藤碱杀菌作用机理验证 |
| 2.4.6 新白叶藤碱杀菌作用靶点研究 |
| 2.4.7 新白叶藤碱对立枯丝核菌细胞膜及细胞核的影响 |
| 2.4.8 新白叶藤碱对立枯丝核菌菌核抑制作用 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 简单苯丙素类化合物生物活性评价及作用机理研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 简单苯丙素类化合物杀菌活性评价 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果与讨论 |
| 3.2.4.结论 |
| 3.3 简单苯丙素类化合物杀虫活性评价 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果及讨论 |
| 3.3.4 结论 |
| 3.4 简单苯丙素类化合物杀螨活性评价及作用机理研究 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果及讨论 |
| 3.4.4 结论 |
| 3.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 醌类化合物生物活性评价及作用机理初探 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 醌类化合物杀菌活性评价及作用机理初探 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.2.4 结论 |
| 4.3 醌类化合物的杀虫活性评价及酶抑制活性研究 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.4 结论 |
| 4.4 醌类化合物杀螨活性评价及酶抑制活性研究 |
| 4.4.1 实验材料 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 实验结果与讨论 |
| 4.4.4 结论 |
| 4.5 醌类化合物的细胞毒性 |
| 4.5.1 实验方法及材料 |
| 4.5.2 实验结果与讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 香豆素类化合物生物活性评价及作用机理初探 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 香豆素类化合物杀菌活性评价和作用机理初探 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 实验结果与讨论 |
| 5.2.4 结论 |
| 5.3 香豆素类的杀虫活性评价及作用机理初探 |
| 5.3.1 实验材料 |
| 5.3.2 实验方法 |
| 5.3.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.4 结论 |
| 5.4 香豆素类化合物杀螨活性评价 |
| 5.4.1 实验材料及方法 |
| 5.4.2 实验结果与讨论 |
| 5.5 香豆素类化合物细胞活性评价 |
| 5.5.1 实验材料与方法 |
| 5.5.2 实验结果与讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.1.1 首次明确新白叶藤碱杀菌活性及作用机理 |
| 6.1.2 发现简单苯丙素类、醌类及香豆素类中具有良好杀菌活性的化合物及可能的作用机理 |
| 6.1.3 发现简单苯丙素类、醌类及香豆素类中具有良好杀虫活性的化合物及可能的作用机理 |
| 6.1.4 发现简单苯丙素类、醌类及香豆素类中具有良好杀螨活性的化合物及可能的作用机理 |
| 6.2 工作展望 |
| 6.2.1 基于杀菌作用靶点的新白叶藤碱衍生物的衍生合成及先导化合物的发现 |
| 6.2.2 丁香酚等简单苯丙素类似物的杀菌、杀虫作用机制及制剂学研究 |
| 6.2.3 醌类化合物的杀菌、杀虫及杀螨作用机制及蓝雪醌衍生物的修饰、合成 |
| 6.2.4 香豆素类化合物的杀菌、杀虫及杀螨作用机制及4-甲氧基香豆素衍生物的修饰、合成 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、感染HaSNPV棉铃虫幼虫的组织病理和免疫组化研究（论文参考文献）
- [1]枣瘿蚊图尔病毒2 ELISA检测方法的建立与应用[D]. 马光皇. 塔里木大学, 2021(08)
- [2]微囊藻毒素-LR对斑马鱼非特异性免疫功能的影响及其机制[D]. 林旺. 华中农业大学, 2020
- [3]烟芽夜蛾囊泡病毒3h株六个结构蛋白的鉴定与特征分析[D]. 赵莹. 湖南农业大学, 2020
- [4]一种诱导的高蛋白血症无脊椎动物疾病模型及其病理影响研究[D]. 王永峰. 苏州大学, 2020
- [5]单核细胞增生李斯特菌棉铃虫感染模型的建立、膜囊泡的制备及功能探究[D]. 杨丽玉. 华中师范大学, 2020(01)
- [6]甲状旁腺激素类似受体（iPTHRs）及其配体对昆虫发育与表皮形成的影响及作用机制研究[D]. 谢佳. 南京师范大学, 2020(03)
- [7]桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及几丁质酶基因功能研究[D]. 刘世火. 西南大学, 2020
- [8]两种棘球绦虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及其生物学活性研究[D]. 臧小燕. 新疆医科大学, 2020(07)
- [9]棉铃虫作为单核细胞增生李斯特菌感染模型的初步研究[J]. 杨丽玉,刘婵娟,杨诗怡,王菁妍,罗勤. 微生物学杂志, 2019(06)
- [10]四类天然产物的生物活性评价及作用机制研究[D]. 尚小飞. 兰州大学, 2019(02)