一、二氟甲基鸟氨酸对K562细胞生长特性的影响及其与端粒酶活性的相关性（论文文献综述）
聂江平[1]（2020）在《手性紫罗兰酮生物碱衍生物ION-31a的结构优化和抗肿瘤转移活性研究》文中研究指明目的:以具有抗乳腺癌转移作用的手性紫罗兰酮生物碱衍生物ION-31a为先导化合物,对ION-31a的叔胺基团进行结构修饰,同时针对该化合物具有手性特点进行骨架跃迁改造,合成手性紫罗兰酮生物碱和其他生物碱衍生物,结合抗肿瘤转移活性筛选,进行构效关系的研究,以期发现活性更强的衍生物。方法:以药物化学方法设计具有不同结构的手性紫罗兰酮生物碱衍生物,采用脂肪酶拆分得到手性α-紫罗兰酮,进一步以其为原料,经过卤仿反应、酰胺缩合反应、催化氢化反应、酰胺还原反应、氨基保护及脱保护反应、烯丙位氧化反应、还原胺化反应、溴代反应、Suzuki偶联反应和亲核取代反应等制备手性紫罗兰酮生物碱衍生物;另一方面,以非手性结构为原料,结合手性紫罗兰酮生物碱的构效关系,合成其他生物碱衍生物。应用核磁共振波谱和高分辨质谱等表征衍生物的化学结构,通过乳腺癌细胞趋化迁移实验筛选衍生物的抗肿瘤转移活性,研究生物碱衍生物的构效关系。结果:1、本文通过有机合成手段共制备化合物155个,其中中间体67个,目标衍生物88个。以核磁共振波谱鉴定了各衍生物的化学结构。所有目标衍生物都是未见文献报道的新化合物。2、对合成的88个生物碱衍生物进行了细胞毒性评价,实验结果表明,目标衍生物在0.25-50?M浓度范围内不具有细胞毒性。在非细胞毒浓度下,进行了抗肿瘤转移活性筛选。实验结果表明,化合物N2、N5、N7、N8、N10、N18、N25、N26、N37、N38、N43和N71的抗乳腺癌转移活性较强,IC50值在0.035-1.096?M之间,其中强活性衍生物N18(IC50为0.035?M)具有非常重要的研究价值。3、手性紫罗兰酮生物碱的构效关系研究表明,叔胺基团的取代基及其旋转自由度大小会显着影响化合物抗肿瘤转移活性,其中含有苯甲腈取代基团,会显着提高衍生物的活性。将联苯片段引入衍生物中,由于苯环具有刚性,使得分子中可旋转键数目减少,衍生物活性降低。叔胺部分构象限制衍生物基本上失去活性,提示链状叔胺基团对化合物的活性具有重要的影响。4、考察了4种常见类药性参数（c Log P、t PSA、氢键受体数、可旋转键数）和生物活性的关系,其中化合物的c Log P、t PSA和可旋转键数与活性具有一定相关性。在10μM浓度下抗肿瘤转移抑制率大于70%的化合物中,大部分化合物为N-甲基结构片段修饰衍生物,其c Log P集中在5.5-7.0范围之内,t PSA集中25.0-55.0范围之内,可旋转键数目多为8-10个。这为后期结构优化提供了重要的理论依据。结论:本文经过多步有机合成反应制备手性紫罗兰酮生物碱和其他生物碱衍生物,共88个,都是未见文献报道的新化合物,化合物N2、N5、N7、N8、N10、N18、N25、N26、N37、N38、N43和N71具有较强的抗乳腺癌转移活性。构效关系研究表明,链状叔胺基团对化合物的活性具有重要的影响,引入苯甲腈取代基团会显着提高衍生物的活性。
张丽[2]（2019）在《天然活性分子吲哚2,3-二酮抗神经母细胞瘤转移的作用及分子机制研究》文中研究说明目的:神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是小儿最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,早期转移多,是NB患者的主要死因;此高度的侵袭转移特性也成为NB在整个恶性肿瘤疾病中极具特点的现象。因此,探明NB的转移机制、控制转移是决定预后的关键,也是NB治疗所面临的最具挑战性的问题。目前临床上对恶性程度高、发生转移早的高危NB病人常采用超大剂量联合化疗,尽管开始时对治疗有效,但化学合成药物毒副作用大,易复发,效果不佳,而天然产物毒副作用相对较小,且具有靶向杀伤肿瘤细胞的优点,已成为目前抗肿瘤药物的研究热点。因此从中寻找抗NB转移的天然药物具有重要意义。本课题组已对吲哚2,3-二酮研究多年,1999年首次在国际会议上报告了吲哚2,3-二酮具有抗氧自由基的作用,不但能够保护正常神经细胞,而且可以拮抗环境毒素所造成的神经细胞的死亡,之后发现其还有抗肿瘤作用。吲哚2,3-二酮的这种既可以抗肿瘤又能抗氧自由基而保护正常细胞的优点,是目前大多数抗肿瘤药所不具备的重要特征。吲哚2,3-二酮的优势在于其分子量小,可口服给药,能够靶向抑制肿瘤细胞增殖,避免损伤正常细胞,且毒副作用低,是具有开发价值的天然小分子化合物类药物。本项目拟利用NB转移瘤细胞系和可视化动物模型明确吲哚2,3-二酮抗NB转移的作用,并探讨其分子机制。本研究旨在阐明吲哚2,3-二酮抗NB转移的作用及分子机制,以期发现NB转移治疗的潜在靶点。方法:1.体外培养人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,采用CCK8法检测不同浓度吲哚2,3-二酮对NB细胞的增殖活力的影响;采用软琼脂集落形成实验检测吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞集落形成能力的影响;用划痕实验检测不同浓度吲哚2,3-二酮（0、50、100、200μmol/L）处理后,SH-SY5Y细胞迁移能力的变化;用Transwell小室法检测不同浓度吲哚2,3-二酮（0、50、100、200μmol/L）处理后,SH-SY5Y细胞侵袭和运动能力的改变;用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测不同浓度吲哚2,3-二酮处理后对SH-SY5Y细胞凋亡、细胞周期、线粒体膜电位的影响情况;采用荧光染色、RT-PCR、Westernblot等方法,观察不同浓度吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响,并探讨其相关作用机制。2.采用免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测45例神经母细胞瘤患者癌组织中LSD1的表达情况。3.将慢病毒载体pLenti-LUC与辅助质粒共同转染293 T细胞,制备好慢病毒,用此慢病毒感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,继续经嘌呤霉素筛选出持续表达较强发光信号的细胞,然后体外扩大培养,将荧光素酶标记的SH-SY5Y细胞注射于裸鼠左心室制备神经母细胞瘤转移瘤模型。活体成像仪监测裸鼠在体荧光信号。观察吲哚2,3-二酮对裸鼠转移瘤模型生长的抑制情况,检测吲哚2,3-二酮处理后裸鼠体内各主要脏器的转移情况,并观察肺、脑转移灶的病理学变化。结果:1.体外培养人NB细胞系SH-SY5Y,吲哚2,3-二酮（0、50、100、200μmol/L）处理SH-SY5Y细胞48 h后,分别检测了吲哚2,3-二酮对细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的影响。用CCK8试剂盒检测细胞增殖结果显示,吲哚2,3-二酮能明显抑制SH-SY5Y的细胞增殖;软琼脂集落形成实验中,吲哚2,3-二酮处理后的细胞,在软琼脂中继续生长14天后,拍照观察SH-SY5Y细胞集落形成数,结果发现吲哚2,3-二酮作用后能明显减少SH-SY5Y细胞的集落形成数,进一步证实了吲哚2,3-二酮抑制细胞增殖的作用;划痕实验结果显示,与对照组比较,吲哚2,3-二酮处理组细胞的迁移能力减弱（P<0.05）,并且呈浓度依赖性;Transwell小室实验结果发现,与对照组比较,细胞侵袭运动能力下降（P<0.01）,结果也呈明显的浓度依赖性;在荧光显微镜下观察到200μmol/L吲哚2,3-二酮处理组细胞出现典型的凋亡形态学变化:如细胞核固缩、核分裂现象明显,凋亡小体数目增多;采用流式细胞术（FCM）,用FITC-Annexin V/PI双染的方法,检测到吲哚2,3-二酮处理后,随着用药浓度的增加,SH-SY5Y细胞的凋亡率随之上升;进一步采用FCM法检测细胞周期,分析结果表明,经50、100、200μmol/L吲哚2,3-二酮处理48 h后,G1期SH-SY5Y细胞数明显增加,呈明显的G1期阻滞;不同浓度吲哚2,3-二酮处理NB细胞48 h后,用罗丹明123染色,采用FCM检测了线粒体膜电位的变化,结果显示,加药后线粒体膜电位明显下降,并呈浓度依赖趋势。2.通过实时定量（Real-time）PCR、蛋白免疫印迹（Westernblot）、免疫荧光、免疫共沉淀等方法,检测了吲哚2,3-二酮处理SH-SY5Y细胞后,相关信号通路的变化,结果显示,吲哚2,3-二酮能够产生抑制NB细胞增殖、迁移、侵袭的能力,可能一方面是通过降低线粒体膜电位,从而诱导细胞凋亡,另一方面,吲哚2,3-二酮又可作用于线粒体外膜上的单胺氧化酶MAO,通过抑制细胞转移相关的活性氧（ROS）,缺氧诱导因子（HIF-1α）、趋化因子受体（CXCR4）、基质金属蛋白酶（MMP2、MMP9）、血管内皮生长因子（VEGF）等发挥作用,从而在抑制肿瘤细胞的生存、增殖、血管生成、侵袭和转移等多个方面发挥抗NB细胞转移的能力。而且,可能由于吲哚2,3-二酮分子量小,能够直接入核抑制单胺氧化酶赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶（LSD1）的活性,从而改变了LSD1对组蛋白H3的赖氨酸k4位点的甲基化修饰,使H3K4的单、双甲基化水平增高,进而改变了基因表达调控。同时,吲哚2,3-二酮通过抑制LSD1的表达,使p53基因表达上调,进一步激活其下游基因p21蛋白,p21蛋白与细胞周期素依赖性激酶复合物结合,抑制其活性,使细胞有丝分裂停滞在G1期;另一方面,p53还可以通过上调Bax表达以及下调Bcl-2、MDM2表达,促进癌细胞凋亡。此外,由于吲哚2,3-二酮抑制了LSD1的活性,从而减少了P-NF-κb与LSD1的结合,进而抑制了ERK的活性,也影响了TGFβ1对ERK的激活,吲哚2,3-二酮通过抑制TGFβl的表达,从而抑制了肿瘤侵袭转移的上皮间质转化EMT过程。因此,我们推断吲哚2,3-二酮可能是通过多途径产生抗神经母瘤细胞转移的作用。3.免疫组织化学法检测45例神经母细胞瘤患者癌组织中LSD1的表达情况,其中阳性表达44例,阴性表达1例,其阳性表达率97.78%,提示在NB患者肿瘤组织中LSD1高表达。4.裸鼠神经母细胞瘤转移瘤模型采用荧光素酶Luc标记的SH-SY5Y细胞,经左心室注射肿瘤细胞的方法造模。将成功建模的入选裸鼠随机分为模型组、阳性药物环磷酰胺（CTX 40 mg/kg）组、吲哚2,3-二酮治疗组（吲哚2,3-二酮200 mg/kg）、阳性药物CTX和吲哚2,3-二酮合用组（CTX 20 mg/kg+吲哚2,3-二酮200 mg/kg）,用小动物活体成像仪每周进行活体成像,观察裸鼠转移灶的形成与药物治疗情况,第4周活体成像后结束实验,结果发现,与模型组相比,吲哚2,3-二酮治疗组、阳性药物CTX组、以及吲哚2,3-二酮和CTX合用组裸鼠体重变化差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组相比,各用药组均能减少裸鼠体内转移灶荧光强度,差异有统计学意义（P<0.01）;各用药组均能减少裸鼠骨组织转移灶离体成像的荧光信号强度,差异有统计学意义（P<0.01）;各用药组均能减少裸鼠体内主要脏器转移灶离体成像的荧光信号强度,差异有统计学意义（P<0.01）。对各组裸鼠血清中肿瘤转移相关因子VEGF、MMP2、MMP9的检测结果显示,模型组各因子含量较其他三组显着升高,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,其中VEGF浓度,与模型组比较,ISA组和CTX+ISA合用组含量更低,差异有统计学意义（P<0.05）;MMP2、MMP9浓度,与模型组比较,其他各组含量更低,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。对各组裸鼠血清中氧化应激相关指标SOD（超氧化物歧化酶）、GSH-PX（谷胱甘肽过氧化物酶）、MDA（丙二醛）的检测结果显示,CTX组SOD、GSH-PX活力显着低于其他三组,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,与CTX组比较,ISA组、CTX+ISA合用组裸鼠血清SOD含量更高,差异有统计学意义（P<0.01）,CTX+ISA合用组裸鼠血清GSH-PX含量更高,与其他三组比较,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;而CTX组MDA浓度显着高于模型组与CTX+ISA合用组,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。对各组裸鼠血清中肾功能相关指标的检测结果显示,CTX组肌酐、尿素氮含量较其他三组显着升高,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。对各组裸鼠血清中肝功能相关指标的检测结果显示,CTX组碱性磷酸酶（AKP）、谷氨酰转移酶（GGT、γ-GT）、谷丙转氨酶（ALT）、血清总胆红素（Tbil）含量较模型组与CTX+ISA合用组显着升高,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,CTX组谷草转氨酶（AST）较模型组含量更高,差异有统计学意义（P<0.05）,其他各组间差异无统计学意义。ALT/AST的比值,各组之间差异均无统计学意义（P>0.05）。对各组裸鼠血清中钙、钾、钠电解质相关指标的检测结果显示,各组之间差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:1.吲哚2,3-二酮具有抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移和侵袭能力的作用,能够明显诱导细胞凋亡并造成细胞周期G l期阻滞;2.细胞水平分子机制实验结果显示,吲哚2,3-二酮可能是通过多途径产生抗神经母瘤细胞转移的作用,一是可能通过MAOA/HIF/CXCR4信号通路,并且抑制VEGFR1活化,降低ROS水平,抑制肿瘤血管生成;二是可能通过LSD1/p53介导的细胞凋亡通路,增加p53的表达,促进细胞凋亡;3.体内实验中,采用心腔注射瘤细胞的方法成功制备了Luc标记的SH-SY5Y裸鼠转移瘤模型;吲哚2,3-二酮能够减少裸鼠体内NB细胞的转移,与化疗药环磷酰胺合用可以增强环磷酰胺的抗肿瘤转移效果,并能减少环磷酰胺对肝、肾造成损伤的毒副作用,产生增效减毒的作用。
唐晓霞[3]（2015）在《芪蟾口服结肠靶向片中有效组分的纯化及其体外抗结肠癌作用的研究》文中研究说明目的研究芪蟾口服结肠靶向片中有效组分的最佳纯化工艺,并进一步研究有效组分对结肠癌CT-26细胞增殖抑制作用及对促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2、血管生成相关因子VEGF和HIF-1α表达的影响,以探讨其体外抗结肠癌作用。为后续体内实验研究工作的展开提供实验基础,为芪蟾口服结肠靶向片用于临床结肠癌的预防、治疗、康复提供理论依据。方法采用大孔吸附树脂法对黄芪总皂苷和苦参生物碱进行纯化;采用硅胶柱层析法对干蟾皮中的酯蟾毒配基和华蟾酥毒基进行纯化。采用MTT法检测芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对结肠癌CT-26细胞增值抑制作用的影响。采用荧光定量PCR法检测芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达的影响。采用Western blot法检测芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对血管生成相关因子VEGF和HIF-1α表达的影响。结果黄芪总皂苷的最佳纯化工艺为选用AB-8大孔吸附树脂,上样量为220mL（生药浓度0.2g/mL）,洗脱时先用蒸馏水洗至无molish反应再用0.1%NaOH和20%乙醇洗脱除杂,70%乙醇洗脱,洗脱溶剂用量为5BV。苦参生物碱的最佳纯化工艺为采用D101大孔吸附树脂法纯化,上样量为120mL（生药浓度0.2g/mL）。洗脱时先用蒸馏水和20%的乙醇洗脱除杂,再用70%的乙醇洗脱,洗脱用量为5BV。干蟾皮中的酯蟾毒配基和华蟾酥毒基最佳纯化工艺为径高比2:14,上样量10g,洗脱溶剂用量160mL。芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对结肠癌CT-26细胞具有明显的增殖抑制作用。芪蟾口服结肠靶向片中有效组分各浓度作用24h、48h、72h,IC50值分别为95.04、49.84、23.67 μg/mL。芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对结肠癌CT-26细胞的抑制率具有时间和剂量依赖性。芪蟾口服结肠靶向片中有效组分300.00 μ g/mL药物组与5Fu组比较无统计学差异（P>0.05）。与空白组相比,作用24h、48h、72h后芪蟾口服结肠靶向片中有效组分组及5Fu组Bax基因表达均增强,且有统计学差异（P<0.01,P<0.05）,Bcl-2基因表达下调,具有显着性差异（P<0.01）。与5Fu组比,芪蟾口服结肠靶向片中有效组分各组Bax基因表达,具有显着性差异（P<0.01）,Bcl-2基因表达有统计学差异（P<0.01,P<0.05）。芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对Bax、Bcl-2的表达呈时间和剂量依赖性。作用48h后,与空白组比较,芪蟾口服结肠靶向片中有效组分各浓度组VEGF、HIF-1α蛋白表达均明显下降,具有显着性差异（P<0.01）。与5Fu组比较,VEGF和HIF-1α75.00μ g/mL组无统计学差异（P>0.05）。芪蟾口服结肠靶向片中有效组分各浓度组VEGF和HIF-1α的表达随着浓度的增加而降低,具有统计学差异（P<0.01,P<0.05）。结论大孔吸附树脂法适用于黄芪总皂苷、苦参生物碱的纯化,硅胶柱层析法适用于干蟾皮中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的纯化,经纯化后黄芪总皂苷、苦参生物碱、酯蟾毒配基和华蟾酥毒基纯度提高。芪蟾口服结肠靶向片中有效组分能明显抑制结肠癌CT-26细胞的增殖;能上调促凋亡基因Bax的表达、下调抗凋亡基因Bcl-2的表达,对结肠癌CT-26细胞凋亡具有促进作用;能抑制血管生成相关因子VEGF和HIF-1α的表达,对肿瘤血管生成具有抑制作用。提示芪蟾口服结肠靶向片中有效组分具有体外抗结肠癌的作用。
李熙[4]（2015）在《以Src为靶点的吖啶类激酶抑制剂设计、合成及活性研究》文中指出Src激酶是一种非受体型蛋白激酶,其广泛存在于癌细胞中,并在细胞生长、增殖的各个过程中都起到重要作用,如基因转录、细胞分化、迁移、血管生成、防止细胞凋亡等等,Src抑制剂的研究成为抗肿瘤药物研究的热点。目前已有一系列Src抑制剂处于临床研究阶段。吖啶类化合物在抗肿瘤方面有着广泛的应用。其作用靶点一般为DNA及其相关酶,如拓扑异构酶等。2011年,我们实验室通过高通量虚拟筛选发现吖啶类化合物可作为Src抑制剂,其为吖啶类化合物抗肿瘤作用机制研究提供了一条新的思路。吖啶类化合物对Src的抑制作用主要来源于吖啶环以及环上取代基与Src的Hinge区相结合。但遗憾的是,其表现出的抑制活性并不理想。本文通过计算机辅助药物设计,对吖啶环及其侧链进行改造,提高其对Src激酶的抑制活性和抗肿瘤活性。本文主要内容分为3部分。第1部分:以现有Src抑制剂的研究为基础,通过计算机辅助设计,最终优化合成了17个吖啶类目标化合物。对其体外细胞活性,激酶抑制活性进行了研究,并初步研究了其作用机制。激酶实验结果显示,设计合成的代表性化合物对Src具有较好的抑制作用,如8l在10μM时的抑制率可达到59.67%。MTT实验表明合成化合物可较好地抑制肿瘤细胞的生长,8l对所选用细胞系（K562及HepG-2）的IC50值均在10μM以下,且能诱导肿瘤细胞凋亡。第2部分:分子对接表明氮杂吖啶类化合物可提高激酶的抑制活性。而氮杂吖啶的合成却少有文献报道。本部分提供了合成氮杂吖啶类化合物的一种新方法,该反应以邻氨基苯甲酸和氯嘧啶类化合物为原料,先发生亲核取代反应,然后以二氧六环为溶剂,在POCl3介导下关环,可高产率地得到24个含不同取代基的氮杂吖啶类化合物,并研究了取代基效应对产率的影响。第3部分:在前两部分内容的基础上,设计了一系列可潜在抑制Src的氮杂吖啶类化合物,初步合成了3个化合物,MTT结果表明氮杂吖啶类化合物可能具有更好的抗肿瘤应用前景。
张先平[5]（2013）在《当归多糖调控造血干细胞衰老的机制研究》文中研究指明目的成体干细胞是维持组织稳态的重要因素，并在机体衰老进程中起关键作用。造血干细胞（hematopoietic Stem cells，HSCs）是干细胞研究领域中开展最早、技术最成熟、认识最深入并且广泛应用于临床的一种成体干细胞。衰老机体中造血系统基本成分虽然得以维持，但HSCs的功能和数量却逐渐降低，将导致免疫功能衰退和多种老年性疾病的发生。当归多糖（angelica sinensis polysaccharide，ASP）是从当归中分离、提取的药用有效成分，具有促进造血、抗辐射损伤、抗肿瘤和免疫调节等作用。目前，有关ASP能否延缓HSCs衰老及其作用机制尚不清楚。本研究将干细胞研究技术和祖国传统的抗衰老医学理论相结合，采用HSCs体外衰老模型的复制和X线照射致小鼠HSCs衰老等现代生物学的研究手段，分别从体外与体内两条途径系统地探讨ASP调控HSCs衰老的作用及其可能的生物学机制，旨为重新激活衰老HSCs及调控其靶向分化提供实验依据和理论基础。方法1.免疫磁珠分选技术（magnetic-activated cell sorting，MACS）分离、纯化干细胞抗原-1（Sca-1+）HSCs，流式细胞术测定细胞分选纯度，台酚蓝染色检测细胞活性。2.采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法、细胞周期分析、甲基纤维素半固体培养等方法，观察氧化低密度脂蛋白（oxidation lowdensity lipoprotein，ox-LDL）对Sca-1+HSCs衰老生物学特性的影响，以建立ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs衰老模型。3. ASP与ox-LDL共培养Sca-1+HSCs，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析及甲基纤维素半固体培养观察衰老生物学指标的变化；酶学比色法测定细胞培养上清液超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；免疫荧光检测Sca-1+HSCs内活性氧（reactive oxygen specie，ROS）水平；荧光定量PCR及Western blot检测Sca-1+HSCs衰老相关基因p16、p21mRNA及细胞周期调控蛋白P16、P21、CDK2、CDK4、cyclinD及cyclinE表达的变化；Southern blot和TRAP-PCR检测Sca-1+HSCs端粒长度与端粒酶活性，以阐明ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs衰老及ASP体外调控Sca-1+HSCs衰老的生物学机制。4. X线3.0Gy/8F全身均匀照射（total body irradiation，TBI）小鼠，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析、甲基纤维素半固体培养等方法，观察X线TBI对小鼠对Sca-1+HSCs衰老生物学特性的影响，以建立小鼠Sca-1+HSCs体内衰老模型。5.小鼠X线3.0Gy/8F全身均匀照射期间给予ASP灌胃，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析及甲基纤维素半固体培养观察衰老生物学指标的变化；酶学比色法测定Sca-1+HSCs总抗氧化能力（totalanti-oxidant，T-AOC）；免疫荧光检测Sca-1+HSCs内ROS水平；荧光定量PCR及Western blot检测HSCs衰老相关基因p16、p21mRNA及细胞周期调控蛋白P16、P21、CDK2、CDK6、cyclinD及cyclin E表达的变化；Southern blot和TRAP-PCR测定Sca-1+HSCs端粒长度与端粒酶活性，以阐明3.0Gy/8F的X线TBI体内诱导Sca-1+HSCs衰老及ASP体内调控Sca-1+HSCs衰老的生物学机制。结果1. MACS分离纯化后Sca-1+细胞纯度为（86.216.17）%，显着高于分离纯化前Sca-1+细胞百分比为（11.451.87）%；台盼蓝染色法测定分选的Sca-1+HSCs活性为（93.65±4.54）%。表明分选的Sca-1+HSCs细胞有较高的纯度和良好的活性。2. ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs呈现典型的衰老生物学表现：SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加；增殖能力明显减弱； G1期细胞比例显着升高、S期细胞比例显着减少；混合集落形成单位（colonyforming unit-mixture，CFU-Mix）数量显着减少。ox-LDL可诱导衰老Sca-1+HSCs培养上清液SOD、GSH-Px活性下降及MDA含量升高；细胞内ROS水平增加；端粒长度缩短，端粒酶活性降低；p16、p21mRNA及蛋白表达增强，CDK4、cyclinD及cyclinE蛋白表达降低，而对CDK2蛋白表达无影响。3. ASP体外作用于衰老Sca-1+HSCs可降低其SA-β-gal染色阳性细胞率、G1期细胞比例及P16表达；增加S期细胞比例及CDK4、cyclinD蛋白表达；抑制端粒DNA损伤；而对CFU-Mix数量、ROS水平、细胞培养上清液SOD、GSH-Px活性与MDA含量、P21、CDK2、cyclinE蛋白表达及端粒酶活性均无明显影响。4. X线3.0Gy/8F全身均匀照射诱导小鼠Sca-1+HSCs呈现典型的衰老生物学表现：SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加； G1期细胞比例显着升高，S期细胞比例显着减少；CFU-Mix数量显着减少。3.0Gy/8F的X线可诱导衰老Sca-1+HSCs T-AOC下降，ROS水平增加；端粒长度缩短、端粒酶活性降低；p16、p21mRNA及蛋白表达增强，CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表达降低，而对CDK2蛋白表达无影响。5. ASP体内作用于衰老Sca-1+HSCs后可降低其SA-β-gal染色阳性细胞率下降及G1期细胞比例、增加S期细胞比例及CFU-Mix数量；增加细胞T-AOC、降低ROS水平；抑制端粒DNA损伤，增强端粒酶活性；下调p16、p21mRNA及蛋白表达，上调CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表达，CDK2蛋白表达无显着性变化。结论1. MACS可有效分选小鼠Sca-1+HSCs，分离纯化的Sca-1+HSCs纯度较高，活性良好。2．ox-LDL可作为一种体外复制Sca-1+HSCs衰老模型的有效致衰剂。3．ASP体外作用可通过调节部分细胞周期调控蛋白表达及抑制端粒DNA损伤延缓ox-LDL诱导的Sca-1+HSCs衰老。4.3.0Gy/8F的X线全身均匀照射小鼠可诱导Sca-1+HSCs衰老以用于小鼠HSCs体内衰老模型的构建。5. ASP体内作用可通过抑制氧化应激损伤、调节细胞周期调控蛋白表达、抑制端粒DNA损伤及端粒酶活性下降以延缓X线TBI诱导的小鼠Sca-1+HSCs衰老。
胡亮杉[6]（2011）在《植物多酚提高CD34+早期急性髓系白血病细胞被活化免疫细胞杀伤的敏感性》文中研究指明研究背景与目的白血病是在造血过程中由于某一阶段细胞克隆扩增而产生的造血系统恶性疾病,在我国发病率约为4-5/10万,是青少年死亡的首位疾病。近来,随着污染的逐渐加剧,累积损伤造成白血病发病率越来越高,难治性越来越强。目前认为,白血病中存在具有长期自我更新能力的白血病干细胞,是白血病发病的根源,也是白血病治疗后耐药和复发的主要根源。由于白血病干细胞处于细胞分裂的休眠期（Go期）,使其对常规剂量药物和放射损伤产生强大的抵抗力,甚至对人体致死剂量药物（Bu 16mg/kg和Cy 60mg/kg）和全身照射（1100cGy）也产生耐受和抵抗。白血病在机体的发生历经了免疫监视、相互对抗和免疫逃逸的免疫选择和编辑过程,因此白血病细胞能通过基因突变等多种机制逃逸机体的免疫监视,尤其是具有强大增殖能力的白血病干细胞。逃逸后的白血病干细胞获得克隆性增殖,最终发展成白血病状态。如何最大限度的清除耐药和免疫抵抗的白血病细胞是降低白血病复发和治愈白血病的关键。近来发现,在食用性植物中,存在着一大类结构不同的化合物——植物多酚,富含该类化合物的食物和饮料消费与癌症低发密切相关。动物实验表明该类化合物能抑制化学诱发的肿瘤发生,有效抑制肿瘤诱发、促进和发展多个阶段,抑制肿瘤细胞集落形成,延长荷瘤裸鼠的生存期,提示它们可能是在肿瘤干细胞水平上起作用,这为清除药物和免疫耐受的白血病干细胞提供了新的干预方法。因此,本实验以含有白血病干细胞的CD34+早期急性髓系白血病KG-1a细胞为靶细胞,采用白藜芦醇和姜黄素2种植物多酚为干预手段,联合细胞因子激活的免疫细胞,以细胞增殖,细胞周期,细胞凋亡,杀伤效率和克隆形成率等指标,观察KG-1a细胞被活化免疫细胞杀伤敏感性的变化,探讨免疫激活物受配体（NKG2D和DNAM1）和外源性凋亡通路（FaS和TRAIL）在该作用中的机制,为有效清除白血病干细胞提供理论和实验依据,为治愈白血病提供新方法。方法第一章植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞生物学活性的影响利用细胞涂片,台盼蓝染色细胞计数,流式细胞术和半固体培养法等方法选择含有白血病干细胞的细胞株作为后续的靶细胞。选择白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞增殖的50%有效抑制浓度,观察细胞形态变化,荧光显微镜和流式细胞术检测细胞凋亡变化,流式细胞术检测细胞周期和表面标记的变化,半固体培养法检测细胞克隆形成率,分光光度法检测caspase8的活性,比较白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞生物学活性的影响。第二章植物多酚对活化免疫细胞杀伤CD34+早期急性髓系白血病细胞的影响分离正常健康人的外周血单个核细胞,加入细胞因子激活单个核细胞。利用细胞涂片,流式细胞术和LDH释放法,对活化免疫细胞进行鉴定。将白藜芦醇和姜黄素与KG-1a细胞作用24h后,存活的细胞与不同比例的活化免疫细胞共培养,倒置相差显微镜观察活细胞形态变化,LDH检测杀伤效率,半固体培养法检测克隆形成率。第三章植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞免疫激活物和外源性凋亡通路死亡受体的调节流式细胞术检测KG-1a细胞表面免疫激活物的表达,包括NKG2D配体,DNAM1配体,Fas和配体,TRAIL和受体的变化。加入TRAIL纯化蛋白后,XTT试剂盒检测KG-1a细胞增殖率,半固体培养法检测克隆形成率,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,分光光度法检测caspase8的变化,real-time PCR检测凋亡相关基因mRNA。第四章植物多酚作用后的CD34+早期急性髓系白血病细胞对活化免疫细胞的影响将白藜芦醇和姜黄素与KG-1a细胞作用24h后,再用活化免疫细胞以效靶比为10：1进行杀伤4h,对KG-1a细胞作用后的活化免疫细胞表面的NKG2D和DNAM1,Fas和配体,TRAIL和受体及凋亡的变化进行流式细胞术检测,对作用前后的活化免疫细胞内caspase8活性用分光光度法进行检测。统计学方法应用SPSSl3.0软件进行数据处理,数据以均数±标准差（x±s）表示,统计方法主要包括单因素方差分析法,若方差不齐,采用校正的F检验Welch法代替。方差齐时组间多重比较采用LSD法,方差不齐时组间多重比较采用Dunnett’s T3法。两两比较采用配对t检验。多因素分析采用析因分析。P<0.05提示差异有统计学意义。结果第一章植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞生物学活性的影响1.1 CD34+早期急性髓系白血病KG-1a细胞的特性倒置相差显微镜下观察KG-1a细胞和HL-60细胞,圆形透亮,大小均一,折光性好,边缘清晰。细胞涂片瑞氏-吉姆萨染料染色后观察,KG-1a细胞核浆比大,胞浆出现空泡,未见颗粒,胞核体积大,染色质疏松,可见大量核仁；HL-60细胞核浆比较小,胞浆出现大量颗粒,胞核体积较小,染色体较致密,核仁少见。KG-la细胞的对数倍增时间为24.24h,长于HL-60细胞15.83h。KG-1a细胞表达CD34抗原,部分缺失表达CD38抗原；HL-60细胞不表达CD34和CD38抗原。KG-1a细胞14d的克隆形成率低于HL-60细胞的克隆形成率,但21d的克隆形成率KG-1a细胞高于HL-60细胞克隆形成率,提示KG-1a细胞比HL-60细胞处于更早的分化阶段,并有大量细胞处于白血病干细胞阶段。1.2植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞的生物学活性的影响1.2.1白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞生长的抑制作用白藜芦醇和姜黄素均能有效抑制KG-1a细胞的增殖,随着浓度的增加和作用时间的延长,存活的KG-1a细胞逐渐减少,呈剂量和时间依赖性。不同浓度白藜芦醇对外周血单个核细胞增殖有一定的抑制作用,但是25-100umol/L的白藜芦醇对外周血单个核细胞增殖无明显影响。25umol/IL白藜芦醇对KG-1a细胞24h和48h的抑制率均为50%,而该浓度对正常的单个核细胞增殖并无抑制作用。因此,将25umol/L的白藜芦醇作为后续研究的干预因素。不同浓度姜黄素对外周血单个核细胞增殖的抑制作用较明显,但在12.5umol/L时抑制作用较小,而该浓度作用24h对KG-la细胞增殖的抑制率可达到50%。因此,将12.5umol/L的姜黄素作为后续研究的干预因素。1.2.2白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞形态和细胞核形态的影响倒置相差显微镜镜下观察,对照组KG-1a细胞圆形透亮,胞膜完整光滑,细胞碎片较少。而白藜芦醇和姜黄素作用24h后的KG-1a细胞出现细胞形状不规则、胞浆颗粒增多,甚至出现细胞碎片。DAPI染色,荧光显微镜下观察,对照组KG-la细胞胞核染色均一,形状规则,核膜完整,而白藜芦醇和姜黄素作用24h后的KG-la细胞核形状不规则,染色不均一,核膜不完整,甚至呈菜花状和碎片状。1.2.3白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞克隆形成率的影响甲基纤维素半固体培养,KG-1a细胞接种后第14天可形成>50个细胞组成的集落,随着时间延长,集落不断增大,集落数量不断增多,第21天达到高峰,随后集落中的细胞逐渐死亡,集落随之松散。与对照相比,白藜芦醇和姜黄素处理后KG-la细胞14天和21天的克隆数明显减少,提示白藜芦醇和姜黄素均能抑制KG-1a克隆形成细胞。1.2.4白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞周期的影响流式细胞术检测细胞周期变化,与对照组比较,25umol/L白藜芦醇作用后的KG-la细胞,G0/G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞相对减少,提示白藜芦醇将KG-la细胞周期阻滞在G0/G1期；12.5umol/L姜黄素作用后的KG-1a细胞,细胞周期无明显变化。1.2.5白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞表面CD34CD38抗原表达的影响流式细胞术检测细胞表面标记CD34CD38的变化,白藜芦醇能减少KG-1a细胞中较晚期干细胞的比例,使细胞停留在较原始的阶段,而姜黄素则能减少KG-la细胞中原始干细胞的比例,使细胞向成熟阶段分化。1.2.6白藜芦醇和姜黄素诱导KG-1a细胞凋亡的作用流式细胞术检测和荧光显微镜下观察,白藜芦醇和姜黄素均能诱导KG-la细胞凋亡。1.2.7白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞caspase8活性的影响分光光度法检测caspase8的活性变化,与对照组比较,白藜芦醇和姜黄素处理12h后均能提高caspase8活性,随着时间延长caspase8活性下降。第二章植物多酚对活化免疫细胞杀伤CD34+早期急性髓系白血病细胞的影响2.1活化免疫细胞的特性2.1.1活化免疫细胞的形态倒置相差显微镜下观察,细胞呈克隆样悬浮生长,聚团紧密,细胞胞体较小,圆形透亮,边缘光滑。瑞氏-吉姆萨染色细胞涂片观察,细胞圆形,较小胞浆蓝色,无颗粒,胞核染色质致密,符合典型淋巴细胞的特性。2.1.2活化免疫细胞凋亡和细胞周期的分布细胞因子IL-2和IL-15激活的活化免疫细胞发生自发凋亡的比例低,且大多细胞处于细胞周期的G0/G1期,不易被外环境所激活。2.1.3活化免疫细胞活化性受体的表达活化免疫细胞NKG2D的表达为（51.27±7.41）%,DNAM1的表达为（47.10±3.21）%,提示外周血单个核细胞在细胞因子IL-2和IL-15作用下能被激活表达活化性受体。2.1.4活化免疫细胞外源性凋亡通路Fas/FasL和TRAIL的表达活化免疫细胞TRAIL的表达为（44.17±7.22）)％,Fas为（89.03±7.14）%,FasLigand为（19.20±4.70）%。2.1.5活化免疫细胞对K562杀伤功能的检测LDH法检测对K562的杀伤效率,效靶比10：1时为（61.67±16.47）%,20：1时为（85.56±8.88）%,提示在抑制性受体的配体MHC-I类分子缺失的状态下,活化免疫细胞具有很高的杀伤活性。2.2植物多酚对活化免疫细胞杀伤CD34+早期急性髓系白血病细胞的影响2.2.1 LDH法检测白藜芦醇和姜黄素对活化免疫细胞杀伤KG-1a细胞的影响白藜芦醇和姜黄素作用后的KG-1a细胞,与活化免疫细胞共培养,倒置相差显微镜下观察,活化免疫细胞体积较小,紧密围绕在胞体较大的KG-1a细胞周围。LDH法检测杀伤率,在效靶比为10：1时,白藜芦醇和姜黄素能提高活化免疫细胞对KG-1a细胞的杀伤效率,而在效靶比为20：1时,白藜芦醇能提高活化免疫细胞对KG-1a细胞的杀伤效率,而姜黄素则不能提高杀伤效率。2.2.2白藜芦醇和姜黄素对活化免疫细胞杀伤KG-1a克隆形成细胞的影响半固体培养法检测白藜芦醇和姜黄素对活化免疫细胞杀伤KG-la克隆形成细胞的影响。结果显示,活化免疫细胞不能杀伤KG-1a14天克隆形成细胞,但能杀伤KG-1a21天克隆形成细胞；白藜芦醇不能增强活化免疫细胞杀伤KG-1al4天克隆形成细胞的敏感性,但能增强活化免疫细胞杀伤KG-1a21天克隆形成细胞的敏感性；姜黄素能增强活化免疫细胞杀伤KG-1a14天和21天克隆形成细胞的敏感性。第三章植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞免疫激活物和外源性凋亡通路死亡受体的调节3.1白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞NKG2D配体MICA,MICB,ULBP1,ULBP2和ULBP3表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞NKG2D配体MICA, MICB, ULBP1, ULBP2和ULBP3表达的影响。结果显示,姜黄素能提高MICA和MICB的表达,而白藜芦醇能提高ULBP1,ULBP2和ULBP3的表达。3.2白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞DNAM1配体CD112和CD155表达的影响的表达流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素对DNAM1配体CD112和CD155表达的影响。结果显示,白藜芦醇能下调KG-1a细胞CD112的表达,而姜黄素则能下调KG-la细胞CD112和CD155的表达。3.3白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞Fas和Fas Ligand表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素对Fas和Fas Ligand表达的影响。结果显示,白藜芦醇不能影响KG-1a细胞Fas和Fas Ligand的表达,但姜黄素能下调KG-1a细胞Fas Ligand的表达。3.4白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞TRAIL通路的影响3.4.1白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞TRAIL,死亡受体DR4/5和诱骗受体DcR1/2表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素TRAIL,死亡受体DR4/5和诱骗受体DcRl/2表达的影响。结果显示,白藜芦醇能提高KG-1a细胞死亡受体DR5的表达,下调诱骗受体DcR1的表达,而姜黄素不能提高死亡受体DR4/5的表达,但能下调诱骗受体DcRl的表达。3.4.2 TRAIL联合白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞的杀伤作用XTT试剂检测不同浓度TRAIL对25umol/L白藜芦醇和12.5umol/L姜黄素作用前后KG-1a细胞增殖的影响。结果显示,白藜芦醇能增强TRAIL对KG-1a细胞的细胞毒作用,与浓度无关；而姜黄素不能增强TRAIL对KG-1a细胞的细胞毒作用。因此,选择10ng/ml作为后续TRAIL实验的靶浓度。3.4.3 TRAIL联合白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞克隆形成率的影响半固体培养法检测TRAIL对白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞的克隆形成率的影响。结果显示,TRAIL对KG-1a细胞14天和21天的克隆形成细胞均无抑制作用；白藜芦醇能增强TRAIL对KG-1a细胞21天克隆形成细胞的抑制作用,但对14天克隆形成细胞无影响；.姜黄素不能增强TRAIL对KG-1a细胞21天克隆形成细胞的抑制作用,反而促进KG-1a细胞14天的克隆形成。3.4.4 TRAIL联合白藜芦醇对KG-1a细胞周期的影响流式细胞术检测TRAIL对白藜芦醇作用后KG-1a细胞的细胞周期影响。结果显示,TRAIL作用前后的KG-la细胞和KG-la/RES,细胞周期均无明显变化,提示TRAIL不影响KG-1a细胞周期的变化。3.4.5 TRAIL联合白藜芦醇对KG-1a细胞凋亡的影响流式细胞术检测TRAIL对白藜芦醇作用后KG-1a细胞凋亡的影响。结果显示,白藜芦醇能促进TRAIL诱导KG-1a细胞发生晚期凋亡和死亡。3.4.6 TRAIL联合白藜芦醇对KG-1a细胞caspase8活性的影响分光光度法检测TRAIL对白藜芦醇作用后KG-1a细胞凋亡相关蛋白caspase8活性的影响。结果显示,TRAIL不能上调KG-1a细胞caspase8的活性,白藜芦醇也不能增强TRAIL上调KG-1a细胞caspase8的活性。3.4.7 TRAIL联合白藜芦醇对KG-1a细胞抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的影响实时定量RT-PCR检测TRAIL对白藜芦醇作月后KG-1a细胞凋亡相关基因bcl-2和bcl-xl的影响。结果显示,TRAIL能下调KG-1a细胞抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的表达,白藜芦醇能增强TRAIL下调KG-1a细胞bcl-2基因表达,但不能增强TRAIL下调KG-1a细胞bcl-xl基因的表达。第四章植物多酚作用后的CD34+早期急性髓系白血病细胞对活化免疫细胞的影响4.1白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞活化性受体的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞活化性受体表达的影响。结果显示,未处理组KG-1a细胞与活化免疫细胞作用4h后,活化免疫细胞NKG2D和DNAM1的表达无明显变化,白藜芦醇和姜黄素干预后的KG-1a细胞能下调活化免疫细胞表面DNAM1的表达,对NKG2D的表达无影响。4.2白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞Fas/FasL表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞Fas/FasL表达的影响。结果显示,未处理组KG-1a细胞与活化免疫细胞作用4h后,Fas和FasL表达均无明显变化,白藜芦醇和姜黄素干预后的KG-1a细胞均能下调活化免疫细胞表面Fas和FasL的表达。4.3白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞TRAIL和受体表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞TRAIL受体表达的影响。结果显示,未处理组KG-1a细胞能下调TRAIL死亡受体DR4/5的表达,但同时上升诱骗受体DcRl的表达,对诱骗受体DcR2的表达无影响,白藜芦醇和姜黄素干预后的KG-1a细胞能下调活化免疫细胞表面TRAIL,死亡受体DR4/5和诱骗受体DcRl/2的表达。4.4白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞凋亡的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞凋亡的影响。结果显示,杀伤KG-la细胞后活化免疫细胞的凋亡率升高,杀伤白藜芦醇和姜黄素处理KG-1a细胞后活化免疫细胞的凋亡率升高更为明显。4.5白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞caspase8活性的影响分光光度法检测白藜芦醇和姜黄素干预后的白血病细胞对活化免疫细胞caspase8活性的影响。结果显示,与活化免疫细胞作用4h后与Oh比较,未处理组KG-1a细胞能增强活化免疫细胞内caspase8活性,而白藜芦醇和姜黄素作用后的KG-1a细胞则对活化免疫细胞内caspase8活性无影响。结论1.白藜芦醇和姜黄素能抑制含有白血病干细胞的CD34+早期急性髓系白血病KG-1a细胞增殖,抑制KG-1a细胞14天和21天的克隆形成,说明对白血病干细胞有直接作用。2.白藜芦醇和姜黄素诱导KG-1a细胞发生凋亡。3.白藜芦醇提高KG-1a细胞ULBP1-3的表达,姜黄素提高KG-la细胞MICA/B的表达,从而激发免疫细胞杀伤能力。4.白藜芦醇上调KG-1a细胞表面死亡受体DR5表达,下调诱骗受体DcR1和抗凋亡基因bcl-2的表达,增强caspase8活性,提高KG-la细胞被活化免疫细胞杀伤的敏感性。5.白藜芦醇和姜黄素能阻止KG-1a细胞通过外源性凋亡途径诱导活化免疫细胞凋亡。
刘卫海[7]（2011）在《新藤黄酸抗肿瘤作用及其机制研究》文中指出研究背景与目的中药藤黄（Gamboge）系藤黄科植物藤黄树（Garcinia hanburyi Hook. F. G）所分泌出的干燥树脂,近年来,其抗肿瘤作用受到高度关注。已经有研究表明,新藤黄酸（neogambogic acid. NGA）为藤黄抗肿瘤作用的主要有效成分之一,有望开发成抗肿瘤新药。但目前对其抗瘤谱的筛选尚不完全,尚未查阅到给药后新藤黄酸在体内分布的资料,对其抗肿瘤作用机制的研究也仅限于新藤黄酸对白血病细胞周期的影响,许多对该药物的应用较为重要的资料仍不完善。鉴于此,本文旨在进一步探讨新藤黄酸的体外和体内抗肿瘤活性,并在此基础上从细胞凋亡、细胞周期、细胞信号转导、端粒酶活性以及血管生成等角度入手,探索新藤黄酸的抗肿瘤作用机制,为新藤黄酸的开发及临床应用奠定理论基础。方法与结果1新藤黄酸的体外抗肿瘤作用运用MTT法和CCK-8法,通过测定新藤黄酸对体外培养肿瘤细胞的抑制率求出新藤黄酸对各肿瘤细胞株的IC50（半数抑制浓度）,考察新藤黄酸对体外培养肿瘤细胞的抗增殖作用,结果发现新藤黄酸对非选择性获得的16株肿瘤细胞均具有抗增殖作用,IC50在1.14～4.25μg/mL之间,说明新藤黄酸具有确切的体外抗肿瘤活性（IC50<10μg/mL）。对人正常肝细胞株HL-7702的抗增殖实验结果显示,新藤黄酸对人正常肝细胞HL-7702的IC50为5.23±0.04μg/mL,新藤黄酸对人肝细胞癌Hep G2细胞株的IC50为1.22±0.12μg/mL,提示新藤黄酸对正常肝细胞的增殖有一定的抑制作用,但作用强度较其对肿瘤细胞的作用强度弱,推论在一定浓度范围内（1.25-2.50μg/mL）新藤黄酸具有选择性抑制肿瘤细胞增殖的作用。2新藤黄酸的体内抗肿瘤作用经过急性毒性试验,运用SPSS11.5统计学软件按机率单位加权回归法（Bliss法）计算得出新藤黄酸对小鼠的LD50（半数致死量）为36.66mg/kg,在此基础上确定小鼠实验的高、中、低三个剂量分别为8.0 mg/kg、4.0 mg/kg、2.0 mg/kg.采用荷S180腹水瘤小鼠模型,以存活时间为指标,观察新藤黄酸对动物肿瘤的体内抗肿瘤作用。结果显示,NGA中剂量（4.0 mg/kg）对延长荷瘤小鼠的存活时间效果最好,明显高于阳性对照药氟尿嘧啶（5-FU） （10.0 mg/kg）的疗效（P<0.05）,但NGA高剂量（8.0 mg/kg）和NGA低剂量（2.0 mg/kg）的疗效均低于5-FU （10.0 mg/kg）的疗效（P<0.05）,且NGA低剂量的平均存活时间与阴性对照组的差异无统计学意义（P>0.05）。提示新藤黄酸发挥治疗作用的剂量范围较窄,高剂量组的疗效比中剂量组差可能是由新藤黄酸的毒副作用所引起的。在建立小鼠血液及器官组织中新藤黄酸的HPLC测定方法后,建立荷S180实体瘤模型,考察给药后新藤黄酸在小鼠体内的分布情况。结果显示,腹腔注射后新藤黄酸在心、肝、肺、脾、肾及肿瘤组织中的峰浓度值分别为9.58±2.79、16.49±4.17、14.51±3.68、8.23±1.88、8.85±2.37、10.28±2.75μg/g,但在试验条件下,未能在脑组织中检测到新藤黄酸,其原因可能是新藤黄酸未能通过血脑屏障或者浓度水平未达到检测限。根据体内分布实验结果和体外实验结果,确定裸小鼠移植瘤模型的瘤株为人肝细胞癌Hep G2细胞株,建立人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤模型,以相对肿瘤体积（relative tumor volume, RTV）和抑瘤率（inhibition rate of tumor growth, TGI）为指标考察新藤黄酸对人肿瘤的体内抗肿瘤作用,结果显示,新藤黄酸对人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用,在实验时间范围内,给药8d后,可观察到RTV随着给药剂量的增大而减小,给药14d后,阴性对照组、5-FU组、NGA高剂量（8.0 mg/kg）组、中剂量（4.0 mg/kg）组和低剂量（2.0 mg/kg）组的RTV分别为10.72±4.83、7.57±2.24、1.34±0.36、2.52±1.37和7.02±1.94；5-FU组、NGA高剂量（8.0 mg/kg）组、中剂量（4.0 mg/kg）组和低剂量（2.0 mg/kg）组的TGl分别为46.54%、83.75%、68.09%和22.14%；提示在一定剂量范围内,新藤黄酸具有确切的体内抗肿瘤作用。3新藤黄酸的抗肿瘤作用机制在确定新藤黄酸具有确切的抗肿瘤作用后,从细胞凋亡、细胞周期、细胞信号转导、端粒酶活性和肿瘤血管生成五个方面进一步研究新藤黄酸的抗肿瘤作用机制。采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测新藤黄酸干预后体外培养HepG2细胞的早期凋亡率,结果显示,早期凋亡率的最大值为（49.44±3.12）%,且出现在给药后24h,说明新藤黄酸具有诱导体外培养Hep G2细胞早期凋亡的作用。琼脂糖凝胶电泳DNA片段化分析的结果显示,新藤黄酸能使Hep G2细胞核DNA发生明显的降解,但未观察到细胞凋亡的特征DNA梯状条带,其原因可能是细胞在发生早期凋亡后,DNA又被进一步降解成200bp左右的片段。为了进一步研究细胞凋亡的机制,采用Western blot法检测给药后Hep G2细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的水平,结果显示,Bax呈浓度依赖性升高,Bcl-2呈浓度依赖性降低；对照组、NGA（1.0μg/mL）组、NGA（2.Oμg/mL）组和NGA（3.0μg/mL）的Bax/Bcl-2比值分别为0.06、0.29、2.25和21.14。说明新藤黄酸在一定浓度范围内可以上调体外培养Hep G2细胞的Bax/Bcl-2比值。免疫组化法检测人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤组织Bax、Bcl-2蛋白水平的结果显示,NGA低剂量（2.0mg/kg）组的Bax蛋白水平和Bcl-2蛋白水平与阴性对照组相比无显着差异（P>0.05）,NGA中剂量（4.0mg/kg）组和NGA高剂量（8.0mg/kg）组的Bax蛋白水平明显高于阴性对照组,而Bcl-2蛋白水平明显低于阴性对照组；阴性对照组、NGA（2.0mg/kg）组、NGA（4.0mg/kg）组和NGA（8.0mg/kg）的Bax/Bcl-2比值分别为0.729、0.808、1.679和1.688。提示新藤黄酸在一定剂量范围内可以上调Hep G2裸小鼠移植瘤组织的Bax/Bcl-2比值。可见,体外试验结果和体内试验结果均支持新藤黄酸可通过上调Bax的水平和（或）下调Bcl-2的水平,从而升高Bax/Bcl-2比值诱导细胞凋亡。在对细胞周期进展的影响方面,采用PI单染流式细胞术检测处于各细胞周期时相的细胞数占总细胞数的百分比,结果显示,与对照组相比,给药后12～36h,S期细胞明显增多,在给药后48h,G0/G1期细胞增多,说明新藤黄酸能使细胞阻滞在S期,且随着时间的延长,能进一步使细胞阻滞在G0/G1期。在对MAPK细胞信号转导通路的影响方面,采用免疫组化法检测Ras/Raf/MEK/ERK级联通路中ERK和MEK的活化形式p-ERK1/2和p-MEK1/2的水平,结果显示,新藤黄酸可下调ERK1/2蛋白和MEK1/2蛋白的磷酸化水平,说明新藤黄酸可以通过下调ERK信号通路的信号引起细胞周期阻滞从而抑制细胞的增殖。但其调节点可能在Ras/Raf/MEK/ERK级联通路中MEK的上游,因为MEK的活化形式p-MEK1/2的水平也得到了下调。在对端粒酶活性的影响方面,采用荧光定量PCR法,检测端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）的mRNA水平来间接反映端粒酶的活性。结果显示,新藤黄酸给药各组Hep G2细胞的hTERT mRNA水平都明显低于对照组（P<0.05）,且新藤黄酸给药各组的Hep G2细胞hTERT mRNA水平随给药浓度的升高而降低,各组间均有显着差异（P<0.05）。说明新藤黄酸对端粒酶活性具有抑制作用,且表现为浓度依赖性增强。据此推断,新藤黄酸可通过抑制端粒酶活性发挥体外抗肿瘤作用。在对肿瘤细胞血管生成的影响方面,运用免疫组化法检测Hep G2裸小鼠移植瘤组织中CD31（血小板内皮细胞粘附分子）的水平,从而反映新藤黄酸对肿瘤血管生成的影响,实验结果显示,新藤黄酸3个给药组的CD31阳性表达量IOD值均明显低于阴性对照组,且差异具有统计学意义（P<0.05）,提示在一定浓度范围内,新藤黄酸可降低实体瘤组织的CD31水平,说明新藤黄酸对实体肿瘤的血管生成有一定的抑制作用。结论新藤黄酸具有广谱的体外抗肿瘤作用,在一定浓度范围内,新藤黄酸可选择性抑制肿瘤细胞的增殖,而对正常细胞的抗增殖作用相对较弱。新藤黄酸给药后能在小鼠体内广泛分布,其中以肝脏分布最高,在肿瘤组织中也有较高的分布；新藤黄酸可显着延长荷S180腹水瘤小鼠的存活时间,说明新藤黄酸对动物肿瘤具有确切的体内抗肿瘤活性；新藤黄酸能显着减小人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤的相对肿瘤体积,抑瘤率可达到83.75%,说明新藤黄酸对人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤具有确切的体内抗肿瘤活性。新藤黄酸可通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期进展、抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用。新藤黄酸诱导肿瘤细胞凋亡与其对上调Bax/Bcl-2的比值有关。另外,新藤黄酸尚可通过下调MAPK/ERK信号通路关键酶的活性阻断MAPK级联反应,从而引起细胞周期阻滞,产生抗增殖作用；同时,细胞周期阻滞尚可诱导肿瘤细胞程序性死亡。
王伟[8]（2009）在《人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTpromoter）介导的ODC、SAMDC反义腺病毒的构建及其靶向抗肿瘤研究》文中认为多胺（polyamine）广泛存在于生物体内的各组织细胞中,是重要的代谢调控物质。在肿瘤组织中多胺的含量明显升高。鸟氨酸脱羧酶（ODC）是多胺生物合成的第一个关键酶,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。1992年Auvinen等首次在Nature上发表论文,认为ODC活性增高能促进细胞转化。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）是多胺合成的第二个限速酶,可以促进细胞的的恶性转化。文献报道SAMDC较ODC是更为有效的细胞转化的诱导因子。抑制多胺代谢途径成为治疗肿瘤的有效途径。相应的化学抑制剂如二氟甲基鸟氨酸（DFMO）、APA、CGP48664和AMA虽然在体内外的抑癌作用良好,但其严重的毒副作用极大的防碍了临床应用。寻找一种更高效更低副作用的抑制多胺合成途径的方法势在必行。如今,美国已启动600多个基因治疗的临床实验,其中60%是关于癌症治疗的。其中腺病毒介导的基因转染途径在癌症的基因治疗中特别引人关注,因为腺病毒的DNA不能整合到宿主基因组中,也不能感染卵细胞,具有很高的生物安全性。迄今为止,基因治疗的临床实例中近30%采用的是腺病毒载体。国内外研究证明反义核酸技术是比较理想的一种基因治疗方法,构建能转录反义RNA的重组载体在细胞内不断地转录出反义RNA,抵消酶解作用,发挥较持久的治疗效应。基因治疗在当今临床已经产生令人振奋的研究结果,但它的靶向安全性仍然是人们关注的焦点。许多肿瘤组织特异性启动子已被人类所认识,hTERT基因启动子更是备受关注。体外转基因实验中分别采用hTERT启动子与CMV启动子来转染不同的肿瘤细胞系,包括人肺癌细胞系（CH1299和A549）,结肠癌细胞系（DLD1和LoVo）,人宫颈癌细胞Hela及两种正常细胞系,结果显示:对于肿瘤细胞,hTERT启动子的转基因表达效率较CMV高2-3倍;而就正常细胞来说,CMV转基因的表达比hTERT高500多倍,这充分展示了hTERT启动子在肿瘤细胞中转基因表达的高效性与特异性。此后进行的体内直接转基因实验也证实了这一点。据此,本课题拟将ODC、SAMDC的反义基因分别构建入pAdEasy1系统,由人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTp）启动表达,检测重组病毒对肿瘤细胞的特异抑制作用,为肿瘤疾病的靶向性基因治疗奠定基础。第一部分细胞端粒酶活性检测及外源hTERT启动子活性检测【研究目的】检测本实验中拟使用的五株细胞中端粒酶的活性,并检测端粒酶催化亚基启动子在肿瘤细胞系和正常细胞系中的启动活性,为下一步人端粒酶逆转录酶启动子启动的ODC、SAMDC反义病毒载体的构建奠定基础。【研究方法】（1）体外稳定培养肿瘤细胞系（人肺癌细胞系A549、人肝癌细胞系Bel-7402、HepG2）及正常细胞系（人胚肺成纤维细胞HELF、人肝细胞LO2）。（2）提取各株细胞端粒酶蛋白,利用TRAP法进行端粒酶活性的检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。即将10μlTRAP产物与含溴酚蓝的6×凝胶载样缓冲液2μl混合,在120V的电压下,进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,直至电流使溴酚蓝色带泳出凝胶为止。固定银染显色后,出现4条以上间隔6bp的梯度条带者为端粒酶活性阳性。（3）将带有由人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTp）启动的指示基因luc的重组质粒（pGL3-hTERT-luc,由美国肯塔基大学微生物教研室惠赠）,转入各株培养细胞。（4）通过双荧光素酶法检测指示基因luc的表达活性,从而反映hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的启动活性。【实验结果】（1）利用TRAP法进行端粒酶活性的检测,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示:对于肿瘤细胞系（A549、Bel-7402和HepG2）,均具有大于4条以上的阳性带;而对于正常细胞系（HELF和LO2）,均未见阳性条带出现。（2）双荧光素酶法检测结果显示,在肿瘤细胞系中,hTERT启动子的比活性分别是:A549细胞为4.5±0.25;Bel-7402细胞为5.1±0.24;HepG2细胞为4.9±0.3。而在正常细胞中,hTERT启动子的比活性分别是:HELF细胞为0.16±0.02;LO2细胞为0.11±0.01。【结论】本实验中拟使用的三株肿瘤细胞（A549、Bel-7402和HepG2）,其端粒酶活性为阳性;而对应的两株正常细胞（HELF和LO2）,其端粒酶活性为阴性。荧光素酶活性检测显示:hTERT启动子在肿瘤细胞中具有较强启动活性而在正常细胞中未见有明显活性。第二部分hTERT启动子介导的人ODC、SAMDC反义腺病毒载体的构建【研究目的】分别构建由人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp介导ODC和SAMDC反义RNA表达的腺病毒载体,为在肿瘤细胞中靶向性抑制多胺合成提供新工具和手段。【研究方法】（1）应用PCR方法扩增出ODC mRNA翻译起始位点区120bp的基因片断,和SAMDC mRNA翻译起始位点区205bp的基因片断。PCR扩增产物和带有hTERT启动子的质粒pGL3-hTERT-luc均经XbaI、NcoI双酶切,回收质粒酶切长片段和PCR酶切产物片段。（2）将ODC和SAMDC回收片段分别与pGL3-hTERT-luc酶切长片段（-pGL3-hTERT-）进行连接,分别构成了pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒。（3） KpnI和SalI双酶切pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒,回收短片段（-hTERT-ODC-和-hTERT-SAMDC-）与经KpnI和SalI双酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack长片段连接。分别构成pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC重组质粒。（4）重组质粒经PmeI酶切线性化后,转入Adeasy-1细菌与pAdeasy-1质粒发生同源重组。挑选阳性重组质粒pAdeasy-hTERT-ODC和pAdeasy-hTERT-SAMDC,经PacI酶切后,转染293细胞包装和扩增出腺病毒颗粒。荧光显微镜和PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。【实验结果】（1）采用PCR方法扩增出120bp、205bp的ODC、SAMDC基因片断,经电泳鉴定正确。（2） pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒经XbaI、NcoI双酶切分别得到120bp、205bp小片段和4.5kb大片段,经测序鉴定正确。（3） pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC重组质粒经PCR扩增分别得到长120bp的ODC片断和长205bp的SAMDC片断,经测序鉴定此序列正确。（4）重组质粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC分别经PacⅠ酶切得4.5kb和35kb两个片段。（5）重组质粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC分别转染293细胞进行包装扩增,可见明显病毒空斑形成,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在293细胞中表达。扩增后腺病毒滴度为2×109pfu/ml,PCR证实两个重组质粒基因组中分别含有目的基因ODC和SAMDC。【结论】成功构建了由人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp介导ODC反义RNA表达的腺病毒载体rAd-hTERT-ODC和SAMDC反义RNA表达的腺病毒载体rAd-hTERT-SAMDC,为肿瘤疾病的靶向性基因治疗和预防提供了必要的侯备工具。第三部分两组反义腺病毒载体靶向性抑制肿瘤细胞增殖作用的研究【研究目的】研究两组重组腺病毒rAd-hTERT-ODC/SAMDC（rAd-hTERT-ODC和rAd-hTERT-SAMDC）对五株细胞（A549、Bel-7402、HepG2、HELF和LO2）中ODC、SAMDC基因表达的下调作用,并观察其对肿瘤细胞增殖以及侵袭能力的靶向抑制作用。【研究方法】（1）将两组重组腺病毒载体分别转染入上述五株细胞,通过MTS法测定不同MOI的腺病毒对各株细胞的转染效率,以找到不同细胞的最适感染滴度。rAd-hTERT-ODC/SAMDC分别以最适感染滴度感染人肺癌细胞系A549、人肝癌细胞系Bel-7402、HepG2及正常细胞系人胚肺成纤维细胞HELF、人肝细胞LO2。（2）采用Western-blot技术检测重组腺病毒感染细胞后,ODC和SAMDC蛋白表达情况。（3）采用MTS实验检测重组腺病毒对各株细胞增殖的抑制作用。（4）采用流式细胞术检测重组腺病毒对各细胞周期分布的影响。（5）采用Matrigel侵袭实验分析重组腺病毒对肿瘤细胞侵袭活性的影响。【实验结果】（1）腺病毒对A549细胞的最适感染滴度为50MOI,对其它细胞为25MOI。分别以该MOI的重组腺病毒感染A549、Bel-7402和HepG2肿瘤细胞可明显抑制其生长增殖,最大抑制率分别为65%、62%和55%;但对HELF和LO2正常细胞抑制生长作用不明显。（2）腺病毒感染肿瘤细胞后,可明显抑制ODC和SAMDC基因表达。rAd-hTERT-ODC对A549、Bel-7402和HepG2肿瘤细胞中ODC的抑制分别达50%、60%、50%,rAd-hTERT-SAMDC对SAMDC的抑制可达40%、50%、40%。两种重组腺病毒对正常细胞内的ODC和SAMDC均未见有明显抑制作用。（3）流式细胞DNA含量分析显示,两种重组腺病毒可引起肿瘤细胞周期阻滞于G0-G1期,但并未引起明显凋亡。对于正常细胞,rAd-hTERT-ODC和rAd-hTERT-SAMDC组与rAd-GFP组、PBS组未见明显改变。（4） Matrigel侵袭实验显示,重组腺病毒可显着抑制体外肿瘤细胞的侵袭能力。【结论】两组重组腺病毒rAd-hTERT-ODC、rAd-hTERT-SAMDC分别能有效抑制肿瘤细胞中ODC和SAMDC基因的表达,使细胞周期阻滞于G0-G1期,抑制肿瘤细胞的增殖活性,并明显抑制肿瘤细胞的侵袭活力。而对于正常细胞却没有明显抑制作用。从而初步证明rAd-hTERT-ODC、rAd-hTERT-SAMDC通过靶向性的抑制肿瘤细胞中多胺的合成,目的性抑制肿瘤的生长;重组病毒对于正常细胞却是相对安全的。
卢宏达[9]（2008）在《基于中医整体观念治法治则下的端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸联合作用对肺癌细胞端粒的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理恶性肿瘤,这种由于多种环境因素长期共同作用所产生的多基因疾病,在现代医学注重对单基因、单靶点的对抗性治疗下难以取得良好的效果。然而中医讲究整体、注重变化、注重平衡、辨证施治等基础理论的挖掘,不但可以解决诸如恶性肿瘤等复杂多基因疾病的问题,而且可以促进现代医学向更高境界发展。中医整体观念的治法治则为解决肿瘤分子生物学端粒抗癌靶点的难题提供了良好的思路。端粒是真核生物细胞染色体末端的特殊核酸蛋白结构,能保护染色体末端,以维持染色体结构的稳定。端粒长度的复制性缩短是通过端粒酶的逆转录合成来修复的,而端粒长度的维持对于肿瘤细胞保持无限增殖的永生化倾向至关重要。因此,通过抑制端粒酶来控制肿瘤是近年来国内外学者关注的热点之一。然而,理论推理的逻辑性和实验室工作的初步结果并没有给临床带来满意的效果。因为从整体的角度,除了端粒酶之外,还有众多的端粒相关蛋白因子参与端粒的调控;从平衡的角度,单独的端粒酶抑制是一种不完全的抑制。从理论上看,端粒结合蛋白1（TRF1）通过抑制端粒酶与端粒相互作用而对端粒长度起负向调节作用;而端锚酶能使TRF1发生ADP核糖基化而抑制其与端粒重复片段结合,是端粒长度的正向调节因子。端锚酶、端粒酶同时与TRF1相联系,两者的联合则有可能成为肿瘤基因治疗的一个靶点。为此,我们首先构建端锚酶反义寡核苷酸和反义端粒酶催化亚单位寡核苷酸,以其相应的正义寡核苷酸为对照,采用脂质体法将其导入端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549,观察反义寡核苷酸对A549细胞端粒动力学的影响、与Bcl-2凋亡基因家族的相互联系及反义寡核苷酸作用下A549细胞形态、功能的改变,探讨端锚酶、端粒酶联合作为肿瘤基因治疗的可能性和机理,为日后肿瘤基因治疗提供可靠的实验室数据和充足的理论准备。目的1.观察端锚酶、端粒酶两种反义寡核苷酸联合作用对端粒酶催化亚单位（hTERT）mRNA转录、端粒酶及端锚酶蛋白质表达水平的影响;探讨两种反义寡核苷酸作用对细胞端粒长度的影响。2.探讨两种反义寡核苷酸与Bcl-2凋亡基因家族相互作用的联系,收集其基因学证据。3.观察两种反义寡核苷酸持续作用下A549细胞形态学的改变,细胞传代与端粒缩短之间的相互关系,细胞氚摄取率及X-Gal转染率等功能学改变,探讨其肿瘤基因治疗的潜在价值。方法与结果1.运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对A549细胞端粒酶催化亚单位（hTERT）mRNA表达进行检测。结果发现:端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸（ashTERT）下调hTERT mRNA的转录;而端锚酶正、反义寡核苷酸（sTANKS、asTANKS）不影响其转录;端粒酶催化亚单位及端锚酶反义寡核苷酸联合（ashTERT+asTANKS）时hTERT mRNA的转录水平无额外的变化。2.采用多聚合酶链-酶联免疫吸附实验（PCR-ELISA）定量分析端粒酶活性。结果显示:ashTERT明显抑制端粒酶活性;asTANKS、sTANKS作用下端粒酶活性无明显变化;asTANKS与ashTERT联合作用下端粒酶活性亦无明显额外变化。3.采用Western Blot法检测端锚酶活性显示:asTANKS明显抑制端锚酶活性;ashTERT、shTERT作用下端锚酶活性无明显变化;ashTERT与asTANKS联合作用下端锚酶活性亦无明显额外变化。4.通过定量荧光原位杂交法（Q-FISH）上流式细胞仪检测A549细胞端粒长度。结果显示:与sTANKS、shTERT比较,asTANKS、ashTERT均可导致细胞端粒长度的明显缩短;而asTANKS+ashTERT的联合作用使细胞端粒长度的缩短更为明显,两者有协同作用。5.以RT-PCR法分析反义寡核苷酸作用下A549细胞mcl-1、Bcl-2和Bax基因的转录水平发现:ashTERT不影响上述三种基因的转录水平;asTANKS除上调mcl-1基因的转录外,对Bcl-2和Bax基因无影响;并且asTANKS的此种作用不因ashTERT的联合而发生改变。6.Western Blot法检测Mcl-1、Bcl-2及Bax蛋白活性显示:ashTERT对Mcl-1总蛋白活性无影响,但可使蛋白短拼接体的（Mcl-1s）含量下降;ashTERT对Bcl-2、Bax蛋白的表达无影响。asTANKS上调Mcl-1蛋白的表达,并且上调Mcl-1s的比例;对Bcl-2、Bax蛋白的表达无影响。asTANKS+ashTERT的联合作用可逆转Mcl-1s含量的下降,促进Mcl-1s、Mcl-1总蛋白活性的上调。7.普通光学显微镜及荧光显微镜观察,经asTANKS、ashTERT作用的细胞在形态学上渐出现细胞衰老的征象,并且在后期的传代试验中细胞凋亡的比例渐增;而asTANKS+ashTERT联合作用时细胞衰老和凋亡的特征更明显。8.细胞传代实验的结果显示:经asTANKS、ashTERT处理后的细胞传代时间明显延迟,细胞增殖周期明显缩短;而asTANKS+ashTERT联合作用时细胞增殖周期的缩短更为明显,两者有协同作用。9.经asTANKS、ashTERT处理后的细胞氚摄取率随细胞传代的进行逐渐下降,并且asTANKS+ashTERT联合作用组细胞氚摄取率降低更为明显,作为sTANKS、shTERT对照组的细胞氚摄取率无明显改变。10.经asTANKS、ashTERT处理后的细胞细胞X-Gal转染率随细胞传代的进行逐渐升高,并且asTANKS+ashTERT联合作用组细胞X-Gal转染率升高更为明显,作为sTANKS、shTERT对照组的细胞X-Gal转染率无明显改变。结论1.基于中医学整体平衡观念的治法治则对于解决恶性肿瘤端粒抗癌靶点的难题具有明显的指导意义。2.端锚酶反义寡核苷酸通路是完全有别于端粒酶的端粒抑制途径,其缩短细胞端粒长度的作用发挥有赖于减少自身端锚酶的活性。3.端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸在加速细胞端粒长度的缩短、促进肿瘤细胞衰老、凋亡方面具有协同作用。4.端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸协同作用的机理可能与mcl-1基因在转录及转录后水平的上调有关。总之,在中医学整体平衡观念的治法治则的指导下,端锚酶和端粒酶催化亚单位两种反义寡核苷酸协同作用限制A549恶性肿瘤细胞无限增殖的能力、加速其衰老、凋亡的研究,是肿瘤基因学治疗的新思路,有可能成为抗肿瘤基因治疗的新靶点。
李晋芳,廖建兴[10]（2007）在《端粒酶及端粒酶抑制剂的研究》文中提出随着生物医学的进步,人类对端粒和端粒酶的认识也不断深入。随着医学科学以及肿瘤分子生物学研究的发展,肿瘤的诊断与治疗手段已经出现了生物、
二、二氟甲基鸟氨酸对K562细胞生长特性的影响及其与端粒酶活性的相关性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、二氟甲基鸟氨酸对K562细胞生长特性的影响及其与端粒酶活性的相关性（论文提纲范文）
（1）手性紫罗兰酮生物碱衍生物ION-31a的结构优化和抗肿瘤转移活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、手性紫罗兰酮生物碱衍生物ION-31a的结构优化与表征 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 本实验所用原料与试剂 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 手性紫罗兰酮的合成设计思路 |
| 1.1.4 N-甲基结构片段衍生修饰合成设计思路 |
| 1.1.5 苯环结构片段衍生修饰合成设计思路 |
| 1.1.6 构象限制衍生合成设计思路 |
| 1.1.7 骨架跃迁衍生修饰合成设计思路 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 手性紫罗兰酮的合成与表征 |
| 1.2.2 N-甲基结构片段衍生合成与表征 |
| 1.2.3 苯环结构修饰衍生物的合成与表征 |
| 1.2.4 构象限制衍生物的合成与表征 |
| 1.2.5 骨架跃迁衍生物的合成与表征 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 烯丙位氧化反应条件摸索 |
| 1.3.2 化合物24的制备优化 |
| 1.3.3 化合物32的制备优化 |
| 1.4 小结 |
| 二、抗肿瘤转移活性研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 细胞株 |
| 2.1.4 细胞复苏 |
| 2.1.5 细胞传代及培养 |
| 2.1.6 细胞冻存 |
| 2.1.7 细胞计数 |
| 2.1.8 相关溶液的配制 |
| 2.2 实验原理与方法 |
| 2.2.1 MTT法检测化合物的细胞毒性 |
| 2.2.2 Transwell Chemotaxis方法检测化合物的抗肿瘤转移活性 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 衍生物抗肿瘤转移活性和构效关系 |
| 2.3.2 衍生物抗肿瘤转移活性与其类药性之间的关系 |
| 2.4 小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 部分目标化合物的~1H NMR、~(13)C NMR 和高分辨质谱图 |
| 综述 氮杂环化合物在抗肿瘤方面的研究应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）天然活性分子吲哚2,3-二酮抗神经母细胞瘤转移的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和实验动物 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.2 组织标本 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂和耗材 |
| 1.3.2 免疫组化相关试剂 |
| 1.3.3 RT-qPCR相关试剂 |
| 1.3.4 WB相关试剂 |
| 1.3.5 其他试剂 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 细胞水平和分子水平的抗肿瘤转移活性及其机制研究方法(体外实验) |
| 1.5.1 样品的配制 |
| 1.5.2 细胞培养 |
| 1.5.3 吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞增殖活性的影响 |
| 1.5.4 吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞集落形成能力的影响 |
| 1.5.5 划痕实验检测吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞迁移能力的影响 |
| 1.5.6 Transwell测定吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞侵袭能力的影响 |
| 1.5.7 流式细胞术(FCM)检测凋亡率的变化 |
| 1.5.8 DAPI染色法检测细胞凋亡 |
| 1.5.9 FCM 检测线粒体膜电位的变化 |
| 1.5.10 PI 染色 FCM 分析细胞周期 |
| 1.5.11 细胞免疫荧光 |
| 1.5.12 细胞内ROS水平检测 |
| 1.5.13 分子对接 |
| 1.5.14 实时定量(Real-time)PCR |
| 1.5.15 蛋白免疫印迹(Westernblot) |
| 1.5.16 免疫共沉淀(CO-IP) |
| 1.5.17 IHC检测神经母细胞瘤组织中LSD1 的表达 |
| 1.5.18 统计学分析 |
| 1.6 动物整体水平的抗肿瘤转移活性及其机制研究方法(体内实验) |
| 1.6.1 细胞培养 |
| 1.6.2 细胞转染 |
| 1.6.3 慢病毒转染细胞生物发光强度检测 |
| 1.6.4 转染细胞生长曲线检测 |
| 1.6.5 实验动物及其饲养 |
| 1.6.6 建模方法优化对比 |
| 1.6.7 动物实验 |
| 1.6.8 活体成像观察裸鼠转移瘤生长情况 |
| 1.6.9 实验动物取材 |
| 1.6.10 实验动物血液学检测分析 |
| 1.6.11 裸鼠血清中氧化应激指标SOD、MDA、GSH-PX的含量测定 |
| 1.6.12 裸鼠血清中VEGF、MMP2、MMP9 含量的检测 |
| 1.6.13 组织切片与病理检测 |
| 1.6.14 统计分析 |
| 结果 |
| 2.1 细胞水平和分子水平的抗肿瘤转移活性及其机制研究(体外实验) |
| 2.1.1 吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞增殖活性的影响 |
| 2.1.2 吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞形态的影响 |
| 2.1.3 吲哚2,3-二酮对细胞集落形成的影响 |
| 2.1.4 吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞迁移能力的影响 |
| 2.1.5 吲哚2,3-二酮对SH-SY5Y细胞侵袭能力的影响 |
| 2.1.6 吲哚2,3-二酮处理后细胞凋亡率的变化 |
| 2.1.7 吲哚 2,3-二酮处理后 DAPI 染色分析细胞凋亡 |
| 2.1.8 吲哚2,3-二酮处理后线粒体膜电位的变化 |
| 2.1.9 吲哚2,3-二酮处理后细胞周期的变化 |
| 2.1.10 吲哚2,3-二酮对MAOA/HIF-1α/CXCR4 信号通路的影响 |
| 2.1.11 吲哚2,3-二酮对MMP2、MMP9 的作用 |
| 2.1.12 吲哚2,3-二酮对细胞内ROS水平影响 |
| 2.1.13 吲哚2,3-二酮对MAPK激酶的影响 |
| 2.1.14 吲哚2,3-二酮对VEGFR表达水平影响 |
| 2.1.15 吲哚2,3-二酮与LSD1 的分子对接结果 |
| 2.1.16 吲哚2,3-二酮对LSD1/p53 信号通路的影响 |
| 2.1.17 LSD1 在临床病例神经母细胞瘤组织中的表达情况和细胞定位 |
| 2.2 动物整体水平的抗肿瘤转移活性研究(体内实验) |
| 2.2.1 建模方法优化对比结果: |
| 2.2.2 慢病毒转染效率检测结果 |
| 2.2.3 细胞转染前后生长曲线对比结果 |
| 2.2.4 裸鼠心腔注射瘤细胞建立转移瘤模型活体成像结果 |
| 2.2.5 各组裸鼠体重变化情况 |
| 2.2.6 各组裸鼠骨转移荧光强度分析结果 |
| 2.2.7 各组裸鼠主要脏器转移荧光强度分析结果 |
| 2.2.8 各组实验动物血液学检测分析结果 |
| 2.2.9 HE染色检测各组裸鼠主要转移脏器病理学变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（3）芪蟾口服结肠靶向片中有效组分的纯化及其体外抗结肠癌作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 一 芪蟾口服结肠靶向片中有效组分的纯化 |
| (一) 实验材料与仪器 |
| 1. 实验药材 |
| 2. 实验试剂 |
| 3. 实验仪器 |
| (二) 方法与结果 |
| 1. 黄芪总皂苷的纯化 |
| 2. 苦参中苦参碱的纯化 |
| 3. 干蟾皮中酯蟾毒配基(RBG)和华蟾酥毒基(CBG)的纯化 |
| (三) 分析与讨论 |
| (四) 小结 |
| 二 芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对结肠癌CT-26细胞增殖抑制作用的影响 |
| (一) 实验材料与仪器 |
| 1. 细胞株 |
| 2. 试剂与材料 |
| 3. 实验仪器 |
| 4. 药物的制备与试剂的配制 |
| (二) 方法与结果 |
| 1. 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| (三) 分析与讨论 |
| (四) 小结 |
| 三 芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达的影响 |
| (一) 实验材料与仪器 |
| 1. 细胞株 |
| 2. 试剂与材料 |
| 3. 实验仪器 |
| 4. 荧光定量PCR引物列表 |
| (二) 方法与结果 |
| 1. 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| (三) 分析与讨论 |
| (四) 小结 |
| 四 芪蟾口服结肠靶向片中有效组分对血管生成相关因子VEGF、HIF-1a表达的影响 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 细胞株 |
| 2. 试剂与材料 |
| 3. 实验仪器 |
| (二) 实验方法与结果 |
| 1. 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| (三) 分析与讨论 |
| (四) 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附：文献综述 |
| 参考文献 |
（4）以Src为靶点的吖啶类激酶抑制剂设计、合成及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 酪氨酸蛋白激酶 |
| 1.2 Src激酶 |
| 1.2.1 Src激酶家族 |
| 1.2.2 Src信号通路 |
| 1.2.3 Src抑制剂 |
| 1.3 吖啶类化合物 |
| 1.3.1 吖啶对DNA拓扑异构酶的抑制 |
| 1.3.2 吖啶对端粒酶的抑制 |
| 1.3.3 吖啶对蛋白激酶的抑制 |
| 1.4 化合物的设计 |
| 1.4.1 酪氨酸蛋白激酶结构 |
| 1.4.2 Src激酶抑制剂作用机制 |
| 1.4.3 目标化合物的设计 |
| 1.4.4 目标化合物的合成 |
| 1.4.5 氮杂吖啶合成方法探究 |
| 1.4.6 化合物活性及其作用机制的研究 |
| 1.5 本文工作的意义 |
| 第2章 吖啶类Src激酶抑制的合成及其性质研究 |
| 2.1 目标化合物的设计 |
| 2.2 目标化合物的合成 |
| 2.2.1 目标化合物的合成路线 |
| 2.2.2 实验试剂和实验仪器 |
| 2.2.3 化合物的具体合成方法以及结构数据 |
| 2.3 MTT实验对化合物IC50值的检测 |
| 2.3.1 MTT实验简介 |
| 2.3.2 实验试剂与实验仪器 |
| 2.3.3 MTT实验步骤 |
| 2.3.4 结果与讨论 |
| 2.3.5 MTT结果小结 |
| 2.4 化合物 8l、8m、8q的激酶活性测试 |
| 2.5 化合物 8l诱导K562细胞凋亡 |
| 2.5.1 细胞凋亡实验简介 |
| 2.5.2 实验试剂与实验仪器 |
| 2.5.3 实验操作 |
| 2.5.4 结果与讨论 |
| 2.6 化合物 8l诱导K562细胞凋亡的作用机制的研究 |
| 2.6.1 western blot实验简介 |
| 2.6.2 实验试剂和实验仪器 |
| 2.6.3 实验步骤 |
| 2.6.4 结果与讨论 |
| 2.7 小结 |
| 第3章 POCl_3介导的氮杂吖啶的合成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 化合物的具体合成方法及结构数据 |
| 3.3.1 合成路线 |
| 3.3.2 实验材料与实验仪器 |
| 3.3.3 目标化合物结构数据 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 化合物14最佳合成条件的研究 |
| 3.4.2 不同取代基对反应的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 氮杂吖啶类Src激酶抑制剂设计及合成初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 氮杂吖啶类化合物的优化设计 |
| 4.3 氮杂吖啶类化合物的合成 |
| 4.3.1 方案1合成路线 |
| 4.3.2 方案2合成路线 |
| 4.3.3 实验试剂和实验仪器 |
| 4.3.4 化合物的具体合成方法及结构数据 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 化合物17合成相关研究 |
| 4.4.2 化合物22的合成讨论 |
| 4.4.3 方案2的延伸 |
| 4.5 化合物 29a-c的K562细胞MTT实验结果 |
| 4.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附图 目标化合物核磁~1H谱、~(13)C谱以及质谱 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）当归多糖调控造血干细胞衰老的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 氧化低密度脂蛋白体外诱导造血干细胞衰老及其机制研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 当归多糖体外调控造血干细胞衰老及其机制研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 辐射诱导造血干细胞衰老及其机制研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第四部分 当归多糖延缓辐射致造血干细胞衰老的机制研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间参研课题与发表的学术论文 |
（6）植物多酚提高CD34+早期急性髓系白血病细胞被活化免疫细胞杀伤的敏感性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 植物多酚对CD34~+早期急性髓系白血病细胞生物学活性的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 植物多酚对活化免疫细胞杀伤CD34~+早期急性髓系白血病细胞的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 植物多酚对CD34~+早期急性髓系白血病细胞免疫激活物和外源性凋亡通路死亡受体的调节 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 植物多酚作用后的CD34~+早期急性髓系白血病细胞对活化免疫细胞的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（7）新藤黄酸抗肿瘤作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第1章 文献研究 |
| 1 中药藤黄研究概况 |
| 1.1 藤黄的种质资源 |
| 1.2 藤黄的中医文献考据 |
| 1.3 中药藤黄的化学成分研究进展 |
| 1.4 中药藤黄的现代药理研究进展 |
| 1.5 小结 |
| 2 中药抗肿瘤作用机制研究现状 |
| 2.1 作用于肿瘤细胞 |
| 2.2 作用于肿瘤血管 |
| 2.3 作用于免疫系统 |
| 2.4 抗突变作用 |
| 2.5 小结 |
| 3 新藤黄酸的研究现状 |
| 3.1 新藤黄酸是中药藤黄的有效成分 |
| 3.2 新藤黄酸的制备工艺研究现状 |
| 3.3 新藤黄酸的抗肿瘤作用研究现状 |
| 3.4 新藤黄酸的开发现状 |
| 3.5 小结 |
| 第2章 新藤黄酸的抗肿瘤作用研究 |
| 1 新藤黄酸的体外抗肿瘤作用 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 2 新藤黄酸的急性毒性试验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 新藤黄酸对荷S180腹水瘤小鼠的体内抗肿瘤作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 新藤黄酸在小鼠体内的分布 |
| 4.1 新藤黄酸测定方法的建立 |
| 4.2 液及器官组织中新藤黄酸含量的测定 |
| 4.3 讨论 |
| 5 新藤黄酸对裸小鼠移植瘤的体内抗肿瘤作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第3章 新藤黄酸的抗肿瘤作用机制研究 |
| 1 新藤黄酸对体外培养人肝细胞癌Hep G2细胞早期凋亡率的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 新藤黄酸对体外培养人肝细胞癌Hep G2细胞核DNA的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 新藤黄酸对体外培养人肝细胞癌Hep G2细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 新藤黄酸对实体瘤组织细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 新藤黄酸对体外培养人肝细胞癌Hep G2细胞周期的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 6 新藤黄酸对实体瘤细胞MAPK信号转导通路的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 7 新藤黄酸对体外培养人肝细胞癌Hep G2细胞端粒酶活性的影响 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.4 讨论 |
| 8 新藤黄酸对实体瘤血管生成的影响 |
| 8.1 实验材料 |
| 8.2 实验方法 |
| 8.3 实验结果 |
| 8.4 讨论 |
| 9 本章小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 研究生在学期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTpromoter）介导的ODC、SAMDC反义腺病毒的构建及其靶向抗肿瘤研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 第一部分:细胞端粒酶活性检测及外源hTERT启动子活性检测 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 各细胞株端粒酶活性检测 |
| 2.3 人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)在各细胞株启动标志基因(luc)的活性检测 |
| 结果 |
| 1.细胞端粒酶活性检测 |
| 2.pGL3-hTERT-luc分别转染肿瘤细胞和正常细胞，双荧光素酶活性的测定 |
| 讨论 |
| 第一部分总结 |
| 第二部分:hTERT启动子介导的人ODC、SAMDC反义腺病毒载体的分别构建 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 腺病毒构建流程图 |
| 2.1 ODC、SAMDC基因序列调取 |
| 2.2 pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC质粒载体的构建及鉴定 |
| 2.3 pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC病毒穿梭质粒载体的构建及鉴定 |
| 2.4 pAdeasy-hTERT-ODC和pAdeasy-hTERT-SAMDC腺病毒重组载体的构建 |
| 2.5 rAd-hTERT-ODC和rAd-hTERT-SAMDC重组腺病毒的包装和扩增 |
| 结果 |
| 1.pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC质粒的鉴定 |
| 2.穿梭质粒pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC的酶切鉴定 |
| 3.重组质粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC的鉴定 |
| 4.腺病毒的包装扩增及滴度测定结果 |
| 5.重组腺病毒的PCR鉴定 |
| 讨论 |
| 第二部分总结 |
| 第三部分:两组反义腺病毒载体靶向性抑制肿瘤细胞增殖作用的研究 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 重组腺病毒rAd-hTERT-ODC/SAMDC感染效率的测定 |
| 2.2 MTS细胞活力检测 |
| 2.3 细胞裂解 |
| 2.4 BCA试剂盒测定融合蛋白浓度 |
| 2.5 SDS-PAGE |
| 2.6 Western blotting鉴定表达蛋白 |
| 2.7 细胞周期的检测 |
| 2.8 基底膜侵袭实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.rAd-hTERT-ODC/SAMDC感染效率 |
| 2.Western blot鉴定ODC和SAMDC蛋白表达 |
| 3.MTS细胞生长曲线 |
| 4.rAd-hTERT-ODC/SAMDC对细胞周期影响 |
| 5.重组腺病毒对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响 |
| 讨论 |
| 第三部分总结 |
| 其它附图 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表的SCI文章 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附两篇英文文章 |
（9）基于中医整体观念治法治则下的端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸联合作用对肺癌细胞端粒的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:理论探讨 |
| 端粒酶抗癌靶点 |
| 中医的整体观念 |
| 基于整体观念治法治则指导下的端粒抗癌靶点研究 |
| 第二部分:实验研究 |
| 实验1:两种反义寡核苷酸对A549细胞端粒的影响 |
| 实验1研究图片 |
| 实验2:两种反义寡核苷酸对A549细胞基因学影响 |
| 实验2研究图片 |
| 实验3:两种反义寡核苷酸对A549细胞形态与功能的影响 |
| 实验3研究图片 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一:浅谈中西医结合的新观念 |
| 文献综述二:端粒的维持与肿瘤的发生 |
| 致谢 |
| 附录一:中英文缩写对照 |
| 附录二:学习期间发表论文 |
（10）端粒酶及端粒酶抑制剂的研究（论文提纲范文）
| 1 端粒、端粒酶及其与肿瘤的关系 |
| 1.1 端粒 (telomere) |
| 1.2 端粒酶 (telomerase) |
| 1.3 端粒酶活性与肿瘤相关性 |
| 2 端粒酶抑制剂治疗肿瘤的研究 |
| 2.1 作用于端粒酶的抑制剂 |
| 2.1.1 针对h TR的端粒酶抑制剂 |
| 2.1.2 通过抑制端粒酶催化蛋白亚单位 |
| 2.2 直接作用于端粒的抑制剂 |
| 2.3 通过核苷类似物竞争性抑制端粒酶的转录过程 |
| 2.4 对细胞内调节机制进行调控抑制端粒酶活性 |
| 2.5 通过细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性 |
| 2.6 化疗药物对端粒酶活性的影响 |
| 2.7 天然草药成分对端粒酶活性的抑制 |
| 3 问题与展望 |
四、二氟甲基鸟氨酸对K562细胞生长特性的影响及其与端粒酶活性的相关性（论文参考文献）
- [1]手性紫罗兰酮生物碱衍生物ION-31a的结构优化和抗肿瘤转移活性研究[D]. 聂江平. 天津医科大学, 2020(06)
- [2]天然活性分子吲哚2,3-二酮抗神经母细胞瘤转移的作用及分子机制研究[D]. 张丽. 青岛大学, 2019(07)
- [3]芪蟾口服结肠靶向片中有效组分的纯化及其体外抗结肠癌作用的研究[D]. 唐晓霞. 浙江中医药大学, 2015
- [4]以Src为靶点的吖啶类激酶抑制剂设计、合成及活性研究[D]. 李熙. 清华大学, 2015(07)
- [5]当归多糖调控造血干细胞衰老的机制研究[D]. 张先平. 重庆医科大学, 2013(04)
- [6]植物多酚提高CD34+早期急性髓系白血病细胞被活化免疫细胞杀伤的敏感性[D]. 胡亮杉. 南方医科大学, 2011(04)
- [7]新藤黄酸抗肿瘤作用及其机制研究[D]. 刘卫海. 广州中医药大学, 2011(09)
- [8]人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTpromoter）介导的ODC、SAMDC反义腺病毒的构建及其靶向抗肿瘤研究[D]. 王伟. 山东大学, 2009(10)
- [9]基于中医整体观念治法治则下的端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸联合作用对肺癌细胞端粒的影响及机制研究[D]. 卢宏达. 湖北中医学院, 2008(10)
- [10]端粒酶及端粒酶抑制剂的研究[J]. 李晋芳,廖建兴. 口腔颌面外科杂志, 2007(03)