一、膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染（论文文献综述）
李琪[1]（2021）在《miRNA-129-1-3p在芦丁减轻吡柔比星所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌药效中的介导作用》文中研究说明蒽环类药物吡柔比星（Pirarubicin,THP）是多种实体肿瘤和血液淋巴系统恶性肿瘤的常用化疗药物,疗效确切、抗肿瘤强,其中乳腺癌是以THP为一线药物进行治疗的癌症之一。在过去20年的早期诊断中,手术、放化疗和靶向治疗等显着降低了乳腺癌的死亡率。然而,存活率的提高使人们意识到抗癌治疗过程中改善THP所致心脏毒性的重要性。临床观察和研究显示THP主要毒副作用之一是心脏毒性,且往往呈进展性和不可逆性,严重限制了THP在临床上广泛和长期的使用。因此,发现新的药物靶点干预THP所致心脏毒性显得尤为重要。芦丁（Rutin,RUT）又名芸香苷,属黄酮类化合物,是《中国药典》收录的传统中药槐花的主要有效成分之一,广泛存在于槐花、银杏叶、大枣等中药材中。RUT具有抗自由基、抗脂质过氧化、抗炎、抗癌和保护心血管等药理作用。本课题组多年来一直进行RUT对心血管系统保护作用的研究,在大鼠实验中证实RUT对THP所致心脏毒性具有保护作用,并利用微小RNA（microRNA,miRNA）芯片技术构建RUT干预THP诱导大鼠心脏毒性miRNA表达谱。但RUT的具体作用机制尚未进行深入的探索,且对于RUT干预疾病发生发展过程中miRNA的作用知之甚少。本研究基于RUT干预THP诱导心肌损伤miRNA表达谱的分析结果,并通过miRbase数据库,发现miR-129-1-3p是与RUT抑制心脏毒性密切相关的一种潜在的生物标志物,且在不同物种中高度保守。随后使用Target Scan数据库搜索miR-129-1-3p的靶基因,将靶基因通过KEGG富集分析后发现,富集分析结果中的Ca2+通路与蒽环类药物所致心脏毒性的机制相关,我们对位于Ca2+通路中靶基因进行挑选,发现GRIN2D与miR-129-1-3p的靶向性最好。由此,我们推测RUT通过miR-129-1-3p直接靶向GRIN2D调节Ca2+通路,从而发挥对THP诱导的心肌细胞损伤的保护作用。随后,通过双荧光素酶报告基因实验证实,miR-129-1-3p可直接调控GRIN2D。此外,通过文献检索发现miR-129-1-3p在多种肿瘤中起到抑制作用。因此,本研究从细胞及整体动物实验对miR-129-1-3p/GRIN2D调控Ca2+通路介导的RUT减轻THP所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌的作用进行了探索,以期系统深入地揭示miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT干预心脏毒性和乳腺癌发生发展中所扮演的角色,从miRNA的角度阐明RUT治疗心脏毒性和乳腺癌的可能机制。（1）在心肌细胞（体外）实验中,我们采用RUT 100μM预处理,THP 5μM刺激小鼠心肌HL-1细胞24h,模拟RUT改善THP所致HL-1细胞损伤内环境,从细胞水平探讨RUT对THP诱导HL-1细胞损伤保护的具体机制。通过qPCR在HL-1细胞中进行验证,发现miR-129-1-3p在THP处理后的HL-1细胞中下调,而在RUT干预后使其上调,GRIN2D mRNA与其趋势相反,说明miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT对THP诱导HL-1细胞损伤的保护作用中发挥重要作用。为了研究miR-129-1-3p在RUT对THP诱导的心肌细胞损伤的保护作用,将miR-129-1-3p模拟物（mimics）转染至HL-1细胞中,通过DCFH-DA、MAD、SOD、Fluo-3 AM、TUNEL和Western blot实验证实,RUT和miR-129-1-3p可以抑制THP诱导的心肌细胞氧化损伤、钙超载,使Ca2+相关通路蛋白GRIN2D、钙调蛋白-1（Calm1）、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ（Ca MKⅡδ）和磷酸化的雷诺定受体2（Ry R2-p S2814）表达减少,肌质内皮网钙泵（SERCA2a）和钠钙交换剂1（NCX1）表达增加,并降低细胞凋亡率及抑制凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3的表达。（2）在乳腺癌细胞（体外）实验中,我们采用体外培养小鼠乳腺上皮HC11细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞,通过CCK-8检测发现,100μM的RUT抑制4T1细胞增殖,且与THP发挥协同作用。qPCR检测miR-129-1-3p在两种细胞中的表达,发现4T1细胞miR-129-1-3p的表达水平低于HC11细胞,而加入RUT干预后4T1细胞miR-129-1-3p的表达水平上升,GRIN2D mRNA与其趋势相反,说明miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT抑制小鼠乳腺癌细胞增殖的作用中也同样发挥重要作用。为了研究miR-129-1-3p对4T1细胞的抑制作用,将miR-129-1-3p mimics和miR-129-1-3p抑制物（inhibitor）分别转染至4T1细胞中,应用平板克隆、细胞划痕、Transwell、Fluo-3 AM和Western blot实验证实,miR-129-1-3p mimics可以抑制4T1细胞增殖、迁移和侵袭及其相关蛋白CD147、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达、抑制Ca2+水平及GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ蛋白的表达,促进Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达,而miR-129-1-3p inhibitor发挥相反作用。（3）在动物（体内）实验中,采用BALB/c小鼠作为研究对象,成功构建乳腺荷瘤与THP心脏毒性小鼠复合模型。给予RUT灌胃给药或尾静脉注射miR-129-1-3p模拟物（agomirs）4周后,BALB/c小鼠的心脏毒性得到明显减轻,心电图和心肌组织病理学损伤得以改善,心肌酶指标趋于正常,心肌组织miRNA-129-1-3p表达升高,GRIN2D mRNA表达降低,使Ca2+水平降低,GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ和Ry R2-p S2814蛋白表达减少,SERCA2a和NCX1的蛋白表达增加、心肌细胞凋亡减少,Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达降低。并且BALB/c小鼠乳腺肿瘤的生长、肝转移及肺部炎症反应得到进一步控制,肿瘤组织中miRNA-129-1-3p表达进一步上升,GRIN2D mRNA表达进一步下降,进一步抑制肿瘤组织中Ca2+含量及GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ、CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF的表达,并进一步促进肿瘤组织细胞凋亡及其相关蛋白Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3的表达。综上所述,本研究通过体内外实验得到以下结论:（1）体内外THP诱导小鼠HL-1细胞/心肌损伤实验证明,RUT可逆转THP诱导的HL-1细胞/心肌氧化应激损伤、小鼠心脏系数增加、血清心肌酶损伤、心电图异常及心肌组织病理学改变,对THP诱导的心脏毒性发挥保护作用。（2）RUT逆转THP诱导的小鼠HL-1细胞/心肌组织中miRNA-129-1-3p下调、GRIN2D mRNA上调、钙超载及细胞凋亡。表明RUT通过逆转THP所致小鼠心脏毒性的机制可能是通过miR-129-1-3p抑制GRIN2D表达及其调控的Ca2+通路,进而抑制心肌细胞凋亡所实现的。（3）体内外THP抑制乳腺癌实验证实,RUT可增敏THP抑制4T1细胞增殖、迁移和侵袭,抑制肿瘤生长、肝转移及肺部炎症反应,对THP抑制乳腺癌发挥增敏作用。（4）RUT增敏THP抑制4T1细胞/肿瘤组织中miRNA-129-1-3p下调、GRIN2D mRNA上调、使钙水平进一步降低并促进细胞凋亡。表明RUT通过增敏THP抑制小鼠乳腺癌的机制可能是通过miR-129-1-3p抑制GRIN2D表达及其调控的Ca2+通路,进而促进肿瘤细胞凋亡所实现的。本研究拓展了RUT的药理作用,并对miR-129-1-3p/GRIN2D的生物学功能提供了重要的补充,表明miR-129-1-3p可能是治疗THP所致心脏毒性及乳腺癌的新靶点,可作为开发治疗蒽环类药物所致心脏毒性和乳腺癌的新型药物的理论基础和实验依据。
赵巧云[2]（2021）在《PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究》文中研究表明研究背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,预后较差。胃癌的发生发展经过了一系列漫长的演变过程,其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染是该演变过程中最重要的始动因子。H.pylori通过多种毒力因子如Cag A、Oip A、Vac A等调控胃上皮细胞生物学行为的改变,但其致病机制目前尚不明确。我们前期利用H.pylori 7.13和CCS9803两种野生菌株分别感染胃上皮细胞GES-1,构建体外细菌细胞共培养模型,并进行细胞转录组学测序分析和实验验证,发现H.pylori感染可上调胃上皮细胞GES-1的前列腺跨膜蛋白雄激素诱导基因1（prostate transmembrane protein androgen inducible gene 1,PMEPA1）的m RNA和蛋白的表达,提示了PMEPA1可能参与H.pylori感染相关的胃黏膜病变过程。PMEPA1是于2000年在前列腺组织中被发现的一种新型雄激素诱导基因,主要在细胞膜和亚细胞器如溶酶体、高尔基体等的亚细胞器膜上表达。已知PMEPA1基因是一种TGF-β诱导基因,负性调控TGF-β信号通路。研究发现,PMEPA1在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程。然而,PMEPA1在胃癌中的研究尚不明确,且PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜改变过程中的作用也未见报道。因此本文通过生物信息学、PMEPA1基因干预、细胞转录组学等多种方法研究了PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜病变过程中的作用及机制,为进一步挖掘H.pylori感染致病的新的分子机制及为H.pylori相关胃癌的靶向调控提供新的理论依据。材料方法:（一）PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中的表达分析:（1）利用Oncomine数据库、GEO数据库、TCGA数据库的胃癌测序数据,分析PMEPA1在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达及PMEPA1在不同劳伦分型胃癌中的表达;（2）从南昌大学第一附属医院手术室收集18对胃癌及癌旁组织标本,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白质印迹（western blot,WB）的方法检测了PMEPA1在胃癌及癌旁组织的表达。2.PMEPA1表达与胃癌患者的预后分析:利用Kaplan-Meier Plotter在线分析数据库,评价PMEPA1与胃癌患者的总体生存期（over survival,OS）,无进展生存期（progression-free survival,FP）和进展后生存期（post-progression survival,PPS）的关系,明确PMEPA1的表达与胃癌患者预后的关系。3.PMEPA1在胃癌的诊断价值:利用p ROC包对TCGA数据库中的375例胃癌和32例正常胃黏膜组织测序样本进行受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析,并计算曲线下面积（Areas under the curve,AUC）,评估PMEPA1在胃癌的诊断价值。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）根据PMEPA1的中位表达值,将TCGA数据库的375个胃癌样本分为PMEPA1高表达组和低表达组,利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析两个差异基因集富集的生物学过程;（2）用R语言对TCGA数据库中与PMEPA1基因相关的基因进行批量计算,并对相关基因进行KEGG信号通路富集。（二）H.pylori感染及其毒力因子对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.H.pylori及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）构建H.pylori 7.13和PMSS1的oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）,并制备抗Oip A抗原的抗体,在基因和蛋白水平对oip A基因的敲除效果进行验证;（2）将H.pylori PMSS1野生菌株以不同感染复数（MOI）与胃上皮细胞GES-1共培养不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）,检测PMEPA1蛋白表达水平,并检测感染6h时PMEPA1的m RNA表达水平;（3）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）分别以不同MOI感染AGS细胞6h,检测PMEPA1蛋白的表达水平;（4）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）、cag A基因敲除菌株（Hp7.13Δcag A和Hp PMSS1Δcag A）及oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）分别与胃上皮细胞GES-1细胞和AGS细胞共培养6h,检测PMEPA1的蛋白和m RNA表达水平。2.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:从南昌大学第一附属医院病理科收集H.pylori感染的不同胃黏膜病理阶段的内镜标本石蜡切片,通过免疫组化法检测PMEPA1的表达。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1过表达及敲减稳转细胞株的构建:分别构建过表达PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1highGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1highGES-1)、敲减PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1lowGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1lowGES-1)、过表达PMEPA1的BGC-823细胞(PMEPA1highBGC-823)及对照细胞(NC-PMEPA1highBGC-823)。2.PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响及机制:（1）通过平板克隆形成实验、实时无标记细胞分析（Real Time Cellular Analysis,RTCA）技术、CCK8法检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖的影响;（2）通过transwell侵袭和迁移实验、划痕修复实验检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞侵袭和迁移的影响;（3）通过生物信息学分析TCGA数据库胃癌数据集中PMEPA1与EMT转录因子的相关性;（4）Western Blot检测EMT相关分子的蛋白表达水平。3.PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响:（1）H.pylori PMSS1的野生菌株、cag A及oip A敲除菌株感染PMEPA1highBGC-823细胞及其对照细胞,RTCA技术、transwell侵袭和迁移实验检测PMEPA1过表达对H.pylori感染的胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;（2）H.pylori 7.13野生型菌株感染PMEPA1lowGES-1及其对照细胞NC-PMEPA1lowGES-1,transwell实验检测PMEPA1敲减对H.pylori感染的胃上皮细胞的侵袭和迁移能力的影响。（四）转录组学分析PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学功能的影响1.转录组学样品准备:将Hp7.13wt和Hp PMSS1wt分别感染PMEPA1lowGES-1及NC-PMEPA1lowGES-1细胞（MOI=100）,将Hp7.13wt、Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染PMEPA1highGES-1及NC-PMEPA1highGES-1细胞（MOI=100）,H.pylori感染6h后收集细胞总RNA;同时收集PMEPA1highBGC-823及NC-PMEPA1highBGC-823细胞总RNA;每个组设置三个生物学重复,共收集48个RNA样品。2.转录组测序及分析:（1）转录组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司,基于Illumina Novaseq 6000测序平台,通过c DNA文库构建、上机测序、测序数据质控、基因注释等步骤获得基因表达量数据;（2）利用DESeq2软件对表达基因进行差异分析,筛选标准为差异基因表达倍数（Fold Change）>1.5,校正P<0.05;（3）采用Goatools软件对差异基因进行GO富集分析,校正P<0.05为显着富集;采用R语言对差异基因进行KEGG富集分析,P<0.05为显着富集。结果:（一）PMEPA1在胃癌组织的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中高表达:（1）Oncomine数据库分析结果显示,PMEPA1在多种癌症组织中显着高表达（P<0.05）,包括乳腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌及多个消化系统肿瘤如食管癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌。（2）利用GEPIA数据库,共纳入408例TCGA胃癌样本和211例包含TCGA及GETx数据库的正常胃黏膜组织样本,分析结果显示,PMEPA1在胃癌组织样本的表达显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（3）从GEO数据库中下载三个胃癌测序数据集（GSE54129,GSE79973,GSE118916）,分析结果显示,在三个GEO数据集中,PMEPA1在胃癌组织中的转录水平均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（4）利用Oncomine数据库分析PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织中的表达情况,结果显示PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织的表达均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（5）18例胃癌及癌旁手术标本的q RT-PCR及WB结果显示,PMEPA1在胃癌组织的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）。2.PMEPA1高表达与胃癌患者不良预后有关:Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示,PMEPA1是胃癌患者预后不良的风险因素（HR>1）,PMEPA1高表达的胃癌患者总体生存期（HR=1.52）、无进展生存期（HR=1.38）及进展治疗后生存期（HR=1.67）显着缩短（P<0.05）。3.PMEPA1诊断胃癌的临床价值:对TCGA数据库的胃癌数据集绘制PMEPA1基因的受试者工作曲线（ROC）,曲线下面积AUC为0.893,说明PMEPA1是良好的胃癌诊断标志物。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）GSEA分析结果显示,PMEPA1高表达与TGF-β、上皮间充质转化（EMT）、血管生成、缺氧、Wnt信号通路和Hedgehog信号通路显着正相关（FDR q-value<0.05）;（2）批量相关性基因的KEGG富集分析结果显示,PMEPA1及其相关性基因主要富集在E2F靶基因、有丝分裂纺锤体、MYC靶基因、蛋白质分泌、DNA修复、G2M细胞周期检查点、血管生成、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、紧密连接、EMT等信号通路,其中PMEPA1与EMT信号通路呈显着正相关（校正P值=0.005）。（二）H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.成功构建了Hp7.13和Hp PMSS1菌株的oip A基因敲除菌株,及抗Oip A抗原的兔多克隆抗体。2.H.pylori感染上调胃上皮细胞PMEPA1蛋白和m RNA表达水平:（1）前期转录组学分析结果显示,Hp7.13和Hp CCS9803菌株感染感染GES-1细胞24h,与未感染H.pylori的细胞相比,PMEPA1表达分别上调1.59倍和1.13倍,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Hp PMSS1以不同MOI感染胃上皮GES-1细胞1、3、6、12、24h,在感染6h和12h时随着MOI增大,PMEPA1蛋白表达水平逐渐上升,在MOI=50表达水平最高（P<0.05）,PMEPA1的m RNA表达水平在感染6h时MOI=100表达最高（P<0.05）。（3）将Hp 7.13和PMSS1以不同MOI感染胃癌细胞株AGS 6h,随着MOI的增加,PMEPA1蛋白表达水平上升,其中MOI=50在两个菌株中都有统计学差异（P<0.05）。3.Hp毒力因子Cag A和Oip A对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1 6h,Western Blot结果显示,Hp7.13wt或PMSS1wt感染后PMEPA1蛋白表达高于未感染的对照组,而cag A和oip A基因敲除菌感染的PMEPA1蛋白表达低于野生组;（2）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1和AGS细胞6h,荧光定量PCR结果显示,Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染GES-1和AGS细胞后,PMEPA1的m RNA表达水平显着高于未感染细胞（P<0.05）,而cag A和oip A基因敲除菌感染时PMEPA1的m RNA表达显着低于野生菌感染的细胞（P<0.05）。4.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:（1）PMEPA1在炎细胞和腺细胞中均有表达,主要定位于细胞质及核膜。（2）在腺细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的轻度慢性非萎缩性胃炎、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）;在炎细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的重度非萎缩性炎症、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）。（3）在H.pylori感染的标本中,PMEPA1在轻度和重度非萎缩性胃炎患者标本腺细胞中的表达显着低于肠化生、异型增生和胃癌组（P<0.05）;在轻度非萎缩性胃炎的炎细胞中的表达显着低于其它各组（P<0.05）;在H.pylori未感染患者,无论是腺细胞还是炎细胞,PMEPA1的表达在胃癌组均显着高于其它各组（P<0.05）。以上结果提示,PMEPA1可能参与了H.pylori感染的胃黏膜病变过程。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖:（1）平板克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highGES-1的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;PMEPA1lowGES-1的增殖能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）体外克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highBGC-823的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;2.PMEPA1促进胃上皮和胃癌细胞的侵袭和迁移:（1）Transwell侵袭和迁移实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的侵袭和迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1lowGES-1细胞的侵袭和迁移能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）划痕修复实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）。3.PMEPA1与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）有关:（1）利用Cbioportal数据库分析了PMEPA1与EMT有关基因的相关性,分析结果显示,PMEPA1与间充质细胞标志物N-cadherin的编码基因CDH2、Vimentin的编码基因VIM、EMT间充质细胞转录因子ZEB1、TWIST1、TWIST2显着正相关（P<0.05）,与Snail转录因子编码基因SNAI1和Slug转录因子编码基因SNAI2显着正相关（P<0.05）;与基质金属蛋白酶分子编码基因MMP11、MMP14、MMP7、MMP2、MMP1、MMP17、MMP13和MMP24显着正相关（P<0.05）;（2）Western Blot结果显示,PMEPA1lowGES-1的E-cadherin蛋白表达显着高于NC细胞（P<0.05）,N-cadherin蛋白表达显着低于NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1high GES-1则反之（P<0.05）。4.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞BGC-823增殖的影响:Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823细胞和对照细胞,RTCA结果显示,H.pylori感染18小时后开始促进NC组细胞的增殖,在感染后的40-78h内,Hp PMSS1wt菌株显着促进NC-PMEPA1highBGC-823细胞的增殖（P<0.05）,而Hp PMSS1Δcag A及Hp PMSS1Δoip A感染组与Hp PMSS1wt感染组相比,细胞增殖无统计学差异（P>0.05）;Hp PMSS1wt菌株及cag A和oip A敲除菌株对PMEPA1highBGC-823细胞的增殖无统计学差异（P>0.05）。5.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞和胃上皮细胞迁移和侵袭的影响:（1）PMEPA1过表达对H.pylori感染的BGC-823胃癌细胞迁移和侵袭的影响:H.pylori未感染组中,过表达PMEPA1显着促进BGC-823细胞的迁移和侵袭（P<0.05）;Hp7.13wt感染PMEPA1highBGC-823及对照细胞后细胞迁移和侵袭能力显着高于未感染细胞（P<0.05）,同时Hp7.13wt感染组细胞的迁移和侵袭能力显着高于Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染组（P<0.05）;Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823和NC细胞后,细胞侵袭能力同Hp7.13菌株,而迁移能力在PMEPA1highBGC-823细胞各组无统计学差异（P>0.05）。（2）PMEPA1敲减对Hp7.13wt感染的胃上皮GES-1细胞的迁移和侵袭的影响:Hp7.13wt感染PMEPA1lowGES-1及对照细胞后,细胞迁移和侵袭能力显着增加（P<0.05）。（四）转录组学分析PMEPA1在H.pylori感染的胃上皮细胞作用的生物学功能1.PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响:（1）PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞GES-1转录水平的影响:（1）GES-1过表达PMEPA1后共有1025个差异基因,敲减PMEPA1后共有1376个差异基因;（2）差异基因主要富集的GO通路有细胞运动相关如质膜黏附分子的细胞间黏附作用、趋化运动、黏附过程、细胞迁移、细胞运动、细胞外基质成分、细胞运动的调节等生物过程;（3）差异基因富集到的KEGG信号通路主要有细胞粘附分子、TGF-β、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）PMEPA1过表达对胃癌细胞株BGC-823转录水平的影响:（1）共有132个差异基因;（2）主要富集的GO通路有细胞外基质组成、组织形态发生、急性炎症反应、TGF-β的分泌调控等生物过程;（3）主要富集到的KEGG通路包括耶尔森菌感染、小细胞肺癌、内吞、抗坏血酸和醛酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、ECM-受体相互作用。综上,PMEPA1过表达或敲减主要影响细胞运动、迁移、细胞黏附、受体配体相关作用、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用等生物学过程。2.H.pylori感染对敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响（1）H.pylori感染对敲减PMEPA1的GES-1细胞转录水平的影响:（1）Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染PMEPA1lowGES-1细胞后,分别有2315和959个差异基因;（2）差异基因富集的GO通路相似,主要包括细胞对缺氧的反应、细胞分裂、血管发育的调控、细胞周期的正向调控、细胞运动的正向调控等生物过程;（3）共同富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）H.pylori感染对过表达PMEPA1的GES-1转录水平的影响:（1）Hp7.13wt感染NC-PMEPA1highGES-1后,共有1646个差异基因,富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路的研究、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路等;（2）Hp7.13wt与Hp7.13Δcag A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因富集到了17条信号通路,主要有肿瘤中的micro RNAs、细胞周期、P53信号通路、细胞衰老、FOXO信号通路、癌症中的转录调控异常、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路等,说明cag A可能通过以上这些通路起作用。（3）Hp7.13wt与Hp7.13Δoip A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因未富集到KEGG通路。综上,H.pylori感染可能通过转录因子的调控作用、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路介导敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的变化,其中毒力因子Cag A可能发挥重要作用。3.PMEPA1对不同H.pylori菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响（1）PMEPA1敲减对Hp7.13（或PMSS1）感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp PMSS1wt）感染PMEPA1lowGES-1及其对照组细胞,差异基因富集的KEGG通路相似,主要包括AGE-RAGE信号通路的研究、癌症中胆碱代谢、细胞衰老、Hippo信号通路、EGFR酪氨酸酶抑制耐受、癌症中的micro RNA、Fox O信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞骨架调控等;（2）PMEPA1过表达对不同H.pylori菌株感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）感染PMEPA1highGES-1及其对照细胞,差异基因富集的信号通路相似,主要的GO富集有TGF-β的反应、趋化性的调节、质膜粘附分子的粘附、细胞对生长因子刺激反应等过程等生物过程;主要的KEGG富集有细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路等。综上,在H.pylori感染胃上皮细胞的过程中,PMEPA1可能通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。结论:1.PMEPA1在胃癌组织高表达,与胃癌不良预后有关,是良好的胃癌诊断标志物。2.PMEPA1高表达促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,与EMT表型相关。3.H.pylori感染调控PMEPA1的表达,促进胃上皮细胞的增殖、侵袭和迁移,部分依赖于毒力因子Cag A和Oip A的作用。4.H.pylori感染胃上皮细胞调控多种生物学过程;PMEPA1通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。
宫文静[3]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中研究说明研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。
陈琼锋[4]（2021）在《磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究》文中研究说明背景与目的:原发性肝癌是临床常见的一种恶性肿瘤,其中75%至85%的原发性肝癌为肝细胞癌。肝细胞癌的主要危险因素是肝炎病毒感染,由于全球对肝炎病毒的传染控制力度加大,使其发病率保持稳定,但肝癌的死亡率却在逐年上升,主要原因是分子机制多样性和不确定性,难以实施靶向治疗。Akt作为肿瘤生长的重要分子,受促癌因子和癌基因的调控,他的生物学功能与mTORC1和mTORC2的参与密不可分。一方面,Akt的许多生物学功能由mTORC1介导,后者磷酸化S6K1,调节蛋白质合成;另一方面,Akt与血清葡萄糖激酶（SGK）和蛋白激酶C（PKC）一样作为底物,其活性受mTORC2调节。研究发现,PEBP4在许多癌组织中上调,并发挥促癌作用;另外,有报道显示PEBP4与Akt结合并参与其活性调节。然而,PEBP4与Akt-mTOR在肝癌中的相互作用尚未见报道,故成为本课题的研究重点,结果将为肝细胞癌的治疗提供分子靶点。实验方法:1.观察PEBP4对肝癌细胞生物行为学的影响（1）免疫组化:检测肝癌患者癌组织和癌旁组织中PEBP4的表达;（2）Western blot（WB）和qPCR:比较正常肝细胞（LO2）和恶性程度相对不同的肝癌细胞系,包括低恶性程度:MHCC97L,中度恶性程度:He PG2,SMMC-7721,高恶性程度:MHCC97H和HCCLM3中PEBP4的表达情况;（3）构建稳定细胞系:用sh RNA-PEBP4和PCMV6-PEBP4分别敲低MHCC97H细胞和过表达MHCC97L细胞中的PEBP4,WB和qPCR验证细胞系的成功构建;（4）通过CCK8,克隆形成实验,检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞生长能力的影响;（5）采用划痕实验,Transwell检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响;（6）皮下植瘤实验:在裸鼠皮下（腋窝）接种肝癌细胞,体内观察敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞生长能力的影响;（7）肺转移模型构建:通过裸鼠尾静脉接种肝癌细胞,检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞转移能力的影响。2.观察PEBP4对Akt/mTOR信号通路的影响（1）WB检测敲低和过表达PEBP4细胞中Akt/mTOR信号通路的变化;（2）IGF-1刺激敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化;（3）Akt腺病毒（Akt-S473D）感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化;（4）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化。3.探讨PEBP4、Akt/mTOR信号通路在肝癌细胞生物行为学中的作用（1）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,采用CCK8、Transwell分别检测肝癌细胞的生长、迁移和侵袭能力;（2）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,CCK8、Transwell分别检测肝癌细胞的生长、迁移和侵袭能力。4.观察PEBP4对EMT的影响（1）WB检测敲低和过表达PEBP4细胞系中EMT的变化;（2）免疫荧光检测敲低和过表达PEBP4细胞系中E-cadherin和N-cadherin的变化;（3）IGF-1刺激敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测EMT的变化;（4）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB和免疫荧光检测EMT的变化;（5）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,WB和免疫荧光检测EMT的变化。5.探讨PEBP4、Akt、mTOR之间的关系（1）免疫共沉淀检测MHCC97H细胞中PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（2）用N-myc-PEBP4转染HEK293T细胞,免疫共沉淀方法检测PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（3）在敲低PEBP4细胞系中,采用免疫共沉淀检测PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（4）siRNA-mTOR转染HEK293T细胞后,采用免疫共沉淀检测Akt、mTOR、PEBP4之间的关系。结果:1.PEBP4对肝癌细胞生物行为学的影响（1）免疫组化结果显示,癌旁组织中PEBP4表达偏低,癌组织中PEBP4表达偏高;（2）WB和qPCR结果表明,与正常肝细胞（LO2）和恶性程度低的肝癌细胞（MHCC97L）比较,PEBP4在恶性程度高的肝癌细胞（MHCC97H,HCCLM3）中的表达要高;（3）CCK8和克隆形成实验表明,敲低PEBP4使肝癌细胞较对照组的生长能力减弱,而过表达PEBP4使肝癌细胞生长能力增强;（4）敲低PEBP4后,划痕实验和Transwell结果显示肝癌细胞的迁移和侵袭能力减弱,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;（5）皮下移植实验结果表明敲低PEBP4的肝癌细胞在裸鼠体内的生长能力较对照组下降,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;（6）肺转移结果显示:敲低PEBP4的肝癌细胞较对照组在裸鼠肺中形成的结节减少,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反。2.PEBP4对Akt/mTOR信号通路的影响（1）与对照组相比,WB结果显示,敲低PEBP4后（a）mTORC2 Ser2481的磷酸化以及mTORC2的底物SGK1、PKCα的磷酸化降低;（b）Akt Ser473和Thr308磷酸化被抑制;（c）Akt调节直接底物RSK2和mTORC1 Ser2448的磷酸化下降;（d）mTORC1介导的p-S6K1表达下降;（e）过表达PEBP4对以上指标的影响结果与敲低PEBP4完全相反;（2）WB结果显示,（a）IGF-1不影响PEBP4的表达;（b）IGF-1不能逆转敲低PEBP4对结果（1）中各指标的影响;（3）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞后,WB结果发现:（a）Akt-S473D不影响PEBP4的表达;（b）Akt-S473D对PEBP4敲低引起的mTORC2Ser2481磷酸化下调没有影响;（c）Akt-S473D逆转敲低PEBP4对Akt Thr308磷酸化的下调作用;（d）Akt-S473D抵消敲低PEBP4对RSK2和mTOR Ser2448磷酸化的抑制作用;（e）Akt-S473D逆转敲低PEBP4对p-S6K1表达的下调作用。（4）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞后,WB结果显示:（a）MK-2206对PEBP4的表达没有影响;（b）MK-2206对过表达PEBP4上调mTOR Ser2481、SGK1、PKCα磷酸化没有影响;（c）MK-2206抑制过表达PEBP4对Akt Ser473和Thr308磷酸化的上调作用;（d）MK-2206抑制过表达PEBP4对RSK2和mTOR Ser2448磷酸化的促进作用;（e）MK-2206下调过表达PEBP4对p-S6K1表达的上调作用。3.PEBP4、Akt/mTOR信号通路对肝癌细胞生物行为学的作用（1）CCK8结果显示,Akt-S473D可以部分逆转敲低PEBP4对肝癌细胞生长能力的抑制作用,而MK-2206可以抑制过表达PEBP4对肝癌细胞生长的促进作用;（2）Transwell结果显示,Akt-S473D可以部分逆转敲低PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用,而MK-2206可以抑制过表达PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭的促进作用。4.PEBP4对EMT的影响（1）WB结果显示,敲低PEBP4上调E-cadherin的表达,且下调N-cadherin,vimentin和integrin的表达,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;免疫荧光检测结果与WB一致;（2）WB结果证明,IGF-1刺激PEBP4敲低的细胞并不能影响EMT等指的变化;（3）WB和免疫荧光结果显示Akt-S473D可逆转敲低PEBP4对EMT的作用,且MK-2206可抵消过表达PEBP4对EMT的作用。5.PEBP4、Akt、mTOR之间的关系（1）免疫共沉淀结果显示,无论是在MHCC97H细胞中还是在N-myc-PEBP4转染HEK293T细胞中,都能证明PEBP4,Akt,mTOR之间存在相互作用;（2）在敲低PEBP4细胞系中,免疫共沉淀结果显示,PEBP4与Akt和mTOR之间的相互作用消失,但Akt和mTOR之间的关系仍然存在;（3）siRNA敲除mTOR后,免疫共沉淀结果显示,Akt与PEBP4之间的关系存在,而PEBP4与mTOR之间的关系消失。结论:本实验主要研究PEBP4对肝细胞癌的作用。结果表明,1.PEBP4促进肝癌细胞生物学行为;2.PEBP4促进Akt/mTOR信号通路的活化,籍此调节肝癌细胞的生物行为学;3.PEBP4除了通过Akt发挥功能外,还参与调节其它信号分子,其可能的靶点是mTORC2;4.PEBP4,Akt,mTOR之间存在相互作用,发挥生物学功能。
董西华[5]（2021）在《S100A6在原发性胆汁性胆管炎肝内胆管上皮细胞损伤中的作用机制》文中认为目的:原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis,PBC）是一种慢性胆汁淤积的自身免疫性疾病,主要累及肝内小叶间胆管。PBC在各年龄段均可发病,多集中在30-70岁,50岁为发病高峰,以女性居多,男女比例为1:9-10,是女性肝移植最常见的原因。PBC患者常有疲劳和顽固性的全身瘙痒等症状。30%的PBC患者可能发展到失代偿性肝病或死亡。随着自身抗体血清学检测的开展,以及我国人民对肝脏健康日益重视,中国可检出PBC患病人数也日渐增多,但我国现今还未进行全国范围的流行病学研究。而中国香港的调查发现,2015年PBC发病率达到百万分之82.3。PBC的主要病理学特点为外源性物质刺激易感人群的免疫系统,发生自身免疫反应,形成自身抗体复合物,从而特异性攻击肝内胆管上皮细胞,使肝内小胆管逐渐消失,肝内继而发生胆汁淤积,肝脏组织反复再生并逐渐纤维化,肝脏功能最终发生衰竭。基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）是现今被广泛应用的高通量功能基因组数据的国际公共资源库。利用生物信息学的方法分析GEO数据库中已有的芯片数据,可筛选PBC肝组织或胆管上皮细胞的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）,从而寻找PBC发病或治疗的新靶点,而通过实验手段可对预测的结果进行验证。胆管结扎（Bile duct ligation,BDL）是一种常见的胆道梗阻手术,广泛应用于胆汁淤积和肝损伤研究的啮齿类动物模型。以BDL小鼠模型模拟PBC疾病的发生,可动态观察肝脏及肝内胆管上皮细胞发生的损伤,同时验证筛选出的靶基因在肝内胆管上皮细胞中的表达是否存在差异。肝内胆管上皮细胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,i BECs）是肝细胞的重要组成部分,其损伤机制是研究PBC发病机制的关键。胆汁盐作为“细胞毒素”在肝脏组织中累积,在肝细胞坏死和肝纤维化发展过程中起关键的作用。本研究利用甘氨鹅脱氧胆酸（Glycochenodeoxycholate,GCDC）处理人肝内胆管上皮细胞系从而模拟PBC患者肝内胆汁淤积的环境,通过体外实验研究靶基因在PBC肝内胆管上皮细胞的损伤机制中所起的作用。转录因子与疾病的发生、进展密切相关,在基因表达调控中也起到重要的作用。本研究通过生物信息学的方法对靶基因启动子的转录因子进行预测,并通过体外实验来验证转录因子对靶基因启动子的调控,进而探索PBC肝内胆管上皮细胞的损伤机制。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lnc RNAs）可参与调控细胞内的多种过程。lnc RNAs可作为一种结构组分与基因调控转录因子形成核酸蛋白复合体,同时还可与特定转录因子相结合,改变其在细胞内的定位,从而影响靶基因的转录。患者血浆中lnc RNAs表达水平异常可准确预测疾病的发生或进展。综上所述,本研究以动物模型验证生物信息学预测的靶基因,同时以人肝内胆管上皮细胞为研究对象,探索转录因子对靶基因启动子的调控作用机制,从而对胆汁酸诱导的肝内胆管上皮细胞损伤在PBC发病机制所起的作用做一阐述,并对PBC患者血浆中靶基因作为诊断和分期生物标志物的价值进行评估,为PBC发病机制、疾病监测和靶向治疗提供依据。研究对象:生物信息学分析包含来自GEO数据库的GSE79850和GSE29776芯片;小鼠模型:6-8周龄、雄性,SPF级C57BL/6J小鼠21只;选取在中国医科大学附属第一医院确诊的PBC患者145名,体检中心健康体检者110名,其中训练集包括80名PBC患者和60名健康对照者;验证集包括65名PBC患者和50名健康对照者;细胞系:人肝内胆管上皮细胞系、293T细胞系。研究方法:1、生物信息学分析（1）应用Gene Spring软件对GSE79850中PBC患者肝组织数据进行差异表达基因分析;对差异基因进行基因本体、通路富集和蛋白-蛋白相互作用网络分析,并在线进行文献挖掘;对PBC关键基因及其转录因子进行分析;（2）对GSE29776芯片中BDL组与sham组小鼠肝脏差异表达基因进行分析;（3）qRT-PCR法在PBC患者和健康对照者血浆中筛选并验证差异表达基因。2、靶基因在BDL小鼠模型中的验证（1）BDL小鼠模型的建立:实验（BDL）组行胆总管结扎术;假手术（sham）组开腹后游离胆总管随即缝合;分别在术后5天、10天和15天处死小鼠取肝脏组织,行HE和Masson染色,观察肝组织纤维化程度,选取最佳建模时间;（2）免疫荧光双标记法检测BDL小鼠肝组织中肝内胆管上皮细胞CK19和S100a6蛋白,验证生物信息学的预测。3、S100A6在GCDC处理后人肝内胆管上皮细胞中的生物学功能（1）GCDC处理人肝内胆管上皮细胞时间和浓度的筛选:分别用200μM、500μM和1000μM GCDC处理人肝内胆管上皮细胞,分别培养2小时、6小时和24小时后用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,选取统计学差异最大的浓度和培养时间作为后续实验的条件;（2）免疫组化法检测CK19蛋白鉴定人肝内胆管上皮细胞;（3）qRT-PCR和Western Blotting法检测S100A6过表达质粒和Smart silencer转染人肝内胆管上皮细胞的干扰效率;（4）流式凋亡检测S100A6对人肝内胆管上皮细胞凋亡能力的影响;（5）CCK8法检测S100A6对人肝内胆管上皮细胞增殖水平的影响。4、转录因子ESR1对S100A6启动子的调控作用（1）qRT-PCR法检测ESR1对Hi BECs中S100A6 mRNA表达的影响;（2）Western Blotting法检测转录因子ESR1对Hi BECs中S100A6和PDC-E2蛋白表达的影响;（3）双荧光素酶报告基因实验验证ESR1对S100A6启动子的调控作用;（4）S100A6干扰质粒转染过表达ESR1的Hi BECs细胞,流式凋亡检测细胞凋亡水平;CCK8法检测细胞增殖水平。5、血浆S100A6和相关lnc RNAs作为生物标志物在PBC诊断和分期中的价值（1）生物信息学方法预测与S100A6相关的lnc RNAs;（2）qRT-PCR法检测PBC患者及健康对照者血浆S100A6 mRNA和lnc RNAs的相对表达量;（3）ROC曲线评价S100A6和相关lnc RNAs在PBC诊断和分期中的价值。研究结果:1、生物信息学分析结果（1）PBC患者肝脏组织生物信息学分析（a）对GSE79850中PBC患者与对照组肝组织基因表达谱进行比较分析,共得到77个DEGs（P<0.05,且FC>2.0）,其中包含47个上调DEGs和30个下调DEGs;（b）GO富集分析:所有DEGs均显着富集在生物过程（BPs）。表达上调的DEGs主要富集于免疫应答、细胞因子应答和细胞因子刺激应答;表达下调DEGs主要富集于免疫防御、炎症反应和细胞因子应答;（c）通路分析:表达上调DEGs主要富集在A型流感和单纯疱疹病毒感染通路;表达下调DEGs主要富集在肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和NF-k B信号通路;（d）选取STRING分析中PPI分数>0.4的数据,获得74个节点和356个蛋白质对;簇分析得到了两个MCODE评分>3的簇;（e）对PPI网络中得分大于10的基因进行文献挖掘,得到27个在细胞活化、先天免疫应答和免疫系统方面富集于先前报道的基因构建共引网络;（f）DEGs中发现在CTD中列出的3个与PBC相关的关键基因,包括CCL5、IL7R和TNFRSF1A;同时分析出5个转录因子并构成转录调控网络。（2）BDL小鼠模型肝内胆管上皮细胞差异基因筛选:在30名PBC患者和30名健康对照者血浆中用qRT-PCR法检测差异表达上调基因mRNA,发现S100A6变化最大（t=20.28,P<0.0001）。2、BDL小鼠模型的建立及差异基因的鉴定（1）BDL组小鼠肝脏组织病理学大体符合肝纤维化改变;（2）HE染色:BDL组与sham组、健康对照组小鼠肝组织相比,汇管区炎性细胞计数显着增多（P<0.05）;（3）Masson染色:BDL组小鼠肝组织汇管区周边发生Ι型胶原纤维化、纤维间隔形成、纤维间隔伴小叶结构紊乱、肝硬化;sham组小鼠肝组织状况良好,无纤维化出现;（4）免疫荧光双标记结果显示,CK19和S100a6蛋白在BDL小鼠肝内胆管上皮细胞均有阳性表达,sham组小鼠肝内胆管上皮细胞中这两种蛋白仅有微弱表达;3、S100A6促进Hi BECs细胞凋亡、抑制细胞增殖（1）与NC组相比,S100A6在GCDC处理后Hi BECs中表达水平显着升高（P<0.05）;（2）与NC组相比,转染S100A6 Smart silencer后,Western Blotting结果显示,Hi BECs细胞系中PDC-E2蛋白表达显着下降（P<0.05）;转染S100A6过表达质粒后,Hi BECs细胞系中PDC-E2蛋白表达显着升高（P<0.05）;（3）与NC组相比,转染S100A6 Smart silencer后,CCK8实验结果显示:Hi BECs细胞增殖能力显着升高（P<0.05）;转染S100A6过表达质粒之后,细胞增殖能力显着降低（P<0.05）;（4）与NC组相比,转染S100A6 Smart Silencer之后,流式凋亡结果显示,Hi BECs细胞凋亡水平显着降低（P<0.05）;转染S100A6过表达质粒之后,Hi BECs细胞凋亡水平显着升高（P<0.05）;4、转录因子ESR1通过激活S100A6启动子促进Hi BECs凋亡、抑制细胞增殖（1）与NC组相比,ESR1在GCDC处理后Hi BECs中的表达水平显着升高（P<0.05）;（2）ESR1过表达质粒转染Hi BECs后,细胞中S100A6 mRNA相对表达量显着升高（P<0.05）;ESR1 Smart silencer转染Hi BECs后,细胞中S100A6 mRNA相对表达量显着降低（P<0.05）;（3）Western Blotting法检测Hi BECs中ESR1过表达或敲减后S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达水平。过表达ESR1后,GCDC组与正常组相比,S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达都上调（P<0.05）;GCDC+ESR1-OE组S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达量显着高于其他组（P<0.05）;敲减ESR1后,GCDC组与正常组相比,S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达都下调（P<0.05）;GCDC+ESR1-KD组S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达量显着低于其他组（P<0.05）;（4）双荧光素酶报告基因实验结果表明,野生型p GL3 basic-S100A6的活性在ESR1过表达组中显着升高,而点突变法构建突变体p GL3 basic-S100A6-Luci在ESR1过表达组无明显改变;（5）S100A6干扰质粒转染过表达ESR1的Hi BECs,与control+si-control组相比,ESR1+si-control组Hi BECs细胞凋亡百分率较对照组和ESR1+S100A6-si组显着升高（P<0.05）,细胞增殖水平显着降低（P<0.05）;5、S100A6及相关lnc RNAs作为PBC诊断和分期标志物的评估（1）LncRNAs的筛选:通过生物信息学方法筛选出于S100A6相关的lnc RNAs LINC00312、LINC00472和LINC01257;（2）PBC患者血浆中Log10 ESR1和S100A6 mRNA相对表达量呈正相关（r=0.367,P=0.001）;（3）PBC患者血浆中S100A6 mRNA、log10 LINC00472和LINC1257相对表达量与健康对照者相比,相对表达显着升高（P<0.0001）;LINC00312的相对表达水平显着低于健康对照者（P<0.0001）;（4）PBC晚期与健康对照者（P<0.0001）和PBC早期（P<0.0001）相比,S100A6 mRNA表达上调;PBC早期S100A6 mRNA水平高于HCs（P=0.03）;与HCs相比,LINC01257在早期和晚期PBC相对表达均上调（P<0.0001）。PBC晚期LINC00312表达水平低于PBC早期和HCs（P=0.01,P<0.0001）;同时,LINC00312在早期PBC表达水平低于HCs（P<0.0001）;晚期PBC log10 LINC00472的表达水平高于早期PBC（P<0.0001）和HCs（P<0.0001）;（5）PBC诊断S100A6、LINC00312、log10 LINC00472、LINC01257的曲线下面积（AUC）分别为0.759、0.7292、0.6942、0.7158;对于PBC分期的判断曲线下面积（AUC）分别为0.666、0.661、0.839和0.5549;（6）S100A6 mRNA相对表达水平与log10 LINC00472呈正相关（r=0.683,P<0.0001）;血清C-IV水平与log10 LINC00472的相对表达水平呈正相关（r=0.482,P<0.0001）;S100A6 mRNA的相对表达水平与血清C-IV水平呈正相关（r=0.732,P<0.0001）;（7）采用配对t检验分析比较治疗一年前后这4个基因的表达水平变化,S100A6 mRNA、log10 LINC00472、LINC01257的相对表达量均显着降低（P值分别为0.0018、0.036和0.0006）;与治疗前相比,LINC00312治疗后的相对表达量显着增加（P=0.0007）;（8）根据log10 LINC00472 cutoff值（2.33）的相对表达水平进行分组,PBC患者在L1亚组中,S100A6 mRNA的相对表达量和血清C-IV水平较低（P<0.0001）;同时,L1组中LINC01257的相对表达量高于L2亚组（P=0.005）;（9）以独立的PBC队列数据构建ROC曲线验证生物标志物预测的PBC诊断和分期的价值。S100A6 mRNA、LINC00312、log10 LINC00472和LINC01257对PBC诊断的曲线下面积（AUC）分别为0.769、0.772、0.755和0.695;log10 LINC00472对PBC分期的曲线下面积为0.835。结论:1、CCL5、IL7R、TNFRSF1A基因和免疫应答通路以及分子模拟可能在PBC发病机制中发挥重要作用。这些基因和通路可能成为治疗PBC的新靶点;2、S100a6在胆汁淤积小鼠模型肝内胆管上皮细胞表达上调;3、S100A6基因能够促进胆汁淤积人肝内胆管上皮细胞凋亡,同时抑制其细胞增殖,在胆汁淤积胆管上皮细胞损伤中起到重要作用;4、转录因子ESR1通过激活S100A6启动子促进人肝内胆管上皮细胞凋亡,并抑制其细胞增殖;5、ESR1/S100A6信号通路在PBC胆汁淤积肝内胆管细胞损伤中起到重要作用;6、PBC患者血浆中S100A6 mRNA、LINC00312、LINC00472和LINC01257可作为PBC诊断的潜在生物标志物,LINC00472可作为PBC分期的潜在生物标志物。
陆枢桠[6]（2021）在《MTSS1靶向HK2调控有氧糖酵解影响乳腺癌转移的机制研究》文中研究说明背景乳腺癌（Breast Cancer,BC）是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤,居女性癌症发病率首位。侵袭和迁移引起的并发症是引起乳腺癌患者死亡的主要原因之一。肿瘤转移抑制基因-1（MTSS1）可以调控多种肿瘤细胞的侵袭和迁移,但其机制尚不明了。研究显示,肿瘤细胞有氧糖酵解可以介导肿瘤转移,但有氧糖酵解是否参与了MTSS1对肿瘤转移调控尚不清楚。我们前期研究发现高表达MTSS1可以明显降低乳腺癌细胞有氧糖酵解,同时可引起有氧糖酵解关键限速酶HK2活性降低,提示MTSS1可能通过HK2调控肿瘤有氧糖酵解,从而影响乳腺癌的转移。明确MTSS1调控癌症转移的作用机制,为治疗乳腺癌提供新的潜在靶点。目的明确MTSS1对乳腺癌有氧糖酵解的影响,明确有氧糖酵解对MTSS1调控乳腺癌细胞迁移与侵袭的影响,明确HK2在MTSS1调控有氧糖酵解和乳腺癌细胞迁移与侵袭中的作用,探讨MTSS1与HK2之间的相互作用机制,为临床治疗乳腺癌提供新的方向。方法1、利用Western Blotting检测乳腺癌细胞系中MTSS1蛋白水平的表达。筛选出MTSS1低表达乳腺癌细胞株。2、利用实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative PCR,qRT-PCR）检测乳腺癌细胞系中MTSS1 mRNA水平的表达。3、利用腺病毒转基因技术增强乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR3中MTSS1的表达,利用RNA干扰技术降低乳腺癌细胞MCF7中MTSS1表达水平,并利用Western blotting和qRT-PCR进行蛋白和mRNA水平的验证。4、利用PCR array检测过表达MTSS1基因后对乳腺癌细胞MDA-MB-231糖代谢相关基因表达的影响。5、利用葡萄糖检测和乳酸检测技术检测过表达MTSS1基因后对乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR3葡萄糖摄取和乳酸生成的影响。6、利用Transwell迁移实验和划痕实验检测抑制有氧糖酵解对MTSS1调控乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR3以及MCF7迁移情况的影响,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变。7、利用激酶检测技术检测过表达MTSS1基因后对乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR3糖酵解相关激酶的影响。8、利用Western Blotting和qRT-PCR检测乳腺癌细胞系中HK2蛋白和mRNA水平的表达,筛选出HK2低表达乳腺癌细胞株。9、利用基因沉默技术敲低乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR3细胞中HK2表达水平,并利用Western blotting和qRT-PCR进行蛋白和mRNA水平的验证。10、利用葡萄糖检测和乳酸检测技术检测敲低HK2基因后对乳腺癌细胞MDAMB-231、SKBR3葡萄糖摄取和乳酸生成的影响。11、利用Transwell迁移实验和划痕实验检测抑制HK2激酶活性对MTSS1调控乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR3以及MCF7迁移情况的影响,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变。12、利用尾静脉注射技术建立乳腺癌转移模型,给予糖酵解抑制剂和HK2抑制剂观察糖酵解和HK2在MTSS1调控乳腺癌肝、肺转移中的作用。13、利用HE染色技术对动物实验中肝脏及肺脏进行染色分析。14、利用免疫共沉淀技术检测MTSS1与HK2蛋白结合情况。15、利用线粒体分离技术检测高表达MTSS1后乳腺癌细胞胞浆和线粒体中HK2的表达情况。结果1、MTSS1不同乳腺癌细胞株中的表达情况:Western Blotting和qRT-PCR结果表明MTSS1在5种乳腺癌细胞株中存在显着差异性表达（P<0.05）,MTSS1表达量较高的是MCF7细胞,表达量相对较低的是MDA-MB-231和SKBR3细胞。因此选择这3株细胞进行后续相关实验。2、构建MTSS1高表达细胞株MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-MTSS1;SKBR3-NC、SKBR3-MTSS1,同时采用qRT-PCR和Western Blotting方法进一步验证所构建细胞系MTSS1的表达情况,结果显示过表达MTSS1效果明显,差异具有统计学意义（P<0.05）。3、PCR array检测结果显示,MTSS1高表达可以明显的增加乳腺癌细胞MDAMB-231三羧酸循环相关基因表达,降低糖酵解相关基因的表达。4、葡萄糖摄取和乳酸生成检测试剂盒检测结果显示,高表达MTSS1可以明显的降低乳腺癌细胞葡萄糖摄取量和乳酸生成量。5、划痕愈合实验、Transwell迁移实验和侵袭实验结果显示:抑制糖酵解可以明显的降低高表达MTSS1引起的迁移和侵袭的抑制作用。差异具有统计学意义（P<0.05）。6、激酶检测试剂盒结果显示,高表达MTSS1后己糖激酶（HK）活性明显下降,其他激酶（PFK、PK、LDH）活性无明显变化。差异具有统计学意义（P<0.05）。7、HK2在不同乳腺癌细胞株中的表达情况:Western Blotting和qRT-PCR结果表明HK2在5种乳腺癌细胞株中存在显着差异性表达（P<0.05）,HK2表达量较高的是MDA-MB-231和SKBR3细胞。因此选择这2株细胞进行后续相关实验。8、构建HK2低表达细胞株MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-sh HK2;SKBR3-NC、SKBR3-sh HK2,同时采用qRT-PCR和Western Blotting方法进一步验证所构建细胞系HK2的表达情况,结果显示干扰HK2效果明显,差异具有统计学意义（P<0.05）。9、葡萄糖摄取和乳酸生成检测试剂盒检测结果显示,与单独敲低HK2组相比,NC组和sh HK2+MTSS1组葡萄糖摄取和乳酸生成量显着升高,结果证明,敲低HK2可以明显的降低MTSS1对乳腺癌细胞糖酵解的抑制作用。差异具有统计学意义（P<0.05）。10、划痕愈合实验和Transwell迁移实验结果显示:敲除HK2后可以明显的降低高表达MTSS1引起的肿瘤的迁移抑制,进一步利用Transwell检测细胞侵袭能力发现,敲除HK2可以明显的降低高表达MTSS1引起的侵袭的抑制作用。差异具有统计学意义（P<0.05）。11、裸鼠乳腺癌转移模型实验结果显示:乳腺癌细胞在肺脏中发生了明显的转移,在肝脏中的转移不明显。HE结果显示,与单独高表达MTSS1组相比较,联合糖酵解抑制剂3-BP组可以明显的降低高表达MTSS1引起的转移的抑制作用。12、免疫共沉淀结果显示,MTSS1和HK2蛋白发生明显的结合。13、线粒体分离结果显示,高表达MTSS1可以降低线粒体靶向的HK2,提示MTSS1可能通过降低线粒体结合型HK2水平抑制了有氧糖酵解。结论MTSS1通过影响HK2激酶活性调控乳腺癌有氧糖酵解和转移;MTSS1通过竞争性结合线粒体靶向的HK2抑制乳腺癌有氧糖酵解;抑制有氧糖酵解可以明显的降低MTSS1对乳腺癌细胞迁移与侵袭以及乳腺癌转移中的抑制作用。
张璇[7]（2021）在《邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯与双酚A单独和联合暴露对甲状腺发育及肿瘤发生的影响及其机制研究》文中研究指明目的:甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤,我国肿瘤年报数据显示,城市女性恶性肿瘤发病中第一位为乳腺癌,其次是肺癌、结直肠癌、甲状腺癌和胃癌。随着检查手段的日益完善及人群健康意识整体提升,甲状腺癌发病率也呈现逐年增高的趋势。甲状腺癌在沿海地区最高,内陆较低,城市发病率高于农村。甲状腺癌的发病存在明显的性别差异,男女比约为1:3～1:4,且育龄期女性高发,绝经后发病率呈逐渐下降的趋势。已知射线辐射、碘过量、内分泌紊乱以及遗传等因素均为甲状腺癌比较明确的的危险因素。此外,甲状腺干扰物等外界刺激也影响着甲状腺肿瘤及相关疾病的发生发展,尤其是近年来在人类生活中广泛暴露的环境内分泌干扰物（EDCs）,会干扰下丘脑-垂体-甲状腺轴,破坏甲状腺激素稳态,最终影响甲状腺的正常生理功能。其中,邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯与（DEHP）和双酚A（BPA）作为塑料产品的主要材料和塑化剂,被广泛应用于日常生产和生活中,在环境和人体内均可以检测到,已成为比较严重的化学污染物之一。由于实际生活中环境污染物的暴露多混合形式存在,人体暴露途径呈多样化,而混合暴露模式可能与各个物质单独暴露时呈现不同的毒性效应,因此对单一污染物毒效应的研究具有一定的局限性。甲状腺作为DEHP和BPA的重要靶器官之一,二者混合暴露是否会影响甲状腺癌的发生及其作用机制至今仍不清楚。肿瘤的发生是基因与环境因素相互作用的结果,而环境因素可以通过表观遗传调控相关基因的表达,在肿瘤的发生过程中发挥重要作用。环境内分泌干扰物是否会经表观遗传修饰调控相关基因表达,影响甲状腺肿瘤的发生至今还不清楚。本研究首次采用3×3析因设计证实DEHP和BPA青春期暴露对甲状腺功能及激素稳态的影响,发现二者存在交互作用干扰甲状腺功能。据此提出长期EDCs单独及联合暴露可能增加甲状腺肿瘤发生的易感性,通过构建环境内分泌干扰物暴露影响甲状腺肿瘤发生的实验动物模型,阐明邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯与双酚A单独和联合暴露是否会通过HDAC6调控抑癌基因PTEN,进而促进甲状腺肿瘤发生。同时结合体外研究,采用人甲状腺癌细胞BCPAP及甲状腺正常上皮细胞Nthy-ori3-1进一步探讨DEHP主要代谢产物MEHP及BPA促进甲状腺细胞增殖和迁移的具体作用机制,为合理评价环境内分泌干扰物暴露的安全性提供科学依据,为甲状腺相关疾病的预防疗提供理论参考。研究方法:首先,本研究采用SPF级4周龄健康雌性SD大鼠63只,DEHP（0、150 mg/kg、750 mg/kg）和BPA（0、20 mg/kg、100 mg/kg）按照3×3析因设计进行连续灌胃染毒42天。观察各组大鼠生长发育情况,记录大鼠体重及脏器系数,将组织在福尔马林中固定,石蜡包埋后切片,通过HE染色后镜下观察大鼠甲状腺病理改变情况,酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血液中甲状腺激素TT3、TT4、FT3、FT4及TSH浓度变化。利用STITCH数据库确定DEHP和BPA的潜在靶标,借助Cytoscape软件构建DEHP-BPA-靶标相互作用网络。使用DAVID数据库对DEHP和BPA的潜在靶标进行KEGG信号通路富集分析。通过RT-PCR和免疫组化染色（IHC）检测各组动物甲状腺ESR1及其下游相关转录因子CREB的m RNA和蛋白表达情况,探究DEHP和BPA对甲状腺激素稳态的影响是否存在交互作用。其次,采用SPF级4周龄健康雌性SD大鼠160只,构建大鼠甲状腺肿瘤模型,随机分为致癌物DMD（二乙基亚硝胺DEN,N-甲基亚硝基脲MNU和二异丙醇亚硝胺DHPN）给药组（DA组）假给药组（DN组）。将DA组分为四组:对照组、DEHP150 mg/kg组、BPA 20mg/kg组及DEHP 150 mg/kg+BPA 20 mg/kg组,每组20只大鼠,DN组同样也分为以上四组。即DA组造模动物在第1天按照100 mg/kg给予大鼠腹腔注射DEN,在第5、8、11、14天按照20 mg/kg给予大鼠腹腔注射MNU,第1周和第3周按照0.1%DHPN饮水染毒,DN组动物给予生理盐水注射和日常饮水,第4周进行休息调整后所有动物开始给予DEHP和BPA单独及联合灌胃染毒至第30周。造模期间观察并记录各组大鼠生长状态、体重变化以及死亡情况。染毒结束后统计分析各组大鼠脏器系数变化,留取所有大鼠甲状腺组织,行HE染色后镜下扫片,由病理科医师阅片,统计各组大鼠甲状腺肿瘤发生率及肿瘤类型。采用IHC测定各组大鼠甲状腺组织中肿瘤标记物PCNA及Tg的表达情况,通过IHC评分对免疫组化结果进行半定量分析。Westernblot检测各组大鼠甲状腺组织中ESR1、TSHR、HDAC6、PTEN和c-MYC蛋白表达情况及CREB、AKT的磷酸化水平,进一步揭示DEHP和BPA单独及联合暴露对甲状腺肿瘤发生的影响及可能的机制。最后,本研究采用人甲状腺癌BCPAP细胞及甲状腺正常上皮Nthy-ori3-1细胞,给予DEHP代谢产物MEHP和BPA单独及联合处理细胞24h及48h后,CCK8检测二者对甲状腺癌细胞的促增殖效应,确定产生增殖效应剂量。免疫荧光及Transwell小室检测MEHP和BPA单独及联合处理细胞后Ki67和PCNA的表达情况及细胞迁移能力。Westernblot检测MEHP和BPA单独及联合处理细胞后HDAC6,PTEN及c-MYC的蛋白表达情况,CREB,AKT及ERK的磷酸化情况,RT-PCR检测HDAC6及PTEN的m RNA改变情况。通过小干扰RNA构建HDAC6敲除细胞系,同时采用HDAC6选择性抑制剂Tub A处理细胞,Westernblot检测下游信号通路相关因子变化情况,验证MEHP及BPA通过HDAC6抑制PTEN,激活下游AKT磷酸化。应用Ch IP实验检测甲状腺癌细胞PTEN基因启动子区组蛋白H3K9ac的富集情况,Westernblot及RT-PCR检测抑制剂处理后H3K9ac水平及PTEN基因表达情况,进一步证实敲低HDAC6可阻断BPA和MEHP对PTEN的抑制及对AKT信号通路的活化,主要通过对PTEN基因启动子区的组蛋白H3K9乙酰化修饰调控PTEN表达。结果:1.青春期DEHP和BPA单独及联合暴露,各处理组大鼠体重均稳定上升,组间未见显着性差异。与对照组相比,DEHP750+BPA100处理组大鼠甲状腺脏器系数显着降低（P<0.05）,且低于DEHP750单独处理组（P<0.05）。ELISA检测发现DEHP150与BPA联合处理组大鼠血清TT3水平显着低于DEHP150单独处理组（P<0.05）,DEHP750+BPA20处理组大鼠TT3水平显着低于DEHP750单独处理组（P<0.05）。与对照组相比,DEHP750、BPA以及二者联合处理组大鼠血清TT4水平均显着降低（P<0.05）,同时DEHP与BPA联合暴露进一步降低了DEHP单独暴露组大鼠TT4水平（P<0.05）,而各处理组大鼠血清FT3、FT4、TSH水平与对照组相比未见显着改变。病理结果显示DEHP750和BPA100暴露组大鼠甲状腺组织的滤泡上皮细胞数量增多,且DEHP750显着高于对照组（P<0.05）。2.利用STITCH、Swiss Target等数据库确定DEHP和BPA的潜在靶标,借助Cytoscape软件可视化DEHP-BPA-靶标网络。其中ESR为两种化合物共有靶标,提示ESR1可能作为DEHP和BPA相互作用的中介。DAVID数据库对DEHP和BPA的潜在靶标进行KEGG信号通路富集分析,以P值排序,在排名前5的信号通路中关注了雌激素受体信号通路,并检测了各处理组大鼠甲状腺ESR1及其下游相关转录因子CREB磷酸化情况,结果显示DEHP750暴露组大鼠甲状腺ESR1的表达显着上调（P<0.05）,且CREB磷酸化水平显着升高（P<0.05）,而DEHP750+BPA100组大鼠甲状腺ESR1的表达与DEHP750相比显着下调（P<0.05）,初步评估了EDCs混合暴露对甲状腺激素稳态的影响。3.长期DEHP和BPA单独及联合染毒期间,DN组（无致癌物DMD预处理）大鼠生长稳定,摄食量及体重逐渐增加,反应敏捷,体毛光滑,大便呈颗粒状。DA组（给予致癌物DMD预处理）大鼠生长缓慢,摄食量较少,精神萎靡,体毛脱落较明显,外阴周围毛湿,多稀便。DA组染毒期间大鼠均生长缓慢,从第10周开始至第30周染毒结束,各处理组大鼠体重呈下降趋势（P<0.05）。DN组中,各处理组大鼠甲状腺脏器系数未见显着改变,DEHP处理组大鼠肝脏器系数显着高于对照组（P<0.05）,其他脏器系数未观察到明显变化。而DA组中,各处理组大鼠甲状腺脏器系数均显着低于对照组（P<0.05）,肝脏、肾脏的脏器系数均显着升高（P<0.05）,其中DEHP和BPA联合处理组大鼠的肾脏器系数也显着高于二者单独处理组（P<0.05）。4.DN组中,各处理组均未见甲状腺肿瘤发生,DEHP和BPA单独处理组大鼠甲状腺组织的滤泡上皮细胞数量明显增多,甲状腺滤泡直径降低,且二者联合处理组大鼠甲状腺组织可见明显的滤泡碎裂等病理改变。DA组出现多种病理改变:乳头状癌、髓样癌、癌前病变（增生或腺瘤）以及部分炎性反应。在DA组中,BPA和DEHP+BPA处理组甲状腺肿瘤的发生率显着高于对照组（P<0.05）。各处理组癌前病变的发生率与对照组相比,均具有统计学差异（P<0.05）。DN组中,DEHP和BPA单独及联合处理组大鼠甲状腺组织PCNA和Tg的阳性率与对照组比未见显着差异。DA组中,BPA和DEHP+BPA处理组大鼠甲状腺组织PCNA的阳性率显着高于对照组（P<0.05）,同时,DEHP和BPA单独及联合处理组大鼠甲状腺Tg的强阳性率显着高于对照组（P<0.05）,说明成功构建了大鼠甲状腺肿瘤模型,并证实了DEHP和BPA联合暴露的在肿瘤发生中的促进作用。5.初步探究了DEHP和BPA单独及联合暴露对大鼠甲状腺肿瘤发生的促癌机制,无论是否给予DMD预处理,DEHP和BPA单独及联合处理组大鼠甲状腺ESR1蛋白表达与对照组相比均未观察到明显变化。在DN组中,BPA及DEHP+BPA处理组大鼠甲状腺TSHR蛋白表达显着高于对照组（P<0.01）,且二者单独及联合处理组大鼠甲状腺CREB的磷酸化水平也显着高于对照组（P<0.05）,DEHP和BPA单独处理组大鼠甲状腺HDAC6表达升高,二者联合处理组显着高于对照（P<0.05）,各处理组大鼠甲状腺PTEN蛋白表达及AKT磷酸化水平未见显着性改变。在DA组中,各处理组大鼠甲状腺TSHR的表达呈升高趋势,DEHP和BPA单独及联合处理组大鼠甲状腺CREB磷酸化水平与对照组相比均显着上调（P<0.05）,各处理组大鼠甲状腺HDAC6蛋白表达均呈上升趋势,且DEHP及DEHP+BPA处理组显着高于对照组（P<0.05）,各处理组大鼠甲状腺的PTEN表达呈下降趋势,且BPA和DEHP+BPA处理组显着低于对照组（P<0.05）,各处理组大鼠甲状腺AKT磷酸化水平均显着高于对照组（P<0.05）。6.DEHP代谢产物MEHP和BPA在10-9～10-6mol/L浓度范围内,均能够显着诱导人甲状腺癌BCPAP细胞增殖,二者在10-7mol/L单独及联合处理细胞24 h后,细胞核内Ki67的表达增多,细胞的迁移能力显着升高（P<0.05）。BPA单独及联合MEHP处理细胞24 h和48 h均能够显着诱导CREB蛋白磷酸化,累积入核,进而上调HDAC6 m RNA和蛋白表达（P<0.05）。BPA联合MEHP处理48 h能够显着抑制BCPAP细胞PTEN蛋白及m RNA水平（P<0.05）,且主要是对细胞质膜PTEN具有显着抑制作用（P<0.05）,同时激活下游AKT磷酸化。BPA单独及联合MEHP处理细胞48 h还会诱导c-MYC蛋白表达显着上调（P<0.05）。同时二者单独及联合处理BCPAP细胞24 h及48 h后细胞的β-catenin蛋白总量均没有明显变化,但免疫荧光检测发现BPA单独及联合MEHP处理细胞24 h后β-catenin入核明显增多。7.采用小干扰RNA及HDAC6选择性抑制剂Tub A抑制HDAC6,发现PTEN蛋白表达没有显着变化,但AKT磷酸化水平显着下调（P<0.05）,在此基础上给予MEHP和BPA单独及联合处理细胞,发现对PTEN的抑制作用消失了,也阻断了MEHP和BPA对BCPAP细胞AKT磷酸化的激活,同时抑制了MEHP和BPA单独及联合暴露对BCPAP细胞c-MYC的诱导。证实BCPAP细胞中H3K9ac在PTEN基因启动子区的富集情况,抑制HDAC6后再给予MEHP和BPA单独及联合处理,细胞H3K9ac的蛋白表达均显着上调（P<0.05）,且PTEN的m RNA水平与对照组相比显着上调（P<0.05）。8.MEHP和BPA在10-6mol/L能够显着诱导人甲状腺正常上皮Nthy-ori3-1细胞增殖,二者单独及联合处理细胞24h后,可见细胞核内PCNA的表达明显增多。BPA单独及联合MEHP处理Nthy-ori3-1细细胞24 h和48 h均能够显着诱导CREB蛋白磷酸化并上调HDAC6蛋白和m RNA表达（P<0.05）,但PTEN蛋白及m RNA水平均没有明显变化,且细胞质膜PTEN也未观察到显着改变,AKT丝氨酸（Ser473）位点的磷酸化水平在BPA单独及联合MEHP处理48 h后出现显着上调（P<0.05）。BPA联合MEHP处理细胞24 h和48 h后能够显着诱导Nthy-ori3-1细胞ERK磷酸化（P<0.05）,敲低HDAC6后ERK磷酸化水平显着下调,在此基础上给予MEHP和BPA单独及联合处理细胞,发现BPA单独及联合MEHP部分恢复了对Nthy-ori3-1细胞AKT磷酸化的激活,而MEHP单独处理组ERK磷酸化水平仍然显着低于对照组。结论:1.DEHP和BPA较高剂量暴露导致大鼠甲状腺滤泡上皮细胞增生。此外,青春期DEHP单独暴露可使大鼠甲状腺组织ESR1表达上调,而与BPA联合暴露抵消了DEHP单独暴露所导致的上调,二者联合作用可能通过ESR1相关信号通路,进而干扰甲状腺激素稳态。2.BPA单独及联合DEHP较长期暴露可促进雌性大鼠甲状腺组织增生,能够上调HDAC6,同时诱导癌基因c-MYC表达增加。3.二者长期联合暴露对大鼠甲状腺不具有致癌性,但会产生促癌效应,导致大鼠甲状腺肿瘤发生率增加,且BPA能够增强DEHP单独暴露所产生的效应,能够上调HDAC6蛋白表达,抑制抑癌基因PTEN,激活下游AKT磷酸化,此外,还会诱导癌基因c-MYC表达,增加甲状腺肿瘤易感性。4.BPA单独及联合DEHP代谢产物MEHP能够显着诱导人甲状腺癌细胞BCPAP增殖和迁移,依赖于HDAC6,对抑癌基因PTEN启动子区域H3K9ac修饰抑制PTEN,激活下游AKT信号转导通路,同时上调癌基因c-MYC表达。5.BPA单独及联合MEHP能够显着诱导人甲状腺正常上皮细胞Nthy-ori3-1增殖,可能部分的依赖于HDAC6,进而激活下游ERK信号通路。
杜雨露[8]（2020）在《MUC2和TFF1基因在猪流行性腹泻中的调控作用分析》文中提出猪流行性腹泻是一种高传染性和死亡率的传染病,易导致规模化猪场的巨大经济损失。其病原是猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,临床表现为严重的腹泻、呕吐和脱水等,猪的各个年龄段都易感,且日龄越小特别是哺乳仔猪发病率高,死亡率也高。目前药物和疫苗尚不能完全治愈和预防PEDV。肠道黏膜屏障完整性与腹泻发生密切相关,黏蛋白2（Mucin2,MUC2）和三叶因子1（Trefoil factor 1,TFF1）是由胃肠道分泌的蛋白,参与形成肠黏液屏障,在胃肠黏膜保护和修复中发挥着重要作用,它们可以在胃肠道上皮表面形成保护层,保护和润滑上皮表面,维持上皮的完整性,帮助细胞粘附,防止病原体、毒素和异物的入侵。基于MUC2和TFF1的生物学功能,本研究分析了猪MUC2和TFF1基因表达水平对抵抗PEDV感染的调控作用,同时探究启动子区DNA甲基化对MUUC2和TFF1基因表达的影响。试验结果如下:1.观察发生猪流行性腹泻后仔猪肠道黏膜变化,同时在组织和细胞水平上检测了MUC2和TFF1基因的表达变化,并在细胞水平检测RNA干扰MUC2和TFF1对PEDV病毒复制的影响。石蜡切片结果显示,腹泻仔猪肠道绒毛受损、脱落,高度、密度都下降,固有层暴露;而正常仔猪肠道黏膜屏障结构完整,层次分明。荧光定量PCR结果表明:腹泻组小肠（十二指肠、空肠、回肠）MUC2基因表达水平均极显着高于正常组（P<0.01）;TFF1基因在十二指肠中差异不显着,而在空肠和回肠中,腹泻组TFF1表达量极显着高于正常组（P<0.01）。此外,用PEDV（0.1 MOI）持续侵染IPEC-J2细胞,检测不同时间段MUC2和TFF1的表达变化。结果显示,MUC2基因在侵染24 h时表达水平呈现显着的上调（P<0.05）;TFF1基因表达则呈现先下降后上升的趋势,在侵染48 h呈现出极显着的上调表达（P<0.01）。最后本研究利用RNAi分别沉默MUC2和TFF1表达后,均发现PEDV病毒基因组M基因的表达量极显着升高（P<0.01）。这些结果表明MUC2和TFF1的高表达有利于仔猪抵抗PEDV侵染。2.通过重亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）分别检测MUC2和TFF1启动子区DNA甲基化程度,分析MUC2和TFF1基因启动子区甲基化与mRNA的表达关系,并利用双荧光素酶报告基因系统,检测甲基化状态对启动子活性的影响。结果表明MUC2和TFF1基因启动子甲基化与基因的表达水平呈现负相关,其中MUC2 mC-5位点和TFF1 mC-6位点的甲基化与mRNA的表达存在显着的负相关（P<0.05）。双荧光素酶报告基因系统检测发现DNA甲基化能极显着降低MUC2和TFF1启动子活性（P<0.01）。3.通过对MUC2和TFF1启动子元件进行预测分析,发现MUC2 mC-5和TFF1 mC-6位点分别位于转录因子YY1和C/EBPα结合域内。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）试验验证了转录因子YY1与MUC2基因启动子序列结合,转录因子C/EBPα与TFF1基因启动子序列结合。分别进行转录因子YY1和C/EBPα干扰后,MUC2和TFF1基因表达量均呈现显着的下降（P<0.05）,由此推测MUC2 mC-5和TFF1 mC-6位点甲基化可能抑制了转录因子与启动子DNA的结合,进而抑制了MUUC2和TFF1基因的表达。综合以上结果,PEDV感染仔猪后肠道黏膜受损,黏液屏障被破坏,同时MUC2和TFF1基因较正常仔猪呈现出上调表达的趋势,并且MUC2 mC-5位点和TFF1 mC-6位点甲基化可能阻碍了转录因子与启动子的结合,抑制了 MUC2和TFF1基因的表达水平,从而提高了仔猪对PEDV的易感性。本研究从表观遗传学层面揭示了 DNA甲基化对仔猪抵抗PEDV感染的分子调控机制,为以后从肠道黏膜屏障角度研究PEDV的致病机理提供了理论参考。
高畅[9]（2020）在《REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响》文中认为禽网状内皮组织增生病（reticuloendotheliosis,RE）是由禽网状内皮组织增生病病毒（reticuloendotheliosis virus,REV）感染禽类宿主引起的一种病理综合征,包括生长迟缓,免疫抑制以及肿瘤发生等。由于REV传播途径多样,宿主范围广泛,因此自从1958年始,REV得以被广泛分布在全世界。此外,疫苗等生物制品也可能被REV污染,从而造成疫苗接种失败,抑制宿主免疫系统使其免疫力降低,导致其他疾病的共发,给畜牧养殖业经济造成巨大损失。本实验通过高通量测序、实时荧光定量PCR等方法手段,检测鸡胚成纤维细胞（CEF）在REV感染过程中可变剪接以及miRNA-155表达的变化,发掘二者在CEF应答REV感染的转录后水平上所发挥的调控作用,为进一步研究REV的免疫致病机制及其对感染动物免疫抑制以及肿瘤形成机制的探讨,提供新的研究方向,同时为该病的防制（治）提供理论依据和新思路。主要研究内容和结果如下:（1）荧光定量检测REV方法的建立将复制得到的病毒液提取RNA经PCR验证后,在紫外灯下可观察到195 bp长度的条带,证明病毒液为REV阳性。将复制成功的病毒液与质粒连接,并进行连续十倍稀释,通过荧光定量PCR得到REV LTR片段的扩增曲线、熔解曲线及标准曲线。各稀释度的重组质粒在达到对数增长期时间距均匀,证明其表达差异呈线性变化,同时阴性对照无扩增,证明本实验无假阳性干扰;扩增产物熔解峰单一,证明无引物二聚体和非特异性扩增,且熔解温度为85.252±0.057℃;REV LTR片段的标准曲线呈线性回归方程,所选取的各稀释度点均在线上,其回归方程为y=2.899x+4.464,相关系数R2=0.9991,证明可信度高。（2）病毒滴度测定于REV感染后第7 d记录细胞完全发生病变的孔数,经计算得到病毒液的TCID50为10-4.625/0.1ml,即将该病毒稀释104.625倍后接种100μl可使50%的细胞发生病变。（3）高通量测序结果及分析将CEFs分为对照组（C组）和病毒感染组（VB组）,每组均有3个重复,6个样本经高通量测序后均得到大量数据,长度为10.2 G-12.92 G,错误率为0.02%,Q20大于96%,Q30大于90%,GC含量在50%左右,去除其中影响分析结果的低质量及含有接头等的数据后,数据仍能达到原始数据的94.6%以上,说明测序数据质量较好。将处理后数据与参考基因组比对发现,70%以上可比对到参考基因组序列上,其中能唯一比对到参考基因组序列上的数据大于90%,说明样品未被污染,且选择的参考基因组是合适的。同时还发现,可比对到参考基因组序列的蛋白编码区域,即外显子的百分比均大于70%,说明检测到的基因绝大多数都是编码蛋白质的基因,也证明了测序的序列都来自于m RNA。在两个比较组中,共发现15973个基因,其中6 939个基因发生了可变剪接,外显子跳跃（SE）事件发生数量为16 860,占总事件数量89.22%,是最普遍的一种剪接模式,也是产生差异最主要的可变剪接模式,上调事件为183,下调事件为524。在C组和VB组间共发现5 607个基因显着差异表达,2 825个基因在REV感染组的表达显着高于对照组,2 782个基因在REV感染组的表达显着低于对照组。差异表达可变剪接基因主要与GO富集分析中的细胞组成相关,如细胞器管腔、膜结合细胞器、细胞质与囊泡等。差异表达可变剪接基因富集较多的KEGG细胞信号转导通路为磷脂酰肌醇信号通路、MAPK信号通路、凋亡、焦点粘连等。（4）高通量测序结果验证随机选择FN1、TNC和SEC61B被剪接的外显子,分别命名为Fe、Te和Se,作为对照,这3个外显子临近未被剪接的外显子同样被检测,依次命名为Fn、Tn和Sn。Fe、Te和Se的泳道没有或仅有少量PCR产物,其余泳道均有明显且长度正确的条带,说明高通量测序预测的可变剪接事件是真实发生的。（5）miR-155表达与REV接毒时间和剂量的关系与C组相比较,VB组接毒后12、24、48、72、96和120 h的miR-155表达量显着上升（P<0.01）,并随病毒作用时间的延长而升高,且二者呈正相关,并于接毒后第72 h达到峰值（P<0.001）。另外,随着REV感染滴度的增加,miR-155表达量也随之升高（P<0.001）,二者呈正相关。（6）miR-155 NC、mimics和inhibitors转染效率检测在荧光倒置显微镜下观察发现,未转染的正常CEFs中未见荧光,而分别转染了miR-155NC,mimics和inhibitors的CEFs胞质中均出现了程度不同的荧光,且荧光效率可达60%以上。经荧光定量PCR检测,转染miR-155 mimics的CEFs中miR-155表达量显着升高（P<0.001）,并随转染时间的延长逐渐增强,转染后第72 h达到较高水平并基本维持不变;转染miR-155 inhibitors的CEFs中miR-155表达量显着降低（P<0.01）,在转染后第12 h即被完全被抑制,并且在转染后72 h内miR-155表达量均保持在较低水平;转染miR-155 NC的CEFs中,miR-155表达量与未经转染的CEFs之间无显着性差异（P>0.05）。（7）REV感染对CEFs活力的影响将CEFs分别分为:C（对照组）、V（只接毒不转染）、VN（接毒后转染miR-155 NC）、VM（接毒后转染miR-155 mimics）和VI（接毒后转染miR-155 inhibitors）组。与C组相比,V组CEFs活力极显着（P<0.001）降低。与V组相比,VM组细胞活力极显着（P<0.001）提高,而VI组细胞活力极显着（P<0.01）降低,VN组与V组间细胞活力无显着性（P>0.05）差异。（8）REV感染对CEFs凋亡及其相关酶活性的影响流式细胞仪检测结果显示,与C组相比,V组凋亡细胞数量极显着（P<0.01）增加。与V组相比,VM细胞凋亡率显着（P<0.05）降低,VI组显着（P<0.05）的增加了CEFs的凋亡率,VN组与V组间细胞凋亡率无显着性（P>0.05）差异。Caspase-3活性检测结果显示,与C组相比,V组中ρNA产量显着（P<0.05）提高。与V组相比,VM组降低ρNA产量,VI组极显着（P<0.01）提高ρNA产量,VN组与V组间ρNA产量未见显着性（P>0.05）差异。（9）REV感染对CEFs细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示,与C组相比,V组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）提高,而S期和G2期细胞极显着（P<0.01）或显着（P<0.05）减少。与V组相比,VM组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）减少,而S期细胞极显着（P<0.01）增加,G2期细胞数量有所增加;VI组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）增加,G2期细胞数量显着（P<0.05）减少,S期细胞相对减少。而VN组与V组间各细胞周期分布无显着性（P>0.05）差异。（10）miR-155靶基因验证经Targetscan、miRanda软件以及高通量测序结果分析发现,caspase-6和FOXO3a是数据库中共同命中的miR-155靶基因。Western Blot（WB）检测结果显示,与C组相比,V组caspase-6和FOXO3a蛋白表达量显着（P<0.05）升高。与V组相比,VM组caspase-6和FOXO3a蛋白表达量显着（P<0.05）降低;VI组FOXO3a蛋白表达量进一步显着（P<0.05）升高,caspase-6蛋白表达量也有所升高。VN组与V组的caspase-6和FOXO3a蛋白表达量未见统计学差异（P>0.05）。上述研究结果为进一步阐明REV感染对CEFs转录后调控的影响,及可变剪接和miR-155在其中所扮演的重要角色提供了重要的科学实验依据,也为进一步在分子水平探讨REV的免疫致病机制提供了新思路。
朱爱华[10]（2019）在《下调SSFA2对胶质瘤细胞生物特性的影响及分子机制研究》文中提出胶质瘤（glioma）是颅内最常见的一种原发性神经系统恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的46%,占全身恶性肿瘤的1%到3%。世界卫生组织（WHO）根据肿瘤细胞的密度、瘤细胞的多形性或非典型性、瘤细胞核的高度异型性、核分裂活性、血管增生、坏死、增值指数等7项指标,将胶质瘤在病理上分为4级,I-II级为低级别胶质瘤,III-IV级为高级别胶质瘤。IV级的胶质瘤也称为胶质母细胞瘤或者多形性胶质母细胞瘤,在病理上常特征性表现为组织缺血性坏死,强浸润性及微血管增殖。随着分子生物学技术的不断进步,目前认为脑胶质瘤细胞主要来源于神经元周围发生恶变的胶质细胞,星形细胞或少突胶质细胞等,其具有高度异质性的特点。现有的经典病理学往往忽视了胶质瘤的高度异质性,难以满足精准治疗的要求。2016年脑胶质瘤的WHO分类引入了基因型,将胶质瘤分为许多亚类,如IDH1突变型和野生型弥漫性胶质瘤。同时强调了分子事件在胶质瘤中的重要性,如ATRX和TP53突变多发生在星形胶质细胞瘤,1p/19q共缺失多见于少突胶质细胞瘤等。虽然经典组织病理学结合基因的分子分型为胶质瘤患者带来了新的诊断和治疗策略,但是胶质细胞瘤的治疗效果仍不令人满意。胶质母细胞瘤患者采用手术切除,联合术后放疗及替莫唑胺（TMZ）化疗,五年生存率仅为9.8%,中位生存期仅为14.6个月。目前国际上对于原发或者复发胶质母细胞仍没有一个有效临床治疗方法。胶质瘤特别是高级别胶质瘤的治疗是目前国际上神经外科的难点和挑战之一。近年来,分子靶向治疗正成为恶性肿瘤治疗的一个新方法,这或许为神经胶质瘤的治疗提供了一个可能的途径。因此,寻找神经胶质瘤发生、发展及浸润等过程中重要的分子正成为目前神经外科专业的研究热点和方向之一,以期为胶质瘤的诊断及治疗寻找可能的靶点。SSFA2（精子特异性抗原2）,也称为KRAS诱导肌动蛋白相互作用蛋白（KRAP）。人KRAP基因最初被鉴定为在人结肠癌HCT116细胞中被激活的KRAS上调表达水平的基因之一,被认为是大肠癌中解除调控的基因之一。KRAP基因编码一种与丝状肌动蛋白（f-actin）相关的细胞质蛋白,氨基酸序列在从鱼类到哺乳动物的KRAP直系亲属中均高度保守。目前研究发现缺乏KRAP的小鼠表现出全身能量代谢的改变和对饮食引起的肥胖和糖尿病的抵抗。尽管KRAP缺陷小鼠代谢表型的确切机制尚不清楚,KRAP还是被认为是代谢相关疾病的目标。近年来,越来越多的研究表明SSFA2可能成为癌症的潜在靶点。在小细胞肺癌中SSFA2与癌细胞的肝脏优先转移有关;在淋巴瘤中实验P38-MAPK信号通路抑制剂可以下调SSFA2在淋巴瘤细胞中的表达,有效抑制恶性淋巴瘤的进展;在慢性淋巴细胞白血病SSFA2的表达可能与癌细胞的增殖表型相关等。这些研究均表明SSFA2与癌症的恶性进展密切相关。然而,SSFA2基因在胶质瘤发生发展中所发挥的作用目前尚不清楚。在本研究中我们将SSFA2作为胶质瘤的一个潜在靶点,研究其在胶质瘤恶性进展中所发挥的作用及分子机制,为胶质瘤的诊断和治疗提供一个新的靶点。第一部分SSFA2在人脑胶质瘤及胶质瘤细胞中的表达目的:明确SSFA2基因在人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞中的表达情况,为我们进一步研究SSFA2在恶性胶质瘤细胞中的生物学功能奠定实验基础。方法:（1）通过分析常用肿瘤数据库（TCGA,CGGA,REMBRANDT）中SSFA2基因在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况。（2）采用实时定量PCR方法检测30例手术收集的人脑胶质瘤组织标本（较低级别18例:WHO II-III级,胶质母细胞瘤12例）及6例外伤手术中废弃的正常脑组织标本中SSFA2的m RNA的表达水平。（3）采用实时定量PCR方法,检测人源的4株胶质瘤细胞株U251、U87、U373、A172细胞中SSFA2基因m RNA水平的表达丰度。结果:（1）TCGA、REMBRANDT数据库中SSFA2的表达在胶质瘤组织中相较于正常脑组织明显升高（p<0.01）;CGGA数据库中显示SSFA2的表达随胶质瘤级别的升高不断升高（p<0.01）。（2）定量PCR结果显示与正常脑组织相比,胶质瘤组织中SSFA2的表达明显升高（p<0.01）。（3）实时定量PCR方法检测SSFA2在胶质瘤细胞U251、U87、U373、A172四株胶质瘤细胞株中的表达丰度,结果显示在胶质瘤细胞系中SSFA2基因均具有很高的表达丰度。结论:SSFA2基因在胶质瘤组织中的表达明显升高,且在胶质瘤细胞株中具有很高的表达丰度。为下一步继续研究SSFA2在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定了基础。第二部分下调SSFA2对胶质瘤细胞增殖、周期及凋亡的影响（体外试验）目的:体外研究SSFA2对于胶质瘤细胞株U87及U251的增殖、细胞周期及凋亡的影响,初步阐明SSFA2基因在胶质瘤细胞株U87及U251中的功能。方法:（1）设计和合成靶向SSFA2的短发夹RNA（sh RNA）,同时构建慢病毒载体（LV-sh RNA-SSFA2）。（2）慢病毒转染胶质瘤细胞株,构建稳定敲低SSFA2基因的细胞株,采用实时定量PCR测定SSFA2基因在两株胶质瘤细胞的敲减效率;慢病毒转染293 T细胞,Western Blot检测干扰靶点的有效性。（3）用MTT法和Celigo细胞计数测定下调SSFA2基因的表达后,对胶质瘤细胞U251及U87细胞增殖的影响。（4）流式细胞仪分析下调SSFA2基因的表达后,对胶质瘤细胞U251及U87细胞周期和细胞凋亡的影响。结果:（1）定量PCR结果显示我们设计的LV-sh RNA-SSFA2能够明显下调SSFA2基因在胶质瘤细胞中的表达;Western-blot结果显示LV-sh RNA-SSFA2能够在蛋白水平抑制SSFA2基因的表达。（2）MTT法和Celigo细胞计数结果显示,在胶质瘤细胞中下调SSFA2的表达后,胶质瘤细胞的增殖受到明显抑制（p<0.01）。（3）流式细胞检测显示在胶质瘤细胞中下调SSFA2的表达后,胶质瘤细胞的凋亡率明显增加,同时对细胞周期的分布产生影响。结论:在胶质瘤细胞中,下调SSFA2基因的表达后,胶质瘤细胞的增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加,这提示我们SSFA2基因可能在胶质瘤细胞的细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡过程中存在重要作用。第三部分下调SSFA2基因后对胶质瘤细胞致瘤能力的影响（体内实验）目的:明确在胶质瘤细胞中下调SSFA2基因后,胶质瘤细胞在裸鼠体内致瘤能力的影响。方法:建立稳定低表达SSFA2的胶质瘤细胞U87（LV-sh RNA-SSFA2 U87）及正常表达SSFA2的胶质瘤细胞U87（LV-sh RNA-Ctrl U87）。将裸鼠随机分为对照组和实验组,在各组裸鼠右侧皮腋下注射相同数量的低表达SSFA2的胶质瘤细胞U87（LV-sh RNA-SSFA2 U87）及正常表达SSFA2的胶质瘤细胞U87（LV-sh RNA-Ctrl U87）。在后续饲养过程中观察并记录皮下肿瘤的形成情况,每周2次测量皮下肿瘤瘤体体积和裸鼠重量,并在35天后处死裸鼠后瘤体称重,比较两组的差异。结果:当裸鼠饲养至第16天时,实验组裸鼠（注射LV-sh RNA-Ctrl U87细胞）皮下肿瘤体积明显低于对照组（注射LV-sh RNA-Ctrl U87细胞）;同时我们发现肿瘤体积的差异趋势随着饲养时间的增加愈加明显。在处死裸鼠,对皮下肿瘤进行称重,我们发现实验组裸鼠皮下肿瘤重量明显低于对照组裸鼠皮下肿瘤重量。结论:在胶质瘤细胞中下调SSFA2基因的表达后可以明显抑制胶质瘤细胞的成瘤能力。第四部分下调SSFA2基因影响胶质瘤细胞生物学特性的分子机制研究目的:通过基因芯片初步研究SSFA2影响胶质瘤细胞生物学特性的分子机制。方法:在胶质瘤细胞U87中对SSFA2进行基因敲减,分为阴性对照组及敲减组,分别分离总RNA,使用Affymetrix全基因组表达谱芯片进行杂交,检测该基因敲减后其他基因的变化水平。对差异基因进行IPA分析和个性疾病关键基因分析,分析得到下游重要信号分子。选取显着变化的下游应答基因,通过qPCR及WESTERN BLOT检测其表达水平。结果:我们在下调SSFA2基因的胶质瘤细胞U87中获得了许多与阴性对照相比的差异基因。进一步使用IPA分析分析了基因表达谱的结果,结果表明NLRP12被预测为强激活,下游有10个基因被这个基因激活。同时IL2被预测为强烈抑制,下游有29个基因被该基因抑制。此外,基因相互作用网络图显示了一个特定功能区内分子间相互作用的网络。最后,我们使用WB检测了相关蛋白的表达。分析结果表明,IL1A蛋白下调了76%,IL1B蛋白下调了54%,CDK6蛋白明显下调。结论:靶基因SSFA2可能通过调控IL1A、IL1B、CDK6等基因调控胶质瘤的进展。
二、膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染（论文提纲范文）
（1）miRNA-129-1-3p在芦丁减轻吡柔比星所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌药效中的介导作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词对照表 |
| 第1篇 前言 |
| 第2篇 文献综述 蒽环类药物致乳腺癌患者心脏毒性的研究进展 |
| 1.1 蒽环类药物心脏毒性临床表现 |
| 1.1.1 蒽环类药物心脏毒性发病率 |
| 1.1.2 蒽环类药物心脏毒性临床类型 |
| 1.1.3 蒽环类药物心脏毒性病理特征 |
| 1.2 蒽环类药物所致心脏毒性的发生机制 |
| 1.2.1 氧化应激 |
| 1.2.2 内质网应激和肌浆网钙稳态 |
| 1.2.3 线粒体功能障碍 |
| 1.2.4 铁调节蛋白紊乱 |
| 1.2.5 炎症反应 |
| 1.2.6 细胞自噬 |
| 1.2.7 细胞凋亡 |
| 1.3 蒽环类药物所致心脏毒性的药物防治 |
| 1.3.1 右雷佐生 |
| 1.3.2 卡维地洛 |
| 1.3.3 他汀类药物 |
| 1.3.4 辅酶Q10 |
| 1.3.5 中药 |
| 1.4 蒽环类药物所致心脏毒性与miRNAs |
| 1.4.1 miRNAs简介 |
| 1.4.2 心脏miRNAs表达的变化 |
| 1.4.3 循环miRNAs表达的变化 |
| 1.4.4 miRNAs在预防和治疗中的作用 |
| 1.5 乳腺癌与miRNAs |
| 1.5.1 诊断与分型 |
| 1.5.2 治疗 |
| 1.5.3 预后 |
| 1.6 miRNAs在蒽环类药物致乳腺癌患者心脏毒性中应用的展望 |
| 第3篇 实验研究 |
| 第1章 RUT减轻THP所致心脏毒性的miRNA生物信息学分析及miRNA-129-1-3p/GRIN2D介导的Ca~(2+)通路的构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 miRNA芯片生物信息学分析及信号通路构建 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.2.4 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 生物信息学分析预测miR-129-1-3p靶基因和Ca~(2+)通路的联系 |
| 1.3.2 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.4 本章小结 |
| 第2章 miRNA-129-1-3p在 RUT减轻THP诱导的小鼠心肌细胞损伤中的介导作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 实验用药配制 |
| 2.2.3 CCK-8 细胞毒性-增殖检测 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR) |
| 2.2.5 细胞转染 |
| 2.2.6 ROS检测 |
| 2.2.7 细胞丙二醛检测 |
| 2.2.8 超氧化物歧化酶检测 |
| 2.2.9 Fluo-3 AM钙离子检测 |
| 2.2.10 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 RUT、THP对心肌细胞作用的最佳浓度和时间确定 |
| 2.3.2 RUT逆转THP处理的HL-1细胞中miR-129-1-3p下调和GRIN2D mRNA上调 |
| 2.3.3 miR-129-1-3p转染至HL-1细胞中的效率评价 |
| 2.3.4 RUT和miR-129-1-3p改善THP诱导的HL-1细胞损伤 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 miRNA-129-1-3p在 RUT协同THP抑制乳腺癌4T1细胞增殖、迁移及侵袭中的介导作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HC11及4T1细胞培养 |
| 3.2.2 实验用药配置 |
| 3.2.3 CCK-8细胞毒性-增殖检测 |
| 3.2.4 qPCR |
| 3.2.5 细胞转染 |
| 3.2.6 平板克隆形成实验 |
| 3.2.7 划痕实验 |
| 3.2.8 Transwell迁移和侵袭实验 |
| 3.2.9 Fluo-3 AM钙离子检测 |
| 3.2.10 Western blot |
| 3.2.11 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 RUT和/或THP对乳腺(癌)细胞作用及最佳浓度和时间确定 |
| 3.3.2 RUT协同THP上调4T1细胞miR-129-1-3p、下调GRIN2D mRNA的表达 |
| 3.3.3 miR-129-1-3p mimics/inhibitor成功转染至4T1细胞 |
| 3.3.4 miR-129-1-3p介导4T1细胞增殖、迁移、侵袭的作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 miRNA-129-1-3p在RUT对乳腺荷瘤与THP心脏毒性复合模型小鼠心肌保护及增敏抗肿瘤的介导作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.14T1细胞培养 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 乳腺荷瘤与心脏毒性小鼠复合模型的复制方法 |
| 4.2.4 实验分组及处理因素 |
| 4.2.5 小鼠血液标本的采集 |
| 4.2.6 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织标本的采集 |
| 4.2.7 心电监测 |
| 4.2.8 心脏系数的测定 |
| 4.2.9 血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶检测 |
| 4.2.10 血清MDA检测 |
| 4.2.11 血清SOD检测 |
| 4.2.12 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织HE染色 |
| 4.2.13 肿瘤组织免疫组织化学染色 |
| 4.2.14 qPCR |
| 4.2.15 心肌与肿瘤组织中Ca~(2+)水平检测 |
| 4.2.16 TUNEL检测心肌与肿瘤组织细胞凋亡 |
| 4.2.17 Western blot |
| 4.2.18 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠一般状况及体重变化 |
| 4.3.2 小鼠肿瘤生长情况 |
| 4.3.3 小鼠心电图变化 |
| 4.3.4 小鼠心脏系数变化 |
| 4.3.5 小鼠血清LDH及CK变化 |
| 4.3.6 小鼠血清MDA、SOD变化 |
| 4.3.7 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织病理学改变 |
| 4.3.8 小鼠肿瘤组织中Ki67 变化 |
| 4.3.9 小鼠心肌和肿瘤组织中miR-129-1-3p和GRIN2D mRNA的变化 |
| 4.3.10 小鼠心肌和肿瘤组织中钙含量变化 |
| 4.3.11 小鼠心肌和肿瘤组织的细胞凋亡 |
| 4.3.12 小鼠肿瘤组织中与迁移、侵袭相关蛋白表达的变化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第4篇 讨论 |
| 1.1 THP诱导小鼠心肌细胞损伤模型及乳腺荷瘤与THP心脏毒性复合小鼠模型的复制 |
| 1.1.1 THP诱导的小鼠心肌细胞损伤模型的复制 |
| 1.1.2 乳腺荷瘤与心脏毒性复合小鼠模型的复制 |
| 1.2 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用及机制 |
| 1.2.1 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用 |
| 1.2.2 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用机制 |
| 1.3 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌中的作用及机制 |
| 1.3.1 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌中的作用 |
| 1.3.2 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌的作用机制 |
| 第5篇 结论 |
| 创新点 |
| 今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 H.pylori主要的致癌因子 |
| 1.3 H.pylori感染胃黏膜改变的关键分子PMEPA1 |
| 第2章 PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及其生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床组织标本及资料收集 |
| 2.1.2 生物信息学数据库 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学数据挖掘 |
| 2.2.2 组织蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 2.2.3 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PMEPA1在胃癌组织中显着高表达 |
| 2.3.2 PMEPA1与胃癌患者预后的关系 |
| 2.3.3 PMEPA1诊断胃癌的临床价值 |
| 2.3.4 生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 H.pylori感染及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 临床组织标本收集 |
| 3.1.2 细胞系及实验菌株 |
| 3.1.3 质粒及感受态细胞 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 幽门螺杆菌的复苏、鉴定、传代 |
| 3.2.2 H.pylori7.13和PMSS1 oipA基因敲除菌株的构建 |
| 3.2.3 制备抗oipA重组抗原的免疫兔多克隆抗体 |
| 3.2.4 细胞培养及细菌细胞共培养模型的构建 |
| 3.2.5 蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 3.2.6 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 3.2.7 石蜡切片及免疫组织化学 |
| 3.2.8 细胞转录组学 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hp7.13和PMSS1 菌株的oipA基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 3.3.2 H.pylori感染上调胃上皮细胞中PMEPA1的表达水平 |
| 3.3.3 H.pylori cag A和 oipA影响胃上皮细胞PMEPA1的表达 |
| 3.3.4 PMEPA1在不同胃黏膜病变阶段的表达及与H.pylori感染的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒稳转细胞株的构建 |
| 4.2.2 CCK8 细胞增殖实验 |
| 4.2.3 实时无标记细胞增殖实验 |
| 4.2.4 Transwell细胞迁移和侵袭实验 |
| 4.2.5 划痕修复实验 |
| 4.2.6 克隆形成实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 成功构建PMEPA1过表达和敲减稳转细胞株 |
| 4.3.2 PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.3 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞的生物学行为的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 PMEPA1在H.pylori感染胃上皮细胞改变的转录组学研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞转录组测序流程 |
| 5.2.2 转录组测序数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 测序样品的RNA验证 |
| 5.3.2 PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响 |
| 5.3.3 Hp感染对过表达或敲减PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.3.4 PMEPA1对不同Hp菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 小结和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 PMEPA1在肿瘤中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 幽门螺杆菌外膜蛋白致病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 ILT4对非小细胞肺癌血管生成的作用和预后分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4调控非小细胞肺癌血管内皮细胞迁移和血管生成的机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分体内验证ILT4通过诱导血管生成促进肿瘤进展 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述:ILT4和VEGF-A的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 引言 |
| 1.1 肝癌基本概况 |
| 1.2 PEBP4 概况 |
| 1.2.1 PEBP4 的结构,分布和功能 |
| 1.2.2 PEBP4 在肿瘤中的作用 |
| 1.2.3 PEBP4 参与的信号通路 |
| 1.3 Akt概况 |
| 1.3.1 Akt的结构,生物学功能和调节 |
| 1.3.2 Akt与肿瘤 |
| 1.4 mTOR概况 |
| 1.4.1 mTOR复合物 |
| 1.4.2 mTOR信号通路 |
| 1.4.3 mTOR与肿瘤 |
| 1.5 EMT概况 |
| 1.5.1 EMT特征和功能 |
| 1.5.2 诱导EMT因素和相关信号通路 |
| 1.5.3 EMT与肿瘤 |
| 1.6 本课题研究内容与创新之处 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 主要创新之处 |
| 第二部分 PEBP4 对肝癌细胞生物行为学的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组化 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 WB |
| 2.2.4 qPCR检测组织PEBP4的m RNA表达水平 |
| 2.2.5 质粒扩增: |
| 2.2.6 sh-PEBP4 敲低 MHCC97H中 PEBP4,构建敲低 PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.2.7 用PCMV6-PEBP4 过表达MHCC97L中的PEBP4,构建过表达PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.2.8 细胞活力测定 |
| 2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.10 克隆形成实验 |
| 2.2.11 Transwell实验 |
| 2.2.12 增殖模型构建(皮下移植模型) |
| 2.2.13 肺转移模型构建 |
| 2.2.14 形态学观察(肺部组织HE染色) |
| 2.2.15 统计学分析:采用SPSS软件对实验结果行统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PEBP4 在肝癌组织和细胞中高表达 |
| 2.3.2 构建敲低和过表达PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.3.3 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞的生长 |
| 2.3.4 过表达 PEBP4 促进肝癌细胞的生长 |
| 2.3.5 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 2.3.6 过表达PEBP4 促进肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 2.3.7 敲低PEBP4 抑制异体移植瘤的生长 |
| 2.3.8 过表达PEBP4 促进异体移植瘤的生长 |
| 2.3.9 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞肺转移 |
| 2.3.10 过表达PEBP4 促进肝癌细胞肺转移 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 WB检测敲低和过表达PEBP4 细胞系中Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.3 免疫荧光检测敲低和过表达PEBP4 细胞系中E-cadherin和N-cadherin的表达 |
| 3.2.4 IGF-1 刺激敲低PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.5 Akt抑制剂MK-2206 处理过表达PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.6 Akt-S473D感染敲低PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.7 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达PEBP4细胞系,CCK8 检测细胞增殖能力 |
| 3.2.8 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达PEBP4细胞系,Transwell检测细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.2.9 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达 PEBP4细胞系,免疫荧光检测E-cadherin和 N-cadherin的表达 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 敲低PEBP4 下调Akt/mTOR信号通路 |
| 3.3.2 过表达PEBP4 上调Akt/mTOR信号通路 |
| 3.3.3 PEBP4 参与Akt/mTOR信号通路活化 |
| 3.3.4 PEBP4 促进Akt/mTOR信号通路活化 |
| 3.3.5 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 3.3.6 敲低PEBP4 抑制EMT进展 |
| 3.3.7 过表达PEBP4 促进EMT进展 |
| 3.3.8 PEBP4 可能通过Akt/mTOR信号通路调节EMT的进展 |
| 3.3.9 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路调节E-cadherin和 N-cadherin的表达 |
| 3.3.10 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进EMT的进展 |
| 3.4 讨论 |
| 第四部分 探讨PEBP4、Akt、mTOR之间的关系 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 免疫共沉淀 |
| 4.2.3 N-myc-PEBP4 质粒扩增 |
| 4.2.4 N-myc-PEBP4 转染HEK293T用于免疫共沉淀 |
| 4.2.5 siRNA-mTOR转染HEK293T细胞用于验证siRNA敲低效果 |
| 4.2.6 siRNA-mTOR转染HEK293T细胞用于免疫共沉淀 |
| 4.2.7 Western blot |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PEBP4、Akt、mTOR之间具有相互作用 |
| 4.3.2 mTOR可能通过Akt与 PEBP4 发生作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第五部分 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 NF-κB 信号通路在肝细胞癌作用中的研究进展 |
| References |
（5）S100A6在原发性胆汁性胆管炎肝内胆管上皮细胞损伤中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:原发性胆汁性胆管炎生物信息学分析及胆管上皮细胞靶基因蛋白表达验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 PBC患者及健康对照 |
| 2.2.2 BDL小鼠模型 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 PBC患者肝脏组织生物信息学分析 |
| 2.3.2 BDL小鼠模型胆管上皮细胞差异基因的筛选 |
| 2.3.3 BDL小鼠模型的建立 |
| 2.3.4 小鼠肝组织HE和Masson染色 |
| 2.3.5 小鼠肝内胆管细胞免疫荧光双标记 |
| 2.3.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PBC患者肝脏组织生物信息学分析 |
| 3.1.1 PBC患者肝脏组织差异基因的鉴定 |
| 3.1.2 GO富集分析 |
| 3.1.3 通路分析 |
| 3.1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.1.5 PBC关键基因和转录因子分析 |
| 3.2 胆汁淤积小鼠模型胆管上皮细胞差异基因筛选 |
| 3.3 BDL小鼠模型的建立及差异基因的鉴定 |
| 3.3.1 BDL组小鼠肝脏组织病理学大体改变 |
| 3.3.2 BDL小鼠肝脏HE染色 |
| 3.3.3 BDL小鼠肝脏Masson染色 |
| 3.3.4 BDL小鼠肝内胆管上皮细胞免疫荧光双标记 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:ESR1/S100A6信号促进人肝内胆管上皮细胞凋亡并抑制细胞增殖 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 生物信息学分析 |
| 2.3.2 逆转录扩增及荧光实时定量PCR |
| 2.3.3 人肝内胆管上皮细胞的复苏和培养 |
| 2.3.4 GCDC处理人肝内胆管上皮细胞时间和浓度筛选 |
| 2.3.5 人肝内胆管上皮细胞鉴定 |
| 2.3.6 细胞总RNA提取 |
| 2.3.7 质粒抽提 |
| 2.3.8 细胞转染 |
| 2.3.9 构建pGL3 basic-S100A6启动子质粒和突变体 |
| 2.3.10 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.11 细胞总蛋白提取及定量(BCA法) |
| 2.3.12 Western Blotting |
| 2.3.13 流式细胞仪凋亡检测 |
| 2.3.14 细胞增殖实验(CCK8) |
| 2.3.15 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 GCDC处理人肝内胆管上皮细胞时间和浓度筛选 |
| 3.2 免疫组化法鉴定人胆管上皮细胞 |
| 3.3 S100A6对人胆管上皮细胞功能的影响 |
| 3.3.1 S100A6在人肝内胆管细胞中表达分析 |
| 3.3.2 S100A6在人肝内胆管上皮细胞系中干扰效率分析 |
| 3.3.3 S100A6对PBC凋亡小体中PDC-E2蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 S100A6抑制人肝内胆管上皮细胞增殖 |
| 3.3.5 S100A6促进人肝内胆管上皮细胞凋亡水平 |
| 3.4 转录因子ESR1 与S100A6启动子相互作用的验证 |
| 3.4.1 转录因子ESR1在HiBECs中干扰效率分析 |
| 3.4.2 转录因子ESR1对HiBECs中S100A6和PDC-E2表达的影响 |
| 3.4.3 双荧光素酶报告基因验证转录因子ESR1对S100A6启动子激活作用 |
| 3.5 转录因子ESR1通过激活S100A6启动子促进HIBECS凋亡、抑制细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:血浆S100A6及其相关lncRNAs作为PBC诊断和分期生物标志物的分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 PBC患者及健康对照者 |
| 2.2.2 细胞系 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 生物信息学分析 |
| 2.3.2 血浆S100A6和lncRNAs作为PBC诊断和分期生物标志物的实验设计 |
| 2.3.3 逆转录扩增及荧光实时定量PCR |
| 2.3.4 细胞总RNA提取 |
| 2.3.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PBC患者与健康对照者一般情况比较分析 |
| 3.2 PBC患者与健康对照者血浆S100A6MRNA和LNCRNAS的差异表达 |
| 3.3 PBC不同分期血浆S100A6MRNA和LNCRNAS表达水平的比较分析 |
| 3.4 PBC患者血浆S100A6和LNCRNAS的诊断及分期价值 |
| 3.5 血浆S100A6和LNCRNAS与临床血清学指标相关性分析 |
| 3.6 治疗前后生物标志物表达水平比较 |
| 3.7 PBC患者LINC00472高低水平组差异比较 |
| 3.8 血浆S100A6和LNCRNAS诊断和分期价值的验证 |
| 3.9 PBC患者及健康对照者血浆中ESR1 MRNA相对表达水平 |
| 3.9.1 PBC患者与健康对照者ESR1 mRNA表达水平的差异 |
| 3.9.2 PBC患者血浆中ESR1 mRNA与S100A6mRNA表达水平相关性分析 |
| 3.10 S100A6和LNCRNAS在HIBECS中表达分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 原发性胆汁性胆管炎胆管上皮细胞损伤机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）MTSS1靶向HK2调控有氧糖酵解影响乳腺癌转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 MTSS1对乳腺癌有氧糖酵解的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第二部分 有氧糖酵解对MTSS1调控乳腺癌细胞迁移与侵袭的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第三部分:HK2在MTSS1调控有氧糖酵解对乳腺癌迁移和侵袭中的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 第四部分:体内实验明确MTSS1靶向调控HK2影响乳腺癌转移 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 第五部分:MTSS1与HK2之间的相互作用及对HK2线粒体靶向的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 有氧糖酵解调控肿瘤转移和乳腺癌发生发展的机制 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词注解 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯与双酚A单独和联合暴露对甲状腺发育及肿瘤发生的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:DEHP和BPA单独及联合暴露影响甲状腺激素稳态 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂配置 |
| 2.3 研究对象和分组 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 动物标本采集 |
| 2.4.2 大鼠甲状腺病理检测 |
| 2.4.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 |
| 2.4.5 组织总RNA提取 |
| 2.4.6 逆转录cDNA |
| 2.4.7 引物合成与稀释 |
| 2.4.8 实时定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.4.9 生物信息学分析DEHP和BPA潜在靶标 |
| 2.4.10 分子对接 |
| 2.4.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 DEHP和BPA单独及联合暴露对大鼠体重及脏器系数的影响 |
| 3.2 DEHP和BPA单独及联合暴露对大鼠血清中THs和TSH的影响 |
| 3.3 DEHP和BPA单独及联合暴露对大鼠甲状腺病理的影响 |
| 3.4 DEHP和BPA潜在靶标及通路富集分析 |
| 3.5 DEHP和BPA单独及联合暴露对ESR及下游相关因子的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 DEHP和BPA单独及联合暴露促进甲状腺肿瘤发生 |
| 6 前言 |
| 7 材料与方法 |
| 7.1 主要试剂和仪器 |
| 7.1.1 主要试剂 |
| 7.1.2 主要仪器 |
| 7.2 主要试剂的配置 |
| 7.3 研究对象 |
| 7.4 实验方法 |
| 7.4.1 动物分组及染毒 |
| 7.4.2 动物肿瘤模型建立 |
| 7.4.3 致癌物的配置 |
| 7.4.4 石蜡包埋及切片 |
| 7.4.5 苏木素-伊红染色 |
| 7.4.6 免疫组织化学染色 |
| 7.4.7 组织总蛋白提取 |
| 7.4.8 蛋白浓度测定及样品处理 |
| 7.4.9 Westernblot检测 |
| 7.4.10 统计学分析 |
| 8 结果 |
| 8.1 造模期间大鼠生长状况观察 |
| 8.2 DEHP和BPA单独及联合暴露对肿瘤模型大鼠体重的影响 |
| 8.3 DEHP和BPA单独及联合暴露对肿瘤模型大鼠脏器系数的影响 |
| 8.4 DEHP和BPA单独及联合暴露促进大鼠甲状腺肿瘤发生 |
| 8.5 DEHP和BPA单独及联合暴露对大鼠甲状腺肿瘤标记物的影响 |
| 8.6 DEHP和BPA单独及联合暴露对肿瘤模型大鼠甲状腺ESR1的影响 |
| 8.7 DEHP和BPA单独及联合暴露对肿瘤模型大鼠甲状腺TSHR的影响 |
| 8.8 DEHP和BPA单独及联合暴露对肿瘤模型大鼠甲状腺HDAC6的影响 |
| 8.9 DEHP和BPA单独及联合暴露对肿瘤模型大鼠甲状腺PTEN及下游信号通路的影响 |
| 8.10 DEHP和BPA单独及联合暴露对肿瘤模型大鼠甲状腺c-MYC的影响 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分:DEHP和BPA单独及联合暴露促进甲状腺肿瘤发生的机制研究 |
| 11 前言 |
| 12 材料与方法 |
| 12.1 主要试剂和仪器 |
| 12.1.1 主要试剂 |
| 12.1.2 主要仪器 |
| 12.2 研究对象 |
| 12.3 实验方法 |
| 12.3.1 细胞培养 |
| 12.3.2 受试物的配置 |
| 12.3.3 细胞转染 |
| 12.3.4 CCK-8实验 |
| 12.3.5 Transwell迁移实验 |
| 12.3.6 细胞RNA提取 |
| 12.3.7 反转录(RT-PCR) |
| 12.3.8 引物合成与稀释 |
| 12.3.9 实时定量PCR(Real-time PCR) |
| 12.3.10 细胞蛋白提取及定量 |
| 12.3.11 Western blot |
| 12.3.12 细胞免疫荧光 |
| 12.3.13 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 12.3.14 细胞膜蛋白提取 |
| 12.3.15 统计学分析 |
| 13 结果 |
| 13.1 MEHP和BPA单独及联合暴露诱导人甲状腺癌BCPAP细胞增殖和迁移 |
| 13.1.1 MEHP和BPA促进人甲状腺癌BCPAP细胞的增殖 |
| 13.1.2 MEHP联合BPA诱导人甲状腺癌BCPAP细胞的增殖和迁移 |
| 13.2 MEHP联合BPA诱导人甲状腺癌BCPAP细胞HDAC6上调和PTEN下调 |
| 13.2.1 MEHP联合BPA上调人甲状腺癌BCPAP细胞HDAC6的表达 |
| 13.2.2 MEHP联合BPA抑制人甲状腺癌BCPAP细胞PTEN表达激活下游信号通路 |
| 13.3 MEHP联合BPA诱导人甲状腺癌BCPAP细胞c-MYC上调 |
| 13.4 抑制HDAC6可阻断MEHP和 BPA对人甲状腺癌BCPAP细胞PTEN及AKT磷酸化和c-MYC的影响 |
| 13.4.1 敲低HDAC6可阻断MEHP和BPA对人甲状腺癌BCPAP细胞PTEN及其下游和c-MYC的影响 |
| 13.4.2 Tubastatin A抑制MEHP和BPA对人甲状腺癌BCPAP细胞PTEN及其下游信号通路和c-MYC的作用 |
| 13.5 抑制HDAC6可通过H3K9ac修饰调控BCPAP细胞PTEN表达 |
| 13.6 MEHP联合BPA诱导人甲状腺正常上皮Nthy-ori3-1细胞增殖 |
| 13.7 MEHP联合BPA对人甲状腺正常上皮Nthy-ori3-1细胞HDAC6和PTEN及其下游的影响 |
| 13.8 MEHP联合BPA经HDAC6诱导ERK磷酸化促进Nthy-ori3-1细胞增殖 |
| 13.9 HDAC6/PTEN/AKT信号通路及c-MYC在人甲状腺癌组织中异常表达 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 内分泌干扰物影响甲状腺肿瘤发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）MUC2和TFF1基因在猪流行性腹泻中的调控作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪流行性腹泻 |
| 1.1.1 病原PEDV |
| 1.1.2 PED临床症状和发病机理 |
| 1.2 黏蛋白2 (Mucin 2) |
| 1.2.1 黏蛋白家族 |
| 1.2.1.1 膜结合型黏蛋白 |
| 1.2.1.2 分泌型黏蛋白 |
| 1.2.2 黏蛋白2 (MUC2) |
| 1.2.2.1 MUC2的合成 |
| 1.2.2.2 MUC2的生理功能 |
| 1.2.2.3 MUC2与癌症 |
| 1.2.2.4 MUC2与肠道感染 |
| 1.3 三叶因1(Trefoil factor 1) |
| 1.3.1 三叶因子家族 |
| 1.3.2 三叶因子结构特性 |
| 1.3.3 TFFs功能 |
| 1.3.3.1 黏膜防御 |
| 1.3.3.2 修复黏膜损伤 |
| 1.3.4 TFF1和癌症 |
| 1.3.4.1 TFF1与胃癌 |
| 1.3.4.2 TFF1与乳腺癌 |
| 1.3.4.3 TFF1与前列腺癌 |
| 1.3.4.4 TFF1与结肠癌 |
| 1.4 DNA甲基化 |
| 1.4.1 DNA甲基化 |
| 1.4.2 CpG岛 |
| 1.4.3 DNA甲基化与疾病研究 |
| 1.5 本研究目的意义 |
| 第2章 MUC2和TFF1基因对抵抗PEDV感染的调控作用分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.1.1 试验动物 |
| 2.1.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.2.1 腹泻仔猪PEDV病原学鉴定 |
| 2.1.2.2 小肠组织HE染色鉴定 |
| 2.1.2.3 引物设计 |
| 2.1.2.4 MUC2和TFF1基因在组织和细胞感染中的表达差异 |
| 2.1.2.5 MUC2和TFF1基因干扰细胞系的构建及PEDVM基因表达检测 |
| 2.1.2.6 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 猪流行性腹泻病毒的鉴定 |
| 2.2.2 小肠组织HE染色结果分析 |
| 2.2.3 MUC2和TFF1基因在组织和细胞感染中的表达差异分析 |
| 2.2.4 MUC2和TFF1基因干扰细胞系构建以及对PEDV病毒复制的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 MUC2和TFF1基因启动子区DNA甲基化对其表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.1.1 试验样本 |
| 3.1.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.1.3 主要实验仪器 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.2.1 组织DNA提取 |
| 3.1.2.2 基因组DNA亚硫酸氢盐处理 |
| 3.1.2.3 CpG岛PCR扩增及纯化 |
| 3.1.2.4 连接转化 |
| 3.1.2.5 阳性单克隆挑选及BSP测序 |
| 3.1.2.6 构建启动子重组质粒和M.SssI甲基化酶处理 |
| 3.1.2.7 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 CpG岛PCR扩增 |
| 3.2.2 启动子区CpG岛甲基化分析 |
| 3.2.3 DNA甲基化对MUC2和TFF1基因启动子活性的影响 |
| 3.2.4 MUC2和TFF1基因启动子区甲基化和mRNA表达相关性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 MUC2和TFF1基因启动子区转录因子结合位点分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验样本 |
| 4.1.2 转录因子结合位点预测分析 |
| 4.1.3 染色质免疫共沉淀(ChIP)试验 |
| 4.1.4 转录因子YY1和C/EBPα干扰细胞系构建及MUC2和TFF1基因表达检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转录因子结合位点分析 |
| 4.2.2 ChIP鉴定分析 |
| 4.2.3 转录因子YY1和C/EBPα干扰细胞系构建及MUC2和TFF1基因表达变化 |
| 4.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新点及下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽网状内皮组织增生病及其研究进展 |
| 1.1.1 禽网状内皮组织增生病病毒及其研究进展 |
| 1.1.2 REV的致病机制 |
| 1.1.3 REV感染动物的临诊主要症状及其病理变化 |
| 1.1.4 RE诊断及其防制(治) |
| 1.2 可变剪接及其研究进展 |
| 1.2.1 可变剪接概述 |
| 1.2.2 可变剪接的研究历史 |
| 1.2.3 可变剪接的主要形式 |
| 1.2.4 可变剪接的功能 |
| 1.2.5 可变剪接的产生机制 |
| 1.2.6 可变剪接的调控 |
| 1.2.7 可变剪接的应用与展望 |
| 1.3 microRNA及其研究进展 |
| 1.3.1 microRNA概述 |
| 1.3.2 microRNA-155及其研究进展 |
| 1.3.3 microRNA应用及其展望 |
| 1.4 本项目研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 病毒 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 主要化学试剂和生物制剂 |
| 2.1.5 主要溶液及其配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 制备鸡胚成纤维细胞 |
| 2.2.2 病毒复制 |
| 2.2.3 REV荧光定量检测方法的建立 |
| 2.2.4 REV滴度测定 |
| 2.2.5 REV感染CEFs后可变剪接分析 |
| 2.2.6 REV感染对CEFs中miR-155的影响 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 REV荧光定量检测方法的建立及病毒滴度测定 |
| 3.1.1 REV复制及其检测 |
| 3.1.2 REV荧光定量检测方法的建立 |
| 3.1.3 病毒滴度测定 |
| 3.2 高通量测序结果及其分析 |
| 3.2.1 样本转录组 |
| 3.2.2 可变剪接基因的识别 |
| 3.2.3 可变剪接基因差异表达分析 |
| 3.2.4 差异表达可变剪接基因功能分析 |
| 3.2.5 测序结果的验证 |
| 3.3 miR-155检测及其分析 |
| 3.3.1 REV接毒时间对CEFs中miR-155表达的影响 |
| 3.3.2 REV感染剂量对CEFs中miR-155表达的影响 |
| 3.3.3 转染效率的检测 |
| 3.3.4 细胞活力的检测 |
| 3.3.5 REV感染对CEFs细胞凋亡及其相关酶活性的影响 |
| 3.3.6 REV感染对CEFs细胞周期的影响 |
| 3.3.7 miR-155靶基因验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 REV复制及其验证 |
| 4.2 REV荧光定量PCR检测方法的建立及其应用 |
| 4.3 REV感染对CEFS可变剪接的影响 |
| 4.3.1 禽类病毒对可变剪接的影响 |
| 4.3.2 REV感染CEFs中差异表达可变剪接基因的功能分析 |
| 4.3.3 REV感染所致的可变剪接对CEFs细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 REV感染所致的可变剪接对CEFs细胞周期的影响 |
| 4.3.5 高通量测序结果的进一步验证 |
| 4.4 miR-155对REV感染CEFS的影响 |
| 4.4.1 miRNA在病毒感染中的作用 |
| 4.4.2 miR-155在REV感染CEFs中的变化 |
| 4.4.3 miR-155对CEFs应答REV感染的调控作用 |
| 4.4.4 miR-155对CEFs应答REV感染的调控机制 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）下调SSFA2对胶质瘤细胞生物特性的影响及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SSFA2在人脑胶质瘤及胶质瘤细胞系中的表达 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验仪器和材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、基于生物信息学分析SSFA2在胶质瘤组织中的表达 |
| 二、定量PCR检测SSFA2 在人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞株中的表达 |
| 三、生物信息学分析SSFA2的表达对人脑胶质瘤患者生存期的影响 |
| 讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SSFA2 在胶质瘤细胞株U87及U251中的功能学研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料和仪器 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一.病毒介导的的干扰SSFA2 基因的Sh RNA工具(LV-SSFA2-sh RNA)感染目的细胞后的细胞状态及荧光表达情况 |
| 二.慢病毒(LV-SSFA2-sh RNA)转染后SSFA2 基因m RNA水平及蛋白水平的消减效率 |
| 三.下调SSFA2基因后对胶质瘤细胞增殖的影响 |
| 四.下调SSFA2基因后对胶质瘤细胞周期的影响 |
| 五.FACS检测SSFA2 基因消减对凋亡的影响 |
| 讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 研究SSFA2对胶质瘤细胞成瘤能力的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一.实验材料和仪器 |
| 二.实验方法 |
| 实验结果 |
| 一.慢病毒转染胶质瘤细胞U87后的细胞状态 |
| 二.胶质瘤细胞下调SSFA2后对皮下移植瘤的抑制作用 |
| 讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 SSFA2对胶质瘤细胞增殖功能的作用机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一.实验材料和仪器 |
| 二. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 一.RNA及芯片数据的质量检测 |
| 二.基因表达谱芯片的检测 |
| 三.差异基因的IPA分析 |
| 四.下调SSFA2基因后,胶质瘤细胞增殖和迁移相关分子的网络图 |
| 五.Real-time qPCR检测下调SSFA2 基因后,下游相关差异基因的表达 |
| 六. western-blot 检测显着差异基因蛋白水平的变化 |
| 七 颅内移植瘤中细胞的生长情况及裸鼠生存期变化 |
| 八. 颅内移植瘤中相关指标的检测 |
| 讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 综述 IL-1α、IL-1β 在癌症中作用及调控 |
| 参考文献 |
| 英文缩写一览表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
四、膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染（论文参考文献）
- [1]miRNA-129-1-3p在芦丁减轻吡柔比星所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌药效中的介导作用[D]. 李琪. 吉林大学, 2021(01)
- [2]PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究[D]. 赵巧云. 南昌大学, 2021(01)
- [3]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
- [4]磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究[D]. 陈琼锋. 南昌大学, 2021(01)
- [5]S100A6在原发性胆汁性胆管炎肝内胆管上皮细胞损伤中的作用机制[D]. 董西华. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]MTSS1靶向HK2调控有氧糖酵解影响乳腺癌转移的机制研究[D]. 陆枢桠. 新乡医学院, 2021(01)
- [7]邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯与双酚A单独和联合暴露对甲状腺发育及肿瘤发生的影响及其机制研究[D]. 张璇. 中国医科大学, 2021
- [8]MUC2和TFF1基因在猪流行性腹泻中的调控作用分析[D]. 杜雨露. 扬州大学, 2020
- [9]REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响[D]. 高畅. 东北农业大学, 2020(04)
- [10]下调SSFA2对胶质瘤细胞生物特性的影响及分子机制研究[D]. 朱爱华. 苏州大学, 2019(06)