一、副溶血弧菌不耐热溶血毒素的表达与纯化（论文文献综述）
刘杰,贺晓晨,黎姗梅,黄艳华,张振豪,黄德生,杨廷雅,吴伟锋,梁静真,黄钧[1]（2020）在《广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌3种毒力基因检测及tlh基因的蛋白表达》文中提出采用PCR技术检测分离自广西钦州、北海和防城港3市凡纳滨对虾样品中的67株副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）3种毒力基因tdh、trh和tlh的携带情况,并将tlh基因进行原核表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,67株副溶血弧菌均未扩增出tdh和trh基因,而tlh基因检出率为100.0%,所检副溶血弧菌的毒力基因型为tdh-trh-tlh+。成功构建了原核表达质粒pET-28a-tlh,将其转化至大肠杆菌BL21 （DE3）感受态细胞后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测得到大小约为53 kDa的产物,与预测值相符。经Western blotting鉴定,该重组表达产物能与抗6×His标签的单克隆抗体发生特异性反应。
孟红梅[2]（2020）在《副溶血弧菌VPA0041和VPA1701蛋白调控运动性的分子机制研究》文中认为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是一种革兰氏阴性菌,广泛存在于各种水环境中,如海洋,沿海和淡水环境。副溶血弧菌也是一种重要食源性病原菌,不仅能够导致海洋动物弧菌病,人们食用生的或者未煮熟的水产品可以导致急性胃肠炎。不仅严重威胁人类的饮食健康,也给水产养殖业造成巨大的经济损失,目前研究发现其致病性主要与黏附因子、溶血毒素、T3SSs、T6SSs、运动性、摄铁系统和蛋白酶等毒力因子息息相关。转录调控因子（TFs）主要是通过直接结合到启动子区域,直接调控下游基因的表达,如代谢途径、群体感应系统、毒力系统以及运动性等多种信号通路。为了深入了解毒力基因致病机制,前期研究通过转座子插入失活的方法（TIS）筛选出230个与肠道定殖相关的基因。本研究筛选其中8个转录调控因子作为本次研究的对象,分别为VPA0041、VPA0076、VPA0240、VPA0692、VPA0806、VPA1365、VPA1562和VPA1701。利用同源重组的方法分别成功构建了这8个基因的缺失突变株,分别为△VPA0041、△VPA0076、△VPA0240、△VPA0692、△VPA0806、△VPA1365、△VPA1562和△VPA1701。幼兔灌胃实验发现△VPA1365与△VPA1701相比于WT毒力显着下降,且qRT-PCR实验结果显示△VPA1365中的T3SSs相关基因表达下调,上述结果表明VPA1365通过调控T3SSs基因的表达介导副溶血弧菌肠道定殖。运动性实验发现△VPA0041与△VPA1701的泳动能力丧失,透射电镜（TEM）观察到在固体硬板培养后△VPA0041与△VPA1 701细胞无周生鞭毛的生长。qRT-PCR和RNA-seq实验结果表明△VPA0041与△VPA1 701中侧生鞭毛基因均下调表达。此外,RNA-seq的结果也表明VPA0041与VPA1701在副溶血弧菌中是一种重要的调控因子,不仅能够调控运动性,还参与细菌的生长代谢途径、群体感应系统、ABC转运系统和双组分系统等通路全局把控细菌。为了进一步了解VPA0041与VPA1701调控运动性的分子机制,分别构建了△VPA0041与△VPA1 701的蛋白表达菌株,表达并纯化两种蛋白,凝胶迁移阻滞实验（EMSA）结果表明,VPA0041和VPA1701蛋白分别结合鞭毛基因的启动子调控鞭毛系统进而介导副溶血弧菌的运动性。副溶血弧菌作为一种重要的致病菌,严重威胁人类的身体健康。本研究主要通过构建8个转录调控因子的缺失突变株,并通过幼兔模型和运动性实验进行筛选,最终发现△VPA0041、△VPA1365和△VPA1701毒力显着下降。深入研究发现,VPA1365与VPA0041和VPA1701分别通过调控T3SSs基因与侧生鞭毛基因的表达来介导副溶血弧菌的肠道定殖。
王润东[3]（2019）在《副溶血性弧菌在六种食品中致病力的差异及与肠道菌群的关联性研究》文中研究表明副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是一种海洋源致病菌,常从海产品中检出,然而,由于食品生熟加工不规范等,极易导致淡水鱼类、畜禽肉类和鸡蛋制品的交叉污染,特别是造成了误食者不同程度的食物中毒。Vp中毒症状的差异与其致病力的变化相关,目前已经清楚该菌的致病力来源于菌体和有毒代谢物的作用。但是,不同食品中Vp致病力的变化规律及体内的致病机制仍不清楚。因此,本文从以下四方面开展研究,具体内容和结果如下:1、体外试验考察Vp在六种食品中生长和产毒的规律Vp接种到对虾、牡蛎、淡水鱼、猪肉、鸡肉和蛋炒饭中培养后,采用菌落计数、血平板法、相对溶血活度法、q-RT-PCR和胞外酶检测,分别测定六种食品中Vp的菌量、TDH活性、总溶血活性、溶血素基因表达和胞外酶活性。结果表明,Vp在对虾、牡蛎、淡水鱼和蛋炒饭中的生长速率明显高于猪肉和鸡肉,但生长稳定期各食品中Vp菌量均达到109 CFU/g。Vp在对虾、牡蛎、淡水鱼和蛋炒饭中培养6-12 h内,总溶血活性随时间呈线性增长,速率常数均大于0.052;而在猪肉和鸡肉中线性增长范围为6-18 h,速率常数均为0.023;线性增长后,Vp在各食品中总溶血活性均达到最大值且保持稳定。培养终点,Vp在蛋炒饭中tdh和tlh基因上调幅度最大,因此具有最高的TDH活性和总溶血活性,其次为对虾>淡水鱼>鸡肉>牡蛎>猪肉。然而,胞外酶活性规律与溶血活性并非完全一致,Vp在对虾中明胶酶、酪蛋白酶、DNA酶、脲酶和磷脂酶的综合活性最高,随后为淡水鱼>鸡肉>牡蛎>猪肉>蛋炒饭。2、体内试验考量Vp在六种食品培养后对小鼠致病力的差异采用小鼠攻毒试验,观察并测定六种食品培养的Vp感染小鼠后的临床症状、死亡率、血常规、肝肾功能及脏器系数。结果表明,攻毒48 h内对虾、淡水鱼和鸡肉组的小鼠最先出现行动迟缓、被毛蓬松和死亡等症状,且各组的小鼠死亡率分别为41.7%（对虾）、16.7%（牡蛎）、33.3%（淡水鱼）、0%（猪肉）、25%（鸡肉）、8.4%（蛋炒饭）。对虾、淡水鱼和鸡肉组小鼠的白细胞（WBC）、红细胞（RBC）和血红蛋白含量均显着降低（p<0.05）,血小板含量上升（p<0.05）。其中对虾组变化幅度最大,分别为-64.2%、-45.4%、-18.7%和48.6%。牡蛎、猪肉和蛋炒饭组WBC和RBC含量降低（p<0.05）。对虾组小鼠的尿素氮（BUN）、碱性磷酸酶（ALP）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）均显着增加（p<0.05）,分别为191.7%、208.5%、109.1%、200%;牡蛎、淡水鱼和鸡肉组除ALP未升高,其他指标均显着升高（p<0.05）,但幅度小于对虾组,猪肉和蛋炒饭组ALT和AST升高（p<0.05）。各组小鼠的肠系数均显着上升（p<0.05）,尤其在对虾和淡水鱼组胃和肝系数特异性增加。综合比较,六种食品培养的Vp对小鼠的致病力存在明显差异,致病力强弱顺序为:对虾>淡水鱼>鸡肉>蛋炒饭>牡蛎>猪肉。3、自主构建伪无菌小鼠模型考证肠道菌群与Vp在体内致病的相关性采用灌胃正常小鼠混合抗生素的方法,剔除肠道菌群,构建伪无菌小鼠模型。再将Vp菌悬液分别攻毒伪无菌小鼠和正常小鼠,比较两组小鼠的肠道损伤、机体炎症和肝肾功能差异。结果表明,具有完整肠道菌群的小鼠的肠壁出血和黄色粘液量明显多于伪无菌小鼠,且正常小鼠血清炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-10平均变化幅度为伪无菌小鼠的2.5倍,肝肾功能指标ALT、AST、ALP和BUN的平均变化幅度为伪无菌小鼠的1.6倍。正常小鼠受到Vp感染后,出现肠道损伤、机体炎症和肝肾功能恶化,其程度均比伪无菌小鼠严重。首次发现肠道菌群参与Vp在体内的致病。4、宏基因组16S rDNA测序技术考究与六种食品中Vp致病力关联的目标菌群针对六种食品培养的Vp感染小鼠,采用宏基因组16S rDNA测序法,通过多样性参数、物种丰度变化、主坐标分析和预测群落功能等,识别与六种食品中Vp致病力关联的目标菌群。结果表明,小鼠被六种食品培养的Vp感染后,肠道菌群α多样性指数Shannon、Chao1和Ace指数及物种分类单元OTU均显着降低（p<0.05）,菌群结构明显改变。在门水平,六种食品的感染组较对照组肠道内拟杆菌门比例显着降低而厚壁菌门和变形菌门比例明显升高。在属水平,与对照组相比,六种食品的感染组小鼠肠道内Bacteroides、Lactobacillus、Bifidobacterium、Rikenellaceae和Lachnospiraceae比例显着降低,而Enterococcaceae、Streptococcus、Clostridiales和Vibrio比例明显升高。尤其是在强致病力的对虾、淡水鱼和鸡肉感染组小鼠肠道内益生菌、产丁酸和短链脂肪酸相关的Akkermansia、Ruminococcaceae和Faecalibacterium比例特异性减少,而促进炎症和肝损伤的Prevotella和Sutterella比例增加,不同食品感染组之间存在不同的Biomarker菌。在Metastats分析的基础上,进一步应用PICRUSt群落功能预测程序挖掘发现肠道菌群的新陈代谢、遗传信息处理和弧菌感染功能在各食品感染组均显着改变,然而,侵袭上皮细胞途径、cAMP信号通路和胆汁酸合成功能仅在对虾、淡水鱼和鸡肉感染组改变,六种食品中Vp的致病强弱与其诱导的小鼠肠道菌群结构差异和群落功能改变密切关联。综上所述,本研究在探明六种食品中Vp生长、产毒及对机体损伤差异的基础上,利用自主构建的伪无菌小鼠模型阐明宿主肠道菌群促进Vp的致病,进一步经宏基因组学16S rDNA测序挖掘到与Vp在体内致病力相关联的标志菌群和重要群落功能,为Vp污染不同食品后的风险评估及其在体内致病机制的解析提供理论依据。
刘雅玲[4]（2019）在《副溶血弧菌tlh重组表达产物溶血活性及抑制KYSE450细胞增殖的初步研究》文中进行了进一步梳理目的副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus,VP）存在于温带和热带海洋系统,引起的食物中毒通常发生在夏季,主要与进食未加工或未煮熟海鲜有关。副溶血弧菌中毒的典型临床症状是急性肠胃炎,常伴有腹痛,腹泻,恶心,呕吐,发烧,发冷和水样大便。在我国沿海地区,由副溶血弧菌引起的食物中毒位居前列。tlh基因编码不耐热溶血毒素（Thermolabile Hemolysin,TLH）,是副溶血弧菌的遗传检测过程中的靶向基因,但对其致病机制尚未明确。首次利用毕赤酵母构建针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素外源蛋白表达体系,进行表达分泌蛋白并将之沉淀浓缩,验证其分子量及溶血功能,并初步探究不耐热溶血毒素对人食管癌细胞KYSE450增殖的抑制作用,为癌细胞增殖抑制研究和抗癌药物研发提供有价值的参考方向。方法在已经成功采用电转化法把重组表达质粒pPIC9K-tlh转化至毕赤酵母宿主菌SMD1168的完整菌株基础上,活化菌株。选取高拷贝的阳性菌株,在含有甲醇的诱导培养液中分泌产生目的靶蛋白（TLH）,取分泌上清液离心后,采用三氯乙酸（Trichloroacetic Acid,TCA）-丙酮沉淀法分离浓缩靶蛋白。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl SulfatePolyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE）验证蛋白大小,添加卵磷脂进行该靶标蛋白溶血功能检测。最后,使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法测定不耐热溶血毒素抑制人食管癌细胞KYSE450生长的量效关系曲线。结果（1）SDS-PAGE结果显示,获得的分泌蛋白分子量大小接近43KD,与文献报道相符,证明目的蛋白成功表达。（2）将卵磷脂加入工程菌株分泌的靶蛋白中,溶血检测结果阳性,而对照组阴性,表明靶蛋白具备依赖卵磷脂酶溶血活性,与不耐热溶血毒素所报道的功能相符,再次验证目的蛋白。（3）人食管癌细胞KYSE450随靶蛋白浓度增加而活度随之降低,初步推测:TLH对人食管癌细胞KYSE450增殖起抑制作用。结论利用毕赤酵母宿主分泌表达胞外不耐热溶血毒素蛋白体系,成功表达TLH;通过实验验证其溶血功能,表明靶蛋白具备卵磷脂依赖性磷脂酶活性,并且溶血程度随着工程菌株的诱导时间增加而增高;CCK-8实验证明其对人食管癌细胞KYSE450增殖起抑制作用。
高璐[5]（2019）在《水产品中弧菌污染、胁迫响应及其噬菌体靶向抑菌研究》文中研究指明弧菌（Vibrio）是一类菌体短小、杆状或弧状的革兰氏阴性运动性细菌,广泛分布于自然界,以海洋、河口的咸水和淡水生态系统为主,其种类丰富、功能多样,在地球水生生态系统的生物、化学循环中发挥着重要作用。弧菌也是水产养殖中最常见、分布最广、危害最严重的病原菌之一。随着水产养殖业的发展,弧菌病的爆发越来越频繁,传播速度越来越快,给世界水产养殖业带来了巨大的经济损失。目前已知有12种人类致病性弧菌,包括副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、霍乱弧菌（V.cholerae）、辛辛那提弧菌（V.cincinnatiensis）、创伤弧菌（V.vulnificus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、拟态弧菌（V.mimicus）、梅契尼柯夫弧菌（V.metschnikovii）、霍利斯弧菌（V.hollisae）、海鱼弧菌（V.damsela）、河流弧菌（V.fluvialis）、弗尼斯弧菌（V.furnissii）和鲨鱼弧菌（V.carchariae）等。由于海水、淡水养殖环境中含有大量弧菌,各种天然和养殖的鱼类、贝类等水产品均可能受到弧菌污染,食用这些受弧菌污染的水产品易导致人类胃肠炎等疾病的爆发。流行病学调查显示致病性弧菌是我国沿海、沿江城市人群腹泻病的主要病原菌。江苏地区临近黄海,属于典型的温带气候,江河、海洋捕捞业和水产养殖业发达,水产品品种繁多、贸易频繁,是弧菌感染的高发地区。因此,本研究系统研究该地区水产品中弧菌菌群的分布、污染水平、致病特征、环境适应以及生物防治措施等,这对于了解该地区水产品中弧菌的分布规律、环境适应特征和制定有效的生物防控策略具有重要意义。1水产品中弧菌菌群多样性1.1高通量测序分析水产品中TCBS菌群多样性2014年秋季（11月初）从扬州市五大超市、农贸市场采集90份水产样品,按超市淡水产品（CSDS）、超市海水产品（CSHS）、农贸市场淡水产品（NMDS）、农贸市场海水产品（NMHS）分为四份混合样品,经3%氯化钠碱性蛋白胨水（Alkaline peptone water,APW）10倍稀释后涂布硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS）平板富集弧菌;另取4份样品经APW过夜增菌后再涂布TCBS平板富集弧菌,过夜培养后刮取平板上所有菌苔提取细菌总DNA,通过16S rDNA 454焦磷酸测序分析不同水产品中可培养TCBS菌群。结果显示四类样品中TCBS菌群增菌前后在门、纲、目、科、属的水平上有较大差异,而海水、淡水、超市、农贸市场来源的水产品的菌群组成基本一致,但其构成比例有明显差异。4份水产品样品TCBS直接富集后的优势菌属依次是:弧菌属（Vibrio）、链球菌属（Streptococcus）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、乳酸菌属（Lactobacillus）、梭菌属（Clostridium）;而经APW增菌再由TCBS富集后的菌群有较大变化,其优势菌属主要有:硝化螺菌属（Nitrospira）、链球菌属（Streptococcus）、希瓦氏菌属（Shewanella）、独岛菌属（Dokdonella）、弓形杆菌（Arcobacter）、弧菌属（Vibrio）。1.2水产品中弧菌菌群分离、鉴定与致病性分析2015和2016年温暖季节（5-10月）从江苏部分地区随机采集225份水产品样品,通过生化鉴定、特异性基因扩增和16S rDNA PCR扩增对TCBS平板分离纯化出的1850株分离株进行鉴定,结果显示,江苏部分地区水产品中普遍存在弧菌污染现象,且污染弧菌种类具多样性。225份样品中共有195份样品被检出弧菌,弧菌总检出率为86.7%,各弧菌种的检出率分别为:V.parahaemolyticus 76.0%、V.alginolyticus 79.0%、V.harveyi1 3.0%、V.aestuarianus 7.5%、V.metschnikovii 6.3%、V.azureus 6.0%、V.natriegens 3.6%、V.diazotrophicus 2.7%和V.owensii 2.0%,其中副溶血弧菌和溶藻弧菌的分离率明显高于其他弧菌。从样品来源看,海水产品中弧菌的检出率（92.4%）明显高于淡水产品（82.4%）,鱼类产品中弧菌的检出率（89.7%）略高于虾、贝类（83.1%）;从采样地区看,沿海、沿江的弧菌检出率（88.2%）稍高于内陆地区（84.6%）;而从采样场所看,农贸市场的检出率（96.0%）明显高于超市（76.8%）。通过对1850株分离株的tdh、trh基因扩增、神奈川试验和部分分离株的小鼠肠积水试验分析分离株的致病性,结果显示,1406株副溶血性弧菌分离株中,tdh+菌株13株、trh+菌株10株,阳性率分别为0.92%和0.71%;神奈川试验结果显示1850个弧菌分离株的溶血阳性率为49.32%;肠积水试验表明几乎所有受试菌株,尤其是tdh+、trh+菌株灌胃小鼠后均出现不同程度的小肠积水、肠壁充血效应（变红）。2胁迫生长条件下弧菌生物学特性及转录组分析2.1胁迫生长条件下弧菌生物学特性以副溶血性弧菌（CICC21617）和溶藻弧菌（CICC 10484）参考菌株为研究对象,研究其在不同盐度、pH值和温度等应激条件下的胁迫生长能力、细胞形态、生物被膜形成能力、溶血素活性等生物学特性。首先确定了应激培养条件:副溶血性弧菌（CICC 21617）能生长（OD600nm>0.3）的最低盐度为0.9%、最高盐度8.0%、最低pH5.0、最高pH10.0、高温45℃5 min、低温-20℃ 2 h;溶藻弧菌（CICC 10484）能生长（OD600nm>0.3）的最低盐度为0.5%、最高盐度8.0%、最低pH4.0、最高pH9.0、最高温度是50℃下5 min、低温-20℃ 下 2h。菌株在低盐、高盐、低pH和高pH液体培养基中能缓慢生长,但将胁迫株再接种入含3.0%NaCl的LB培养基时,其恢复生长能力出现较大差异,高、低pH与高、低温胁迫株恢复生长能力明显高于高、低盐胁迫株,表明胁迫株比未胁迫菌株更能应对相同的胁迫环境。电镜下,胁迫菌株出现明显的细胞壁凹陷、细胞表面破损等变化,严重者甚至出现细胞内容物外泄;2株受试弧菌经高温、高pH胁迫以及溶藻弧菌CICC 10484经高盐胁迫后细胞表面破损最为严重,细胞之间可见絮状物质凝聚。虽然副溶血性弧菌（CICC 21617）和溶藻弧菌（CICC 10484）原始菌株的生物被膜生成能力差异较大,但与未胁迫菌株相比,胁迫菌株的生物被膜生成能力的变化趋势完全一致。多数条件下胁迫株的生物被膜生成能力均有所提升,其中副溶血性弧菌（CICC 21617）低盐胁迫株的生物被膜生成能力最强,其次是低pH、高温、高pH;溶藻弧菌（CICC 10484）低pH、高pH、高温、低盐胁迫株的生物被膜生成能力也比未胁迫株强,但高盐和低温胁迫株的生物被膜生成能力却远远低于未胁迫菌株。副溶血性弧菌（CICC 21617）和溶藻弧菌（CICC 10484）经过各种胁迫传代培养后,溶血素活性均有所降低,尤其是低盐、低pH、高温胁迫株下降最为显着,与原代菌株相比,差异显着（P<0.05）;而胁迫传代培养菌株产胞外蛋白酶的能力虽有所降低,但与原代菌株比差异并不显着。综上所述,2株受试弧菌经应激胁迫培养后其生长能力、抗逆境能力、细胞形态、生物被膜形成能力、溶血素活性等生物学特性均发生了较大的变化。2.2盐胁迫弧菌菌株的转录组学分析为了解弧菌应对盐胁迫条件的响应机制,采用RNA-seq技术,对经0.5%NaCl一次胁迫和连续胁迫20代以及常规LB（3.5%NaCl）培养的副溶血弧菌（CICC 21617）菌株进行了 Illumina HiSeq 2500转录组学分析。测序结果显示,一次胁迫培养组与未胁迫培养组相比,共有1240个基因的转录出现变化,其中上调基因637个,下调基因603个;连续传代20次胁迫组与未胁迫培养组相比共有1418个基因的转录出现了变化,其中上调基因715个,下调基因703个。这些差异表达基因主要参与氨基酸代谢、能量代谢、转运结合相关、细胞进程、定向运动等生物过程。通过KEGG通路分析,一次胁迫组与未胁迫组相比差异表达基因被富集到342条信号通路上,富集基因数量较多的通路有氨基酸代谢通路、能量代谢通路、转运结合相关通路等;连续传代20次胁迫组与未胁迫组相比差异表达基因被富集到296条信号通路上,富集基因数量较多的通路,与一次胁迫相似。3水产品中致病性弧菌噬菌体的分离鉴定与靶向抑菌3.1弧菌噬菌体的分离与生物学特性随着致病性弧菌对水产品带来的食品安全隐患日益加剧,迫切需要开发非药物天然生物抑菌剂来控制水产品中致病性弧菌的繁殖。以5株弧菌参考菌株（溶藻弧菌CICC 17749、副溶血性弧菌CICC 21617、拟态弧菌CICC 21613、霍乱弧菌CICC 23794、拟态弧菌CICC10383）为宿主菌从水产品污水中分离到27株噬菌体,筛选出3株具有跨种裂解特性的烈性弧菌噬菌体,其中Vmp 03、Vpp 07可裂解6个弧菌种的部分菌株,噬菌体Vap 04能裂解4个弧菌种的部分菌株。显微观察显示Vmp 03、Vpp 07为短尾噬菌体,Vap 04为肌尾噬菌体。噬菌体Vmp 03、Vpp 07、Vap 04的最适MOI分别为0.001、0.01、0.01,潜伏期分别为 20 min、30 min、20 min,裂解期分别为 50 min、50 min、60 min,裂解量分别为 60 PFU/cell、15.8 PFU/cell、7.9 PFU/cell;1 h 内能耐受的温度分别为 70℃、60℃、70℃,1 h 内能耐受的pH范围分别为4.0～10.0、6.0～10.0、4.0～12.0。上述裂解特性显示这3株噬菌体具有潜在的应用前景。3.2弧菌噬菌体Vmp 03的全基因组分析噬菌体Vmp 03和Vpp 07的全基因组测序结果显示,噬菌体Vmp 03基因组全长为43,479 bp,其中编码基因总长度为38403 bp,平均长度为936.66 bp,占总长的88.33%,GC含量为49.27%,有65个开放阅读框（ORFs）。噬菌体Vpp 07基因组全长为144768 bp,其中编码基因总长度为32592 bp,平均长度为931.2 bp,占总长的22.51%,GC含量为41.88%,有35个开放阅读框（ORFs）。噬菌体Vmp 03基因组编码40个预测的开放阅读框（ORFs）,其中17个（42.5%）具有已知功能,包括7个结构蛋白（即支架蛋白,主要衣壳蛋白,门静脉蛋白,尾管蛋白A和B,内部核心蛋白和尾纤维蛋白）,6种与DNA代谢相关的蛋白质（引发酶,DNA解旋酶,DNA指导的DNA聚合酶,核酸外切酶,核酸内切酶,DNA指导的RNA聚合酶）和4种成熟蛋白。3.3弧菌噬菌体的靶向抑菌应用LBS培养基和鱼汁模型,研究噬菌体Vmp 03、Vpp 07、Vap 04对3个敏感菌株（拟态弧菌CICC 21613、副溶血性弧菌CICC 21617和溶藻弧菌J 1-4）的抑菌活性。结果显示无论在LBS培养基还是在鱼汁模型中,噬菌体Vmp 03、Vpp 07、Vap 04均能有效抑制敏感菌株的生长,与对照组相比最高可以抑制3 log值CFU/mL的受试弧菌生长。生物被膜形成抑制实验表明噬菌体Vmp 03、Vpp 07、Vap 04能显着抑制敏感菌株生物被膜的形成。
许向军[6]（2018）在《临安水产品中副溶血性弧菌污染情况监测分析》文中指出副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种重要的食源性致病菌,误食了受副溶血弧菌污染食物,可能会引起肠痉挛、腹泻、呕吐等症状,重症患者还会脱水、休克昏迷,甚至死亡。据报道副溶血性弧菌食物中毒主要与鱼虾贝类等水、海产品有关;副溶血性弧菌会以它们为载体对误食了被副溶血性弧菌污染食品的公共大众带来健康及安全的危害,为保证消费者人身健康和安全,本文对临安市场销售的各类水产品副溶血性弧菌的污染情况进行调查。为消费者提供合理的膳食意见,预防和控制食源性疾病的同时,也为监管部门制定对策提供依据。（1）本文从鱼、虾、蟹、贝、头足类等五类水产品,共205份样品中,分离出19株副溶血性弧菌,检出率为9.3%。从鱼类中检出9株,贝类中检出6株,虾类和头足类各检出2株,蟹中未检出。从各农贸市场、超市、酒店、饭馆、集体食堂等采集的鱼类、虾类、贝类、头族类、蟹类等五类水产品样品除蟹类外均有受到副溶血性弧菌污染,存在引起食物中毒的风险。（2）分别对19株食品分离菌株进行毒力基因和血清分型。19株水产品中分离的副溶血性弧菌tdh基因携带率为21.05%（4/19）,trh携带率为5.26%（1/19）。经过血清学鉴定后,分属于8种不同的O抗原群和K抗原群,主要集中在O1、O5、O11和K6、K60、K36中,共有12总O:K血清型组合,以O1:K36（3/19）和O11:K6（3/19）位主。（3）本文从水产品中分离出的19株副溶血性弧菌对氨苄西林耐药性极高,耐药率达到100%,对阿米卡星有少量菌株耐药,对环丙沙星、诺氟沙星、头孢噻肟等3种抗生素完全敏感;多重耐药现象不突出,仅有2株菌株耐2种以上抗生素。（4）19株分离所得菌株的DNA片段得到良好分离,菌株的DNA可分为1525个条带,获得了16种不同的带型,相似度在56.5%100%之间。其中SP07、SP08和SP10、SP11、SP12完全相同。其他目标菌株的DNA条带差异较大。
刘杰[7]（2016）在《广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌毒力基因检测及tlh基因的克隆与表达》文中提出副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus, VP）是我国沿海水产养殖的重要病原菌之一,广泛存在于海水和海产品中,因致病性副溶血弧菌暴发性增殖引发的水生动物疾病每年都会给水产养殖业带来巨大的经济损失。在我国,由副溶血弧菌污染引起的微生物食源性疾病居首位,广西位于我国南部地区,海产品消费量大,人们喜欢食用生的或者半生熟的海产品,因此副溶血弧菌是引起广西地区食物中毒最主要的病原菌。耐热直接溶血毒素（Thermostable direct hemolyticus,TDH）、相对耐热直接溶血素（TDH-related hemolysin,TRH）和不耐热溶血素（Themolabile hemolysion,TLH）是副溶血弧菌的主要毒力因子,能产生多种溶血素,分别由tdh、trh和tlh基因编码。本研究分别从广西沿海的钦州、北海和防城港3市采集160份凡纳滨对虾病样,进行副溶血弧菌的分离、鉴定以及药物敏感性试验,用PCR方法对tdh, trh和tlh毒力基因进行检测,并成功表达了tlh毒力基因,为蛋白纯化、抗体制备及蛋白性质研究等领域打下基础,也为副溶血弧菌感染的监控和防治提供技术支撑。获得的主要结果有：1.通过常规方法进行细菌分离,运用API细菌鉴定系统和16SrRNA基因序列分析对细菌进行生化鉴定和分子鉴定。从160份样本中共检出副溶血弧菌67株,检出率为41.88%；利用Blast分析了67株分离菌株的16S rRNA基因序列,与GenBank中已经登录副溶血弧菌相应序列的同源性进行比对,结果显示,67株分离菌株之间高度同源,相似性99.2%～100%,67株分离菌株与副溶血弧菌标准菌株ATCC 17802 （NR 114632.1）的亲缘关系最近,相似性98.8%～100%。药物敏感性试验结果表明,67株副溶血弧菌对复达欣、菌必治、复方新诺明、舒普深、氟哌酸、恩诺沙星、环丙沙星、左氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、特治星和氟苯尼考12种药物的敏感率在80%以上,青霉素G、氨苄青霉素、磺胺二甲嘧啶、盐酸沙拉沙星和磺胺-6-甲氧嘧啶5种抗生素对67株副溶血弧菌的抑菌能力非常弱,表现出很强的耐药性。2.应用PCR方法对67株副溶血弧菌进行tdh、trh和tlh毒力基因检测,检测结果,67株副溶血弧菌的tdh和trh毒力基因均为阴性,tlh毒力基因均为阳性。3.将扩增得到的tlh基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pET-28a上,构建重组表达载体pET-28a然后转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳证明tlh外源基因发生了融合表达,表达产物与推测的理论产物大小61KDa相符。经Western blotting鉴定TLH融合蛋白能与Anti-6×His tag抗体发生特异反应,说明TLH溶血毒素在大肠杆菌原核表达系统中准确表达。
李灿[8]（2016）在《基于群体感应分析腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制》文中认为副溶血弧菌是引起海产品源食物中毒的最主要致病菌,其常与水产品中的优势腐败菌——腐败希瓦氏菌共存于近岸海水和海产品中。在与腐败希瓦氏菌共培养体系中,副溶血弧菌的溶血活性、耐热直接溶血毒素基因（tdh）、生物被膜等毒力因子表达量显着增加,致病力也显着增强,但其相互作用机制尚不清楚。由于群体感应在细菌毒力因子表达与细菌菌群相互作用中有重要调控作用,本研究从群体感应角度研究腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制。1.以副溶血弧菌ATCC33847为亲本株,利用同源重组技术分别构建副溶血弧菌群体感应信号分子合成酶基因luxM、luxS敲除突变株VPΔLuxM、VPΔLux S,通过氯霉素抗性、菌落PCR和DNA测序对基因敲除突变株进行验证;比较VPΔLuxM、VPΔLuxS与亲本株的生长表型、溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成能力等生物学特性差异。结果显示,副溶血弧菌群体感应信号分子合成酶基因luxM、luxS敲除突变株VPΔLuxM、VPΔLuxS构建成功;VPΔLux M的生长较亲本株弱,其溶血活性、tdh基因表达量、生物被膜形成量较亲本株显着增加（p<0.05）,VPΔLux S的溶血活性、tdh基因表达量较亲本株显着降低（p<0.05）,生物被膜形成量较亲本株显着增加（p<0.05）。研究表明,副溶血弧菌的群体感应信号分子合成酶基因luxM对其溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成有调控抑制作用,对其生长有正向调控作用;副溶血弧菌的群体感应信号分子合成酶基因luxS对其溶血活性、tdh基因表达有正向调控作用,对生物被膜形成有调控抑制作用。2.分别建立腐败希瓦氏菌菌体、腐败希瓦氏菌上清提取物与副溶血弧菌亲本株、突变株VPΔLuxM、VPΔLux S的共培养体系,对比腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌亲本株、突变株的溶血活性、tdh基因表达、生物被膜等毒力因子作用效应,从群体感应角度研究腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制。相对溶血活性结果显示,腐败希瓦氏菌上清提取物对ATCC33847、VP△LuxM、VP△LuxS的溶血活性均有显着增强作用（p<0.05）,分别增加了1.51倍、1.24倍、2.46倍。VP△Lux S在腐败希瓦氏菌菌体、腐败希瓦氏菌上清提取物共培养体系中的溶血活性规律与ATCC33847相同。实时荧光定量PCR法检测各体系下ATCC33847、VP△LuxM、VP△Lux S的tdh基因表达量可知,腐败希瓦氏菌菌体对ATCC33847、VP△LuxM、VP△Lux S的tdh表达均有显着增强作用（p<0.05）,分别增加了2.46、7.66、1.51倍,腐败希瓦氏菌上清提取物对ATCC33847、VP△Lux M、VP△Lux S的tdh表达量分别增加了1.60、17.68、1.14倍。vp△luxm在腐败希瓦氏菌菌体、腐败希瓦氏菌上清提取物共培养体系中的溶血活性规律与atcc33847相同。结晶紫法检测各体系中的生物被膜可知,腐败希瓦氏菌上清提取物对atcc33847、vp△luxm、vp△luxs生物被膜形成能力均有显着减弱作用（p<0.05）,分别降至原来的0.84、0.53、0.75;腐败希瓦氏菌上清提取物、腐败希瓦氏菌菌体的加入对vp△luxm生物被膜的影响效应与atcc33847相同;荧光原位杂交及显微镜观察生物被膜结构可知,vp△luxm、vp△luxs的生物被膜较atcc33847致密、团聚成蘑菇状,腐败希瓦氏菌上清提取物的加入使atcc33847、vp△luxm、vp△luxs被膜结构更厚实、聚成团状,腐败希瓦氏菌菌体的加入使atcc33847、vpΔluxs、vpΔluxm的生物被膜结构变得松散。结果表明,腐败希瓦氏菌可能通过其产生的ahls信号分子竞争性结合至副溶血弧菌luxm群体感应系统或者通过某种代谢产物降解副溶血弧菌ahls信号分子影响副溶血弧菌的溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成;或者腐败希瓦氏菌通过其产生的ai-2信号分子结合至副溶血弧菌luxs群体感应系统影响其溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成。3.对腐败希瓦氏菌与atcc33847、vp△luxm、vp△luxs共培养体系中的ahls信号分子、ai-2信号分子、溶血活性、生物被膜进行动态测定,研究腐败希瓦氏菌-信号分子-副溶血弧菌毒力因子的级联作用,建立lc-ms/ms法检测ahls信号分子,对atcc33847与腐败希瓦氏菌的ahls信号分子谱（种类、含量）进行对比研究。溶血活性体系研究结果显示,ahls信号分子随细菌生长代谢逐渐累积,ai-2信号分子量在细菌生长期至稳定期随菌体量增加逐渐增加,30h以后降解、总量减少;腐败希瓦氏菌与vp△luxs共培养体系的溶血活性随其ai-2信号分子量变化,与其ahls信号分子量无明显相关性。生物被膜体系研究结果显示,ai-2信号分子量随生物被膜被膜增加/衰弱呈现相应的增、减,腐败希瓦氏菌与vp△luxs共培养体系的生物被膜随其ai-2信号分子量变化,与其ahls信号分子量无明显相关性。腐败希瓦氏菌产生c6-hsl（23.47μg/l）、c12-hsl（3.49μg/l）、3-oxo-c12-hsl（0.37μg/l）信号分子;atcc33847产生c4-hsl（11.79μg/l）、3-oxo-c6-hsl（0.46μg/l）、3-oxo-c14-hsl（0.62μg/l）信号分子。结果表明,腐败希瓦氏菌通过其产生的某种代谢产物降解副溶血弧菌ahls信号分子影响副溶血弧菌的溶血活性、tdh表达、生物被膜形成,或者通过其产生的ai-2信号分子结合至副溶血弧菌luxs群体感应系统影响其溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成。综上,本研究从群体感应角度研究了腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制,证实了群体感应在副溶血弧菌溶血活性、tdh基因表达及生物被膜等毒力因子表达中具有重要调控作用,为副溶血弧菌毒力因子与致病力控制提供理论支持与指导;证实了腐败希瓦氏菌通过其产生的某种代谢产物降解副溶血弧菌AHLs信号分子影响其毒力因子表达,或者通过其产生的AI-2信号分子结合至副溶血弧菌Lux S群体感应系统影响其毒力因子表达,可作为菌群间相互作用效应研究及其机制研究的理论支撑;本研究建立的LC-MS/MS法检测AHLs信号分子以及构建的副溶血弧菌群体感应信号分子合成酶基因luxM、luxS敲除突变株VPΔLuxM、VPΔLux S将为副溶血弧菌群体感应系统的后续研究及其它群体感应系统相关研究奠定基础。
侯书宁[9]（2016）在《副溶血弧菌调控蛋白CalR功能的初步研究》文中提出背景:副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）是一种广泛分布于浅海海水,入海港湾,海洋生物及盐渍加工食品中,能引起人类感染患病的革兰氏阴性嗜盐弧菌。人们若误食了生的或未被彻底煮熟的海产品,可能会被感染。副溶血弧菌主要能够引起三种临床综合症:肠胃炎、伤口感染和败血症。其中最常见是肠胃炎,症状包括腹泻、腹痛、反胃呕吐、头痛和低热。副溶血弧菌分泌多种毒力因子,主要包括耐热直接溶血毒素（Thermostable direct hemolysin,TDH）,TDH相关溶血毒素（TDH-related hemolysin,TRH）,III型分泌系统（The type III secretion systems,T3SS）,VI型分泌系统（The type VI secretion systems,T6SS）及荚膜多糖等。其中TDH可在我妻血琼脂平板上表现为神奈川现象阳性。目前在我国沿海地区,由副溶血弧菌感染引起的食源性疾病占这些地区食源性中毒病例的比例越来越高,所以有必要对其致病机理进行深入探讨。Leu O是Lys R家族的转录调控因子,广泛存在于肠道致病菌中。首先被发现于沙门氏菌（Salmonella）中,且因其能激活亮氨酸合成基因座位leu ABCD的转录而得名。在随后的研究表明,Leu O具有解除静默子H-NS对基因的转录抑制作用,并参与调控多种基因,因此被认为是重要的核心调控子。副溶血弧菌的cal R基因位于菌株基因组I上,该基因长960 bp,G+C含量47.29%,编码分子量为36192.8,由319氨基酸残基组成的蛋白。Cal R是Leu O的同源蛋白,其自身的转录和表达受盐度和Ca2+浓度的双重调节。目前只知它具有抑制T3SS1毒力基因的表达和细菌群集性爬动能力（Swarming）,但对其分子机制还一无所知。目的:本文目的在于通过构建副溶血弧菌cal R基因的突变株、回补株和CalR蛋白表达株,进而对Cal R功能进行初步研究。方法:本研究首先利用自杀载体p DS132同源重组的方法构建副溶血弧菌RIMD2210633菌株的cal R无痕突变株（Δcal R）,并在突变株的基础上构建了回补株（Δcal R/cal R::p BAD33,简称C-Δcal R）和携带有相关靶基因的Lac Z菌株。通过测定并比较vop N基因（编码T3SS1外膜蛋白）在WT/p BAD33、Δcal R/p BAD33和C-Δcal R中β-半乳糖苷酶活性的差异,来判定Cal R对vop N的调控关系,明确Δcal R是否为非极性突变株;其次,比较WT和cal R突变株在对应激条件下的适应性、菌落透明度、运动能力、生物膜的形成和细胞毒力等一系列的表型实验结果,其中应激环境选择了温度,盐度和酸度三个不同的条件;利用构建好的靶基因Lac Z菌株进行β-半乳糖苷酶活性检测,判断调控因子Cal R与靶基因之间的调控关系;最后用重组克隆方法诱导表达蛋白,镍柱纯化后可得到纯度高的Cal Rhis6蛋白,从而对其DNA活性分析和Cal Rhis6蛋白与靶基因启动子区的结合活性检测奠定基础。结果:Cal R负调控vop N的转录,且回补株的回补效果良好,表明本研究成功构建了副溶血弧菌cal R基因的无痕突变株和回补株。表型实验中:在对温度（4℃）应激条件下的适应性上,一定时间段内（第二天）,WT的适应能力明显高于Δcal R;Δcal R生物膜的形成能力高于WT;菌落透明度上,与WT相比,Δcal R更加透明;在运动能力上,Δcal R的爬动能力小于WT,而泳动能力与WT比较无显着性差异;Δcal R的细胞毒力和溶血活性都大于WT;Lac Z报告基因融合实验结果显示:cal R能激活cps A转录活性,对exs A,exs B,vop N,syp G,tdh A的转录具有抑制作用,而对syp A转录无调控作用。Cal Rhis6蛋白成功诱导表达并被纯化。结论:副溶血弧菌中的Cal R对应激环境中细菌的适应性、生物膜的形成、动力,透明度、细胞毒和溶血活性等都有一定的调节作用,具有抑制T3SS1和Vp-PAI的转录活性。
张永辉[10]（2014）在《基于绿色荧光蛋白的抗TLH的小分子抗体的研究》文中研究指明副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种棒状的存在于海水中的革兰氏阴性菌,是一种极容易污染海产品的病原微生物。其编码的不耐热溶血毒素TLH是一种广泛存在于其体内的毒素蛋白,可作为检测副溶血弧菌的靶标。绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）是一个由11个β折叠通过loop环连接形成的一个桶装结构的蛋白质,在其loop结构上可以进行外源基因的插入形成新的重组蛋白。本研究是利用已获得的一个抗TLH的单链抗体的不同作用区的片段基因插入到GFP的loop 5中,并通过体外进化的方法对HCDR3进行突变得到了更高亲和力的针对TLH的抗体。本研究的主要内容包括三个方面:首先是把不同的抗体片段基因（LCDR3,HCDR3,VL VH和scFv）插入到GFP的loop 5位置中,检测不同片段的插入所形成的5种重组抗体对抗原TLH的识别作用。结果发现在loop 5位置引入LCDR3和HCDR3后,重组抗体蛋白仍然保持绿色荧光特性同时对TLH有特异性结合作用,而VL,VH和scFv的插入后形成的重组抗体蛋白则既无荧光特性也对TLH没有明显的识别作用。其次是对HCDR3进行突变以得到更高亲和力的重组抗体。先是通过Ala-scanning的方法对HCDR3的11个氨基酸进行丙氨酸突变,检测丙氨酸突变体的抗原结合活性。ELISA结果表明,HCDR3的L/A,D1/A,Y1/A,W/A,Y2/A,F/A,和D2/A氨基酸突变后抗体的亲和力明显下降。同时我们通过对这些关键氨基酸进行赖氨酸突变,发现了第4个氨基酸突变为赖氨酸之后,突变体的亲和力作用明显增加。从而得到了一个具有更高亲和力的突变体。最后是通过对loop 5和loop 9两个loop同时引入CDR3,构建四种组合形式的CDR3双插入情况,结果发现双插入的重组抗体蛋白活性明显高于单插入CDR3的重组蛋白,同时确定双插入5LCDR3和9LCDR3的亲和力是最高的。根据本实验室已研究的LCDR3的最佳突变体情况,同时对loop 5和loop 9位置上的LCDR3进行双突变,得到了一个较高亲和力的重组抗体。本研究通过GFP蛋白作为骨架,融合抗体的不同片段基因,发现在GFP的loop结构中引入CDR后重组抗体仍然具有针对相应抗原的特异性识别作用,并且通过对其HCDR3进行突变,得到了较原来更好的重组抗体。通过双插入的研究获得了具有更高亲和力的抗体。本研究提供了一种提高抗体的亲和力的新思路,同时利用GFP骨架解决了基因工程抗体原核表达的难溶性问题。
二、副溶血弧菌不耐热溶血毒素的表达与纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、副溶血弧菌不耐热溶血毒素的表达与纯化（论文提纲范文）
（1）广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌3种毒力基因检测及tlh基因的蛋白表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 tdh、trh和tlh3种毒力基因检测 |
| 1.2.2 tlh基因的生物信息学分析 |
| 1.2.3 tlh基因原核表达载体构建 |
| 1.2.4 原核表达载体的诱导表达 |
| 1.2.5 原核表达产物SDS-PAGE和Western blotting鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 tdh、trh和tlh 3种毒力基因检测 |
| 2.2 tlh基因生物信息学分析 |
| 2.3 tlh基因的蛋白表达及鉴定 |
| 3 讨论 |
（2）副溶血弧菌VPA0041和VPA1701蛋白调控运动性的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 副溶血弧菌的主要毒力因子及其致病机制 |
| 1 副溶血弧菌 |
| 2 副溶血弧菌主要的毒力因子及致病机制 |
| 2.1 溶血素 |
| 2.2 Ⅲ型分泌系统(T3SSs) |
| 2.3 Ⅵ型分泌系统(T6SSs) |
| 2.4 摄铁系统 |
| 2.5 运动性 |
| 2.6 外膜蛋白 |
| 3 转录调控因子 |
| 3.1 LysR家族(LysR-type of transcriptional regulators,LTTRs) |
| 3.2 GntR家族(GntR-type of transcriptional regulators) |
| 3.3 TetR家族(TetR-type of transcriptional regulators) |
| 3.4 MarR家族(MarR-type of transcriptional regulators) |
| 3.5 LuxR家族(LuxR-type of transcriptional regulators) |
| 4 结语 |
| 第一章 副溶血弧菌毒力相关基因缺失株的构建及毒力筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 副溶血弧菌基因缺失株的构建 |
| 2.2 幼兔灌胃感染实验 |
| 2.3 回补菌株的构建 |
| 2.4 生长曲线的测定 |
| 2.5 T3SSs相关基因转录水平的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 毒力相关基因缺失株的鉴定 |
| 3.2 △VPA1365在幼兔中的肠道定殖能力下降 |
| 3.3回补菌株VPA1365~+的鉴定 |
| 3.4 生长曲线的测定 |
| 3.5 VPA1365基因调控T3SSs相关基因的表达 |
| 4 讨论 |
| 第二章 VPA0041蛋白调控副溶血弧菌运动性的分子机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 运动性实验 |
| 2.2 VPA0041回补菌株的构建 |
| 2.3 生长曲线的测定 |
| 2.4 透射电镜实验(TEM) |
| 2.5 RNA的提取和总RNA的逆转录 |
| 2.6 Real-Time PCR实验 |
| 2.7 RNA-seq实验 |
| 2.8 蛋白表达菌株的构建 |
| 2.9 蛋白纯化与鉴定 |
| 2.10 凝胶迁移阻滞实验(EMSA) |
| 3 结果 |
| 3.1 △VPA041的泳动能力下降 |
| 3.2 △VPA0041与WT的生长趋势无显着性差异 |
| 3.3 VPA0041蛋白调控侧生鞭毛基因的表达 |
| 3.4 VPA0041蛋白在副溶血弧菌中的全局性调控 |
| 3.5 VPA0041蛋白的纯化与鉴定 |
| 3.6 VPA0041蛋白直接调控副溶血弧菌的侧生鞭毛系统 |
| 4 讨论 |
| 第三章 VPA1701蛋白调控副溶血弧菌运动性的分子机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 运动性实验 |
| 2.2 VPA1701回补菌株的构建 |
| 2.3 生长曲线的测定 |
| 2.4 透射电镜实验(TEM) |
| 2.5 RNA的提取和总RNA的逆转录 |
| 2.6 Real-Time PCR实验 |
| 2.7 RNA-seq实验 |
| 2.8 蛋白表达菌株的构建 |
| 2.9 蛋白纯化与鉴定 |
| 2.10 凝胶迁移阻滞实验(EMSA) |
| 3 结果 |
| 3.1 △VPA1701的泳动能力下降 |
| 3.2 △VPA1701与WT的生长趋势无显着性差异 |
| 3.3 VPA1701蛋白调控侧生鞭毛基因的表达 |
| 3.4 VPA1701蛋白在副溶血弧菌中的全局性调控 |
| 3.5 VPA1701蛋白直接调控副溶血弧菌的侧生鞭毛系统 |
| 3.6 钙离子能够恢复△VPA1701的泳动性 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（3）副溶血性弧菌在六种食品中致病力的差异及与肠道菌群的关联性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 副溶血性弧菌概述 |
| 1.1.1 副溶血性弧菌的生物学特征 |
| 1.1.2 副溶血性弧菌在不同食品中的分布 |
| 1.1.3 副溶血性弧菌的危害 |
| 1.1.4 副溶血性弧菌的致病因子 |
| 1.1.5 副溶血性弧菌的毒力表征 |
| 1.2 肠道菌群概述 |
| 1.2.1 肠道菌群的构成 |
| 1.2.2 肠道菌群的功能 |
| 1.2.3 肠道菌群与疾病 |
| 1.2.4 肠道菌群与致病菌 |
| 1.2.5 肠道菌群的研究方法 |
| 1.2.6 肠道菌群的检测方法 |
| 1.3 立题背景及意义 |
| 1.4 研究内容、创新点及技术路线 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 创新点 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 2 副溶血性弧菌在六种食品中生长和产毒的差异 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 菌株及原料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 副溶血性弧菌的活化 |
| 2.2.2 食品基质无菌样品的制备及接菌 |
| 2.2.3 副溶血性弧菌在六种食品中菌量的测定 |
| 2.2.4 副溶血性弧菌在六种食品中产生溶血毒素的测定 |
| 2.2.5 溶血毒素基因相对表达量的测定 |
| 2.2.6 副溶血性弧菌在六种食品中溶血毒素生成的规律 |
| 2.2.7 模型评价分析 |
| 2.2.8 副溶血性弧菌在六种食品中胞外酶组成及活性的分析 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 副溶血性弧菌在六种食品中生长特性 |
| 2.3.2 副溶血性弧菌在六种食品中初级生长模型 |
| 2.3.3 副溶血性弧菌在六种食品中溶血活性 |
| 2.3.4 副溶血性弧菌在六种食品中溶血毒素基因表达量 |
| 2.3.5 副溶血性弧菌在六种食品中溶血活性规律 |
| 2.3.6 副溶血性弧菌在六种食品中胞外酶的活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 副溶血弧菌在六种食品中的培养物对小鼠的致病力差异 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 菌株及原料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 副溶血性弧菌的活化 |
| 3.2.2 食品基质的接菌及待测样的制备 |
| 3.2.3动物实验 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 副溶血性弧菌的六种食品培养物攻毒小鼠的临床症状 |
| 3.3.2 副溶血性弧菌的六种食品培养物攻毒小鼠的死亡率 |
| 3.3.3 副溶血性弧菌的六种食品培养物对小鼠血常规指标的影响 |
| 3.3.4 副溶血性弧菌的六种食品培养物对小鼠肝肾功能的影响 |
| 3.3.5 灌胃六种食品培养的副溶血弧菌对小鼠脏器系数的影响 |
| 3.3.6 灌胃六种食品培养的副溶血弧菌后小鼠血清指标的变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 构建伪无菌小鼠模型探究肠道菌群与副溶血弧菌致病的相关性 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器与设备 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 伪无菌小鼠模型的构建 |
| 4.2.2 伪无菌小鼠模型的评估 |
| 4.2.3 副溶血性弧菌的活化 |
| 4.2.4 副溶血性弧菌菌悬液的制备 |
| 4.2.5 伪无菌小鼠和普通小鼠的攻毒 |
| 4.2.6 血清炎性及抑炎因子含量的ELISA法检测 |
| 4.2.7 血清肝肾功能指标的检测 |
| 4.2.8 回肠形态观察 |
| 4.2.9 统计学处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 伪无菌小鼠和正常小鼠的肠道菌群计数结果 |
| 4.3.2 伪无菌小鼠和正常小鼠的血常规及血清检测结果 |
| 4.3.3 副溶血性弧菌对伪无菌小鼠和正常小鼠肠道形态的影响 |
| 4.3.4 副溶血性弧菌对伪无菌小鼠和普通小鼠炎性及抑炎因子的影响 |
| 4.3.5 副溶血性弧菌对伪无菌小鼠和普通小鼠肝肾功能的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 基于肠道菌群解析六种食品中副溶血性弧菌的致病力差异 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 菌株及原料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 副溶血性弧菌的活化 |
| 5.2.2 食品基质的接菌及待测样的制备 |
| 5.2.3 实验小鼠的攻毒 |
| 5.2.4 肠道内容物的收集 |
| 5.2.5 小鼠肠道菌群总DNA的提取及纯化 |
| 5.2.6 小鼠肠道菌群总DNA的质量检测 |
| 5.2.7 小鼠肠内容物DNA的16S r DNA扩增子焦磷酸测序 |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 测序前样本质量监控 |
| 5.3.2 DNA扩增产物测序后原数据的处理 |
| 5.3.3 单个样品复杂性分析(Alpha多样性分析) |
| 5.3.4 OTU统计与比较分析 |
| 5.3.5 物种组成分析 |
| 5.3.6 多样品比较分析(Beta多样性分析) |
| 5.3.7 组间菌群差异标志物种识别 |
| 5.3.8 菌群代谢功能预测分析 |
| 5.3.9 小鼠损伤指标与肠道菌群相关性分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 研究结论 |
| 7 研究展望 |
| 8 研究创新意义 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）副溶血弧菌tlh重组表达产物溶血活性及抑制KYSE450细胞增殖的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 材料 |
| 1 实验设备 |
| 2 实验体系及试剂 |
| 方法 |
| 1 实验工程菌的诱导表达 |
| 2 分泌蛋白的浓缩及SDS-PAGE电泳 |
| 3 分泌蛋白溶血活性与卵磷脂的关系 |
| 4 诱导时间与工程菌株tlh基因表达分泌的关系 |
| 5 CCK-8 法检测分泌蛋白对食管癌细胞KYSE450 增殖的影响 |
| 结果 |
| 1 分泌蛋白的验证 |
| 2 分泌蛋白溶血功能检测 |
| 3 诱导时间对工程菌株tlh基因表达分泌的影响 |
| 4 分泌蛋白抑制食管癌细胞KYSE450 的增殖 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）水产品中弧菌污染、胁迫响应及其噬菌体靶向抑菌研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 致病性弧菌与噬菌体控制 |
| 参考文献 |
| 第一章 水产品中弧菌菌群的多样性 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 水产品中TCBS菌群高通量多样性分析 |
| 3.2 弧菌分离与鉴定 |
| 3.3 水产品中弧菌的检出率 |
| 3.4 水产品中弧菌分离株的致病性分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 胁迫生长条件下弧菌生物特性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 胁迫条件的确定 |
| 3.2 胁迫株生物特性 |
| 3.3 低盐胁迫弧菌菌株的转录组学分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 水产品中致病性弧菌噬菌体分离鉴定与靶向抑菌 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 噬菌体的分离纯化与效价测定 |
| 3.2 噬菌体生物学特性 |
| 3.3 噬菌体全基因组测定 |
| 3.4 噬菌体靶向抑菌 |
| 3.5 噬菌体对生物被膜形成的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（6）临安水产品中副溶血性弧菌污染情况监测分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 副溶血性弧菌生物特性 |
| 1.2 副溶血性弧菌全基因组测序及注释信息 |
| 1.3 副溶血性弧菌的主要毒力因子 |
| 1.3.1 溶血毒素 |
| 1.3.1.1 TDH |
| 1.3.1.2 TRH |
| 1.3.1.3 TLH |
| 1.3.2 尿素酶 |
| 1.3.3 钻附因子 |
| 1.3.4 侵袭力 |
| 1.3.5 铁获取系统 |
| 1.4 流行病学特征 |
| 1.5 副溶血性弧菌检测方法的研究进展 |
| 1.5.1 国家标准方法 |
| 1.5.2 PCR方法 |
| 1.5.3 免疫学方法 |
| 1.5.4 核酸杂交 |
| 1.5.5 环介导等温扩增技术 |
| 1.6 基因分型 |
| 1.7 副溶血性弧菌的预防方法 |
| 1.8 课题研究目的与意义 |
| 1.9 主要研究内容 |
| 第二章 临安市水产品中副溶血性弧菌的污染情况 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.1.4 样品采集 |
| 2.1.5 菌株的分离培养 |
| 2.1.6 副溶血性弧菌的分离培养 |
| 2.1.7 初步鉴定 |
| 2.1.8 定量培养 |
| 2.1.9 生化鉴定 |
| 2.1.10 统计学处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 副溶血性弧菌的分离鉴定 |
| 2.2.2 副溶血性弧菌在食品中的分布 |
| 2.2.3 食品样品中副溶血性弧菌的污染情况 |
| 2.2.4 水产品与海产品副溶血性弧菌的检出情况 |
| 2.2.5 不同季节副溶血性弧菌的检出情况 |
| 2.2.6 不同采样地点副溶血性弧菌的检出情况 |
| 2.2.7 生化实验结果 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 分离株的毒力基因和耐药情况分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.4 毒力基因检测 |
| 3.1.5 血清凝集试验 |
| 3.1.6 药敏试验 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 毒力基因检测结果 |
| 3.2.2 血清凝集试验 |
| 3.2.3 药物敏感性实验结果 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 副溶血性弧菌分离株的PFGE分型 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 仪器与试剂 |
| 4.1.3 PFGE实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 菌株的PFGE结果 |
| 4.2.2 聚类分析结果 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌毒力基因检测及tlh基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 凡纳滨对虾养殖及病原菌研究概述 |
| 1.1.1 凡纳滨对虾的养殖现状 |
| 1.1.2 弧菌研究概述 |
| 1.2 副溶血弧菌的研究进展 |
| 1.2.1 副溶血弧菌的流行情况 |
| 1.2.2 副溶血弧菌的毒力因子 |
| 1.3 选题的研究意义与目的 |
| 第二章 凡纳滨对虾源副溶血弧菌的分离鉴定及药敏试验 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 病样来源 |
| 2.1.2 健康小白鼠来源 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌的分离 |
| 2.2.2 细菌的鉴定 |
| 2.2.3 嗜盐性试验 |
| 2.2.4 神奈川试验 |
| 2.2.5 细菌的药物敏感性试验 |
| 2.2.6 菌株对小鼠的致病性试验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 凡纳滨对虾源弧菌的分离 |
| 2.3.2 凡纳滨对虾源副溶血弧菌的API生化鉴定 |
| 2.3.3 凡纳滨对虾源副溶血弧菌的分子鉴定 |
| 2.3.4 67株副溶血弧菌的分布情况 |
| 2.3.5 嗜盐性试验以及神奈川试验 |
| 2.3.6 药物敏感性 |
| 2.3.7 菌株对小鼠的致病性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 关于副溶血弧菌的鉴定 |
| 2.4.2 关于副溶血弧菌的16S rRNA基因和遗传变异 |
| 2.4.3 关于副溶血弧菌的耐药特性 |
| 2.4.4 关于副溶血弧菌的致病性与检出率 |
| 第三章 凡纳滨对虾源副溶血弧菌tdh、trh和tlh 3种毒力基因的检测 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 试验菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细菌基因组DNA的抽提 |
| 3.2.2 PCR检测 |
| 3.2.3 PCR产物的凝胶电泳、回收纯化与测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 tdh基因的检测结果 |
| 3.3.2 trh基因的检测结果 |
| 3.3.3 tlh基因的检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 副溶血弧菌tlh毒力基因的克隆与表达 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 试验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 副溶血弧菌tlh基因的克隆 |
| 4.2.2 tlh表达载体的构建及鉴定 |
| 4.2.3 tlh基因表达产物SDS-PAGE电泳和Western bloting鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 tlh基因的克隆 |
| 4.3.2 tlh基因原核表达载体的构建和鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）基于群体感应分析腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 副溶血弧菌概况 |
| 1.1.1 副溶血弧菌生物学特性 |
| 1.1.2 副溶血弧菌的危害及其主要危害因子 |
| 1.2 细菌间的相互作用 |
| 1.2.1 细菌菌群间的相互作用现象 |
| 1.2.2 细菌菌群间相互作用的研究进展 |
| 1.3 细菌的群体感应现象 |
| 1.3.1 群体感应概况 |
| 1.3.2 群体感应信号分子及其检测方法 |
| 1.3.3 群体感应对细菌毒力因子的影响 |
| 1.3.4 基因敲除技术在群体感应研究中的应用 |
| 1.4 本研究的目的意义、研究内容与创新点 |
| 1.4.1 研究目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 创新点 |
| 2 副溶血弧菌群体感应信号分子合成酶基因luxM、luxS敲除突变株的构建及其生物学特性研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 菌株、质粒及引物 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 副溶血弧菌luxM、luxS基因敲除打靶载体的构建 |
| 2.2.2 接合实验 |
| 2.2.3 大肠杆菌E.coli DH5αλπ、E.coli β2155感受态细胞的制备 |
| 2.2.4 大肠杆菌E.coli DH5αλπ、E.coli β2155感受态细胞的电转化 |
| 2.2.5 副溶血弧菌luxM、luxS基因敲除菌株的筛选 |
| 2.2.6 副溶血弧菌亲本株及其luxM、luxS基因敲除菌株的生物学特性比较 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 副溶血弧菌luxM、luxS基因敲除打靶载体的构建 |
| 2.3.2 副溶血弧菌luxM、luxS基因敲除菌株的筛选 |
| 2.3.3 副溶血弧菌亲本株及其luxM、luxS基因敲除菌株的生物学特性比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 3 腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌亲本株及其群体感应信号分子合成酶基因缺失株毒力因子的作用效应比较 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 腐败希瓦氏菌上清提取物的制备 |
| 3.2.2 溶血效应共培养体系的建立 |
| 3.2.3 腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌生长的影响 |
| 3.2.4 溶血实验 |
| 3.2.5 耐热直接溶血毒素基因tdh表达量 |
| 3.2.6 生物被膜共培养体系的建立 |
| 3.2.7 结晶紫法检测生物被膜 |
| 3.2.8 荧光原位杂交法检测生物被膜 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌生长的影响 |
| 3.3.2 溶血实验 |
| 3.3.3 耐热直接溶血毒素基因tdh表达量 |
| 3.3.4 结晶紫法检测生物被膜 |
| 3.3.5 荧光原位杂交法检测生物被膜 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 4 群体感应信号分子与腐败希瓦氏菌-副溶血弧菌作用效应的关联性 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 溶血活性与信号分子的级联作用 |
| 4.2.2 生物被膜与信号分子的级联作用 |
| 4.2.3 LC-MS/MS法检测群体感应信号分子AHLs |
| 4.2.4 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 溶血活性与信号分子的级联作用 |
| 4.3.2 生物被膜与信号分子的级联作用 |
| 4.3.3 LC-MS/MS检测群体感应信号分子AHLs |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（9）副溶血弧菌调控蛋白CalR功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 副溶血弧菌的生物学特性 |
| 1.1.1 形态染色 |
| 1.1.2 培养特性 |
| 1.1.3 生化反应 |
| 1.2 副溶血弧菌毒力研究概述 |
| 1.2.1 耐热直接溶血素（TDH）和相关溶血素（TRH） |
| 1.2.2 III型分泌系统 |
| 1.2.3 VI型分泌系统 |
| 1.2.4 多种酶类 |
| 1.2.5 粘附因子 |
| 1.2.6 不耐热的溶血素 |
| 1.3 弧菌生物膜形成 |
| 1.3.1 鞭毛 |
| 1.3.2 IV型菌毛（type IV pilus） |
| 1.3.3 多糖 |
| 1.4 细菌密度感应系统（Quorum sensing，QS） |
| 1.5 转录调控蛋白Cal R的研究进展 |
| 1.6 本文研究目的和路线 |
| 第二章 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 本文引物汇总 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 cal R基因的敲除 |
| 2.2.2 cal R回补株的构建 |
| 2.2.3 表型实验 |
| 2.2.4 Lac Z报告基因融合实验 |
| 2.2.5 重组蛋白Cal R（Cal Rhis6）的克隆表达 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 cal R突变株和回补株的构建与验证 |
| 3.1.1 cal R突变株的构建 |
| 3.1.2 回补株构建 |
| 3.1.3 非极性突变株的验证 |
| 3.2 表型实验和相关基因Lac Z实验 |
| 3.2.1 菌株对应激条件的适应性 |
| 3.2.2 菌落透明度 |
| 3.2.3 菌株动力实验（Swimming和Swarming） |
| 3.2.4 菌株生物膜形成实验 |
| 3.2.5 Cal R对菌株溶血活性调控 |
| 3.2.6 Cal R对菌株细胞毒调控 |
| 3.3 Cal Rhis6蛋白的表达 |
| 3.3.1 目的基因片段的扩增 |
| 3.3.2 Cal Rhis6蛋白表达载体重组克隆的鉴定 |
| 3.3.3 Cal Rhis6蛋白预表达与纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 cal R突变株和回补株的构建 |
| 3.4.2 Cal R对菌株表型的调控 |
| 第四章 主要结论及展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 下一步的研究方向 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
（10）基于绿色荧光蛋白的抗TLH的小分子抗体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1. 绿色荧光蛋白的研究 |
| 1.1 GFP的发现 |
| 1.2 GFP的发光机制 |
| 1.3 GFP的结构 |
| 1.4 GFP的突变及其他荧光蛋白 |
| 1.5 GFP的应用 |
| 2. 副溶血弧菌的研究 |
| 2.1 副溶血弧菌的概况 |
| 2.2 副溶血弧菌产生的毒素 |
| 2.3 副溶血弧菌的检测 |
| 3. 抗体的研究 |
| 3.1 抗体的概况 |
| 3.2 基因工程抗体 |
| 4. 本文的研究思路和内容 |
| 4.1 抗体片段在loop 5的插入研究 |
| 4.2 对HCDR3进行突变筛选高亲和力抗体 |
| 4.3 双插入CDR3的研究 |
| 第二章 抗体片段在GFP的loop 5的插入研究 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株与质粒 |
| 2.1.2 常用缓冲液 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 试剂与耗材 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 不耐热溶血毒素TLH的表达与纯化 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 质粒提取 |
| 2.2.4 PCR扩增与回收 |
| 2.2.5 基因和载体的酶切与连接 |
| 2.2.6 转化 |
| 2.2.7 重组载体的鉴定 |
| 2.2.8 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.9 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.10 TLH和重组蛋白的浓度测定 |
| 2.2.11 ELISA检测重组蛋白的活性 |
| 2.3 结果及分析 |
| 2.3.1 TLH的表达与纯化 |
| 2.3.2 载体的构建 |
| 2.3.3 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.4 重组蛋白的活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 抗原TLH的纯化 |
| 2.4.2 重组载体的构建 |
| 2.4.3 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.4.4 重组蛋白的活性 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 HCDR3高亲和力突变体的构建和筛选 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株与质粒 |
| 3.1.2 其他试剂耗材仪器等 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 质粒提取 |
| 3.2.3 PCR扩增 |
| 3.2.4 酶切与连接 |
| 3.2.5 转化 |
| 3.2.6 突变体的鉴定 |
| 3.2.7 突变体蛋白的表达 |
| 3.2.8 突变体蛋白的纯化 |
| 3.2.9 突变体蛋白的浓度测定 |
| 3.2.10 ELISA检测突变体蛋白的活性 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.3.1 PCR扩增丙氨酸突变体 |
| 3.3.2 丙氨酸突变体的鉴定 |
| 3.3.3 丙氨酸突变体的纯化 |
| 3.3.4 蛋白质标准曲线 |
| 3.3.5 丙氨酸突变体的蛋白活性 |
| 3.3.6 赖氨酸突变体的PCR |
| 3.3.7 赖氨酸突变体的鉴定 |
| 3.3.8 赖氨酸突变体的表达与纯化 |
| 3.3.9 赖氨酸突变体的活性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Ala-scanning确定关键氨基酸 |
| 3.4.2 Lys突变体的构建和筛选高亲和力抗体 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 双插入互补决定区的研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌株与质粒 |
| 4.1.2 其他试剂耗材仪器等 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 质粒提取 |
| 4.2.3 PCR扩增与基因回收 |
| 4.2.4 酶切与连接 |
| 4.2.5 转化 |
| 4.2.6 重组载体的鉴定 |
| 4.2.7 重组载体的蛋白诱导表达 |
| 4.2.8 重组载体的蛋白纯化 |
| 4.2.9 ELISA检测重组蛋白的活性 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 9L-5L,9L-5H,9H-5L和9H-5H载体的构建 |
| 4.3.2 四种重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.3.3 四种重组蛋白活性的测定 |
| 4.3.4 赖氨酸突变体的构建 |
| 4.3.5 赖氨酸突变体的表达与纯化 |
| 4.3.6 赖氨酸突变体的活性测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、副溶血弧菌不耐热溶血毒素的表达与纯化（论文参考文献）
- [1]广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌3种毒力基因检测及tlh基因的蛋白表达[J]. 刘杰,贺晓晨,黎姗梅,黄艳华,张振豪,黄德生,杨廷雅,吴伟锋,梁静真,黄钧. 河北渔业, 2020(08)
- [2]副溶血弧菌VPA0041和VPA1701蛋白调控运动性的分子机制研究[D]. 孟红梅. 扬州大学, 2020(01)
- [3]副溶血性弧菌在六种食品中致病力的差异及与肠道菌群的关联性研究[D]. 王润东. 广东海洋大学, 2019(01)
- [4]副溶血弧菌tlh重组表达产物溶血活性及抑制KYSE450细胞增殖的初步研究[D]. 刘雅玲. 福建医科大学, 2019(07)
- [5]水产品中弧菌污染、胁迫响应及其噬菌体靶向抑菌研究[D]. 高璐. 扬州大学, 2019(06)
- [6]临安水产品中副溶血性弧菌污染情况监测分析[D]. 许向军. 浙江农林大学, 2018(01)
- [7]广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌毒力基因检测及tlh基因的克隆与表达[D]. 刘杰. 广西大学, 2016(02)
- [8]基于群体感应分析腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制[D]. 李灿. 广东海洋大学, 2016(02)
- [9]副溶血弧菌调控蛋白CalR功能的初步研究[D]. 侯书宁. 江苏大学, 2016(11)
- [10]基于绿色荧光蛋白的抗TLH的小分子抗体的研究[D]. 张永辉. 福建农林大学, 2014(05)