一、RT-PCR快速诊断禽流感（论文文献综述）
刘琳[1]（2020）在《H5亚型AIV荧光RT-PCR、数字PCR方法建立及HA单抗的重组表达》文中研究指明H5亚型AIVs可分为高致病性禽流感病毒与低致病性禽流感病毒,其中高致病性禽流感病毒可感染野鸟,并可在养鸡场内持续爆发,对养殖户造成巨大的经济损失。近些年,H5亚型流感病毒的遗传特性和抗原性上出现了很多新的变化,N2、N3、N5、N6、N8和N9基因片段取代N1基因片段的病毒,其中高致病性H5N6流感病毒自2013年开始在亚洲,特别是东南亚的家禽中频繁出现,已经逐渐代替H5N1成为新的优势流行毒株。当H5N6禽流感病毒在家禽中传播时,接触受感染家禽的人可能会出现散发性感染,甚至导致人的死亡,对公共卫生健康造成严重的威胁。因此,针对不断变异的H5亚型AIVs开展快速准确的检测方法研究具有重要意义。首先,开展了H5N6流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法的研究工作。根据H5N6 AIVs HA基因与NA基因核苷酸序列,设计并合成3组HA和4组NA的引物与探针,筛选出一组理想的引物探针,建立了检测H5N6流感病毒的双重荧光RT-PCR检测方法。用H1-H16亚型禽流感病毒评价了该方法特异性,结果显示H5病毒可以在FAM通道、N6病毒可以在VIC通道获得荧光信号,其他亚型流感禽病毒均无荧光信号。用拷贝数为6.9×1010 HA质粒评估检测HA基因的敏感性,可以达到69个拷贝;用拷贝数为8.4×1010 NA质粒评估检测NA的敏感性,可达到84个拷贝。对40份试验感染样品进行检测,其中阳性样品40份,与鸡胚接种的符合率为100%。结果表明,该方法具有快速、特异和敏感的特点,可用于H5N6高致病性流感病毒的核酸检测,本工作为H5N6高致病性流感病毒的监测与防控工作提供了技术支持。其次,开展了H5亚型流感病毒数字PCR检测方法的研究工作。在前期筛选的H5亚型流感病毒HA特异性引物与探针基础上,结合数字PCR工作原理,建立了检测H5亚型流感病毒的数字PCR检测方法。用H1-H16亚型流感病毒评价了该方法特异性,结果显示只有H5亚型流感病毒可以在FAM通道获得扩增,其他亚型流感禽病毒均无荧光信号。与荧光RT-PCR方法比较,dPCR可以达到7.19个拷贝,而荧光RT-PCR为69个拷贝表明建立的d PCR方法比qPCR方法的灵敏度高近10倍。其批内与批间变异系数为2.08%-12.41%,表明建立dPCR方法重复性良好,准确度高。对现地样品进行检测,阳性率为24.2%,与荧光RT-PCR结果100%符合。结果表明,该方法可用于H5亚型流感病毒的核酸检测与核酸标准物质的定量研究,为流感病毒核酸的绝对定量提供新的检测方法。最后,开展了抗H5亚型流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备、测序和重组表达工作。筛选出针对H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体35株,其中21株单抗重链属于IgG亚型,14株单抗重链属于IgM亚型,轻链都属于κ链。通过竞争ELISA方法的筛选,表明20B3、21D2、22G3具有良好的竞争抑制作用。对所筛选出的3株HA单克隆抗体20B3、21D2、22G3进行免疫球蛋白基因测序,并对测得的序列在体外进行表达,间接免疫荧光实验结果表明3株抗体在体外表达成功,血凝抑制实验表明20B3与22G3这两株单抗具有血凝抑制活性,该方法为后续开展单抗为基础的诊断方法研究奠定了基础。
郑鸿[2]（2020）在《永川地区规模养鸡场H5亚型禽流感病原学检测和免疫效果分析》文中认为流行性感冒简称流感,是一种由正黏病毒引起的可以感染包括人以及其他多种动物的急性、热性、高度接触传染的流行性疾病。根据记载流感在全世界各地都有分布,在多种动物种群和人体中普遍传染流行。高致病性禽流感已经被农业农村部列入了国家动物疫病强制免疫计划中。在每年的强制免疫计划里,都对高致病性禽流感作出明确的要求,群体免疫密度应达到在90%以上,并且如家禽、水禽等养殖的应免畜禽免疫密度应达到100%。而经过强制免疫后的家禽、水禽种群的免疫抗体合格率必须常年保持在70%以上才算是合格。针对永川地区的肉鸡、蛋鸡规模化养殖场的养殖种群开展为期三年的随机抽样检测,同时开展禽流感病原学检测和H5亚型高致病性禽流感免疫抗体合格率的检测,从而了解永川地区肉鸡和蛋鸡养殖种群的H5亚型高致病性禽流感的免疫效果情况,是否有效的防止了H5亚型高致病性禽流感在永川地区的传播以及免疫抗体合格率是否满足国家要求。重庆市永川区有众多的家禽养殖场,包括有种禽（鸡）、肉鸡、蛋鸡、水禽等多种饲养禽类,其中肉鸡、蛋鸡年存栏量在300万-400万羽,是重要的经济产业及农民的收入来源。为了更好的了解目前全区H5亚型高致病性禽流感的免疫情况及效果,从而做到国家要求的“预防为主,养防结合”的方针。特意针对永川辖区内肉鸡、蛋鸡规模化养殖场的养殖种群进行H5亚型高致病性禽流感病原检测以及H5免疫抗体合格率的检测与分析,从而来了解永川地区规模化养鸡场的抗体水平是否达到国家规定的抗体标准。也是对我们基层免疫防疫工作效果进行的一次检测,论证目前我们所采取的免疫防疫工作是否能增强辖区内养殖家禽（肉鸡、蛋鸡）对H5亚型禽流感病毒的抵抗力,从而达到降低规模化养鸡场对H5亚型高致病性禽流感的感染率和发病率。本次实验的主要内容是对永川地区辖区内所有养殖规模达到养殖专业户（按照重庆市畜禽养殖规模标准,蛋鸡存栏600羽以上,肉鸡存栏1200羽以上）以上并且经过养殖备案的规模化养殖场,共计35家进行采样监测（其中蛋鸡场16个,肉鸡场19个）,养殖总量年平均数为62.22万羽。从2017年第一季度至2019年第四季度,每个季度随机从各个养殖场中随机采取共计100份的咽、肛拭子以及未知疾病死亡的组织样品,通过普通PCR的方法去监测是否有禽流感病原感染,经检测17年-19年所采取的1200份样品,均为阴性,没有发现有禽流感病毒感染的迹象。同时从2017年1月开始至2019年12月截止,每个月随机采取200-300份血清,通过血凝试验和血凝抑制试验来检测养殖种群中免疫抗体浓度和免疫抗体的合格率。通过检测永川地区规模化养鸡场2017年整体免疫抗体合格率为83.09%,2018年合格率为87.20%,2019年整体免疫抗体合格率为91.52%。均满足国家要求。另外,通过横向对比分析,蛋鸡场抗体合格率总体优于肉鸡场,通过走访了解和论证分析,这个原因主要是由于蛋鸡养殖周期长,个体免疫的效果相对于养殖周期短的肉鸡更稳定,效果更好。由此体现在蛋鸡场种群的免疫抗体合格率一直保持在较高水平,肉鸡场的免疫抗体水平则根据时间推移有一定的规律波动。经上述检测表明,2017年-2019年永川地区规模化养鸡场的H5亚型高致病性禽流感免疫效果达到国家标准,根据禽流感病原学的实验结果证明在规模化养鸡场内没有禽流感病毒感染的现象。大型养殖场（蛋鸡养殖存栏量在6000羽以上,肉鸡养殖存栏量在12000羽以上）的免疫抗体浓度和合格率均有较高水平,存栏量略小的养殖专业户（蛋鸡存栏量600-6000羽之间,肉鸡存栏量1200-12000之间）的免疫抗体浓度和合格率整体略低于大型养殖场,但是均满足国家70%的标准。
侯力嘉[3]（2020）在《基于交流动电效应与阻抗免疫传感的禽流感快速诊断方法研究》文中研究指明禽流感（avian influenza,AI）主要是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种全身性或呼吸器官性传染疾病,其中高致病性禽流感具有致死率高、传播范围广等特点。目前,国际检验兽疫局（OIE）已将禽流感定为A类传染病,我国也将其列为一类动物疫病。禽流感属人畜共患病,它一旦爆发不仅给禽类养殖业用户带来巨大的经济损失,同时还会给公共卫生事业造成严重威胁,目前我国把对禽流感防控作为重要的任务。如何防控禽流感是一个长期而艰巨的任务,控制禽流感不仅需要将患者进行隔离,而且需要对动物进行早期的检测,做到及时切断动物方面的传播途径。目前,对于禽流感病毒的主要检测技术有禽流感病毒的分离与检测、血凝-血凝聚合酶抑制（HA-HI）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）和免疫胶体金等。禽流感病毒的检测以及分离诊断相对比较准确,但是操作繁琐且比较耗时,不利于快速的检测;HA-HI试验对环境比较敏感,外界的条件会对检测结果产生影响;ELISA试验由于步骤简便,有利于大量病毒样品的分析检测,但其需反复洗涤,耗时且检测灵敏度有限;PCR这种方法虽然具有能够直接检出禽流感病毒的基因的功能,且检测灵敏度相对较高,但检测成本以及技术要求比较高,只适用于检测机构和实验室诊断,不适合现场快速诊断;针对于胶体金检测鉴定技术,目前已有相关产品被开发,但其检测灵敏度不高,产品质量不一,只能定性,不能定量,只能用于疫病的辅助检测。因此,针对于目前禽流感检测方法的一些局限性,探索一种高效、特异、准确、简便的检测手段对于禽流感的及时防控具有十分重要的意义。而现有的血清学检测方法主要基于抗原抗体的反应,目前国内禽流感病毒抗体产品质量参差不齐,国外已有比较成熟的商品化抗体,但价格十分昂贵。因此,制备高效价、特异性强、低成本的禽流感病毒单克隆抗体可为禽流感的检测鉴定与及时防控提供有效试剂。快速、低成本免疫检测对全球健康有重要意义,传统的免疫检测方法因过程繁琐等问题,无法于现场快速完成。而利用交流动电富集蛋白并基于阻抗免疫传感的方法操作简单,可将传统的ELISA的检验时间从数个小时缩短到1分钟之内,同时还具有非常低的检出限。该技术主要利用交流动电效应加快微粒操控芯片表面抗原抗体特异性结合,此时阻抗免疫传感器可实时监测芯片表面因抗原抗体结合所引起双电层厚度的变化从而判定阴阳性结果。该方法具有低成本、高灵敏度、覆盖面广等优点,有望用于临床疾病的即时检测（Point-of-care testing,POCT）。目前国外有文献报道将该技术用于双酚A（BPA）,寨卡病毒RNA、革兰氏阴性菌、人体D-Dimer等的检测,均取得了理想的实验结果。前期本实验室已成功将该项技术应用于禽类新城疫病毒和布鲁氏菌病抗体的检测。而该技术应用于禽流感的检测尚未见报道。本研究拟采用原核表达系统制备H9N2 AIV血凝素（HA）蛋白,用HA蛋白作为免疫原对BALB/c小鼠进行了免疫,利用PEG1500细胞融合技术制备HA单克隆抗体。此外,以所制备的HA抗原、抗体作为禽流感诊断试剂原料,将制备的HA抗体加入经臭氧处理后的微电极芯片表面,臭氧处理可实现芯片表面改性过程,使得芯片电极表面形成大量羟基（-OH）从而增加芯片电极表面的亲水性,有利于抗体与之固定结合。另外,芯片表面从纳米尺度上可观察到起伏不平的表面,这也增加了抗体包被于芯片电极表面的面积。再对未结合位点进行封闭处理以减少非特异性结合,从而制得用于禽流感抗原检测的微电极芯片,将芯片与阻抗仪连接即可监测芯片表面免疫反应情况,初步建立基于交流动电效应与阻抗免疫传感器相结合的禽流感抗原检测方法,并对方法进行评价,为禽流感的现场即时诊断提供了一种新的检测技术。本文的研究内容如下:（1）为了实现H9N2 AIV HA蛋白在原核表达系统中进行高效表达,根据GenBank发布的A/chicken/Gansu/2/99（H9N2）HA（ID=EF070733.1）基因序列,优化该密码子,化学方法合成HA全基因,并在合成HA基因的5’段和3’段分别重新设计酶切位点NcoI和酶切位点XhoI,使用DNA Ligation Kit将该HA片段连接转化到质粒载体pET28a（+）中,以构建重组质粒pET28a（+）-HA。再将pET28a（+）-HA重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态的细胞中,为了表达出大量的HA重组蛋白,对于诱导基因表达中各项的条件（包括温度、时间、诱导剂浓度）进行了优化。然后利用镍柱（His-tag）对HA重组蛋白进行分离纯化,纯化后的HA重组蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以及蛋白印迹实验（Western-blot）对其进行初步的纯度和特异性分析;经二喹啉甲酸（BCA）法对HA重组蛋白进行浓度的测定。（2）将上述方法制备的H9N2 AIV HA蛋白对BALB/c小鼠进行常规免疫,取免疫后的小鼠血清通过ELISA检测的方法进行抗体效价的测定,取抗体效价达到融合要求的小鼠,分离小鼠脾脏并制成脾细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）通过PEG1500进行细胞融合;建立间接酶联免疫吸附法（ELISA）,用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体,采用有限稀释法对阳性克隆细胞进行亚克隆,并从中筛选出可稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株,将其扩大培养后取适量细胞注射至BALB/c小鼠的腹腔内以形成腹水,收集小鼠腹水并使用Protein A柱对其纯化,将纯化后的抗体进行生物特性（包括纯度、浓度、效价、特异性）鉴定。（3）建立并优化交流动电阻抗传感检测方法,并应用于禽流感病毒的检测。首先对芯片表面微电极清洗条件进行优化,然后对芯片进行臭氧化处理使表面带有亲水性的-OH等基团而利于禽流感抗体的固定,然后将纯化所得抗H9N2 AIV HA单抗包被于芯片表面并对抗体修饰芯片的浓度及时间进行优化,然后优化封闭时间后将芯片连接于阻抗仪检测禽流感抗原,并对阻抗仪检测电压及电流参数进行优化以获得最适用于检测禽流感抗原的条件。最后分别从其灵敏度、特异性、重复性对实验方法效果进行初步的评价。结果:（1）成功构建基因工程菌株pET28a（+）-HA/BL21（DE3）,筛选得出了该基因工程菌最优蛋白表达条件,在30℃、IPTG添加终浓度为0.8mmol/L持续诱导6h,HA重组蛋白的表达量最大;经镍柱亲和层析纯化后的HA蛋白纯度较高,达到了电泳纯,此外经过Western-blot鉴定,63KD处存在与其预期蛋白大小完全相符的条带,表明HA蛋白得到成功表达。（2）在制备H9N2 AIV HA单抗的过程中,共进行了两次细胞融合试验,两次的融合率分别为86.7%与94.4%。初次检测阳性率分别为33.5%和86.75%。在对融合后的杂交瘤细胞株进行多次克隆化反复筛选后总共成功获得了3株能持续地分泌抗体的单克隆株,分别为1F10E7,2D10D10,5A10C3;亚型鉴定结果显示3株抗体亚型均为IgG1型;将1F10E7细胞扩大培养后注入BALB/c小鼠的腹腔制备小鼠腹水型单抗,收集小鼠腹水用ProteinA柱抗体进行腹水型抗体的纯化,SDS-PAGE电泳鉴定结果显示纯化后抗体达到了电泳纯,且经BCA法浓度测定其浓度可达到2.518mg/ml,制备所得HA单抗经Western-blot鉴定后证实能与H9N2 AIV HA抗原以及H9N2标准病毒特异性结合,而与NDV的F蛋白无反应,说明制备的HA单抗具有较好的特异性。（3）在建立并优化禽流感抗原的检测方法过程中,确定了最佳芯片清洗方法为异丙醇、无水乙醇、超纯水依次超声清洗10min;最优抗体修饰芯片条件为加入10μg/mL的HA单抗于37℃的恒温箱中连续孵育3h;然后加入封闭液1%superblock 25℃封闭30min;阻抗仪最佳电压及电流设置为100mV、100kHZ。包被HA单抗分别检测0.1、1.0、10、100、1000ng/mL重组HA抗原稀释液,结果表明该方法用于检测禽流感抗原最低可以检测到10ng/mL的HA抗原,此时检测结果较为稳定。芯片包被HA单抗后检测经荧光逆转录PCR（reversetran scription-PCR,RT-PCR）鉴定的H9N2阴阳性禽咽拭子样品,共检测12支阳性样品（每支样品平行检测3份）、6支阴性样品,此外还检测了4支新城疫病毒尿囊液样品,其中每支样品平行检测3份。与传统的荧光RT-PCR检测的方法结果相比,其检测结果的灵敏度（检出特异阳性率）的灵敏度可达97.2%,检测特异性（检出特异阴性率）的灵敏度可达96.7%,且这种新的检测方法与其他常见禽类的病毒样品检测无任何交叉性反应,检测的结果表明该方法具备有较的特异性和较好的可重复性。该检测方法有望在未来成为便携式的诊断技术,将包被于HA单抗的微粒操控芯片经保护剂处理后进行真空保存,检测时仅需连接靠一部比手机略大的阻抗仪设备,就可实现现场1分钟检测并立即报告检测结果。结论:本研究成功构建了H9N2 AIV HA蛋白基因工程菌pET28a（+）-HA/BL21（DE3）,并通过研究筛选出HA蛋白的最佳蛋白表达条件,实现了HA蛋白在大肠杆菌中高效表达;对HA蛋白进一步的纯化后作为免疫原对小鼠进行常规免疫,经过细胞融合及亚克隆细胞筛选后,共筛选到3株具有持续分泌抗H9N2 AIV HA抗体能力的单克隆细胞株;将制备的抗原、抗体作为试剂原料,用于建立基于交流动电效应与阻抗免疫传感技术相结合的禽流感快速诊断方法,通过对该方法进行优化与评价后,证明该方法具有较高的灵敏度、特异性,且重复性良好,可用于禽流感的现场快速检测,为禽流感的及时防控提供了一种新的检测技术。
庄金秋,梅建国,张颖,苗立中,王玉茂[4]（2019）在《禽流感病毒H7N9亚型实验室检测技术研究进展》文中研究表明H7N9亚型禽流感病毒是我国于2013年3月首次从人群中发现的一种新亚型禽流感病毒。该病毒在家禽中无明显致病性,却能感染人类并引起较高的病死率。因此,H7N9病毒的早期的快速检测对于疫情的控制至关重要。本文对H7N9病毒实验室最新研究进展进行了综述,以期为科研工作者和广大养殖场户更好地研究和防治本病提供参考。
王潇[5]（2019）在《禽流感病毒RT-exoRPA和荧光RT-PCR检测方法的建立和初步应用》文中研究说明禽流感（Avian Influenza,AI）是由属于正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒引起的一种严重危害动物健康和人类健康的烈性传染性疾病综合症。A型流感病毒造成危害最大,且最易变异,能逃避宿主免疫应答,因此难以控制。1878年首次报道在鸡群中暴发了禽流感,至今仍在全球范围内影响着家禽的健康,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失,同时也威胁着人类的生命安全近年来,禽流感诊断技术快速发展,特别是运用于现场快速诊断的技术更是迅速。2006年Piepenburg等人提出了一项新的核酸检测技术,即重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplification,RPA）,在37～42℃条件下,20 min能够完成核酸的扩增,且具有操作方法简便、反应速度快等优点。本文通过分析A型流感病毒的M基因序列,H5亚型、H7亚型禽流感病毒的HA基因序列以及H7N9亚型禽流感病毒的HA、NA基因序列,选取各自相对保守区域,设计多对引物及探针,成功建立了A型流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒RT-exo RPA检测方法,并与荧光PCR检测方法进行对比分析,对RT-exo RPA检测方法进行评价。试验结果表明该检测方法的灵敏度比荧光PCR检测方法稍差,但其检测速度更快,且具有特异性强、操作简单等特点。2013年,一种新的可感染人的禽流感H7N9在我国长江三角洲地区爆发。自禽流感H7N9爆发以来,禽流感导致人死亡的案例越来越多,对我国的养禽业的发展和社会的安定造成了极大的危害。2017年,我国因感染禽流感H7N9死亡的人数又急剧上升,再次引起了全球的轰动。本论文成功建立了高致病性H7亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法,通过3批次H7亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测试验,对其灵敏性和特异性试验进行分析。试验表明该方法的检测灵敏度对高致病性禽流感病毒（H7亚型）的最低检出量为101.869EID50,对低致病性禽流感病毒（H7亚型）的最低检出量为101.940EID50,灵敏度高;该方法可以特异性区分H7亚型禽流感病毒和高致病性H7亚型禽流感病毒,并对其他亚型以及其他病毒检测为阴性,具有较强的特异性。该方法可用对H7亚型禽流感的流行病学调查。
赵冬敏,吴青,赵翰飞,刘青涛,杨婧,黄欣梅,刘宇卓,韩凯凯,毕可然,李银[6]（2019）在《H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立》文中研究说明根据GenBank中H5、H7、H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白（HA）编码基因,使用DNAStar软件比较分析筛选出特异的保守片段,设计3对引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基础上,建立了H5、H7、H9亚型禽流感的三重RT-PCR检测方法,本方法可同时检测出样品中的H5、H7、H9亚型禽流感病毒。敏感性试验结果表明,该方法检测H5、H7、H9亚型禽流感RNA的敏感性分别达2.80、10.50、5.73 pg/μL,该方法检测其他相关病毒时均为阴性,具有很高的特异性,此外,该方法具有良好的重复性。利用所建立方法对240份禽流感临床样品进行检测,结果与血凝试验和血凝抑制试验结果的符合率为100%。此诊断方法检出时间早,且特异、敏感、经济、快速,可普遍推广,在禽流感诊断和防制中具有重要意义和应用价值。
李玥[7]（2019）在《H9N2亚型禽流感病毒株遗传演化分析及HA和NA基因核酸标准品的研制》文中研究指明禽流感（Avian influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起禽类的一种从轻度的呼吸道症状到全身严重性败血症等多种症状的传染病。由于致病力的不同,禽流感分为高致病性（High pathogenic avian influenza,HPAI）和低致病性（Low pathogenic avian influenza,LPAI）,这些致病性导致禽类死亡症状不同。根据病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同,禽流感可分为多种亚型,目前共有18种HA亚型和11种NA亚型。禽流感病毒不仅感染鸡、鹌鹑、鸭及野禽等禽类,而且还感染猪、马等哺乳动物以及人类。由于H9N2亚型禽流感病毒致病率低,禽类感染后症状表现不明显或者无症状,从而导致H9N2在禽类中大面积流行,给养殖业带来了很大的经济损失,因此对H9N2亚型禽流感病毒的防控至关重要。本研究通过对GenBank上获得国内各地区H9N2亚型禽流感病毒基因序列,分别绘制HA、NA基因进化树,了解H9N2亚型禽流感病毒疫情分布情况。将吉林地区18株H9N2亚型禽流感病毒分离株和2株参考毒株的HA和NA基因进行扩增和序列测定,并对HA、NA基因进行进化分析,掌握吉林地区H9N2亚型禽流感病毒分离株在国内的流行趋势,分析分离毒株亲缘关系和进化关系。针对国内H9N2亚型病毒分离株HA基因的五个分支中的5株典型毒株分别设计了特异性引物和探针,建立了不同的荧光PCR检测方法。然后对H9N2亚型流感病毒的HA和NA基因采用体外转录的方法获得HA-cRNA和NA-cRNA,以cRNA为模板制备了应用于H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因检测的标准品,为H9N2亚型禽流感病毒的检测提供了标准物质。1、从GenBank上获得国内各地区流行的H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因序列,其中1619株HA基因,1104株NA基因,按照时间、地区、宿主等信息进行筛选,分别绘制进化树。结果表明,国内流感毒株共分为北美谱系和欧亚谱系,HA基因共分为五个分支,NA基因分为四个分支。HA、NA基因的各个分支覆盖了我国绝大部分地区,各分支之间没有明显的地域分布差异。病毒株多来源于广东、山东和一些沿海地区,且宿主以鸡源为主。对吉林地区18株H9N2亚型流感病毒分离株和2株参考毒株分别进行HA和NA基因扩增和序列测定,同时对HA、NA基因进行进化分析,通过进化比较分析可以看出,所有分离株分布于HA基因第一至三个分支和NA基因第一、二分支,其中HA基因第五分支属于北美谱系,该谱系以TY66为代表毒株且毒株较少共11株,分离株多来自于野鸟和水禽。其他分支均属于欧亚谱系,其中第四分支只有6株,以HKG1为代表毒株,毒株多来自沿海地区,水禽居多。第三分支毒株共87株,发现时间较早,本试验分离株与代表毒株BJ94亲缘关系较近。第一、二分支共1515株,以Y280为代表毒株,大部分的分离株集中在这两个分支上。NA基因的第四分支是以TY66为代表毒株的北美谱系,该分支共有8个毒株,其它三个分支均为欧亚谱系;第三分支以HKG1为代表毒株,该分支毒株只有6株,毒株也以水禽居多;第二分支有213株,且分离时间较早;第一分支共有887株,近些年的分离株大多集中于该分支。2、为了区分各分支中分离株,建立了特异性荧光PCR的方法,本研究针对5个分支代表毒株的HA基因序列分别设计一对特异性引物和探针,以标准阳性质粒为模板,构建荧光PCR标准曲线,建立荧光PCR检测方法。实验结果显示,将稀释后的质粒,进行荧光PCR扩增,可以分别扩增到102 copies/μL和101 copies/μL,其它毒株均未被扩出,证明该方法具有很好的敏感性及特异性。稳定性实验表明,对重组质粒108 copies/μL106 c opies/μL的浓度进行三次扩增,能呈现较好的梯度曲线,稳定性较好。3、为了提高对H9N2亚型流感病毒检测结果的准确性,本试验针对2株试验毒株的HA、NA基因进行全长的扩增,构建了含有T7启动子的重组质粒,测序成功后,通过体外转录可以快速获得大量的HA-cRNA和NA-cRNA片段。测得产物浓度分别为346 ng/μL、301 ng/μL,经连续倍比稀释后,以此为模板进行Real-time RT-PCR检测,绘制标准曲线图,测定值基本在一条直线上,扩增曲线良好,可用作核酸检测的标准物质。随后对标准物质进行均匀性、稳定性和不确定度分析,经计算结果显示,满足标准样品对均匀性的要求,检测组在稳定性监测期内是稳定的。由于H9N2亚型禽流感在世界范围内广泛流行,为了减少其暴发的可能性,我们应及时掌握该亚型在国内的流行趋势,加强监控和防范措施,保障健康养殖和食品安全。
肖倩[8]（2019）在《蛋白芯片方法检测AIV抗体并区分其H5和H7亚型抗体的初步研究》文中研究表明禽流感病毒（AIV）不仅能感染禽类造成巨大的经济损失,更严重的是,它可以感染人类,特别是H5和H7亚型的AIV,给人类带来巨大危害和损失,引起了公众广泛的关注,所以检测AIV的技术也多种多样。众所周知,单克隆抗体具有很多的优点,是一种有效的检测工具,普遍应用于不同的检测方法中,AIV的单克隆抗体也经常被用于检测和诊断AIV。近年来,蛋白微阵列作为一种新兴的技术正在被开发,它是一种高通量的强大工具。为了减少AIV对人类的健康与财产的威胁,准确检测和判断AIV对及时监测病毒、控制病毒传播和抗AIV疫苗研发都具有重要的指导作用。根据禽流感流行发生的情况,诊断方法需要具有快速、有效、高通量、高特异性和便于操作等特点。本研究基于单克隆抗体和蛋白芯片方法的优点和便利,建立了检测AIV抗体的阻断蛋白芯片的方法,该方法可用于检测不同种属血清中的禽流感抗体,同时区分是否是H5或H7亚型。血清学检测使我们能够确定易感物种或人类是否有感染史,为监测和诊断AIV提供重要线索。1.禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定本研究首先灭活纯化H5N6病毒,然后免疫小鼠。利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,用ELISA对其进行筛选,最后获得2株分泌抗NP抗体的细胞株,命名为3D9和2B10。通过间接ELISA、western blot和间接免疫荧光试验对2株杂交瘤细胞进行鉴定。结果分析显示,间接ELISA检测3D9和2B10的细胞培养上清液抗体效价分别为1:1×103和1:1×104,腹水的抗体效价为1:1×105和1:1×106;3D9和2B10亚类鉴定重链为IgM,轻链为κ链。Western blot分析表明2株杂交瘤细胞上清即能特异的与不同亚型的AIV在56KD处发生反应,也可特异的与原核表达的NP蛋白发生反应。间接免疫荧光结果显示,2株单克隆抗体与不同亚型的AIV感染的MDCK细胞均能产生特异性的免疫荧光。本研究制备了 2株分泌抗NP蛋白的单克隆抗体,它们具有较好的保守性、特异性和广谱性。2.H5N1-HA1、H7N3-HA1和H3N2-NP重组蛋白的表达与纯化扩增H5N1-HA1基因,克隆到原核表达载体pCold Ⅰ和pGEX-4T-1上,两个重组阳性质粒被成功构建,之后转化到E.coli BL21,诱导表达目的蛋白。结果显示H5N1-HA1能在pCold Ⅰ中实现带His标签的融合蛋白的表达,也能在pGEX-4T-1中表达带GST标签的蛋白,两种原核表达系统在IPTG浓度为1mM的条件下37℃或16℃诱导都以不可溶的包涵体的形式进行表达,带更小的His标签的H5N1-HA1蛋白被选择进行大量表达用于下一步的实验。将实验室已有的阳性质粒pCold I-H7N3-HA1和pET-32a-H3N2-NP分别转化到E.coli BL21菌株进行原核表达,在IPTG浓度为1mM的条件下,16℃诱导pCold I-H7N3-HA1 和pET-32a-AIV-H3N2-NP,获得包涵体中的H7N3-HA1和部分在上清中表达的H3N2-NP两种重组蛋白。上述AIV蛋白纯化后获得三种不同的较高纯度蛋白,利用相对应的单克隆抗体进行western blot实验,结果分析发现,三种蛋白都具有较好的特异性,为禽流感病毒抗体阻断蛋白芯片检测方法的建立提供了可用且质量高的抗原。3.AIV抗体及其H5和H7亚型抗体蛋白芯片检测方法的构建及优化本研究研制了一种新型的蛋白芯片诊断方法,用于快速地确定不同种属的动物体内是否存在禽流感抗体,且能同时区分AIV的H5和H7亚型抗体,以达到对禽流感及禽流感的H5和H7亚型进行鉴别诊断以及疫情监测的目的,从而为禽流感诊断提供一种新方法。本方法首先确定了抗原和单克隆抗体的使用条件,为了获得容易观察和计算的高强度的化学发光信号,H5和H7抗原浓度确定为0.2mg/mL,NP抗原浓度确定为0.05mg/mL;H5、H7和NP单克隆抗体的最佳稀释度分别为1:2000、1:2000和1:320000;检测样品的最佳稀释倍数为1:32。然后确定蛋白芯片的阴阳性临界值,鸡、孔雀、鸭血清中H5抗体检测临界值分别为40%、50%、30%,NP抗体检测临界值分别为50%、50%、20%,H7抗体检测临界值分别为40%、50%、40%。其他禽类疾病病毒的阳性血清于蛋白芯片孵育检测其特异性,结果表明,该蛋白芯片能特异的检测AIV抗体。该方法的灵敏度高于传统的HI方法,我们将已知HI滴度的血清在蛋白芯片中孵育,结果表明在蛋白芯片中H5和H7抗体最低检测线均为1个HI滴度,用H5和H7亚型阳性血清测定蛋白芯片NP抗体的最低检测线均为0.5个HI滴度。将蛋白芯片与IDEXX AIV抗体检测试剂盒和HI进行比较,检测了 55份临床鸡血清样品,蛋白芯片H5和NP抗体检测的诊断灵敏性和诊断特异性均为10 0%,H7的诊断灵敏性和诊断特异性分别为10 0%和97.06%。取鸭临床血清20份和孔雀临床血清20份孵育于蛋白芯片,并用HI实验作为对照,孔雀血清的蛋白芯片结果与HI结果完全符合,鸭血清的蛋白芯片的结果与HI符合率为90%。本研究建立的方法具有高通量、准确、特异且敏感等优点,对AIV的血清学诊断和流行病学调查以及疫苗接种效率的监测具有重要价值。更重要的是,该方法为后续同时识别更多的AIV亚型和检测其他病原体打下了基础。
陈淑蕾,张海文,王学梅,吴科榜,管庆丰[9]（2019）在《禽流感病毒的核酸分》文中研究表明禽流感是一种能感染人和动物的烈性传染病,已引起巨大的经济损失,所以对禽流感的诊断防治成为当今研究的一大课题。准确、快速地诊断禽流感是防治的重要前提,日益发展的分子生物学技术在诊断方面无疑具有更大优势,文章就禽流感核酸分子诊断方法研究进展进行综述,对禽流感防控提供参考。
孙志豪[10]（2018）在《H7N9亚型禽流感病毒检测方法的建立及标记疫苗的研制》文中研究表明H7N9亚型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）是一种新出现的人兽共患病原,自从20]3年首次在我国报道以来,在人类已引起5波流行,截止2017年]0月26日,共有1567人发病,其中包括615例死亡病例,病死率接近40%。早期的H7N9亚型AIV对家禽是低致病性的,家禽感染后无明显症状。2017年初开始出现对家禽呈高致病性的H7N9亚型AIV,分布于全国17个省份,并引发多起疫情。2017年下半年,重组AIV（H5+H7）二价灭活疫苗使用后,有效控制了家禽中的H7N9疫情,也显着减少了人的感染病例。但目前仍可在我国个别省份分离到对鸡和鸭均呈高致病性的H7N9和H7N2亚型AIV,使我国H7亚型AIV的防控面临新的挑战。因此迫切需要研制可用于区别自然感染和疫苗免疫动物的标记疫苗以及快速检测方法用于H7亚型AIV的防控和净化。1.鉴别九种禽流感病毒神经氨酸酶基因的—步法多重探针组合rRT-PCR方法的建立目前,已经在家禽和野鸟中鉴定出了 9种不同的禽流感病毒神经氨酸酶（NA）亚型,由于AIV很容易发生重组,同一种血凝素（HA）亚型的AIV可能存在不同的NA组合,在鉴定HA的同时也需要鉴定出NA亚型。我们设计了 9个亚型的NA引物-探针对,根据探针的不同荧光染料（FAM,HEX和TexasRed）将其分成3组,开发了一种基于多重探针组合的一步法rRT-PCR。结果显示,该多重rRT-PCR方法中的每组引物·探针对检测相应的不同亚型的NA特异性良好,无交叉反应;其检测限均小于100copies和100EID50。利用该方法分别检测人工感染H9N2病毒鸡的排毒样品和活禽交易市场的临床样品,结果显示,该方法检测结果的阳性率与病毒分离和基因测序方法的结果相一致,且灵敏度更高。综上所述,我们建立的这种快速、特异且灵敏的多重探针组合rRT-PCR方法,为NA分型提供了新的快速检测方法。2.快速检测H7亚型禽流感病毒的免疫胶体金试纸条的研制以H7N9亚型AIV（A/Chicken/Jiangsu/W1-8/2015,W1-8）作为免疫原制备单克隆抗体,利用抗原逃逸试验和HA基因序列测定及分析确定其针对的抗原表位,选择具有不同抗原表位的单抗研制检测H7亚型AIV的免疫胶体金试纸条。结果显示,共获得了13株具有血凝抑制特性的单抗,鉴定出198、227和235位3个抗原表位。选取了针对227位和235位的单抗制备免疫胶体金试纸条,结果表明,该试纸条具有良好的特异性、稳定性。棉拭和组织样品的检测限均为2.5 1og10 EID50/0.1mL。活禽市场样品的病毒检出率为3%（6/200）,与病毒分离结果（4.5%,9/200）和HA基因PCR测序结果（3.5%,7/200）一致。这为现场快速检测H7亚型AIV提供了新方法。3.H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制通过多肽芯片的检测方法成功筛选到针对H7N9亚型AIV HA2上的特异性抗原表位H7-12肽,利用反向遗传技术修饰该抗原表位,并以H7N9毒株A/Chicken/Huadong/JD/17（JD/17）为骨架,研制出H7N9亚型AIV灭活标记疫苗候选株A/Chicken/Huadong/JD-cHA/17（JD-cHA/17）。该疫苗候选株的 HA 效价为 10 Log2,EID50 为 9.67 Log10oEID50/mL;在一次免疫鸡群3周后,HI抗体效价能达到9.2±0.6,表明该疫苗候选株具有良好的抗原性和免疫原性。攻毒保护试验结果表明,该疫苗候选株的免疫保护效果与母本毒株相当,对高致病性（HP）和低致病性（LP）H7N9AIVs均有100%的保护率。利用H7-12多肽芯片技术成功检测出自然感染后第3d血清转阳情况[信噪比（SNR）=2.33±0.15],灵敏度高于HI试验（HI=0）。疫苗候选株DIVA特性验证结果显示,利用H7-12多肽芯片检测疫苗候选株JD-cHA/17免疫血清（HI=9.2±0.6）和野生型毒株JD/17免疫血清（HI=9.1±0.5）,其针对H7-12多肽的SNR值分别为0.44±0.14和6.39±0.13,差异极显着,表明该灭活标记疫苗不能诱导针对H7特异性的H7-12多肽的抗体,具有DIVA特性和广泛的应用前景。4.区分H7N9亚型禽流感标记疫苗免疫血清和野毒株感染血清的竞争抑制ELISA方法的建立利用H7特异性表位H7-12多肽与BSA偶联作为免疫原,成功制备了 6株单克隆抗体。IFA和Western-blot试验结果显示,该6株单抗均能与H7N9亚型AIVJD/17反应,特异性良好。以JD/17自然感染血清和JD-cHA/17免疫血清为测试血清样品,利用竞争抑制ELISA方法,成功筛选出具有高抑制率的单抗3G10。将H7-12多肽作为包被抗原,纯化的3G10单抗腹水以辣根过氧化酶（HRP）进行标记作为检测抗体,建立针对H7-12抗体的竞争抑制ELISA方法。对竞争抑制ELISA方法的反应条件进行优化,确定抗原的最适包被浓度为50μ吨/mL,酶标抗体的最适工作浓度为1:200,待检血清最适稀释度为1:4,封闭液的最佳选择为8%的小牛血清封闭90 min,TMB的最佳反应时间为10min。判断标准为抑制率≥20%为阳性,≤16%为阴性。运用本方法检测JD/17自然感染血清为阳性,检测JD-cHA/17 免疫血清,HI、H3、H4、H5（RE-6、RE-7 和 RE-8）、H6、H9 和 H10 亚型 AIV的阳性血清均为阴性,说明该竞争抑制ELISA方法具有良好的特异性,可有效区分JD/17自然感染血清和JD-cHA/17免疫血清。
二、RT-PCR快速诊断禽流感（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RT-PCR快速诊断禽流感（论文提纲范文）
（1）H5亚型AIV荧光RT-PCR、数字PCR方法建立及HA单抗的重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 AIV蛋白结构与功能 |
| 1.2.1 血凝素(HA) |
| 1.2.2 神经氨酸酶(NA) |
| 1.2.3 聚合酶蛋白(PB1、PB2、PA) |
| 1.2.4 核蛋白(NP) |
| 1.2.5 非结构蛋白(NS) |
| 1.2.6 基质蛋白(M) |
| 1.3 H5亚型AIV流行情况 |
| 1.4 AIV诊断方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.4.3 杂交瘤抗体基因测序与体外重组表达研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 H5N6 亚型高致病性禽流感病毒TaqMan双荧光RT-PCR方法的建立 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要实验试剂与仪器 |
| 2.1.4 病毒RNA的提取 |
| 2.1.5 引物及探针 |
| 2.1.6 TaqMan荧光RT-PCR反应体系 |
| 2.1.7 TaqMan荧光RT-PCR特异性试验 |
| 2.1.8 TaqMan荧光RT-PCR敏感性试验 |
| 2.1.9 对临床样品的检测 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 引物组筛选 |
| 2.2.2 特异性试验 |
| 2.2.3 敏感性试验 |
| 2.2.4 对临床样品的检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 H5亚型禽流感病毒数字PCR方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验毒株 |
| 3.1.2 试剂与器材 |
| 3.1.3 病毒RNA的提取 |
| 3.1.4 引物及探针设计 |
| 3.2 实验条件 |
| 3.2.1 TaqMan real time RT-PCR反应体系与条件 |
| 3.2.2 数字PCR(dPCR)反应条件优化 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 重复性试验 |
| 3.2.6 现地样品的检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 dPCR反应条件的确定 |
| 3.3.2 dPCR特异性试验结果 |
| 3.3.3 敏感性试验结果 |
| 3.3.4 标准曲线的绘制 |
| 3.3.5 重复性试验结果 |
| 3.3.6 现地样品检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 H5N1亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的制备与体外重组表达 |
| 4.1 实验材料与实验动物 |
| 4.2 实验试剂与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蔗糖梯度纯化病毒总蛋白 |
| 4.3.2 BCA蛋白定量分析试剂盒测定总蛋白的浓度 |
| 4.3.3 免疫动物 |
| 4.3.4 免疫效价的测定 |
| 4.3.5 骨髓瘤细胞(SP20)的制备 |
| 4.3.6 饲养层细胞的制备 |
| 4.3.7 细胞融合 |
| 4.3.8 融合细胞半换液 |
| 4.3.9 融合检测(间接ELISA与 HI) |
| 4.3.10 杂交瘤细胞亚克隆 |
| 4.3.11 杂交瘤细胞的冻存与亚型鉴定 |
| 4.3.12 腹水的制备 |
| 4.3.13 腹水的纯化 |
| 4.3.14 竞争ELISA方法的建立 |
| 4.3.15 抗体的标记(辣根过氧化酶标记法) |
| 4.3.16 细胞总RNA提取 |
| 4.3.17 总RNA反转录 |
| 4.3.18 PCR反应 |
| 4.3.19 胶回收、连接、转化、挑菌、菌液PCR、提质粒、测序 |
| 4.3.20 cDNA5'末端的快速扩增(5'Race) |
| 4.3.21 cDNA3'末端的快速扩增(3'Race) |
| 4.3.22 重链与轻链全长扩增体系 |
| 4.3.23 连接、转化、摇菌、菌液PCR、测序 |
| 4.3.24 转化阳性质粒 |
| 4.3.25 提取质粒 |
| 4.3.26 转染CHO细胞 |
| 4.3.27 间接免疫荧光实验 |
| 4.3.28 Western Blot |
| 4.3.29 细胞上清浓缩 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 纯化蛋白浓度测定 |
| 4.4.2 免疫效价的测定 |
| 4.4.3 筛选出杂交瘤细胞与抗体亚类的鉴定 |
| 4.4.4 竞争ELISA方法的建立 |
| 4.4.5 标记后竞争ELISA方法的建立 |
| 4.4.6 重链与轻链的PCR结果 |
| 4.4.7 20B3、21D2、22G3 重链与轻链5'Race与3'Race测序结果 |
| 4.4.8 20B3、21D2、22G3重链与轻链全长测序结果 |
| 4.4.9 抗体可变区分区结果 |
| 4.4.10 重组表达抗体间接免疫荧光(IFA)结果 |
| 4.4.11 体外重组抗体血凝抑制(HI)结果 |
| 4.4.12 体外重组抗体Western Blot结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）永川地区规模养鸡场H5亚型禽流感病原学检测和免疫效果分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 禽流感病毒的主要结构 |
| 1.1.2 禽流感病毒的亚型 |
| 1.2 病理学 |
| 1.2.1 禽流感发病机理 |
| 1.2.2 家禽感染禽流感病毒的病理表现 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.3.1 传染源及传播途径 |
| 1.3.2 世界禽流感疫情流行情况 |
| 1.3.3 中国高致病性禽流感(H5亚型)流行情况 |
| 1.4 禽流感实验室检测技术 |
| 1.4.1 血凝试验和血凝抑制实验(HA、HI) |
| 1.4.2 琼脂扩散试验(AGP) |
| 1.4.3 病毒中和试验(neutralization test,NT) |
| 1.4.4 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 1.4.5 免疫胶体金标记技术(immunogold labelling technique) |
| 1.4.6 反转录聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的意义 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.3.1 永川区规模养鸡场H5亚型高致病性禽流感病原学检测 |
| 2.3.2 永川区规模养鸡场H5亚型禽流感免疫抗体检测 |
| 2.3.3 永川地区禽流感免疫效果监测 |
| 第3章 RT-PCR法检测规模养鸡场H5 亚型禽流感病毒 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 检测所用试剂盒 |
| 3.1.2 主要实验器材 |
| 3.1.3 养殖场的选择 |
| 3.1.4 采样时间 |
| 3.1.5 采样方法 |
| 3.1.6 样品处理 |
| 3.1.7 RNA提取 |
| 3.1.8 RT-PCR扩增 |
| 3.1.9 RT-PCR产物检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 选择的规模化鸡场概况及样品采集情况 |
| 3.2.2 永川区规模养鸡场H5 亚型禽流感病毒RT-PCR检测结果 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第4章 永川区规模养鸡场H5亚型禽流感免疫抗体检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 抗原 |
| 4.1.2 主要器材 |
| 4.1.3 养殖场的选择 |
| 4.1.4 采样时间 |
| 4.1.5 血清样品的采集 |
| 4.1.6 禽流感免疫抗体的检测 |
| 4.1.7 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 永川地区规模化养殖场H5亚型高致病性禽流感的免疫情况 |
| 4.2.2 永川区规模化养鸡场禽流感免疫抗体合格总体情况 |
| 4.2.3 永川区规模化养鸡场禽流感免疫抗体合格的全年变化情况 |
| 4.2.4 永川区规模化蛋鸡场与肉鸡场禽流感免疫抗体合格的对比 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）基于交流动电效应与阻抗免疫传感的禽流感快速诊断方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写索引 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 禽流感概论 |
| 1.1.1 AIV病原学特点 |
| 1.1.2 致病机制 |
| 1.1.3 H9N2 亚型禽流感流行现状 |
| 1.1.4 禽流感病毒主要外膜蛋白 |
| 1.2 禽流感诊断技术研究进展 |
| 1.2.1 病毒分离鉴定 |
| 1.2.2 血清学鉴定 |
| 1.2.3 分子生物学鉴定 |
| 1.2.4 禽流感生物传感器检测方法进展 |
| 1.3 交流动电效应与阻抗免疫传感技术 |
| 1.3.1 交流动点效应与阻抗免疫传感技术检测特点 |
| 1.3.2 交流动点效应与阻抗免疫传感技术检测原理 |
| 第2章 H9N2 AIV HA蛋白的原核表达及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pET28a(+)-HA重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.1.1 HA序列的分析及合成 |
| 2.2.1.2 pET28a(+)-HA重组质粒的提取 |
| 2.2.1.3 pET28a(+)-HA重组质粒的双酶切鉴定 |
| 2.2.1.4 重组质粒转化及菌种保存 |
| 2.2.2 HA重组蛋白的原核表达与鉴定 |
| 2.2.2.1 HA重组蛋白SDS-PAGE电泳鉴定 |
| 2.2.2.2 HA重组蛋白最佳诱导表达条件的筛选 |
| 2.2.2.3 HA重组蛋白的大量表达 |
| 2.2.2.4 HA重组蛋白的纯化 |
| 2.2.2.5 HA重组蛋白浓度的测定 |
| 2.2.2.6 HA重组蛋白Western-blot检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 pET28a(+)-HA重组质粒的酶切鉴定及测序结果 |
| 2.3.2 HA蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 2.3.2.1 pET28a(+)-HA/BL21(DE3)重组菌株诱导条件的筛选 |
| 2.3.2.2 HA重组蛋白纯化及浓度测定 |
| 2.3.2.3 纯化后HA重组蛋白Western blot分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 抗禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物及细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫方案 |
| 3.2.2 最佳抗原包被浓度及阴阳性血清稀释度的筛选 |
| 3.2.3 融合前小鼠效价的测定 |
| 3.2.4 小鼠腹腔饲养细胞的制备 |
| 3.2.5 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 的制备 |
| 3.2.6 脾细胞制备 |
| 3.2.7 细胞融合 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.9 阳性杂交瘤细胞的克隆化 |
| 3.2.10 腹水型单抗的制备 |
| 3.2.11 腹水型单抗的纯化 |
| 3.2.12 HA单克隆抗体的生物特性鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 抗原最佳包被浓度以及阴阳血清稀释度的确定 |
| 3.3.2 融合前小鼠血清效价ELISA测定结果 |
| 3.3.3 细胞融合结果 |
| 3.3.4 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆结果 |
| 3.3.5 HA单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.3.6 单抗的纯化 |
| 3.3.7 单抗纯度鉴定 |
| 3.3.8 单抗浓度测定 |
| 3.3.9 效价测定 |
| 3.3.10 ELISA检测HA单抗与标准的H9N2 病毒反应性 |
| 3.3.11 1F10E7 HA单抗Western-Blot检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 基于交流动电效应与阻抗免疫传感的禽流感快速诊断方法研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 抗原及抗体 |
| 4.1.2 实验主要试剂 |
| 4.1.3 实验主要设备 |
| 4.1.4 主要试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 H9N2 禽流感阴阳性禽咽拭子的鉴定 |
| 4.2.2 开盖芯片及镜检清洗 |
| 4.2.3 活化芯片 |
| 4.2.4 包被及扫频 |
| 4.2.5 封闭过程 |
| 4.2.6 检测及扫频 |
| 4.2.7 交流动电的阻抗免疫传感器检测禽流感的方法优化 |
| 4.2.7.1 芯片清洗方式的优化 |
| 4.2.7.2 抗H9N2 HA单抗浓度以及时间对富集和传感效果的影响 |
| 4.2.7.3 封闭时间对富集和传感效果的影响 |
| 4.2.7.4 交流电频率及电压对富集传感效果的影响 |
| 4.2.8 重复性实验 |
| 4.2.9 特异性实验 |
| 4.2.10 灵敏度实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 H9N2 禽流感阴阳性咽拭子样品的鉴定结果 |
| 4.3.2 交流动电效应与阻抗免疫传感检测方法的优化结果 |
| 4.3.2.1 芯片清洗方式优化结果 |
| 4.3.2.2 包被浓度以及时间的优化结果 |
| 4.3.2.3 封闭时间的优化结果 |
| 4.3.2.4 交流电频率及电压的优化结果 |
| 4.3.3 免疫传感器重复性实验结果 |
| 4.3.4 免疫传感器特异性实验结果 |
| 4.3.5 免疫传感器灵敏度实验（检出限）结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（4）禽流感病毒H7N9亚型实验室检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 病毒分离与鉴定 |
| 2 血清学方法 |
| 2.1 血凝抑制试验 (HI) |
| 2.2 酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 2.3 免疫胶体金技术 |
| 3 分子生物学方法 |
| 3.1 RT-PCR |
| 3.2 荧光定量RT-PCR |
| 3.3 PCR-ELISA |
| 3.4 等温核酸扩增技术 |
| 3.4.1 逆转录-环介导等温扩增技术 |
| 3.4.2 依赖核算序列的扩增技术 |
| 3.4.3 重组酶聚合酶介导的等温扩增技术 (RPA) |
| 3.4.4 解旋酶依赖性等温扩增技术 |
| 3.5测序技术 |
| 3.5.1 高通量测序技术 (HTS) |
| 3.5.2 焦磷酸测序技术 (Pyrosequencing) |
| 3.6芯片技术 |
| 3.6.1 基因芯片 (Gene Chip) |
| 3.6.2 液相芯片 (MASA) |
| 3.7 高分辨率熔解曲线 (HRM) |
| 4 结语 |
（5）禽流感病毒RT-exoRPA和荧光RT-PCR检测方法的建立和初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 禽流感概述 |
| 1.1.1 禽流感病原及其分类 |
| 1.1.2 禽流感病毒功能蛋白 |
| 1.1.3 禽流感流行情况 |
| 1.2 禽流感诊断方法的研究进展 |
| 1.2.1 病原学诊断 |
| 1.2.2 血清诊断法 |
| 1.2.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 A型流感病毒RT-EXORPA检测方法的建立及初步应用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株及来源 |
| 2.1.2 临床样品来源 |
| 2.1.3 试验试剂及配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 相关生物学软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒RNA的提取 |
| 2.2.2 病毒RNA浓度的测定 |
| 2.2.3 RT-exoRPA反应体系的建立 |
| 2.2.4 RT-exoRPA扩增反应的特异性检测 |
| 2.2.5 RT-exoRPA扩增反应的灵敏性检测 |
| 2.2.6 RT-exoRPA检测方法临床运用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 最佳反应体系和反应条件的确定 |
| 2.3.2 RT-exoRPA扩增反应的特异性检测 |
| 2.3.3 RT-exoRPA扩增反应的灵敏性检测 |
| 2.3.4 临床样品检测结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 H5 亚型禽流感病毒RT-EXORPA检测方法的建立及初步应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株及来源 |
| 3.1.2 临床样品来源 |
| 3.1.3 试验试剂及配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 相关生物学软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 病毒RNA的提取 |
| 3.2.2 病毒RNA浓度的测定 |
| 3.2.3 RT-exoRPA反应体系的建立 |
| 3.2.4 H5-RT-exoRPA扩增反应的特异性检测 |
| 3.2.5 H5-RT-exoRPA扩增反应的灵敏性检测 |
| 3.2.6 H5-RT-exoRPA检测方法临床运用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 最佳反应体系和反应条件的确定 |
| 3.3.2 H5-RT-exoRPA扩增反应的特异性检测 |
| 3.3.3 H5-RT-exoRPA扩增反应的灵敏性检测 |
| 3.3.4 临床样品检测结果 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 H7 亚型禽流感病毒RT-EXORPA检测方法的建立及初步应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株及来源 |
| 4.1.2 临床样品来源 |
| 4.1.3 试验试剂及配制 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.1.5 相关生物学软件 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 病毒RNA的提取 |
| 4.2.2 病毒RNA浓度的测定 |
| 4.2.3 H7-RT-exoRPA反应体系的建立 |
| 4.2.4 H7-RT-exoRPA扩增反应的特异性检测 |
| 4.2.5 H7-RT-exoRPA扩增反应的灵敏性检测 |
| 4.2.6 H7-RT-exoRPA检测方法临床运用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 最佳反应体系和反应条件的确定 |
| 4.3.2 H7-RT-exoRPA扩增反应的特异性检测 |
| 4.3.3 H7-RT-exoRPA扩增反应的灵敏性检测 |
| 4.3.4 临床样品检测结果 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 H7N9 亚型禽流感病毒RT-EXORPA检测方法的建立及初步应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株及来源 |
| 5.1.2 临床样品来源 |
| 5.1.3 试验试剂及配制 |
| 5.1.4 主要仪器设备 |
| 5.1.5 相关生物学软件 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 病毒RNA的提取 |
| 5.2.2 病毒RNA浓度的测定 |
| 5.2.3 H7N9-RT-exoRPA反应体系的建立 |
| 5.2.4 H7N9-RT-exoRPA扩增反应的特异性检测 |
| 5.2.5 H7N9-RT-exoRPA扩增反应的灵敏性检测 |
| 5.2.6 H7N9-RT-exoRPA检测方法临床运用 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 最佳反应体系和反应条件的确定 |
| 5.3.2 H7N9-RT-exoRPA扩增反应的特异性检测 |
| 5.3.3 H7N9-RT-exoRPA扩增反应的灵敏性检测 |
| 5.3.4 临床样品检测结果 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 高致病性H7 亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 毒株及来源 |
| 6.1.2 临床样品来源 |
| 6.1.3 试剂 |
| 6.1.4 主要设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 样品的制备 |
| 6.2.2 病毒RNA核酸的提取 |
| 6.2.3 引物的设计与筛选 |
| 6.2.4 反应体系与反应程序 |
| 6.2.5 荧光RT-PCR方法反应母液的选择 |
| 6.2.6 反应体系的优化 |
| 6.2.7 结果阈值的设定 |
| 6.2.8 特异性性试验 |
| 6.2.9 灵敏性试验 |
| 6.2.10 临床运用 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 引物和探针选取与设计 |
| 6.3.2 最优引物与探针筛选 |
| 6.3.3 最佳荧光RT-PCR方法反应母液的确定 |
| 6.3.4 反应体系的优化 |
| 6.3.5 结果判定标准的确定 |
| 6.3.6 特异性试验结果 |
| 6.3.7 检测灵敏度 |
| 6.3.8 对临床样品的检测 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 全文讨论与总结 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:攻读硕士学位期间发表文章及专利 |
（6）H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 样品的准备 |
| 1.5 单引物单模板验证 |
| 1.6 H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重 RT-PCR检测方法的建立 |
| 1.7 敏感性试验 |
| 1.8 重复性试验 |
| 1.9 特异性试验 |
| 1.10 三重RT-PCR方法对临床样品的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单引物单模板验证 |
| 2.2 H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR方法的建立 |
| 2.3 敏感性试验 |
| 2.4 重复性试验 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 三重RT-PCR方法对临床样品的检测 |
| 3 结论与讨论 |
（7）H9N2亚型禽流感病毒株遗传演化分析及HA和NA基因核酸标准品的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 H9N2亚型禽流感病毒概述 |
| 1.1 H9N2 亚型流感病毒的流行病学调查 |
| 1.2 H9N2 亚型禽流感病毒流行及变异情况 |
| 1.3 H9N2 亚型禽流感病毒的危害 |
| 1.4 H9N2 亚型禽流感病毒的诊断技术 |
| 1.5 核酸标准物质的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 18株H9N2 亚型禽流感病毒分离株分子流行趋势的研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 H9N2 亚型禽流感病毒HA基因不同分支特异荧光方法的建立 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 H9N2 亚型禽流感病毒HA基因和NA基因标准品的研制 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）蛋白芯片方法检测AIV抗体并区分其H5和H7亚型抗体的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 禽流感病毒的研究进展 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 禽流感病毒的危害及公共卫生意义 |
| 2 禽流感病毒的诊断方法 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 分子生物学诊断技术 |
| 2.3 血清学诊断技术 |
| 3 禽流感病毒单克隆抗体的研究进展 |
| 4 蛋白芯片技术 |
| 4.1 蛋白芯片技术的原理 |
| 4.2 蛋白芯片技术的应用 |
| 4.3 蛋白芯片技术的优点 |
| 5 研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病毒、细胞、鸡胚和实验动物 |
| 1.2 菌株、载体以及主要生物试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病毒的增殖及纯化 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 2.4 细胞融合 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.6 杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.7 单克隆抗体腹水的制备 |
| 2.8 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 H5N6抗原的制备 |
| 3.2 间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 免疫小鼠效价的测定 |
| 3.4 细胞融合 |
| 3.5 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.6 抗体效价测定 |
| 3.7 单克隆抗体亚型测定 |
| 3.8 单克隆抗体特异性检测 |
| 3.9 Western blot检测 |
| 3.10 IFA检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H5N1-HA1、H7N3-HA1和H3N2-NP重组蛋白的表达与纯化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA的提取 |
| 2.2 反转录 |
| 2.3 目的基因的扩增 |
| 2.4 感受态细胞的制备 |
| 2.5 原核表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白在原核系统中的表达 |
| 2.7 抗原的制备 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 目的基因的扩增 |
| 3.2 重组载体的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达与筛选 |
| 3.4 重组蛋白的鉴定 |
| 3.5 重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.6 重组蛋白纯化后的western blot分析结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 AIV及其H5和H7亚型抗体蛋白芯片检测方法的构建及优化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 蛋白芯片的原理示意图 |
| 2.2 蛋白芯片的制备 |
| 2.3 禽流感和其他禽病病毒的阳性血清的制备 |
| 2.4 H5、H7和NP阻断MAbs的筛选 |
| 2.5 蛋白芯片检测条件的优化 |
| 2.6 蛋白芯片方法的特异性 |
| 2.7 蛋白芯片方法的敏感性 |
| 2.8 蛋白芯片重复性试验 |
| 2.9 蛋白芯片试剂盒有效性验证 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 禽流感和禽病毒病的阳性血清的制备 |
| 3.2 H5、H7和NP阻断MAbs的筛选 |
| 3.3 蛋白芯片检测条件的优化 |
| 3.4 蛋白芯片方法优化后的具体操作步骤 |
| 3.5 蛋白芯片方法的特异性 |
| 3.6 蛋白芯片方法的敏感性 |
| 3.7 蛋白芯片重复性试验 |
| 3.8 蛋白芯片试剂盒有效性验证 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（9）禽流感病毒的核酸分（论文提纲范文）
| 1 基于聚合酶链式反应技术 (P olyme ra s e Cha in Re a ction, P CR) |
| 1.1 反转录PCR技术 (reverse transcription PCR, RT-PCR) |
| 1.2 荧光定量PCR技术 (quantitative real-time PCR, q PCR) |
| 1.3 数字PCR技术 |
| 1.3.1 微滴数字PCR技术 (droplet digital PCR, dd PCR) |
| 1.3.2 微流控芯片数字PCR技术 (chip digital PCR) |
| 2 环介导等温扩增反应 (LAMP) |
| 3 重组酶聚合酶扩增技术 (re combina s e polyme ra s e a mplifica tion, RP A) |
| 4 小结与展望 |
（10）H7N9亚型禽流感病毒检测方法的建立及标记疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 符号说明 综述 参考文献 第一章 |
| 鉴别九种禽流感病毒神经氨酸酶基因的一步法多重探针组合rRT-PCR方法的建立 1 |
| 材料与方法 2 |
| 结果 3 |
| 讨论 参考文献 第二章 |
| 快速检测H7亚型禽流感病毒的免疫胶体金试纸条的研制 1 |
| 材料 2 |
| 方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 参考文献 第三章 |
| H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制 1 |
| 材料与方法 2 |
| 结果 3 |
| 讨论 参考文献 第四章 |
| 区分H7N9亚型禽流感标记疫苗免疫血清和野毒株感染血清的竞争抑制ELISA方法的建立 1 |
| 材料 2 |
| 方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 参考文献 全文总结 致谢 攻读博士学位期间发表的论文 |
四、RT-PCR快速诊断禽流感（论文参考文献）
- [1]H5亚型AIV荧光RT-PCR、数字PCR方法建立及HA单抗的重组表达[D]. 刘琳. 中国农业科学院, 2020
- [2]永川地区规模养鸡场H5亚型禽流感病原学检测和免疫效果分析[D]. 郑鸿. 西南大学, 2020(01)
- [3]基于交流动电效应与阻抗免疫传感的禽流感快速诊断方法研究[D]. 侯力嘉. 重庆理工大学, 2020(08)
- [4]禽流感病毒H7N9亚型实验室检测技术研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,张颖,苗立中,王玉茂. 家禽科学, 2019(06)
- [5]禽流感病毒RT-exoRPA和荧光RT-PCR检测方法的建立和初步应用[D]. 王潇. 华南农业大学, 2019(02)
- [6]H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立[J]. 赵冬敏,吴青,赵翰飞,刘青涛,杨婧,黄欣梅,刘宇卓,韩凯凯,毕可然,李银. 江苏农业科学, 2019(09)
- [7]H9N2亚型禽流感病毒株遗传演化分析及HA和NA基因核酸标准品的研制[D]. 李玥. 吉林农业大学, 2019(03)
- [8]蛋白芯片方法检测AIV抗体并区分其H5和H7亚型抗体的初步研究[D]. 肖倩. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]禽流感病毒的核酸分[J]. 陈淑蕾,张海文,王学梅,吴科榜,管庆丰. 养禽与禽病防治, 2019(03)
- [10]H7N9亚型禽流感病毒检测方法的建立及标记疫苗的研制[D]. 孙志豪. 扬州大学, 2018(05)