一、硫氧还蛋白及其L79K变体酶切后片段自身重新结合为同源二聚体的稳定性和动力学研究（论文文献综述）
庞雨[1]（2021）在《牛乳蛋白在大肠杆菌中的异源表达和组合合成》文中认为
周星茹[2]（2021）在《耐辐射奇球菌DNA修复相关聚合酶的功能研究》文中认为耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）对于电离辐射、干燥、紫外线和多种化学诱变剂等胁迫都具有极强的抗性,是研究DNA损伤修复系统的模式生物。由于几乎所有的DNA修复途径都需要DNA聚合酶的参与,因此研究耐辐射奇球菌的DNA修复相关聚合酶有助于深入了解生物体的DNA损伤修复机制。耐辐射奇球菌基因组共编码了三个DNA聚合酶:PolⅠ,PolⅢ和PolX。其中,PolⅢ是主要的DNA复制聚合酶,PolⅠ和PolX参与DNA修复。研究表明,DrPol1在耐辐射奇球菌特有的合成依赖型链退火（ESDSA）修复途径中发挥核心功能,DrPolX参与双链断裂修复（DSBR）和碱基切除修复（BER）途径,本文从聚合酶活性、核酸酶活性及二者之间的调控等方面系统地研究了DrPol1和DrPolX的体内外功能。DrPol1属于A家族DNA聚合酶,具有相对独立的DNA聚合酶结构域（KlenDr）和核酸酶结构域（DrPol1-NTD）。本文分别表达纯化了DrPol1全长及其截短结构域,鉴定了DrPol1与DNA修复相关的生化特性:KlenDr是一个不依赖于3′-5′校正核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶,其核苷酸插入的准确性可能与手指结构域中N-helix和O-helix之间相对灵活的连接方式相关;不同于大肠杆菌中的同源物,KlenDr偏好于结合Gap DNA而非DNA复制中常见的引物-模板DNA。酶动力学分析结果显示,DrPol1-NTD具有与大肠杆菌和人类FEN1蛋白类似的Flap核酸内切酶活性,但其Gap核酸内切酶活性比后两者高100倍以上;DrPol1-NTD还能高效地切割更加复杂的Holliday Junction结构。同时,表型实验发现DrPol1-NTD的敲除菌株对紫外线和γ射线的敏感性显着升高。此外,研究还表明聚合酶结构域是DrPol1 DNA结合能力的主要贡献者,能提高DrPol1对复杂DNA底物的核酸酶活性;DrPol1在体外会先对引物-模板底物进行聚合再进行酶切。DrPolX属于X家族DNA聚合酶,具有聚合酶结构域（PolX-core）和组氨酸醇磷酸酶结构域（PHP）,但二者需要协同才能正常工作。DrPolX的DNA结合能力主要来自PolX-core,而PHP结构域能帮助PolX-core稳定蛋白结构和识别无碱基（AP）位点。除了已知的3′-5′核酸外切酶活性,生化分析发现DrPolX还具有BER途径所需的AP核酸内切酶活性。点突变蛋白DrPolXH334A缺失了90%以上的AP核酸内切酶活性,但保留了3′-5′核酸外切酶活性,而DrPolXD339A的活性变化则恰好与之相反。不同于其他X家族DNA聚合酶的“DDD”催化中心,DrPolX的活性中心由“AEE”组成,但体外未能观察到DrPolX的聚合活性。体内实验发现drpol X敲除菌株对烷化剂和紫外线的抗性并未显着下降,表明DrPolX在BER修复途径中的功能可能存在其他同功酶的补偿。综上所述,本文系统地表征了耐辐射奇球菌DrPol1和DrPolX中多种DNA修复相关的生化特性,探索了DrPol1和DrPolX中核酸酶与聚合酶结构域之间的协作,并在体内验证了它们对于耐辐射奇球菌极端抗性的作用。研究结果拓宽了对耐辐射奇球菌DNA修复相关聚合酶的功能认知,也为深入了解生物体的DNA损伤修复系统提供了重要补充。
赵春梅[3]（2020）在《甜瓜叶绿素缺失突变体生理与光合特征及突变分子机制研究》文中提出甜瓜（Cucumis melo L.）以其香甜可口、香气袭人的品质深受广大消费者钟爱。黑龙江省是我国薄皮甜瓜的重要商品基地,薄皮甜瓜生产面积高达7万hm2左右。甜瓜的品质特别是糖分的含量是影响效益的关键因素,而果实中的糖分主要由光合作用产物通过相应的代谢过程转化形成,如果光合作用受阻势必影响甜瓜糖分的转化。叶片是光合作用的器官,叶色突变直接影响作物的光合作用。叶色突变体对研究植物的叶绿素的生物合成、光合作用机理、叶绿体的结构与功能以及叶绿体生理生化过程、质体遗传、质体-核信号传递以及蛋白-蛋白互作等具有特殊研究价值。在育种工作中,叶色突变作为直观的形态学标记用于杂交制种和良种繁育过程中具有重要意义。甜瓜叶绿素缺失突变体,是栽培品种自发突变产生的突变,目前对叶色变异的机理尚未明确,特别是突变体对光合作用的影响还不清楚,因此通过对突变体光合特征、抗氧化生理特征以及叶绿体蛋白表达差异性进行研究,并以此为突破口研究突变体叶绿体代谢路径以及生理变化,以及基因突变相关的分子机制,且应用相关理论提高甜瓜品质。主要研究结果如下:1.甜瓜叶绿素缺失突变体整个生长周期都较野生型矮小,果实大小、折光糖含量以及结果数量与野生型差别不显着。突变体叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量都显着低于野生型,类胡萝卜素含量无显着差异,说明叶色变化主要由总叶绿素减少导致。突变体叶绿素前体物质UrogenⅢ显着减少,推测叶色突变可能与UrogenⅢ合成减少有关。并且突变体中有大量叶绿素前体物质5-氨基乙酰丙酸（ALA）积累。2.甜瓜突变体净光合速率、气孔导度和蒸腾速率降低,胞间CO2浓度升高。突变体叶绿素荧光参数除ΦPSⅡ没有显着变化外,F0、Fm、Fv/Fm、q P值都显着下降。突变体光补偿点升高,光饱和点降低;CO2补偿点降低,CO2饱和点升高;并且净光合速率日变化也较低。这说明叶绿素减少对突变体光合作用影响较大,但是突变体通过提高q N来保护PSⅡ,减少光抑制,并且增加胞间CO2浓度以及升高CO2饱和点等方式提高光合效率。3.甜瓜突变体中电导率升高,活性氧分子(O2·-、H2O2)与丙二醛含量增加,说明突变体细胞处于氧化胁迫状态。突变体中LOX活性下降,以及SOD、POD、CAT以及APX活性显着升高,这可以减少细胞内超氧化反应发生及清除多余的活性氧分子。同时脯氨酸含量升高,这对减少膜脂氧化以及保持质膜渗透性有重要作用。4.运用比较蛋白质组学方法分析了突变体和野生型甜瓜叶绿体蛋白质组的差异表达。分离突变体和野生型甜瓜的叶绿体并提取叶绿体蛋白,经Label-freeLC-MS/MS分析共检测到2569个多肽,来自于475个蛋白,其中189个上调表达,32个下调表达,选取表达比>+/-4.0且P<0.05蛋白作为差异表达蛋白,并运用|log2Ratio|≥1且p<0.05进行校正。经过GO分析和Pathway分析显示不同表达蛋白主要与结合、催化反应、细胞结构、物质转运和抗氧化等生物过程相关。差异表达蛋白涉及到卟啉和叶绿素代谢、碳代谢、核糖体、乙醛酸、碳固定等代谢过程。ALA是叶绿素合成的前体物质,谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶（GSAM）是ALA合成过程的主要酶,突变体中GSAM的丰度增加了6.08倍,同时GSAM辅酶磷酸吡哆醛的合成蛋白也增加了5.02倍。光系统亚基蛋白则主要下调表达,psa D、psa A、psa C、psa B和psb L分别下降2.01、1.59、1.43、1.11和1.06倍。碳固定过程中的多个酶的表达也发生了变化,如1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基、甘油醛3-磷酸脱氢酶亚基,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、叶绿体转酮酶分别上调2.31、2.5、2.5和3.75倍。RNA识别蛋白（RRM）表达降低了5.22倍,脂肪氧合酶降低了2.95倍,过氧化氢酶（CAT）表达增加6.22倍。以上结果说明叶绿素前体ALA的合成过程与叶绿素缺失关系密切,光系统受到破坏,整个叶绿体内代谢发生改变,并且叶绿体内环境处于氧化胁迫状态。5.甜瓜突变体中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶含量是野生型的3.8倍,苹果酸脱氢酶的含量也都上调表达,并且PEPC、NADP-ME和NAD-ME这三个酶在甜瓜突变体内活性都呈现增强趋势。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶都是C4循环及景天酸代谢过程中重要的酶,并且多条与CO2释放有关KEGG路径发生变化。因此推测在甜瓜中应该存在C4途径,在正常生长环境下甜瓜主要以C3循环方式固定CO2,而在叶绿素缺失或环境胁迫下则加强C4方式固定CO2。6.对突变体和野生型中下调和上调表达差别最大的蛋白RRM和GSAM进行分析,选择适合的多肽序列制备多可克隆抗体。对突变体和野生型叶绿体蛋白进行Western blot杂交分析。试验结果是突变体中RRM蛋白下调表达,而GSAM上调表达,与质谱分析结果一致,说明质谱检测结果可靠,可用于后续研究工作。7.应用实时荧光定量PCR技术对差异表达较大的Actin、RRM、GSAM、CAT、RCA、psa D、AOR、氨基转移酶1和磷酸吡哆醛合成蛋白9个蛋白基因进行m RNA水平上的表达分析。结果显示突变体和野生型的actin和RRM在m RNA水平表达差异不显着,除了RCA其他蛋白在m RNA水平的表达趋势与蛋白表达相反呈现降低表达。这说明突变体中这些蛋白主要在转录水平进行调控表达。8.RRM蛋白减少是导致突变体叶绿素缺失的候选基因蛋白,其作用可能与GSAM催化过程密切相关。9.构建了用于敲除RRM基因的Crispr/Cas9表达载体,并成功敲除拟南芥rrm基因,T2代叶色变浅,说明RRM与叶色变化有关。
朱方剑[4]（2020）在《二硫键理性设计提高Thermobifida fusca角质酶热稳定性研究》文中提出聚酯纤维,商品名称涤纶（Poly ethylene terephthalate,PET纤维）,具有弹性好、耐磨性好、强度高、抗褶皱以及干燥快等优点,是纺织工业中产量增长最快的合成纤维之一。PET纤维是由对苯二甲酸和乙二醇脱水聚合形成的聚酯材料,疏水性强,不易染色,严重影响了其纺织品的品质。利用Thermobifida fusca来源的角质酶可水解PET纤维中的酯键,产生亲水性的-COOH和-OH基团以提高其亲水性。然而因PET高度结晶,降低了角质酶对PET纤维中聚酯链的可及性,严重影响角质酶的催化效率。因此,可选用接近或高于PET的玻璃态转变温度（69-80℃）进行酶处理。而T.fusca角质酶在该温度条件下热稳定性差,需通过分子改造提高其热稳定性,以满足应用需求。本研究以质粒pET-20b（+）-cut为模板,以定点突变的方式获得了一株热稳定性和pH稳定性显着提高且其他优良性状均保持不变的突变体D204C/E253C,并通过突变优化、共表达、无信号肽等方式实现了突变体D204C/E253C的高效可溶性表达。和野生型T.fusca角质酶相比,选用突变体D204C/E253C在80℃条件下对PET纤维进行亲水改性,效果提升显着。主要研究结果如下:（1）二硫键理性设计提高T.fusca角质酶热稳定性:以质粒pET-20b（+）-cut为模板,通过理性设计,以定点突变的方式引入二硫键,获得11株突变体。对突变体的热稳定性研究表明,突变体D204C/E253C的热稳定性显着提高,相比于野生型T.fusca角质酶在70℃保温10 min后仅残留10.7%的活性,突变体D204C/E253C在此条件下酶活未有下降,在80℃的半衰期可达16 h,即使在90℃保温10 min,仍具有55.6%的活性。纯化野生型T.fusca角质酶和突变体D204C/E253C,比较了两者的酶学性质,结果表明,突变体D204C/E253C除热稳定增强之外,pH稳定性也显着提升。（2）突变体D204C/E253C的高效可溶性表达:（a）在pET-20b（+）-D204C/E253C的基础上进行优化突变,酶活提升3.89倍,是E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cut的62.5%;（b）以构建重组菌E.coli Origami B（DE3）/pSCDsbC-D204C/E253C的方式,将突变体D204C/E253C与二硫键异构酶Dsb C在大肠杆菌trxB/gor突变株E.coli Origami B（DE3）中的共表达,从而使突变体D204C/E253C能够进行正常的可溶性表达,胞外酶活达61 U·mL-1,是E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cut的1.09倍;（c）构建重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-D204C/E253C,除去角质酶表达时的信号肽,显着提高了其可溶性表达,胞外酶活达192 U·mL-1,是E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cut的3.43倍;延长诱导时间至48 h时,胞外酶活可达351 U·mL-1,是E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cut的6.26倍。（3）突变体D204C/E253C发酵制备及在PET纤维亲水改性中的应用:将突变体D204C/E253C进行3-L罐高密度发酵,全细胞酶活最高可达1449 U?mL-1。突变体D204C/E253C在80℃条件下处理后的PET纤维,其润湿性显着提高,润湿时间降为6.3 s,比野生型T.fusca角质酶在50℃条件下处理后的PET纤维提高了1.62倍。进一步进行SEM分析显示,突变体D204C/E253C在80℃条件下处理的PET纤维表面蚀刻痕迹比野生型T.fusca角质酶在50℃条件下处理的更多,更加明显。
邹杭[5]（2019）在《硫化氢信号分子在大豆-根瘤菌共生固氮体系中的调控作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理豆科植物不仅种类繁多而且分布广泛,由于绝大多数豆科植物可以与土壤中的根瘤菌形成互利共生的关系,并且通过共生固氮满足自身对于氮素营养的大部分需求。Sinorhizobium fredii Q8菌株是从陕西省杨凌区农田土壤中分离得到的一株根瘤菌,与西北地区广泛种植的大豆中黄13品种具有优良的结瘤和固氮性能。本文以S.fredii Q8以及大豆中黄13品种为主要研究材料,通过转录组、基因敲除及互补,结合荧光探针观察等方法研究H2S信号分子及其代谢酶在S.fredii Q8与大豆植株结瘤和固氮过程中的作用及其发挥作用的机制。首先,使用NaHS作为外源H2S供体处理大豆植株后,植株根部以及根瘤内的H2S含量有了较为明显的增加。同时在接种根瘤菌S.fredii Q8之后,大豆植株在经过NaHS处理之后植株的长势有了显着的提高,根长、株高、地上部分以及根部的干重都有了显着增加。光合作用速率以及叶绿素荧光参数的测量表明,经过NaHS处理的植株叶片中,叶绿素含量以及净光合速率都高于对照组植株。在共生能力方面,经过外源H2S处理的大豆植株的结瘤数量也显着高于对照组植株。不仅如此,外源H2S处理还促进了大豆根瘤的固氮能力,固氮酶活性测定结果显示经过NaHS处理的大豆植株所结根瘤内部的固氮酶活性要显着高于未处理的对照组根瘤。而qRT-PCR分析发现,外源H2S处理可以促进共生相关基因如根瘤菌nodA、nodC、nodD以及大豆根部GmENOD40、GmERN、GmNSP2b、GmNIN1a/2a/2b的表达。此外,与氮代谢相关的GmGOGAT、GmAS、GmNiR、GmSAT1、GmLb等基因的表达量也在经过NaHS处理的植株根部有所上调。这些结果说明外源H2S处理可以促进S.fredii Q8与大豆植株的共生与结瘤,并且对大豆根瘤的固氮能力具有促进作用。由于固氮作用的提升,大豆植株的氮素供应较为充足,这也促进了叶绿素的合成以及光合作用的进行,从而提高了大豆植株的碳同化能力,最终使得大豆植株的长势得到促进。其次,通过H2S特异性荧光探针观察后发现,在大豆根瘤的固氮区有大量内源H2S产生。将S.fredii Q8编码cystathionineγ-lyase（CSE）的CSE基因敲除之后,?CSE突变体根瘤菌内源H2S的产量显着降低,并且用?CSE菌株接种大豆植株形成的根瘤内部H2S的产生也受到了明显的抑制。在接种?CSE菌株的大豆根瘤中,不仅内源H2S含量较低,固氮酶活性也显着低于接种野生型菌株WT以及互补菌株Cp?CSE所形成的根瘤。透射电镜的观察发现,虽然?CSE根瘤的外部形态和大小与WT菌株所结根瘤没有显着差异,但是固氮区根瘤细胞内类菌体以及共生体膜的形态都发生了与氧化胁迫条件下相似的变化。不仅如此,内源H2S的不足还会导致根瘤中过氧化氢等活性氧分子（ROS）的积累和氧化损伤的出现。与此同时,H2S含量降低也促进编码抗氧化酶基因的表达以及酶活性的增加。这些结果说明,大豆根瘤的内源H2S可以通过其抗氧化作用维持大豆根瘤内的固氮酶活性,促进大豆的共生固氮作用。最后,根瘤菌的3-mercaptopyruvate sulfurtransferase（3MST）对于S.fredii Q8对大豆中黄13品种的侵染能力也具有很显着的影响。将编码3MST的sseA基因敲除之后,?3MST菌株与大豆中黄13植株共生所形成的根瘤虽然数量明显增加,但都是豆血红蛋白含量极低而且几乎没有固氮能力的无效根瘤。石蜡切片和透射电镜观察根瘤的显微结构以及超微结构发现,?3MST菌株在根瘤细胞内的侵染和定殖能力受到了破坏,类菌体数量极少而且形态出现了明显的畸形。同时,3MST的缺失还会抑制S.fredii Q8 III型分泌系统与结瘤相关的效应蛋白NopX的分泌。通过转录组分析发现,在接种?3MST菌株后1h与3h内差异表达基因较多。通过KEGG通路富集分析发现,接种?3MST菌株与接种WT菌株对植物的与病原物互作通路中的基因的表达影响最为显着。通过qRT-PCR实验发现,在接种WT菌株后1 h,大豆植株根部的与病原物相关的防御基因的表达会被抑制,而在接种?3MST菌株的大豆中,这些与病原物防御反应相关的基因的表达不仅没有受到明显的抑制,少数防御基因的表达量还会出现上调的情况。
王先坤[6]（2019）在《杀稻瘟菌素生物合成中氨酰基转移酶BlsK和甲基转移酶BlsL的研究》文中提出杀稻瘟菌素blasticidin S（BS）是肽核苷类抗生素家族的一员,最早从Streptomyces griseochromogenes中发现并分离纯化得到,它是首个替代有机汞农药用于防治水稻稻瘟真菌病的生物制剂,其作用机制是通过抑制蛋白质合成,从而达到杀死病原菌的作用。由于其活性高于有机汞,且对鱼类无害,BS曾经在日本等亚洲市场广泛应用,取得了良好的防治效果;由于哺乳动物细胞对BS的高敏感性,BS目前主要用作真核细胞转基因工程筛选试剂。BS原始产生菌S.griseochromogenes的遗传操作困难,阻碍了其生物合成途径的研究。为了克服这种不足,BS的生物合成基因簇被嫁接到了变铅青链霉菌S.lividans基因组上,并敲除其中的脱氨酶（deaminase）基因-SLBSD,获得了BS的异源表达菌株WJ2。WJ2发酵产物分析发现除了最终产物BS外,还有三种与BS核心结构相似的代谢物,即去甲基杀稻瘟菌素demethylblasticidin S（DBS）、亮氨酰去甲基杀稻瘟菌素leucyldemethylblasticidin S（LDBS）和亮氨酰杀稻瘟菌素leucylblasticidin S（LBS）。这三种中间物与最终产物在体内合成的先后顺序是怎样的,以及哪些蛋白参与了它们之间的相互转化?这些问题尚不清楚,本研究主要针对上述问题,最终确定BS的生物合成途径。BS的生物合成基因簇于2003年报道,其必需基因簇包含从blsD,E,F,G,H,I,J,K到L的同向开放阅读框以及反向排列的blsM。BS生物合成的最初步骤是通过BlsM将CMP水解产生胞嘧啶,然后通过BlsD将游离胞嘧啶转移至葡萄糖醛酸产生胞嘧啶葡萄糖醛酸（CGA）,除此之外,其他编码蛋白的功能未知。本研究聚焦于BS合成过程中的中间产物DBS的亮氨酰化,因为加载亮氨酰基团之后的LDBS和LBS抑菌活性显着下降。在最终产物BS中,亮氨酰被PepN水解掉,因此亮氨酰基团的加载被认为是BS产生菌独特的自我保护机制。blsK和blsL是BS生物合成基因簇中排列靠后的两个基因,序列比对发现许多蛋白与BlsK同源,但全都被注释为未知功能的蛋白,这暗示它们组成了一个新的蛋白家族。blsK基因突变株WXK3不再产生LDBS和LBS,只有DBS和微量的BS积累,暗示BlsK负责了DBS或BS的亮氨酰化。纯化的BlsK与DBS孵育时不能形成LDBS,而过表达BlsK的无细胞抽提液（CFE）却能催化生成LDBS,暗示CFE中存在BlsK活性必需的辅因子。我们发现当向CFE中添加RNase A时,LDBS不再生成;当向纯化的BlsK体外反应体系中加入tRNAs时,LDBS可以生成;当补加亮氨酰tRNA合成酶（LRS）时,LDBS生成效率进一步提高。当以制备的Leu-tRNALeu为底物时,BlsK可以直接将亮氨酰基团转移到DBS上生成LDBS,这说明BlsK是一个亮氨酰tRNA依赖的氨酰基转移酶。当反应体系中亮氨酸过量时,BlsK能在LDBS亮氨酰的α氨基上加载第二个亮氨酸生成LLDBS;以上结果说明在BS的生物合成途径中,BlsK负责催化亮氨酸加载到DBS上形成LDBS。在纯化BlsK的过程中,我们注意到蛋白溶液呈棕红色,无还原剂DTT保护或长时间暴露在空气中时容易沉淀,推测BlsK是一个[Fe-S]蛋白。UV-VIS光谱分析发现BlsK蛋白溶液在420 nM左右有[Fe-S]簇的特征吸收峰。电子顺磁共振（EPR）分析显示BlsK有一个g=2.01（S=1/2）的信号,而当加入还原剂连二亚硫酸钠（DT）时信号消失。电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析确定了每一个蛋白含有3.253个Fe原子和4.336个S原子,以上结果显示BlsK含有一个[3Fe-4S]簇。为了确定哪些半胱氨酸参与了[3Fe-4S]簇的形成,我们将BlsK氨基酸序列中的9个半胱氨酸残基逐一突变成丝氨酸,发现C236S、C253S和C259S突变体蛋白变成无色,说明[3Fe-4S]簇被破坏;EPR分析检测突变体蛋白[3Fe-4S]簇特征信号消失,但却有Fe3+的信号,说明它们能螯合部分铁离子,但是无法形成完整的[3Fe-4S]簇。生化活性检测发现,突变体C236S、C253S和C259S催化蛋白生成LDBS的能力消失,而圆二色谱分析显示它们的二级结构和野生型蛋白整体相似,表明蛋白活性消失是由于[3Fe-4S]簇不完整导致的。当用不含有亚铁离子的M9培养基过表达BlsK时,蛋白都在沉淀中,这说明铁离子是BlsK正确折叠所必需的。在还原剂连二亚硫酸钠（DT）存在时,[3Fe-4S]1+被还原成[3Fe-4S]0,BlsK会催化产生一个新的不稳定的化合物,其结构还需进一步确定。前期工作中,WJ2缺失blsL基因后不再产生BS,积累的中间产物是DBS和少量LDBS。本研究发现,体外纯化的BlsL不能将DBS转化生成BS,而LDBS却能被高效地转化为LBS。我们测定了BlsL对这两个底物的酶动力学参数,发现BlsL对LDBS（Km≈106.8μM）的亲和力是DBS（Km≈304.8μM）的约3倍,但是BlsL对LDBS催化效率(kcat/Km≈1.475×10-22 mM-1S-1)是DBS(kcat/Km≈2.25×10-66 mM-1S-1)的约6556倍,这说明LDBS是BlsL真正的底物。它的亮氨酰基团对酶的催化活性有很大的影响,底物和酶的共晶结构或许能够解释活性上的差异。因此,这三个中间体与BS之间的转换关系为:BlsK催化亮氨酰基团加载到DBS生成LDBS后,BlsL催化加载一个甲基基团生成LBS,PepN再将亮氨酰基团水解,生成终产物BS。因为氨肽水解酶PepN水解LDBS生成DBS的效率和水解LBS生成BS的效率几乎一致,所以blsL基因缺失后,菌株积累的是大量的DBS而不是LDBS。本文通过对BS生物合成过程中BlsK和BlsL的系统研究,确证了BlsK是负责在DBS上加载亮氨酸生成LDBS的蛋白,它是一个亮氨酰tRNA依赖的氨酰基转移酶。BlsK蛋白中含有一个[3Fe-4S]簇,该[3Fe-4S]簇不仅与蛋白活性相关,而且在维持蛋白正确折叠上起作用。确认了BlsL是一个SAM依赖的甲基转移酶,它的底物是LDBS而非DBS,说明BlsK将DBS转化成LDBS不仅降低了毒性,也为BlsL提供了底物。总之,我们的研究揭示了BS合成途径中最后几个代谢产物DBS、LDBS和LBS合成的先后顺序以及它们之间的转化关系,完善了BS的生物合成途径。
毕继安[7]（2019）在《PRK基因在RSV侵染过程中的功能及对抗RSV药剂的响应》文中指出水稻条纹叶枯病是由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）引起的水稻病毒病。水稻感染RSV会呈现出叶片黄化、条纹甚至枯死,给粮食生产带来巨大损失。RSV在田间由灰飞虱传播侵染水稻,实验条件下可经摩擦接种侵染茄科作物本氏烟。寻找调控RSV侵染植物的寄主因子对于开发水稻条纹叶枯病防治新策略至关重要。本研究采用光合速率检测技术和叶绿素荧光检测技术分析了RSV侵染本氏烟前后植物叶片CO2同化能力和PSII光化学效率,结果显示两者都存在一定的下调,说明RSV侵染本氏烟能够降低植物的光合作用效率。进一步检测研究发现参与光合作用暗反应阶段的特异性酶PRK（phosphoribulokinase）在RSV侵染本氏烟和水稻后发生显着的下调表达。为明确PRK的生物学功能,我们采用TRV诱导的基因沉默技术将本氏烟中的Nb PRKs进行了系统沉默,沉默植株新生叶片呈现明显的褪绿,同时检测发现其CO2同化能力和PSII光化学效率存在明显下调,说明Nb PRKs的沉默能够降低植物的光合作用效率。为探究PRK对RSV侵染的影响,我们在沉默Nb PRKs的植株上摩擦接种RSV,发现RSV的侵染时间推迟,病毒症状减轻,病毒积累量减少;而在转基因过表达Nb PRKs本氏烟植株上摩擦接种RSV,发现RSV的侵染时间提前,病毒症状加重,病毒积累量增加。结合上述结果说明PRK可能在RSV侵染本氏烟和水稻过程中起负调节作用。随后,我们通过TRV诱导的基因沉默技术,将本氏烟中卡尔文循环相关基因Rb CS（Rubisco Small Subunit）和PGK（Phosphoglycerate kinase）进行了系统沉默,沉默植株新生叶呈现出不同程度的褪绿,其中沉默Nb Rb CS导致植株褪绿程度最严重,沉默Nb PGK其次,同时检测发现这些沉默植株的CO2同化能力和PSII光化学效率都有不同程度的降低,这说明卡尔文循环相关基因Nb Rb CS和Nb PGK的沉默同样降低了植物的光合作用效率。同样在沉默Nb Rb CS和Nb PGK的本氏烟上接种RSV后发现沉默植株的系统叶上RSV的发病时间都有不同程度的推迟,病毒症状减轻,病毒积累量也存在不同程度的减少,说明沉默Nb Rb CS和Nb PGK不利于RSV的侵染,RSV侵染需要卡尔文循环正常运行。为探究Nb PRKs在RSV侵染过程中的作用机制,我们采用高效液相色谱检测技术分析了光合作用的主要产物葡萄糖含量,结果显示:RSV侵染本氏烟后植株叶片葡萄糖含量减少;沉默Nb PRKs后葡萄糖含量明显减少,而过表达Nb PRKs后葡萄糖含量有一定程度的增加,说明Nb PRKs表达量的变化能影响植物中葡萄糖含量;接着,在沉默Nb PRKs的本氏烟上分别回补PRK的催化产物Ru BP（Ribulose-1,5-disphosphate）和葡萄糖后再接种RSV,发现相比对照植株病毒积累量有所增加,结合沉默Nb PRKs的植株不利于RSV的侵染、过表达Nb PRK的植株利于RSV的侵染这些结果,表明了RSV侵染本氏烟是需要葡萄糖的。在沉默Nb PRKs的植株上接种RSV后其病毒症状表现不严重,说明葡萄糖可能作为一种信号分子来响应病毒的侵染,进而来调节植物的抗性途径。因此我们认为葡萄糖在平衡植物自身发育和病毒侵染过程中起到了一定的平衡作用。同时,我们检测了葡萄糖的下游产物蔗糖和淀粉含量,结果显示沉默Nb PRKs后它们的含量都有一定程度的减少,说明Nb PRKs的下调表达也能降低植物的蔗糖和淀粉含量。我们采用转基因技术在水稻中过表达Os PRK,并检测了过表达Os PRK的水稻植株中葡萄糖含量变化,结果显示葡萄糖含量有所增加。这与本氏烟中过量表达Nb PRK引起葡萄糖含量变化的趋势一致。这为我们继续探索水稻中Os PRK对RSV侵染的影响指引了方向。我们采用q RT-PCR的方法检测了喷施抗RSV试剂宁南霉素后Nb PRKs的表达情况,结果显示Nb PRKs表达量明显下调,说明抗RSV试剂宁南霉素不但能在钝化病毒过程中起到关键作用,而且还可能通过调节Nb PRKs的表达量来增强植物的抗病性。综上所述,本文揭示了RSV侵染本氏烟破坏了卡尔文循环的正常运行,进而抑制了卡尔文循环相关基因（Nb PRK、Nb Rb CS、Nb PGK）的表达。进一步研究发现Nb PRK的沉默导致卡尔文循环的正常功能受到限制从而使RSV的侵染受到了抑制,而Nb PRK的过量表达促进了RSV的侵染,因此RSV的侵染需要卡尔文循环的正常运行。为探索PRK对RSV侵染的响应机制,我们检测了卡尔文循环终产物的转化产物葡萄糖含量,结果发现RSV侵染本氏烟后植株叶片葡萄糖含量降低,沉默Nb PRK后葡萄糖含量降低,而过表达Nb PRK后葡萄糖含量升高,因此我们推测RSV侵染本氏烟需要寄主的能量原料葡萄糖;同时,植物自身发育也需要葡萄糖,因此葡萄糖作为一种能量原料被植物自身和RSV竞争性利用。PRK对RSV所表现出的应答机制可能是通过改变葡萄糖含量来实现的,它可能作为一种信号分子来启动植物的防御反应,因此葡萄糖在平衡植物自身发育和响应RSV侵染上起着关键作用,这为我们深入理解RSV与寄主的作用关系提供新思路。
管徒晨[8]（2019）在《兼具GPx和SOD活性双功能抗氧化酶的原核表达与表征》文中进行了进一步梳理谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和超氧化物歧化酶（SOD）是机体抗氧化酶学防线的重要成员,已经有大量的研究证明了它们的重要作用。GPx和SOD相互协同清除多种活性氧（ROS）以保护机体免受氧化损伤,同时它们还能组成相互保护的防御体系,这种协同作用是机体正常代谢必不可少的,如果这种协同作用被破坏,可将ROS的损伤效应放大。基于两者的协同作用,获取含有GPx和SOD活性双功能抗氧化酶,相比于单功能抗氧化酶具有更高的应用价值。同时天然酶存在着稳定性差、来源少的缺点,极大限制了它们的应用,因此如何获得具有高活力、高稳定性的双功能抗氧化酶成为了我们的目标,基于这个目标,我们开展了以下研究工作:1.基于h GPx1与Ap SOD的双功能抗氧化酶的表达与表征联合使用半胱氨酸缺陷型表达系统和单一蛋白表达系统（SPP）,在人GPx1突变基因（h GPx1Ser）和庞贝蠕虫SOD基因（Ap SOD）的基础上设计构建了多种兼具GPx和SOD活性的双功能融合蛋白,对活力最高的Se-h GPx1Ser-L-Ap SOD的酶学性质进行了研究,并验证了该融合蛋白的协同作用。2.基于h GPx1与Ap SOD的双功能抗氧化酶的活力改善通过调整连接肽的长度,获得了更高活力的双功能融合蛋白,而新型硒蛋白表达系统（优化UTu表达系统）的使用则使得双功能融合蛋白的活力得到了显着改善,通过计算机辅助结构模拟探讨了结构与活力之间的关系。此外,对活力最高的融合蛋白Se-h GPx1UAG-l L-Ap SOD进行了表征。3.基于h GPx2与Ap SOD的双功能抗氧化酶的表达与表征为了更全面的考察双功能酶设计构建的可行性、合理性以及实用性,我们在人GPx2（h GPx2）和Ap SOD基因的基础上通过缺陷表达系统和优化后UTu表达系统获得了一系列新型双功能融合蛋白,其中Se-h GPx2UAG-l L-Ap SOD具有良好的活力和稳定性,对其酶学性质进行了研究。利用计算机辅助模拟分析比对各融合蛋白间结构与活力的关系,并通过体外实验验证了Se-h GPx2UAG-l L-Ap SOD的协同作用。
池昌标[9]（2018）在《酿酒酵母谷氧还蛋白Grx3的结构和功能研究》文中研究指明活性氧（ROS）会对生物大分子造成氧化损伤。活细胞利用谷氧还蛋白和硫氧还蛋白这两种氧化还原酶来维持氧化大分子氧化还原状态。酿酒酵母由3个双巯基谷氧还蛋白（Grx1、Grx2和Grx8）和5个单疏基的谷氧还蛋白（Grx3、Grx4、Grx5、Grx6和Grx7）来抵抗氧化应激或调节细胞铁代谢。grx3grx4双突变体对氧化应激高度敏感,并且会上调铁转录因子Aft2,导致细胞生长和细胞繁殖缺陷。这表明Grx3/4不仅在细胞抵御氧化应激过程中发挥重要作用,还可以通过与BolA-like蛋白Fra2相互作用来调节Fe感应转录因子Aft2的细胞定位,从而达到调节Fe代谢功能。Grx3和Grx4在序列和结构上高度同源,都是由一个N端Trx结构域连接一个C端Grx结构域组成。其中Grx结构域在细胞抵御氧化应激和存活中发挥作用。而Grx3和Grx4也可以通过Trx结构域在肌动蛋白动力学中发挥作用来帮助细胞抵抗氧化应激。目前还未阐明Grx3/4的两个结构域之间的相互作用及其如何与Fra2和Aft2协同调节细胞内的Fe平衡。我们解析了 Grx3的Trx结构域、Grx结构域的晶体结构以及Fra2的溶液结构。结构分析和酶活实验表明Trx结构域通过分子内二硫键Cys37-Cys176作用参与了 Grx3的谷胱甘肽转移酶活的活性。NMR滴定、pull-down实验以及表面等离子体共振实验表明Fra2可以通过helix-turn-helix motif与Grx结构域的C末端相互作用形成非共价二聚体。该二聚体结构与以前报道的Fe-S簇介导形成的共价二聚体不相同。比较发现,Fra2与Aft2的亲和力强于Grx3与Aft2或者Aft2与靶基因的亲和力。这些结构分析和生化实验结果更加清楚地阐明了 Grx3如何执行多种功能并协调Aft2控制的Fe代谢通路。
郭力维[10]（2018）在《水稻抗病蛋白Pia RATX1结构域识别稻瘟病菌效应蛋白的结构基础》文中研究指明水稻是重要的粮食作物之一,全球超过50%人口的主食。但其产量和品质长年受病害的影响,其中稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻的重要病害之一。选择适宜的抗病品种是控制植物病害最经济有效的方法。因此,深入了解水稻受体识别稻瘟病菌的分子机制,对水稻抗病品种进行遗传改良和合理布局具有重要意义。前人的研究发现,植物病原真菌中存在一类序列不相关、结构保守的效应因子,被命名为Magnaporthe oryzae AVRs 和 ToxB-like（MAX）effector。稻瘟病菌 MAX-effector 中,AVR-PikD、AVR1-CO39和AVR-Pia能被水稻抗病蛋白Pikp-1和RGA5非保守的金属离子结合结构域（HMA或RATX1）直接识别,激发寄主产生ETI免疫反应。目前已解析Pikp-HMA/AVR-PikD复合物晶体结构,证明HMA-effector的结合在Pikp调节抗病反应中具有重要作用。为了进一步了解受体蛋白Pia金属离子结合结构域（RGA5RATx1）识别其它MAX-effector的结构基础,本研究围绕RGA5AS、AVR1-CO39和AVR-Pia开展了蛋白质表达纯化和结构解析研究,并取得以下结果。利用气相扩散法获得RGA5AS/AVR1-CO39复合物晶体,X射线衍射分辨率为2.1 A。采用分子置换法解析了该复合物三维结构。结构显示,与AVR-PikD结合Pikp-HMA二聚体中的第二个单体的模式不同,AVR1-CO39与单体RGA5AS结合,结合界面位于RGA5AS同源二聚体互作面。由于柔性等原因,复合物结构中未发现RGA5AS C末端后47个氨基酸电子密度。ITC（Isothermal Titration Calorimetry）分析结果显示,末端缺失后47个氨基酸的金属离子结合结构域（RGA5RATx1）与RGA5AS结合力基本一致（Kd:5.4 μM和5.3 μM）,表明RGA5RATx1是参与效应蛋白AVR1-CO39结合的核心区域。ITC和分子筛层析技术（Gel filtration chromatography,GF）显示,突变 AVR1-CO39 互作面 β2-sheet 上的第 41 位苏氨基为甘氨酸,AVR1-CO39T41G不能与 RGA5AS结合。表明第41位苏氨酸是影响AVR1-CO39与RGA5AS结合的关键残基。本研究还开展了 RGA5AS与效应蛋白AVR-Pia复合物晶体生长条件的筛选,目前尚未获得该复合物的晶体。同源结构比较分析发现,AVR1-CO39/RGA5RATx1的结合界面同AVR-Pia/RGA5RATX1的结合界面高度重叠。特别是在AVR1-CO39关键残基T41相同的空间位置,位于AVR-Pia β1-sheet N端的残基F24是影响AVR-PiaH3结合RGA5RATx1、诱导ETI免疫反应的核心位点。体外 SV-AUC 和 GF 结果显示,RGA5AS/AVR1-CO39 与RGA5AS/AVR-Pia复合物分子量接近RGA5AS二聚体大小。该结果表明,与AVR1-CO39/RGA5RATX1互作模式相同,AVR-Pia与自身相互作用的RGA5RATx1产生竞争性结合,结合界面位于RGA5RATx1同源二聚体互作面。以上实验结果表明,水稻受体蛋白金属离子结合结构域与MAX-effector存在两种识别模式。其中,效应蛋白AVR1-CO39和AVR-Pia以相同的模式结合到RGA5AS二体互作面,与单体RGA5AS形成稳定的复合物,调控ETI免疫反应。该模式与AVR-PikD结合Pikp-HMA二聚体中第二个单体不同的模式存在显着差异。这些发现为进一步了解植物受体蛋白与真菌效应蛋白的识别分子机制提供新的理论依据。
二、硫氧还蛋白及其L79K变体酶切后片段自身重新结合为同源二聚体的稳定性和动力学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、硫氧还蛋白及其L79K变体酶切后片段自身重新结合为同源二聚体的稳定性和动力学研究（论文提纲范文）
（2）耐辐射奇球菌DNA修复相关聚合酶的功能研究（论文提纲范文）
| ACKNOWLEDGEMENTS |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 耐辐射奇球菌的研究进展 |
| 1.1.1 耐辐射奇球菌概述 |
| 1.1.2 耐辐射奇球菌的极端抗性机制 |
| 1.2 A家族DNA聚合酶研究进展 |
| 1.2.1 A家族DNA聚合酶概述 |
| 1.2.2 A家族DNA聚合酶的结构与功能 |
| 1.2.3 耐辐射奇球菌DrPol1的研究进展 |
| 1.3 X家族DNA聚合酶研究进展 |
| 1.3.1 X家族DNA聚合酶的分布与进化 |
| 1.3.2 X家族DNA聚合酶的功能 |
| 1.3.3 X家族DNA聚合酶的结构 |
| 1.3.4 耐辐射奇球菌DrPolX的研究进展 |
| 第2章 耐辐射奇球菌DrPol1聚合酶结构域的功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器与试剂 |
| 2.2.2 菌株及质粒 |
| 2.2.3 表达菌株的构建 |
| 2.2.4 点突变表达质粒的构建 |
| 2.2.5 KlenDr蛋白的诱导表达 |
| 2.2.6 KlenDr蛋白的纯化 |
| 2.2.7 序列比对及蛋白结构预测 |
| 2.2.8 KlenDr的生化活性分析 |
| 2.2.9 凝胶迁移实验(EMSA) |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 KlenDr的表达及纯化 |
| 2.3.2 KlenDr缺乏3′-5′核酸外切酶活性 |
| 2.3.3 KlenDr的聚合活性具有高保真性 |
| 2.3.4 KlenDr的保真性与N-helix与O-helix之间的连接区域相关 |
| 2.3.5 KlenDr偏好缺口和双链DNA底物 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 耐辐射奇球菌DrPol1核酸酶结构域的功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 仪器与试剂 |
| 3.2.2 菌株和质粒 |
| 3.2.3 蛋白纯化 |
| 3.2.4 核酸酶活性分析 |
| 3.2.5 酶动力学分析 |
| 3.2.6 Δpol1-NTD敲除菌株的构建 |
| 3.2.7 RT-PCR验证补偿基因的表达 |
| 3.2.8 表型与生存率的测定 |
| 3.2.9 生长曲线的测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Pol1-NTD的表达及纯化 |
| 3.3.2 DrPol1-NTD的5′-3′核酸外切酶活性分析 |
| 3.3.3 DrPol1-NTD的Flap核酸内切酶活性 |
| 3.3.4 DrPol1-NTD具有Gap核酸内切酶活性 |
| 3.3.5 DrPol1-NTD的FEN与GEN活性的酶动力学参数分析 |
| 3.3.6 DrPol1-NTD的Holliday Junction内切活性 |
| 3.3.7 DrPol1-NTD核酸酶活性的金属离子偏好性 |
| 3.3.8 ΔPol1-NTD突变菌株的验证 |
| 3.3.9 ΔPol1-NTD突变菌株的表型分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 DrPol1核酸酶与聚合酶结构域的协作 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种和质粒 |
| 4.2.2 蛋白表达与纯化 |
| 4.2.3 生化活性分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DrPol1蛋白的表达纯化 |
| 4.3.2 DrPol1及各结构域的DNA结合能力 |
| 4.3.3 DrPol1与DrPol1-NTD的核酸酶活性比较 |
| 4.3.4 DrPol1的聚合酶活性被核酸酶活性掩盖 |
| 4.3.5 DrPol1先发生聚合再发生酶切 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 耐辐射奇球菌DrPolX的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 蛋白表达与纯化 |
| 5.2.3 生化活性分析 |
| 5.2.4 drpolX敲除及补偿菌株的构建 |
| 5.2.5 突变菌株的表型分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 DrPolX及其截短蛋白的表达与纯化 |
| 5.3.2 DrPolX很可能缺乏聚合酶活性 |
| 5.3.3 DrPolX的AP核酸酶内切酶活性分析 |
| 5.3.4 DrPolX核酸内切酶与外切酶活性的调控 |
| 5.3.5 DrPolX及其截短蛋白的DNA结合能力分析 |
| 5.3.6 ΔpolX突变菌株的MMS敏感性未显着增加 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间研究成果 |
（3）甜瓜叶绿素缺失突变体生理与光合特征及突变分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 叶色突变体研究进展 |
| 1.1.1 叶色突变体的分类、来源及遗传模式 |
| 1.1.2 叶色突变体光合特性研究进展 |
| 1.1.3 叶色突变体生理特征 |
| 1.1.4 叶色突变发生的分子机制 |
| 1.2 蛋白质组学研究进展 |
| 1.2.1 蛋白质组学研究方法 |
| 1.2.2 叶绿体蛋白质组研究进展 |
| 1.2.3 比较蛋白质组学在叶色突变研究应用进展 |
| 1.3 Crispr/cas9 系统 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术在植物基因功能研究中的应用 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应 |
| 1.4 研究的目的、意义与主要内容 |
| 1.4.1 研究的目的、意义 |
| 1.4.2 研究的内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 甜瓜叶绿素缺失突变体生物学特征 |
| 2.2.2 甜瓜突变体与野生型光合特征分析 |
| 2.2.3 甜瓜突变体与野生型生理特性分析 |
| 2.2.4 甜瓜突变体和野生型叶绿体蛋白组分析 |
| 2.2.5 免疫印迹(Western Blot)实验 |
| 2.2.6 荧光定量PCR分析 |
| 2.2.7 RRM及 GSAM生物信息学分析 |
| 2.2.8 RRM CRISPR/CAS9 表达载体构建及植物转化 |
| 3 试验结果与分析 |
| 3.1 甜瓜突变体生物学特征 |
| 3.2 甜瓜突变体与野生型光合特性分析 |
| 3.2.1 突变体和野生型甜瓜叶绿素含量及叶绿素合成中间产物含量检测 |
| 3.2.2 光合速率的测定 |
| 3.2.3 叶绿素荧光动力学参数测定 |
| 3.2.4 光响应曲线和CO2响应曲线的测定 |
| 3.2.5 光合速率日变化 |
| 3.3 甜瓜突变体生理生化分析 |
| 3.3.1 甜瓜突变体与野生型活性氧分子含量及膜脂氧化分析 |
| 3.3.2 甜瓜突变体抗氧化酶活性分析 |
| 3.3.3 甜瓜突变体与野生型渗透调节物质分析 |
| 3.3.4 甜瓜突变体和野生型光合作用关键酶的检测 |
| 3.4 甜瓜突变体与野生型叶绿体蛋白质组分析 |
| 3.4.1 叶绿体分离 |
| 3.4.2 蛋白质浓度测定 |
| 3.4.3 蛋白质鉴定及定量结果 |
| 3.4.4 Gene Ontology(GO)功能注释 |
| 3.4.5 KEGG通路注释 |
| 3.4.6 蛋白质互作分析 |
| 3.5 免疫印迹(Western Blot)分析 |
| 3.6 荧光定量PCR分析 |
| 3.7 RRM及 GSAM生物信息学分析 |
| 3.8 RRM基因的CRISPR/CAS9 表达载体构建及植物转化 |
| 3.8.1 sgRNA设计 |
| 3.8.2 植物表达载体构建 |
| 3.8.3 拟南芥T_1代抗性筛选阳性植株突变测序鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 甜瓜突变体生物学特征分析 |
| 4.2 甜瓜突变体光合特性分析 |
| 4.2.1 甜瓜突变体叶绿素及叶绿素合成中间产物变化 |
| 4.2.2 甜瓜突变体光合特性变化 |
| 4.3 甜瓜突变体生理特性分析 |
| 4.4 甜瓜叶色突变体叶绿体蛋白质组分析 |
| 4.4.1 卟啉和叶绿素合成路径 |
| 4.4.2 光合磷酸化路径 |
| 4.4.3 碳固定途径 |
| 4.4.4 碳代谢途径 |
| 4.4.5 氨基酸代谢与叶绿体核糖体蛋白 |
| 4.4.6 过氧化氢酶(CAT)、脂氧合酶(LOX)和肉桂酸-4-羟化酶(C4H) |
| 4.4.7 RRM和Actin |
| 4.5 qRT-PCR分析 |
| 4.6 RRM基因的crispr/cas9表达载体构建及功能验证 |
| 4.7 创新点 |
| 4.8 下一步工作设想 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| Papers published in the period of Ph.M. education |
（4）二硫键理性设计提高Thermobifida fusca角质酶热稳定性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 角质酶概述 |
| 1.1.1 角质酶的来源 |
| 1.1.2 角质酶的酶学性质 |
| 1.1.3 角质酶的结构 |
| 1.1.4 角质酶在PET纤维改性中的应用 |
| 1.1.5 角质酶的分子改造 |
| 1.2 二硫键概述 |
| 1.2.1 二硫键的分类 |
| 1.2.2 硫醇/二硫键交换反应 |
| 1.2.3 二硫键的氧化与蛋白质折叠 |
| 1.2.4 二硫键对蛋白质稳定性的影响 |
| 1.2.5 二硫键对蛋白在大肠杆菌中表达的影响 |
| 1.3 本课题的主要研究目的和意义 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 突变位点的选择 |
| 2.2.2 定点突变 |
| 2.2.3 E.coli热转化感受态细胞的热击转化 |
| 2.2.4 突变体的筛选与鉴定 |
| 2.2.5 突变体基因及表达载体的获取 |
| 2.2.6 质粒DNA的提取与限制性酶切 |
| 2.2.7 核酸琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.8 目的基因与载体p ET-24a(+)、p SCDsb C的连接 |
| 2.2.9 重组质粒DNA转化E.coli感受态细胞 |
| 2.2.10 重组质粒的筛选和鉴定 |
| 2.2.11 E.coli Origami B(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.2.12 重组质粒转化E.coli Origami B(DE3)感受态细胞 |
| 2.2.13 摇瓶发酵 |
| 2.2.14 PET纤维亲水改性工艺 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 菌浓的测定 |
| 2.3.2 蛋白含量的测定 |
| 2.3.3 pNPB水解酶活性 |
| 2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 |
| 2.3.5 野生型T.fusca角质酶及其突变体的分离纯化 |
| 2.3.6 最适温度和热稳定性测定方法 |
| 2.3.7 最适pH和pH稳定性测定方法 |
| 2.3.8 紫外吸光度测试PET纤维水解产物 |
| 2.3.9 PET纤维的润湿性 |
| 2.3.10 扫描电子显微镜(SEM)测试PET纤维形态结构 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 通过理性设计在T.fusca角质酶中引入二硫键 |
| 3.1.1 T.fusca角质酶突变体的设计 |
| 3.1.2 突变体的构建及表达 |
| 3.1.3 突变体的热稳定性 |
| 3.1.4 突变体D204C/E253C的分离纯化 |
| 3.1.5 T.fusca角质酶及突变体D204C/E253C酶学性质的比较 |
| 3.2 突变体D204C/E253C的高效可溶性表达 |
| 3.2.1 二硫键区域氨基酸的柔性突变 |
| 3.2.2 共表达Dsb C促进突变体D204C/E253C可溶表达 |
| 3.2.3 无信号肽化促进突变体D204C/E253C可溶表达 |
| 3.3 突变体D204C/E253C发酵制备及在PET纤维亲水改性中的应用 |
| 3.3.1 突变体D204C/E253C发酵制备 |
| 3.3.2 酶处理对PET纤维的水解作用 |
| 3.3.3 酶处理对PET纤维润湿性的影响 |
| 3.3.4 SEM分析 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）硫化氢信号分子在大豆-根瘤菌共生固氮体系中的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 豆科植物-根瘤菌共生概述 |
| 1.2 豆科植物-根瘤菌共生的信号及其通路 |
| 1.2.1 结瘤因子的识别 |
| 1.2.2 结瘤因子的信号通路 |
| 1.2.3 早期结瘤过程中植物根表皮以及皮层对于结瘤因子的响应 |
| 1.2.4 结瘤的自主调控 |
| 1.3 植物内源气体信号分子研究进展 |
| 1.3.1 一氧化碳(CO)信号在植物中的研究进展 |
| 1.3.2 一氧化氮(NO)信号在植物中的研究进展 |
| 1.3.3 硫化氢(H_2S)信号在植物中的研究进展 |
| 1.3.4 H_2S分子对于蛋白质的过硫化修饰作用 |
| 1.4 研究内容及技术路线 |
| 1.4.1 本文选题目的及意义 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 H_2S对于大豆植株共生结瘤以及生长的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料试剂以及仪器: |
| 2.2.1 菌株和培养基 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大豆植株种植及H_2S处理 |
| 2.3.2 大豆植株生长表型测定 |
| 2.3.3 大豆根瘤固氮酶活性的测量 |
| 2.3.4 电转化法构建荧光标记菌株以及侵染事件观察和统计 |
| 2.3.5 SF7-AM荧光探针检测H_2S以及组织内H_2S含量测定 |
| 2.3.6 叶绿素含量,大豆叶片光合及叶绿素荧光参数测定 |
| 2.3.7 SDS-PAGE凝胶电泳及Western-blot分析 |
| 2.3.8 类黄酮处理大豆植株 |
| 2.3.9 RNA提取,反转录和荧光定量PCR |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 外源添加H_2S供体对大豆植株生长的影响 |
| 2.4.2 外源添加NaHS可以提高大豆根部组织中的H_2S含量 |
| 2.4.3 外源H_2S处理对大豆植株生长的影响 |
| 2.4.4 H_2S对大豆植株叶绿素合成、光合速率以及叶绿素荧光参数的影响 |
| 2.4.5 H_2S对共生以及固氮相关蛋白的表达 |
| 2.4.6 H_2S对共生相关基因的表达的影响 |
| 2.4.7 H_2S对编码参与N代谢相关酶基因表达的调控作用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 大豆根瘤内源H_2S对根瘤固氮能力的促进作用及其抗氧化作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌株及培养基 |
| 3.2.2 本章所用试剂与酶 |
| 3.2.3 本章所用仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 植物实验及处理方法 |
| 3.3.2 突变载体构建 |
| 3.3.3 三亲本杂交以及CSE基因缺失突变体的筛选 |
| 3.3.4 功能互补菌株的构建 |
| 3.3.5 SF7-AM和PO-1荧光探针观察根瘤内源H_2S以及H_2O_2和含量测定 |
| 3.3.6 固氮酶活性测定 |
| 3.3.7 透射电子显微镜观察大豆根瘤细胞形态 |
| 3.3.8 根瘤组织氧化损伤指标的测定 |
| 3.3.9 抗氧化酶活性测定 |
| 3.3.10 RNA提取、反转录以及表达分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 内源H_2S在大豆根瘤中的产生情况 |
| 3.4.2 内源H_2S的含量对大豆固氮酶活性的影响 |
| 3.4.3 H_2S对大豆根瘤固氮活性的调节机制 |
| 3.4.4 H_2S的缺乏引起大豆根瘤内抗氧化防御反应 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase对大豆与S.fredii Q8 共生结瘤的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和培养基 |
| 4.2.2 本章所用试剂与酶 |
| 4.2.3 本章所用仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 突变体及其互补菌株的构建 |
| 4.3.2 大豆种子表面消毒以及处理 |
| 4.3.3 竞争结瘤 |
| 4.3.4 石蜡切片 |
| 4.3.5 透射电镜 |
| 4.3.6 分泌蛋白的提取以及纯化 |
| 4.3.7 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳发现分泌蛋白的差异条带 |
| 4.3.8 分泌蛋白差异条带的质谱鉴定 |
| 4.3.9 His标记蛋白及Western-blot检验 |
| 4.3.10 RNA提取和纯化 |
| 4.3.11 转录组分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 3MST缺失对根瘤菌生长、与大豆结瘤以及根瘤表型的影响 |
| 4.4.2 3MST缺失型根瘤的固氮酶活性受到严重抑制 |
| 4.4.3 3MST的缺失导致了S.fredii侵染受阻 |
| 4.4.4 3MST缺失会导致分泌系统胞外蛋白分泌的差异 |
| 4.4.5 转录组分析3MST缺失所引起的大豆植株的响应 |
| 4.4.6 4KEGG以及GO富集分析 |
| 4.4.7 3MST的缺失对植物防御反应的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 结论与创新 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 外源H_2S处理对大豆-根瘤菌固氮共生体系的作用 |
| 5.1.2 根瘤中内源H_2S对大豆根瘤固氮酶活性的作用 |
| 5.1.3 3MST对根瘤菌与大豆共生结瘤的影响 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望与不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:亚甲基蓝法测定H2S含量 |
| 附录2:总RNA提取方法 |
| 附录3:热激法转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 附录4:透射电镜制样步骤 |
| 附录5:蛋白质羰基含量测定方法和步骤 |
| 附录6:根瘤组织内超氧阴离子清除能力测定 |
| 附录7:根瘤内超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 |
| 附录8:根瘤内过氧化氢酶(CAT)活性测定 |
| 附录9:根瘤内硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性测定 |
| 附录10:石蜡切片制作所需试剂及制作方法 |
| 附录11:蛋白质质谱鉴定及分析步骤 |
| 附录12:RNA-seq流程及步骤 |
| 附录13:RNA-seq结果验证所用引物序列及信息 |
| 附录14:KEGG富集通路 |
| 附录15:植物-病原物互作通路图 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）杀稻瘟菌素生物合成中氨酰基转移酶BlsK和甲基转移酶BlsL的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 天然产物概述 |
| 1.1.1 天然产物与药物开发 |
| 1.1.2 微生物来源天然产物药物开发的研究进展 |
| 1.2 核苷类抗生素简介 |
| 1.3 杀稻瘟菌素研究背景简介 |
| 1.3.1 杀稻瘟菌素简介 |
| 1.3.2 杀稻瘟菌素生物合成研究进展 |
| 1.4 甲基转移酶综述 |
| 1.4.1 甲基转移酶简介以及分类 |
| 1.4.2 天然产物甲基转移酶NPMTS概述 |
| 1.5 氨酰tRNA合成酶研究综述 |
| 1.5.1 tRNA简介 |
| 1.5.2 氨酰tRNA合成酶简介 |
| 1.5.3 aaRS对 tRNA和氨基酸的选择和识别 |
| 1.6 氨酰tRNA参与蛋白质合成以外的生理过程研究进展 |
| 1.6.1 参与细胞壁合成和细胞膜重构过程依赖aa-tRNA的酶简介 |
| 1.6.2 aa-tRNA依赖的RiPPs合成酶类简介 |
| 1.6.3 含有GNAT结构域的aa-tRNA依赖的转移酶简介 |
| 1.6.4 aa-tRNA依赖的L/F转移酶简介 |
| 1.6.5 aa-tRNA依赖的合成各种天然产物的转移酶简介 |
| 1.6.6 aa-tRNA依赖的环二肽合成酶cyclodipeptide synthases(CDPSs)简介 |
| 1.7 [Fe-S]簇蛋白研究背景及进展 |
| 1.7.1 [Fe-S]簇蛋白简介 |
| 1.7.2 [Fe-S]簇蛋白的研究方法 |
| 1.7.3 [Fe-S]簇蛋白的生物合成 |
| 1.7.4 [Fe-S]簇蛋白的生物学功能 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒和载体 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 化学试剂和缓冲液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 微生物菌株的培养和菌种保藏 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 大肠杆菌基因组DNA的少量提取 |
| 2.2.4 链霉菌基因组DNA的少量提取 |
| 2.2.5 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR) |
| 2.2.6 DNA片段的回收,酶切及连接 |
| 2.2.7 大肠杆菌钙转感受态细胞的制备及质粒转化 |
| 2.2.8 大肠杆菌电转感受态细胞的制备和转化 |
| 2.2.9 链霉菌和大肠杆菌属间接合转移 |
| 2.2.10 大肠杆菌基因功能缺失 |
| 2.2.11 杀稻瘟菌素异源表达菌株WJ2中BS产生功能基因的缺失 |
| 2.2.12 blsK/blsL突变株功能缺失基因的回补 |
| 2.2.13 杀稻瘟菌素异源表达菌株WJ2、突变株和回补菌株的生物发酵 |
| 2.2.14 发酵产物的小量纯化 |
| 2.2.15 发酵产物的HPLC、LC-MS/MS检测 |
| 2.2.16 融合蛋白的表达纯化和SDS-PAGE检测 |
| 2.2.17 BlsK蛋白点突变 |
| 2.2.18 蛋白的厌氧纯化和[Fe-S]簇体外重构 |
| 2.2.19 蛋白铁硫含量的测定方法 |
| 2.2.20 EPR分析方法 |
| 2.2.21 蛋白体外活性分析基本方法 |
| 2.2.22 反应产物和化合物的HPLC、LC-MS/MS分析 |
| 2.2.23 大肠杆菌全细胞裂解液的制备及细胞组分的分子筛分离 |
| 2.2.24 tRNA的体外转录和氨酰化产物的制备 |
| 2.2.25 生物信息学分析 |
| 第三章 氨酰基转移酶BlsK的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 BlsK生物信息学分析 |
| 3.3 基因blsK体内功能研究 |
| 3.3.1 基因blsK功能缺失 |
| 3.3.2 blsK基因回补 |
| 3.3.3 blsK缺失及回补突变株发酵情况HPLC检测 |
| 3.4 DBS、LDBS、LBS和 BS在细胞内外的分布 |
| 3.5 BlsK体外生化活性研究 |
| 3.5.1 BlsK表达载体的构建和蛋白纯化 |
| 3.5.2 BlsK生化活性验证 |
| 3.5.3 BL21(DE3)细胞裂解液(CFE)能激活BlsK催化LDBS生成 |
| 3.5.3.1 大肠杆菌BL21(DE3)氨肽水解酶pepN基因敲除 |
| 3.5.3.2 BlsK与 BL21(DE3)/ΔpepN CFE生化活性检测 |
| 3.5.3.3 tRNAs是 BlsK催化形成LDBS所必需的活性成分 |
| 3.5.3.4 亮氨酰tRNA合成酶LRS可辅助BlsK发挥功能 |
| 3.5.3.5 BlsK是一个亮氨酰tRNA依赖的转移酶 |
| 3.6 BlsK含有一个[3Fe-4S]簇 |
| 3.6.1 UV-VIS分析BlsK |
| 3.6.2 BlsK蛋白中Fe、S含量的测定 |
| 3.6.3 EPR分析BlsK[Fe-S]簇类型 |
| 3.6.4 BlsK中[3Fe-4S]簇结合位点的确定 |
| 3.6.5 BlsK中[3Fe-4S]的功能研究 |
| 3.6.5.1 [3Fe-4S]稳定BlsK蛋白结构 |
| 3.6.5.2 完整的[3Fe-4S]簇是BlsK活性必需的辅因子 |
| 3.6.5.3 [3Fe-4S]的价态对BlsK活性的影响 |
| 3.6.6 BlsK底物特异性研究 |
| 3.6.6.1 BlsK识别氨基酸的种类 |
| 3.6.6.2 Leu-tRNALeu是BlsK的直接底物 |
| 3.6.6.3 亮氨酸的腺苷化活化形式Leu-AMP也可被BlsK识别 |
| 3.6.6.4 BlsK可以将亮氨酸加载到BS上生成LBS |
| 3.7 BlsK反应机理初步探索 |
| 3.8 小结 |
| 第四章 甲基转移酶BlsL的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 BlsL生物信息学分析 |
| 4.2.1 BlsL属于SAM依赖的甲基转移酶家族 |
| 4.2.2 BlsL与常见胍基上甲基转移酶比较 |
| 4.2.3 BlsL中 SAM结合位点分析 |
| 4.3 BlsL体内功能研究 |
| 4.3.1 blsL基因功能缺失 |
| 4.3.2 blsL基因的回补 |
| 4.3.3 WJ2 及突变株WXK1、WXK2 的生物发酵及检测 |
| 4.3.4 WJ2(ΔpepN1-N3)中缺失及回补blsL菌株发酵产物检测 |
| 4.3.5 增加blsL基因拷贝数提高BlsL的表达 |
| 4.3.5.1 增加blsL基因拷贝数的三种方法 |
| 4.3.5.2 增加blsL基因拷贝数菌株发酵HPLC检测 |
| 4.3.6 用强启动子kasOp*和5063p增强blsL基因的表达 |
| 4.3.6.1 pSET152-kasOp*-blsL-tsr和 pSET152-5063p-blsL-tsr质粒构建 |
| 4.3.6.2 kasOp*和5063p强启动子过表达blsL菌株发酵检测 |
| 4.4 BlsL体外生化活性研究 |
| 4.4.1 BlsL表达载体的构建和蛋白纯化 |
| 4.4.2 BlsL蛋白中SAM的检测 |
| 4.4.3 BlsL可以高效地使LDBSβ-精氨酸-胍基N甲基化 |
| 4.4.4 BlsL几乎不能使DBS甲基化 |
| 4.4.5 BlsL对 LDBS和 DBS的酶动力学分析 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 工作总结 |
| 5.1.1 亮氨酰tRNA依赖的氨酰基转移酶BlsK的研究 |
| 5.1.2 甲基转移酶BlsL的研究 |
| 5.2 本文的主要创新点 |
| 5.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间论文发表、参加学术会议及所获荣誉 |
（7）PRK基因在RSV侵染过程中的功能及对抗RSV药剂的响应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻条纹叶枯病的发生现状 |
| 1.1.1 水稻条纹叶枯病的发生、流行分布、危害 |
| 1.1.2 水稻条纹叶枯病的症状 |
| 1.1.3 水稻条纹叶枯病的寄主范围与传播特征 |
| 1.2 水稻条纹叶枯病的防治策略 |
| 1.2.1 化学药剂防治灰飞虱的治虫控病策略 |
| 1.2.2 采用优良抗病品种的抗病策略 |
| 1.2.3 小分子化合物即抗病毒药剂的应用 |
| 1.2.4 采用基因工程策略控制病害 |
| 1.3 水稻条纹病毒的研究现状 |
| 1.3.1 RSV编码的蛋白及其功能 |
| 1.3.2 RSV-Rd RP |
| 1.3.3 RSV-P2 |
| 1.3.4 RSV-PC2 |
| 1.3.5 RSV-P3 |
| 1.3.6 RSV-CP |
| 1.3.7 RSV-SP |
| 1.3.8 RSV-MP |
| 1.3.9 RSV相关的其他研究进展 |
| 1.4 植物PRK蛋白研究进展 |
| 1.4.1 PRK的发现与命名 |
| 1.4.2 PRK的结构与分类 |
| 1.4.3 PRK的催化机制和活性 |
| 1.4.4 PRK的特异性 |
| 1.4.5 PRK的生物学功能 |
| 1.5 卡尔文循环 |
| 1.5.1 卡尔文循环的发现 |
| 1.5.2 卡尔文循环的反应产物 |
| 1.5.3 卡尔文循环的生理功能 |
| 1.5.4 卡尔文循环的生理调节功能 |
| 1.5.5 卡尔文循环的非生物胁迫 |
| 1.5.6 卡尔文循环相关蛋白与病毒的相互作用研究 |
| 1.6 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 仪器设备 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株 |
| 2.2.3 载体 |
| 2.2.4 抗体 |
| 2.2.5 抗病毒药剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.0 植物总RNA提取(Trizol法提取植物总RNA) |
| 2.3.1 RNA浓度、纯度检测 |
| 2.3.2 逆转录 |
| 2.3.3 PCR技术 |
| 2.3.4 PCR产物及目的片段纯化 |
| 2.3.5 DNA克隆技术 |
| 2.3.6 感受态制备 |
| 2.3.7 转化和筛选 |
| 2.3.8 质粒提取(参照Omega Bio-Tek Plasmid Mini Kit I说明书操作) |
| 2.3.9 Northen blot |
| 2.3.10 抗血清的制备 |
| 2.3.11 植物总蛋白提取 |
| 2.3.12 Western blot |
| 2.3.13 农杆菌浸润接种植物 |
| 2.3.14 本氏烟接种水稻条纹病毒 |
| 2.3.15 遗传转化 |
| 2.3.16 植物总DNA提取(CTAB法抽提植物DNA) |
| 2.3.17 阳性植株鉴定 |
| 2.3.18 光化学效率检测 |
| 2.3.19 净光合速率检测 |
| 2.3.20 叶绿素含量测定 |
| 2.3.21 叶绿体分离 |
| 2.3.22 葡萄糖含量的测定 |
| 2.3.23 蔗糖含量测定 |
| 2.3.24 淀粉含量测定(依据植物淀粉含量试剂盒说明书) |
| 2.3.25 Rubisco活性的测定(根据植物Rubisco测定试剂盒) |
| 第三章 RSV侵染本氏烟对植物光合作用的影响 |
| 3.1 RSV侵染本氏烟对植株发育表型的影响 |
| 3.2 RT-PCR检测鉴定RSV-CP |
| 3.3 RSV侵染本氏烟降低植株的光化学效率 |
| 3.4 RSV侵染本氏烟降低植株的固碳效率 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 PRK基因在RSV侵染过程中的功能及对抗病毒药剂的响应 |
| 4.1 RSV侵染本氏烟导致NbPRKs下调表达 |
| 4.2 OsPRK与 NbPRK对 RSV的侵染响应一致 |
| 4.2.1 RSV侵染水稻导致OsRPK下调表达 |
| 4.2.2 OsPRK与 NbPRKs同源性比较 |
| 4.2.3 OsPRK与 NbPRK定位于本氏烟中的叶绿体 |
| 4.3 沉默NbPRKs导致植株叶绿素含量降低 |
| 4.3.1 沉默NbPRKs植株表型分析 |
| 4.3.2 NbPRKs的沉默效率检测 |
| 4.3.3 叶绿素含量测定分析 |
| 4.4 沉默NbPRKs降低了本氏烟的光合作用效率 |
| 4.4.1 沉默NbPRKs降低了本氏烟的固碳效率 |
| 4.4.2 沉默NbPRKs降低了本氏烟的光化学效率 |
| 4.5 沉默NbPRKs降低了本氏烟的Rubisco活性 |
| 4.6 沉默NbPRKs抑制了RSV的侵染 |
| 4.6.1 RSV在沉默NbPRKs的本氏烟上的侵染 |
| 4.6.2 沉默NbPRKs降低了RSV的病毒积累量 |
| 4.6.3 沉默NbPRKs延缓了RSV在本氏烟系统叶的发病时间 |
| 4.7 超表达NbPRK对本氏烟植物光合作用的影响 |
| 4.7.1 超表达NbPRK植株发育表型分析 |
| 4.7.2 超表达NbPRK植株中NbPRK转录水平分析 |
| 4.7.3 超表达NbPRK植株中NbPRK蛋白表达量分析 |
| 4.7.4 超表达NbPRK对植物固碳效率的影响 |
| 4.7.5 超表达NbPRK对植株光化学效率的影响 |
| 4.8 超表达NbPRK促进RSV的侵染 |
| 4.8.1 RSV在超表达NbPRK的本氏烟上的侵染 |
| 4.8.2 超表达NbPRK增加了RSV的病毒积累量 |
| 4.8.3 超表达NbPRK加快了RSV在本氏烟系统叶的发病时间 |
| 4.9 超表达OsPRK植株表型分析 |
| 4.10 抗RSV药剂施加降低了NbPRKs的表达水平 |
| 4.11 讨论 |
| 第五章 本氏烟中卡尔文循环其他关键基因对RSV侵染的响应分析 |
| 5.0 RSV侵染本氏烟导致NbRbCS和 NbPGK下调表达 |
| 5.1 沉默本氏烟中NbRbCS和 NbPGK的植株表型分析 |
| 5.1.1 沉默NbRbCS和 NbPGK对本氏烟发育表型的影响 |
| 5.1.2 NbRbCS和 NbPGK的沉默效率检测 |
| 5.2 沉默NbRbCS和 NbPGK降低植物的光合作用效率 |
| 5.2.1 沉默NbRbCS和 NbPGK降低本氏烟的固碳效率 |
| 5.2.2 沉默NbRbCS和 NbPGK降低本氏烟的光化学效率 |
| 5.3 沉默NbRbCS和 NbPGK抑制RSV的侵染 |
| 5.3.1 沉默NbRbCS和 NbPGK的植株接种RSV |
| 5.3.2 RSV在沉默NbRbCS和 NbPGK的本氏烟上的侵染 |
| 5.3.3 沉默NbRbCS和 NbPGK降低了RSV的病毒积累量 |
| 5.3.4 沉默NbRbCS和 NbPGK延缓了RSV在本氏烟系统叶的发病时间 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 卡尔文循环相关基因对RSV抗性机制初探 |
| 6.1 RSV侵染本氏烟导致植株葡萄糖含量减少 |
| 6.2 沉默NbPRKs导致本氏烟叶绿体中葡萄糖含量降低 |
| 6.3 沉默NbPRKs导致植株叶片葡萄糖含量减少 |
| 6.4 超表达NbPRK导致植株叶片葡萄糖含量增多 |
| 6.5 超表达OsPRK导致植株叶片葡萄糖含量增多 |
| 6.6 NbPRKs沉默植株回补Ru BP利于RSV的侵染 |
| 6.7 NbPRKs沉默植株回补葡萄糖利于RSV的侵染 |
| 6.8 沉默NbRbCS和 NbPGK导致植株葡萄糖含量下调 |
| 6.9 沉默NbPRKs导致植株叶片内蔗糖、淀粉含量降低 |
| 6.10 讨论 |
| 第七章 全文总结与展望 |
| 7.1 RSV侵染降低了本氏烟的光合作用效率 |
| 7.2 NbPRKs的沉默不利于RSV的侵染,NbPRK的过量表达利于RSV的侵染 |
| 7.3 NbRbCS和 NbPGK的沉默导致植株光合作用效率下降并抑制了RSV的侵染 |
| 7.4 葡萄糖在平衡植物自身发育和RSV侵染上起到了关键作用 |
| 7.5 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 本论文所用术语缩写词及中英文对照 |
| 附录Ⅱ 本论文所用引物列表 |
| 附录Ⅲ 常用试剂配方 |
| 附录Ⅳ 发表的论文及参加的科研项目 |
（8）兼具GPx和SOD活性双功能抗氧化酶的原核表达与表征（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 活性氧 |
| 1.1.1 活性氧概述 |
| 1.1.2 ROS的来源 |
| 1.1.3 氧化应激 |
| 1.1.4 ROS与人类疾病 |
| 1.1.5 ROS的控制 |
| 1.2 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| 1.2.1 GPx概述 |
| 1.2.2 GPx分类 |
| 1.2.3 GPx的结构 |
| 1.2.4 含硒GPx催化机制 |
| 1.3 硒与硒蛋白 |
| 1.3.1 硒的概述 |
| 1.3.2 Sec的合成 |
| 1.3.3 Sec的插入机制 |
| 1.3.4 人工硒蛋白的获得方法 |
| 1.4 超氧化物歧化酶 |
| 1.4.1 SOD概述 |
| 1.4.2 SOD与人类健康 |
| 1.4.3 SOD结构 |
| 1.4.4 SOD的催化机制 |
| 1.5 兼具多功能酶活性的人工酶 |
| 1.6 立题依据及研究策略 |
| 第二章 基于hGPx1与ApSOD的双功能抗氧化酶的表达与表征 |
| 2.1 序言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 菌株与质粒 |
| 2.2.4 试剂配方 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ApSOD全基因合成 |
| 2.3.2 基因的调取 |
| 2.3.3 构建表达质粒及鉴定 |
| 2.3.4 非含硒融合蛋白的表达及纯化 |
| 2.3.5 含硒双功能融合蛋白的表达及纯化 |
| 2.3.6 蛋白活力测定 |
| 2.3.7 Se-hGPx1~(Ser)-L-ApSOD的计算机结构模拟分析 |
| 2.3.8 Se-hGPx1~(Ser)-L-ApSOD的最适温度及p H测定 |
| 2.3.9 Se-hGPx1~(Ser)-L-ApSOD的稳定性研究 |
| 2.3.10 Se-hGPx1~(Ser)-L-ApSOD的GPx稳态动力学研究 |
| 2.3.11 Se-hGPx1~(Ser)-L-ApSOD的ESI-MS检测 |
| 2.3.12 抗过氧化氢失活实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于hGPx1与ApSOD的双功能抗氧化酶的活力改善 |
| 3.1 序言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 菌株与质粒 |
| 3.2.4 试剂配方 |
| 3.2.5 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 pCold-hGPx1~(Ser)-lL-ApSOD和pRSF-hGPx1_(UAG)-lL-ApSOD重组质粒的构建 |
| 3.3.2 pCold-hGPx1-lL-ApSOD(C/S)突变质粒的构建 |
| 3.3.3 含硒双功能融合蛋白的表达及纯化鉴定 |
| 3.3.4 蛋白活力的测定 |
| 3.3.5 融合蛋白的计算机结构模拟分析 |
| 3.3.6 Se-hGPx1_(UAG)-lL-ApSOD的性质表征 |
| 3.3.7 Se-hGPx1~(Ser)-lL-ApSOD及Se-hGPx1_(UAG)-lL-ApSOD的GPx稳态动力学研究 |
| 3.3.8 ESI-MS检测Se-GPx1_(UAG)-lL-ApSOD的精确分子量测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于hGPx2与ApSOD的双功能抗氧化酶的表达与表征 |
| 4.1 序言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 质粒与菌株 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 基因的调取 |
| 4.3.2 双功能融合蛋白的表达及纯化鉴定 |
| 4.3.3 蛋白活力测定 |
| 4.3.4 Se-hGPx2_(UAG)-lL-ApSOD的酶学性质研究 |
| 4.3.5 Se-hGPx2~(Ser)-lL-ApSOD和Se-hGPx2_(UAG)-lL-ApSOD的稳定性研究 |
| 4.3.6 Se-hGPx2_(UAG)-lL-ApSOD的GPx稳态动力学研究 |
| 4.3.7 双功能融合蛋白的计算机结构模拟分析 |
| 4.3.8 抗过氧化氢失活实验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结语与创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间取得的成绩 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（9）酿酒酵母谷氧还蛋白Grx3的结构和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1. 谷胱甘肽 |
| 1.2. 蛋白质谷胱甘肽化和去谷胱甘肽化反应 |
| 1.2.1. 蛋白质的谷胱甘肽化反应 |
| 1.2.2. 蛋白质的去谷胱甘肽化反应 |
| 1.3. 硫氧还蛋白概述 |
| 1.3.1. 硫氧还蛋白的结构 |
| 1.3.2. 硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和NADPH还原体系 |
| 1.3.3. 硫氧还蛋白的催化机制 |
| 1.3.4. 酵母中硫氧还蛋白 |
| 1.4. 谷氧还蛋白概述 |
| 1.4.1. 谷氧还蛋白的结构 |
| 1.4.2. 谷氧还蛋白分类 |
| 1.4.3. 谷氧还蛋白催化机理 |
| 1.4.4. 谷氧还蛋白的催化活性 |
| 1.4.5. 谷氧还蛋白的功能 |
| 1.5. 酿酒酵母谷氧还蛋白概述 |
| 1.5.1. 谷氧还蛋白Grx1和Grx2 |
| 1.5.2. 谷氧还蛋白Grx5 |
| 1.5.3. 谷氧还蛋白Grx6和Grx7 |
| 1.5.4. 谷氧还蛋白Grx8 |
| 1.6. 谷氧还蛋白Grx3和Grx4生化研究 |
| 1.6.1. Grx3和Grx4氧化还原活性 |
| 1.6.2. Grx3和Grx4参与Fe-S簇代谢研究 |
| 1.6.2.1. 铁在细胞中的作用 |
| 1.6.2.2. Fra2/Grx3/Grx4参与调控转录因子Aft2 |
| 1.7. 靶标谷氧还蛋白Grx3的研究意义 |
| 第二章 实验材料、设备与方法 |
| 2.1. 实验材料和设备 |
| 2.1.1. 菌株和质粒 |
| 2.1.2. 试剂、酶 |
| 2.1.3. 仪器设备 |
| 2.2. 实验方法 |
| 2.2.1. 分子克隆 |
| 2.2.1.1. 目的基因序列的获取 |
| 2.2.1.2. 靶目的基因的生物信息学分析 |
| 2.2.1.3. 不同版本蛋白的设计 |
| 2.2.1.4. 目的基因扩增 |
| 2.2.1.5. PCR定点突变实验 |
| 2.2.1.6. PCR产物的鉴定 |
| 2.2.1.7. PCR产物的回收 |
| 2.2.1.8. 质粒载体扩增和抽提 |
| 2.2.1.9. 重组质粒的构建和鉴定 |
| 2.2.1.10. 重组质粒的构建 |
| 2.2.1.11. 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.1.12. 基因测序鉴定 |
| 2.2.1.13. 重组PCR |
| 2.2.2. 蛋白质的表达纯化 |
| 2.2.2.1. 目的蛋白的检测表达 |
| 2.2.2.2. 目的蛋白的大量表达 |
| 2.2.2.3. 目的蛋白的纯化 |
| 2.2.2.4. 蛋白质纯度及分子量鉴定 |
| 2.2.2.5. 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.3. 蛋白质结晶 |
| 2.2.3.1 手工初筛:座滴法 |
| 2.2.3.2 晶体鉴定 |
| 2.2.3.3 晶体优化 |
| 2.2.4. 晶体结构解析和精修 |
| 2.2.5. NMR结构的样品数据收集、处理和评估 |
| 2.2.6. 核磁滴定实验: |
| 2.2.7. HEDS酶活测定 |
| 2.2.8. GST活性实验 |
| 2.2.9. NADPH-硫氧还蛋白还原酶-Trx酶活体系 |
| 2.2.10. 交联实验分析Grx与Trx结构域相互作用 |
| 2.2.11. pull-down结合实验 |
| 2.2.12. 表面等离子共振(SPR)实验 |
| 2.2.13. 计算机模拟底物结合 |
| 2.2.14. 荧光偏振分析实验 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1. Grx3和Fra2的生物信息学分析 |
| 3.1.1. Grx3的生物信息学分析 |
| 3.1.2. Fra2的生物信息学分析 |
| 3.2. Grx3、Fra2和Aft2的分子克隆、表达和纯化 |
| 3.3. Grx3的Trx和Grx结构域的晶体学研究 |
| 3.3.1. Grx3的Trx结构域和Grx结构域的蛋白质结晶 |
| 3.3.2. Grx3的Trx和Grx结构域的数据收集、结构解析和精修 |
| 3.3.3. Grx3的Trx结构域和Grx结构域的结构 |
| 3.4. 体外实验验证Grx3全长结构 |
| 3.4.1. Grx3具有经典HEDS和GST活性 |
| 3.4.2. 体外交联实验验证Trx结构域与Grx结构域相互作用 |
| 3.4.3. NADPH-硫氧还蛋白还原酶-Trx酶活体系验证相互作用 |
| 3.4.4. Grx3的全长结构模拟 |
| 3.5. Fra2的NMR结构结构解析 |
| 3.5.1. Fra2的NMR结构的样品准备、数据收集、处理和评估 |
| 3.5.2. Fra2的NMR结构 |
| 3.6. Fra2与Grx3的相互作用模型体外实验 |
| 3.6.1. 核磁滴定实验 |
| 3.6.2. SPR确定Grx结构域相互作用位置 |
| 3.6.3. Grx3~(Grx)-Fra2复合物的模型 |
| 3.6.4. [2Fe-2S]-Grx3~(Grx)-Fra2异源二聚体模型 |
| 3.7. Fra2、Aft2和Grx3的亲和力比较 |
| 3.7.1. Pull-down实验验证Fra2、Aft2和Grx3相互作用 |
| 3.7.2. SPR实验定量分析Fra2,Grx3~(Grx)和Aft2的亲和常数 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1. Grx3作为GST酶参与氧化应激调控 |
| 4.2. Grx3协同Fra2来调节Aft2活性 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 参考文献 |
| 第七章 附录 |
| 7.1. 引物设计 |
| 7.2. 大肠杆菌感受态的制备 |
| 7.3. 蛋白纯化原理简介 |
| 7.4. 蛋白晶体解析(HKL2000处理) |
| 7.5. 晶体数据分子置换MR |
| 第八章 致谢 |
| 第九章 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）水稻抗病蛋白Pia RATX1结构域识别稻瘟病菌效应蛋白的结构基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物与微生物的关系 |
| 1.2 植物的免疫系统 |
| 1.3 真菌效应因子与植物免疫受体的识别模式 |
| 1.4 NLR pair蛋白调节植物抗病反应 |
| 1.5 诱饵结构域在抗病育种中应用潜力 |
| 1.6 水稻-稻瘟病菌病害系统 |
| 1.7 结构生物学方法简介 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 常用培养基和试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 RGA5A S、dSP-AVR1-CO39、dSP-AVR-Pia重组蛋白样品制备 |
| 3.1 RGA5A_S结构域原核表达 |
| 3.2 RGA5_(RATX1)蛋白表达与纯化 |
| 3.3 dSP-AVR1-CO39原核表达 |
| 3.4 dSP-AVR-Pia重组蛋白表达 |
| 3.5 实验结果与讨论 |
| 第四章 RGA5A_S与dSP-AVR1-CO39复合物的结构解析和相互作用关键残基分析 |
| 4.1 RGA5A_S与dSP-AVR1-CO39复合物相互作用分析 |
| 4.2 pETM13: RGA5A_S与pET28a: dSP-AVR1-CO39二元复合物晶体制备和结构解析 |
| 4.3 dSP-AVR1-CO39关键残基与RGA5A_S相互作用的分析 |
| 4.4 dSP-AVR1-CO39与RGA5A_S关键残基相互作用的分析 |
| 4.5 实验结果与讨论 |
| 第五章 RGA5A_SC末端后47个氨基酸对效应蛋白结合的影响 |
| 5.1 RGA5A_S二级结构预测 |
| 5.2 47AA小肽与dSP-AVR1-CO39无结合 |
| 5.3 RGA5_(RATX1)与dSP-AVR1-CO39相互作用的体外分析 |
| 5.4 RGA5_(RATX1)与dSP-AVR1-CO39二元复合物结晶条件筛选 |
| 5.5 实验结果与讨论 |
| 第六章 RGA5A_S与dSP-AVR-Pia复合物的制备、晶体生长 |
| 6.1 RGA5A_S和dSP-AVR-Pia互作验证 |
| 6.2 pETM13:RGA5_(RATX1)与pETMBP-1a: dSP-AVR-Pia体外互作验证 |
| 6.3 dSP-AVR-Pia结晶条件筛选 |
| 6.4 RGA5A_S单独晶体生长条件的筛选和优化 |
| 6.5 RGA5A_S和dSP-AVR-Pia混合物晶体生长 |
| 6.6 _pETM13:RGA5 A_S/_pET22b: dSP-AVR-Pia混合物晶体衍射 |
| 6.7 _pETM13:RGA5 A_S/_pET22b: dSP-AVR-Pia混合物晶体组分Mass Spectrum(MS)分析 |
| 6.8 dSP-AVR-Pia截断体与RGA5_(RATxi)复合物晶体制备 |
| 6.9 实验结果与讨论 |
| 第七章 结果与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
四、硫氧还蛋白及其L79K变体酶切后片段自身重新结合为同源二聚体的稳定性和动力学研究（论文参考文献）
- [1]牛乳蛋白在大肠杆菌中的异源表达和组合合成[D]. 庞雨. 中国农业科学院, 2021
- [2]耐辐射奇球菌DNA修复相关聚合酶的功能研究[D]. 周星茹. 浙江大学, 2021
- [3]甜瓜叶绿素缺失突变体生理与光合特征及突变分子机制研究[D]. 赵春梅. 东北农业大学, 2020(07)
- [4]二硫键理性设计提高Thermobifida fusca角质酶热稳定性研究[D]. 朱方剑. 江南大学, 2020(01)
- [5]硫化氢信号分子在大豆-根瘤菌共生固氮体系中的调控作用及其机制研究[D]. 邹杭. 西北农林科技大学, 2019(02)
- [6]杀稻瘟菌素生物合成中氨酰基转移酶BlsK和甲基转移酶BlsL的研究[D]. 王先坤. 上海交通大学, 2019(06)
- [7]PRK基因在RSV侵染过程中的功能及对抗RSV药剂的响应[D]. 毕继安. 贵州大学, 2019(05)
- [8]兼具GPx和SOD活性双功能抗氧化酶的原核表达与表征[D]. 管徒晨. 吉林大学, 2019(11)
- [9]酿酒酵母谷氧还蛋白Grx3的结构和功能研究[D]. 池昌标. 中国科学技术大学, 2018(10)
- [10]水稻抗病蛋白Pia RATX1结构域识别稻瘟病菌效应蛋白的结构基础[D]. 郭力维. 中国农业大学, 2018