一、视黄酸依赖Fas/RARα融合蛋白表达及其定位研究（论文文献综述）
李萌[1]（2021）在《低剂量PRF诱导的人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞自噬与分化的作用机制》文中认为研究目的急性早幼粒细胞白血病（APL）具有特征性的t（15;17）（q22;q21）,表达PML-RARα融合基因及蛋白,导致髓系细胞的正常发育分化受阻,是发生APL的关键因素。作为一种经典的诱导分化剂,全反式维甲酸（ATRA）已经广泛地应用于APL的临床治疗,与三氧化二砷（ATO）具有协同效应,被公认为是肿瘤靶向治疗最成功的范例。它们可以直接或协同作用于PML-RARα融合蛋白,经过泛素-蛋白酶或自噬这两种途径降解致病靶蛋白,又或抑制mTOR激酶从而激活自噬降解融合蛋白,继而促进APL细胞分化。葛根总黄酮（PRF）是葛根的主要有效成分之一,课题组前期研究发现,PRF诱导多种急性白血病细胞株凋亡,以NB4细胞最为显着。近几年来课题组对上述研究结果的分子机制开展原创性渐进性的探索,取得了良好的研究结果。近年来我们发现低浓度PRF（10μg/ml）虽可有效抑制NB4细胞增殖,但并未观察到细胞凋亡,但BCL-2、ERK磷酸化水平和Beclin1蛋白表达却明显增加,与30～50μg/ml PRF处理组变化趋势一致。那么,较低剂量（10μg/ml）的PRF诱导NB4细胞自噬与凋亡有何关联?与细胞分化有无必然联系?自噬在其中可能的作用机制是什么?诸如此类的问题引发了我们进一步深入研究的兴趣,因此,结合相关文献,本研究拟探讨低剂量PRF诱导的NB4细胞自噬在NB4细胞生存及转归中的作用,利用自噬以及MEK/ERK相关信号分子的变化等揭示可能的分子机制。研究方法1.低剂量PRF对NB4细胞自噬表达的影响NB4细胞经梯度浓度（0、5、10、15μg/ml）PRF处理48h,采用蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达变化;qRT-PCR（quantitative Real-time PCR）技术检测自噬相关基因 ATG5、Beclin1的表达变化;10μg/mlPRF作用48h后,单丹磺酰尸胺（MDC）染色及透射电镜技术检测NB4细胞中自噬小体的变化。2.自噬在低剂量PRF诱导NB4细胞分化的作用NB4细胞经3MA（5mM）预处理1h后,再给予PRF（10μg/ml）作用48h,采用WB检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1以及PML-RARα融合蛋白的表达变化;采用瑞士-吉姆萨染色（Giemsa-Wright’s staining）检测NB4细胞形态学改变情况;采用流式细胞术（FCM）来检测NB4细胞表面分化抗原CD1 1b的表达阳性率以及细胞改变。3.低剂量PRF诱导NB4细胞自噬及分化可能的分子机制NB4细胞经10μg/mlPRF作用48h后,运用WB检测MEK和ERK1蛋白的表达水平。采用该通路抑制剂SCH772984（10μM）预处理NB4细胞1h后,再给予 10μg/mlPRF 作用 48h,WB 检测 ERK1、LC3-Ⅱ、PML-RARα 蛋白表达的变化;MDC染色和Giemsa-Wright’s staining观察NB4细胞中酸性自噬溶酶体和细胞形态学的变化;运用FCM检测NB4细胞表面分化抗原CD1 1b的表达以及细胞周期变化;qRT-PCR技术分析不同浓度梯度（0、5、10、15μg/ml）PRF作用48h后的NB4细胞以及抑制剂SCH772984（10μM）预处理后ERK1、LC3-Ⅱ、PML-RARα在mRNA水平的表达。研究结果1.PRF体外可诱导NB4细胞自噬。PRF（10μg/ml）药物作用48h后自噬水平提升明显,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1的表达升高;ATG5及Beclin1在mRNA水平表达增多;PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达减少;细胞中自噬小体的数量增多。2.自噬抑制剂3MA（5mM）预处理1h,再予以PRF（10μg/ml）作用48h后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达下调,融合蛋白PML-RARα的表达下调,Beclin1、LC3-Ⅱ、MEK、ERK1在mRNA水平表达减少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达增多;抑制NB4细胞向正常粒细胞分化的形态学也发生改变,阻断自噬也降低了 PRF诱导的CD11b表达下降,抑制了细胞周期阻滞在G0/G1期的现象。3.PRF（10μg/ml）作用NB4细胞48h后可显着上调MEK和ERK1的蛋白表达水平。通路抑制剂SCH772984（10μM）预处理1h后,10μg/ml PRF诱导的ERK1、LC3-Ⅱ的蛋白表达及PML-RARα的降解程度均受抑,Beclin1、LC3-Ⅱ、MEK、ERK1在mRNA水平表达减少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达增多;NB4细胞中酸性自噬溶酶体比例下降,抑制细胞形态改变,表面分化抗原CD11b表达下调,表明NB4细胞分化受阻。结论低剂量（10μg/ml）PRF通过激活MEK/ERK信号通路促进NB4细胞的自噬,引起致癌蛋白PML-RARα的降解,最终诱导NB4细胞向正常粒细胞分化。低剂量（10μg/ml）PRF诱导的NB4细胞自噬与分化之间的关系有待进一步通过体内实验验证。
叶娇[2]（2020）在《NLS-RARα的核转运机制研究》文中指出背景与目的:NLS-RARα是中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）切割早幼粒细胞白血病蛋白-维甲酸受体α融合蛋白（PML-RARA）所得。在前期的细胞和样本实验中,我们发现在APL细胞株和APL患者细胞中NLS-RARA皆在核中堆积。因此,本研究主要探究了NLS-RARA向核中堆积的转运机制。方法:1.构建NLS-RARα过表达慢病毒载体,分别感染入U937细胞和HL60细胞。400nmol/L1α,25-二羟基维生素D3（1α,25（OH）2D3）处理空载组（NC组）和NLS-RARα组（NR组）0,12,24,36,48小时。使用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和免疫印迹（WB）法检测U937细胞和HL60细胞的CD11b,CD11c,CD14和CEBPβ的m RNA和蛋白表达水平变化。2.U937,HL60,NB4和293T细胞感染空载慢病毒和NLS-RARα过表达慢病毒,提取核浆蛋白,免疫印迹法（WB）和免疫荧光法检测NLS-RARα的核浆定位。3.NLS-RARα包含切割从PML处获得的NLS以及RARα自身的NLS。本研究中,突变切割ML所得的NLS,称为mut-1;突变RARα自身的NLS,称为mut-2;同时突变这两个NLS,称为mut-12。免疫印迹法和免疫荧光法检测各突变NLS-RARα的定位变化。免疫印迹法和q RT-PCR检测过表达突变的NLS-RARα的U937细胞经过1α,25（OH）2D3处理后,CD11b,CD11c,CD14和CEBPβ的m RNA和蛋白表达水平变化。4.急性髓系细胞系中KPNA2高表达,免疫荧光共定位检测NLSRARα和KPNA2和KPNB1的共定位情况。免疫共沉淀试验检测NLSRARα和KPNA2的相互作用情况。5.使用KPNA2和KPNB1的特异性抑制剂处理U937,HL60,NB4,293T细胞,采用免疫印迹法和免疫荧光法观察NLS-RARα的定位变化;使用脂质体转染,将KPNA2和KPNB1的小干扰RNA（si RNA）转染入293T细胞,采用免疫印迹法观察NLS-RARα的定位变化结果:1.免疫印迹试验和q RT-PCR结果显示,相比较空载组,NLS-RARα组的CD11b,CD11c,CD14和CEBPβ表达下降。2.免疫印迹法和免疫荧光法显示NLS-RARα主要位于细胞核中。3.免疫印迹法和免疫荧光法结果显示突变NLS-RARα的RARα区NLS,NLS-RARα的定位会由胞核转向胞浆。处于胞浆中的NLS-RARα对CD11b,CD11c,CD14和CEBPβ无影响。4.荧光免疫共定位和免疫沉淀法结果显示KPNA2,KPNB1和NLSRARα有相互作用。5.免疫印迹法和免疫荧光试验结果显示,敲低或者抑制KPNA2和KPNB1,NLS-RARα的定位会由胞核转到胞浆。结论1.NLS-RARα主要位于胞核中,并且抑制AML细胞的分化。2.NLS-RARα转运入核依赖RARα区的NLS。当NLS-RARα位于胞浆中,对AML细胞的分化无影响。3.NLS-RARα主要通过KPNA2/KPNB1途径入核。
殷骏[3]（2019）在《低氧诱导精母细胞凋亡导致精子生成减少的机制》文中提出研究背景:高原低张性缺氧（低氧）对男性生殖功能有显着负面影响,其中,精子生成减少是高原男性生殖功能低下的中心环节。精子生成减少的形成是一个复杂的病理生理过程,体内研究表明,在生精细胞中,精母细胞对低氧最为敏感,但是低氧引起体内精母细胞凋亡的机制还不明确。缺氧引起细胞凋亡有两条重要途径:死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径,这两条凋亡途径在肿瘤中被广泛研究,然而这两条凋亡途径是否参与低氧引起的精母细胞凋亡还不清楚。在体内缺血性缺氧所引起的精子生成减少的疾病模型中,HIF-1α与精索静脉曲张、睾丸扭转、寡精症发生发展密切相关,但是HIF-1α是否参与高原低氧所引起的精母细胞凋亡,以及HIF-1α与两条凋亡途径间的调控机制更无从知晓。巨自噬（简称自噬）开始形成于以Beclin-1连接的自噬起始复合物,复合物相互连接形成双层膜结构,双层膜进一步延长形成闭合环装的自噬小体,自噬小体包裹细胞内破坏的细胞器和损伤的蛋白并与溶酶体融合,最终细胞得以存活。自噬与凋亡是两个紧密联系的病理生理学过程,自噬先于凋亡出现,当外界刺激出现时,自噬出现并抑制凋亡;当外界刺激超过一定限度时,凋亡反过来抑制自噬并正反馈加强凋亡。阐明低氧下精母细胞自噬与凋亡相互作用的分子机制,对于研究低氧引起的精子生成减少有着重要的现实意义。本研究旨在查明低氧引起精母细胞凋亡的内在机制,明确低氧对精母细胞自噬的影响,以及探讨自噬和凋亡在精母细胞中相互作用的分子机制。为防治低氧引起的精子生成减少提供新策略和新靶点。研究方法与内容:1.建立低氧（1%氧浓度）诱导小鼠精母细胞系GC-2凋亡模型,并使用TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡。2.缺氧处理GC-2细胞48h后,酶标法检测LDH含量、Caspase-8含量;WesternBlot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas等死亡受体（Death Receptor/DR）凋亡途径相关基因表达,RT-qPCR法检测DR凋亡途径各相关基因mRNA表达。低氧下加入caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK,酶标法检测细胞增殖活性。探讨DR凋亡途径在低氧诱导GC-2细胞凋亡模型中的作用。3.低氧结束后,酶标法检测Caspase-3/9含量;JC-1探针法检测线粒体跨膜电位;检测p53、Bcl-2、Bax等线粒体凋亡途径相关基因蛋白表达,RT-qPCR法检测线粒体凋亡途径各相关基因mRNA表达。低氧下特异性抑制caspase-9和同时抑制caspase-8和caspase-9后,酶标法检测细胞增殖活性。探索线粒体凋亡途径在低氧诱导GC-2细胞凋亡模型中的作用。4.低氧条件下转染HIF-1α特异性siRNA,采用流式细胞术检测GC-2凋亡,酶标法检测caspase-3/8/9含量,Western Blot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas、p53、Bcl-2、Bax等凋亡途径相关基因蛋白表达;研究HIF-1α在低氧激活DR凋亡途径和线粒体凋亡途径中的作用。5.建立低氧抑制小鼠精母细胞系GC-2自噬模型,并使用mCherry-GFP-LC3B法标记自噬小体与自噬性溶酶体并观察自噬流;流式细胞术检测自噬;Western Blot法检测Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-II、p62、mTOR、LAMP2、VMA等自噬途径相关基因蛋白表达。6.低氧下转染Caspase-8特异性siRNA,采用酶标法检测GC-2细胞Caspase-3/8含量;mCherry-GFP-LC3B法观察自噬流;Cyto-ID法和吖啶橙法检测自噬;Western Blot法检测caspase-3/8、cleaved caspase-8、Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-II、p62、mTOR、LAMP2、VMA等蛋白表达。7.低氧下过表达Beclin-1,运用Cyto-ID法检测GC-2细胞自噬;TUNEL法和Annexin V-FITC法检测凋亡;JC-1法检测线粒体跨膜电位;Western Blot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas、p53、Bcl-2、Bax蛋白表达。8.睾丸注射Puro-Beclin 1慢病毒,模拟海拔5000米低压低氧暴露30天,建立小鼠精子生成减少模型;HE染色和透射电镜观察生精小管结构变化;TUNEL法检测生精细胞凋亡。研究结果:1.与常氧对照组比较,1%氧暴露24h可诱导GC-2细胞凋亡增加,并且凋亡增加呈时间依赖性。2.低氧处理48h后,GC-2细胞DR5、TRAIL、Fas的mRNA水平和蛋白表达均显着增加,c-FLIP和DcR2的mRNA水平和蛋白表达均显着减少,DcR1的mRNA水平显着下降;LDH和caspase-8含量显着升高;与低氧对照组比较,特异性抑制caspase-8后,细胞增殖活性显着增加。3.低氧处理后,GC-2细胞Bax和p53的mRNA水平和蛋白表达均显着增加,Bcl-2的mRNA水平和蛋白表达均显着下降;caspase-3/9含量显着增加;线粒体去极化占极化比例显着增加;与低氧对照组比较,特异性抑制caspase-8后,细胞增殖活性显着增加;与常氧对照组比较,同时特异性抑制caspase-8和caspase-9后,细胞增殖活性无显着差异。4.低氧暴露下转染HIF-1α特异性siRNA后,GC-2细胞凋亡和caspase-3/8/9含量显着下降;DR5、TRAIL、Fas、Bax和p53的蛋白表达显着下降,c-FLIP、DcR2和Bcl-2的蛋白表达显着增加。5.与常氧对照组GC-2细胞比较,1%氧暴露24h可抑制自噬,并且自噬呈时间依赖性降低;GC-2细胞Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-II、LAMP2、VMA蛋白表达显着下降,p62和mTOR的蛋白表达显着增加。6.低氧暴露48h和60h后,转染GC-2细胞caspase-8特异性siRNA,caspase-3/8含量显着下降;GC-2细胞自噬显着增加;Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-II、LAMP2、VMA蛋白表达显着升高,caspase-8、p62和mTOR的蛋白表达显着降低。7.1%氧暴露48h和60h后,过表达Beclin-1的GC-2细胞自噬显着升高,细胞凋亡显着下降,线粒体去极化占极化比例显着下降;caspase-3/8、cleaved caspase-8、DR5、TRAIL、Fas、Bax和p53的蛋白表达显着下降,c-FLIP、DcR2和Bcl-2的蛋白表达显着增加。8.模拟海拔5000米低压低氧暴露小鼠30天后,Puro-Beclin 1慢病毒转染后的小鼠睾丸中自噬流显着增加,生精小管病损程度减轻,生精细胞凋亡率显着降低。研究结论:1.低氧通过DR凋亡途径和线粒体凋亡途径诱导GC-2细胞凋亡。2.在低氧诱导的GC-2细胞凋亡中,DR凋亡途径和线粒体途径可能是由HIF-1α调控的。3.低氧通过促进caspase-8的活化,抑制GC-2细胞自噬,使低氧诱导的GC-2细胞凋亡进一步增强。4.低氧下过表达Beclin-1可降低线粒体外膜通透和精母细胞凋亡,并且缓解精子生成减少。5.精母细胞中的Beclin-1和caspase-8基因在精子生成减少的形成中发挥重要作用,有望成为治疗精子生成减少的有效靶点。
倪佩娟[4]（2019）在《ATRA介导组蛋白修饰调控PIM-1抑制HL-60细胞增殖及诱导分化机制研究》文中指出急性早幼粒白血病（Acute Promyelocytic Leukemia,APL）是以髓系细胞分化阻滞在早幼粒阶段为特征的急性骨髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）的一种亚型。染色体易位产生融合蛋白PML/RARA是急性早幼粒细胞性白血病的一个重要的遗传学特征。因此,全反式维甲酸ATRA通过靶向结合到癌蛋白PML/RARA的维甲酸受体α（RARα）作为有效治疗APL的临床药物,可以通过诱导融合蛋白PML/RARA的降解从而达到治疗的效果。有研究表明,ATRA降解PML/RARA融合蛋白的过程涉及多种表观遗传学修饰变化,其中介导H3K27me3的靶向基因沉默是最关键效应,但具体作用机制尚未清楚。本文为了阐明ATRA对早幼粒细胞白血病治疗作用的表观遗传学机制,首先以早幼粒白血病细胞HL-60为模型,使用不同浓度ATRA处理细胞,发现1μM浓度ATRA可以有效抑制PML/RARA的表达。并发现加入药物之后,细胞增殖能力明显下降;同时流式细胞仪检测结果显示CD38+细胞比例大幅上升,表明ATRA促进了HL-60细胞的分化。此基础上,利用RNA-seq测序技术、ChIP-PCR探索与鉴定ATRA处理细胞的显着表达差异基因,并确定H3K27me3结合靶基因位点的修饰变化。结果发现,在ATRA处理后的细胞中,转录因子PIM-1基因启动子区域H3K27me3甲基化修饰水平显着上升,表明ATRA可能通过介导H3K27me3甲基化修饰水平调节靶基因PIM-1的表达,抑制细胞增殖,诱导细胞分化。本实验为完善ATRA治疗APL表观遗传学修饰机制提供了理论证据,并且提示我们H3k27me3修饰的PIM-1可能是治疗癌症的新靶点。
刘卓[5]（2019）在《全反式视黄酸对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成和分泌的影响》文中提出全反式视黄酸（all-trans-retinoic acid,at RA）是视黄酸的主要活化形式,由视黄醇在酶的作用下脱氢氧化而成,通过与视黄酸受体结合发挥生物学作用。已证实多种组织和器官有at RA合成相关酶和视黄酸受体的表达,at RA的作用不局限于视觉维持,对于细胞增殖和分化、机体生长和胚胎发育十分重要,影响免疫系统、神经系统、消化系统、呼吸系统和生殖系统的功能,并能够预防和治疗癌症。在生殖方面,at RA参与性别决定、精子形成和精子能量代谢,影响卵母细胞成熟、受精和胚胎早期发育等。现有文献表明,卵泡颗粒细胞是卵巢内视黄醇摄取的主要位点,at RA主要在颗粒细胞合成。卵泡颗粒细胞是卵泡结构的组成部分,主要功能为合成分泌激素和细胞因子等,通过参与优势卵泡的选择和卵泡的闭锁来调控卵泡发育。既然颗粒细胞是视黄醇的靶细胞并合成at RA,那么推测at RA可能影响颗粒细胞的功能。本研究以KK-1细胞系为模型,探索了at RA对小鼠卵泡颗粒细胞孕酮合成分泌的影响及作用机制以及at RA对小鼠卵泡颗粒细胞m RNAs和mi RNAs表达图谱的影响。主要研究内容和结果如下:1.小鼠卵泡颗粒细胞KK-1中视黄醇摄取转运、视黄酸合成相关基因及视黄酸受体的表达用q PCR检测KK-1细胞中视黄醇摄取转运相关蛋白STRA6、CRBP1、CRBP2,视黄酸合成相关酶ADH1、ADH2、ADH7、ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3,视黄酸受体RARα、RARβ、RARγm RNA的相对表达量。结果显示,以上m RNA均在KK-1细胞中表达。2.at RA对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成和分泌的影响使用不同浓度的atRA（0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、30μM）处理KK-1细胞6h、12h、18h、24h,检测at RA对KK-1细胞活力和孕酮合成分泌的影响。结果显示,0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的at RA处理KK-1细胞6h、12h、18h、24h均能显着提高细胞活力（P﹤0.05）,其中0.1μM、1μM、10μM处理18h效果最佳,三个浓度间细胞活力无显着差异（P﹥0.05）;与对照组相比,用0.1μM和1μM的at RA处理KK-1细胞18h,St AR m RNA表达量显着升高（P﹤0.05）;用0.1μM、1μM、10μM at RA处理KK-1细胞6h、12h、18h、24h均能显着提高St AR蛋白表达量（P﹤0.05）;0.1μM、1μM、10μM at RA处理KK-1细胞6h、12h、18h、24h,孕酮分泌量显着提高（P﹤0.05）。3.at RA对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1 m RNAs和mi RNAs表达图谱的影响使用0.1μM at RA处理KK-1细胞18h,设置空白对照,检测m RNAs和mi RNAs表达图谱的变化并挑选差异表达的m RNA和mi RNA进行q PCR验证。m RNA测序结果显示,与对照组相比,at RA处理组有569个基因差异表达,其中433个基因上调,136个基因下调;选择表达上调的RARβ、VDR、CYP26B1、CD36、Paqr7、AK5和表达下调的BMP4、Ass1、Id1、Ssc5、Tle6、Nos2进行q PCR验证,结果与测序结果相符;mi RNA测序结果显示,与对照组相比,at RA处理组有81个mi RNA差异表达,其中上调34个,下调47个,选择表达下调的mi RNA-6900-5p、mi RNA-181c-3p、mi RNA-6945-3p、mi RNA-3109-5p进行q PCR验证,结果与测序结果相符。4.at RA通过c AMP-PKA-CREB通路对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成分泌的影响利用at RA、c AMP激活剂（forskolin）和PKA抑制剂（H-89）处理KK-1细胞,检测CREB磷酸化水平及对孕酮合成分泌的影响。结果表明,与对照组相比,添加at RA、forskolin、at RA+forskolin显着提高CREB的磷酸化水平（P﹤0.05）,而添加H-89、at RA+H-89显着降低了CREB的磷酸化水平（P﹤0.05）;at RA、forskolin、at RA+forskolin显着提高St AR m RNA的水平（P﹤0.05）,H-89,at RA+H-89显着降低了St AR m RNA的水平（P﹤0.05）;forskolin、at RA+forskolin显着提高CYP11A1 m RNA的水平（P﹤0.05）,H-89、at RA+H-89显着降低了CYP11A1 m RNA的水平（P﹤0.05）;forskolin、at RA+forskolin极显着提高St AR蛋白水平（P﹤0.01）,H-89、at RA+H-89显着降低了St AR蛋白水平（P﹤0.05）;at RA、forskolin、at RA+forskolin极显着提高CYP11A1蛋白的水平（P﹤0.01）,H-89,at RA+H-89显着降低了CYP11A1蛋白的水平（P﹤0.05）;at RA、forskolin、at RA+forskolin极显着提高孕酮分泌水平（P﹤0.01）,H-89、at RA+H-89显着降低了孕酮分泌水平（P﹤0.05）。5.at RA通过RAR对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成分泌的影响用at RA、RAR拮抗剂（AGN193109）处理KK-1细胞,检测对孕酮合成分泌和CREB的磷酸化水平的影响。结果显示,与对照组相比,添加AGN193109、at RA+AGN193109显着降低St AR m RNA水平（P﹤0.05）,添加at RA、AGN193109、at RA+AGN193109极显着降低CYP11A1 m RNA水平（P﹤0.01）;添加AGN193109组、at RA+AGN193109组St AR和CYP11A1蛋白水平极显着降低（P﹤0.01）;添加at RA组孕酮分泌水平极显着升高（P﹤0.01）,而添加AGN193109组、at RA+AGN193109组孕酮分泌水平极显着降低（P﹤0.01）;添加at RA组CREB磷酸化水平显着升高（P﹤0.05）,而添加AGN193109、at RA+AGN193109组CREB磷酸化水平极显着降低（P﹤0.01）。综上所述,在小鼠卵泡颗粒细胞KK-1中,有视黄酸合成事件发生;at RA通过与RAR结合,激活c AMP-PKA-CREB通路,影响St AR和CYP11A1的表达,进而影响小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮的合成与分泌;at RA改变小鼠卵泡颗粒细胞KK-1中m RNAs和mi RNAs的表达图谱。
谢佩珍[6]（2018）在《Z-10的衍生物Z-39抗APL的作用和Myrotoxin A诱导白血病细胞的凋亡研究》文中进行了进一步梳理急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia,APL）是一类特殊的、由染色体易位导致的髓性白血病。APL主要的致病机制是15染色体PML（Promyelocytic leukemia）基因和 17 位染色体RARα(Retinoic acid receptor alpha基因易位形成PML-RARα融合基因所导致。核受体RXRα可以通过与PML-RARα的RARα区域结合,从而形成异源四聚体,再结合到DNA上发挥促癌效应。在这个过程中,RXRα可以稳定PML-RARα的结构,还可以促进PML-RARα与DNA的结合。ATRA和Arsenic通过直接与PML-RARα作用来治疗大多数的APL患者,但在临床上还有很多问题没有解决,比如ATRA和Arsenic的毒副作用和耐药性。因此,寻找治疗APL的新靶点药物和新治疗思路仍具有重要意义。我们课题组前期研究发现,萘硝基乙烯化合物Z-10是RXRα的硝基配体。我们的前期研究还发现:Z-10可以诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞、ATRA抵抗的NB4-LR1和NB4-LR2中PML-RARα的降解,继而诱导NB4细胞发生凋亡。其作用机制是通过抑制PML-RARα与RXRα的相互作用。为了寻找优化的抗APL的芳香硝基乙烯化合物,我们课题组基于Z-10合成了一系列衍生物。其中Z-39和Z-40的结构较为独特,为联苯硝基乙烯化合物。我们研究发现,Z-39可以显着激活RXRα的转录活性,且激活能力强于Z-10。Z-40在同样的条件下不能显着激活RXRα的转录活性。荧光滴定结合实验结果显示Z-39与RXRα结合,所测得的Kd值为～14.87μM。Z-39诱导NB4细胞中的PML-RARα融合蛋白降解和细胞凋亡的作用明显比Z-10强,且具有浓度和时间依赖性。在作用机制研究过程中,我们发现,Z-39与Z-10类似,可以显着地抑制RXRα与PML-RARα的相互作用,并且Z-39的作用比Z-10强。Z-39对RXRα与RARα的相互作用没有影响,同时Z-39也不诱导RARα的降解。此外,我们还发现Z-39可以诱导RXRα发生磷酸化,并且AMPK抑制剂可以抑制Z-39诱导的RXRα的磷酸化,但磷酸化的RXRα在PML-RARα降解中的作用及其机制还不明确,需要进一步地研究。总之,本研究不仅验证了我们以往报道的芳香硝基乙烯化合物抗APL的功效及其中的作用机制,而且我们发现了一个作用效果更好的抗APL的Z-10衍生物。这为硝基乙烯化合物治疗APL的进一步优化提供了新的思路。白血病是由造血异常的恶性肿瘤疾病,发病率在肿瘤中排名第六,根据发病缓急分为急性白血病和慢性白血病。急性白血病发病凶猛、病程较短,常因起病和治疗过程中出现的大出血而致死。慢性白血病发病缓慢、病程较长,进入危急期后,病情发展迅猛,极易导致死亡。目前临床上主要通过化学治疗、靶向治疗、放射治疗、干细胞移植、免疫治疗等这些方法单独或联合治疗白血病,部分病情可以得到缓释或治愈,但是仍存在预后复发、不良反应和耐药等问题。因此,寻找新的治疗白血病的药物对目前白血病的现状是非常重要的。A-S-4-i-4（Myrotoxin A）是我们学院的林挺老师课题组从筋骨草内生真菌中提取得到的单端孢酶烯族化合物。我们在研究中发现,A-S-4-i-4在极低浓度下（1nM左右）就可以抑制80%以上的白血病细胞增殖,但对贴壁细胞需要较高浓度（2nM以上）才能抑制50%以上的细胞增殖。通过检测凋亡通路中的信号蛋白,我们发现A-S-4-i-4可以激活某些白血病细胞（Jurkat细胞、MOLT-4细胞、NB4细胞和U937细胞）中的caspase,并且可以诱导Jurkat细胞发生凋亡,而在同样条件下对贴壁细胞（A431、H-292、Hela、MCF-7和SW620）基本上没有作用。这很好地说明了 A-S-4-i-4对悬浮细胞比对贴壁细胞敏感。接下来,我们选择了作用比较强的Jurkat细胞和同为淋巴瘤细胞的MOLT-4细胞进行下一步研究。我们进行了不同浓度和不同时间试验,研究发现A-S-4-i-4可以诱导caspase通路蛋白的激活,并且具有浓度和时间依赖性。当A-S-4-i-4与caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK共加后,我们发现Z-VAD-FMK可以抑制A-S-4-i-4诱导的caspase-3的激活和PARP的切割,说明A-S-4-i-4有可能是通过caspase通路来诱导白血病细胞凋亡的,但是具体是通过内源凋亡通路还是外源凋亡通路来诱导细胞凋亡还需进行研究。单端孢酶烯族化合物虽然是一种有毒代谢产物,但通过合理的使用方案和结构优化,也许也能如三氧化二砷一样成为治疗白血病的有效药物。本研究确定了此类化合物对一些白血病细胞具有一定选择性的凋亡诱导作用,为进一步研究A-S-4-i-4的凋亡诱导机制和治疗白血病的临床应用打下基础。
项丹艳[7]（2018）在《PML/RARα的NEDDylation修饰及其在急性早幼粒白血病分化治疗中的作用》文中研究表明研究目的:急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia,APL）是急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）的一种亚型,其发病机制与PML/RARα融合蛋白的形成密切相关。该融合蛋白可导致髓系细胞的正常分化受阻而停滞于早幼粒细胞阶段,因此导致了 APL的发生。临床上PML/RARα融合蛋白主要存在三种亚型（L,S和V）,其中L型和S型为主要亚型,约占总数95%。PML/RARα融合蛋白的形成干扰正常细胞生长、分化、成熟与凋亡,具体表现在以下几个方面:（1）改变PML的核定位。PML/RARα融合蛋白干扰PML核体的形成,抑制PML蛋白的正常活性,从而导致细胞增殖异常和凋亡减少;（2）抑制RARα转录激活的能力。PML/RARα形成同源二聚体与RARα竞争维甲酸反应元件RARE,从而使由RARα所调节靶基因的转录激活被抑制,阻碍髓性细胞的分化成熟,导致M3型AML的发生。除了 APL的发生和发展,PML/RARα对于APL的分化治疗也发挥着重要的作用。目前临床上分化治疗所用的药物全反式维甲酸（ATRA）和三氧化二砷（ATO）都是通过降解PML/RARα,诱导早幼粒细胞分化为成熟的粒细胞而达到治疗效果。由此可见,PML/RARα融合蛋白的形成是APL的发病基础,而目前临床上APL诱导分化治疗的关键是使致病融合蛋白PML/RARα发生降解。PML/RARα的降解途径主要包括泛素蛋白酶体途径、自噬溶酶体途径和caspase途径,底物蛋白在被降解之前需要在空间构象、亚细胞定位上发生改变才能被不同的降解途径所识别,蛋白翻译后修饰精准的调控着这些变化。PML/RARα融合蛋白已知的翻译后修饰包括SUMOylation和Ubiquitination,这两种修饰均参与PML/RARα融合蛋白的降解调控。NEDDylation是一种类蛋白质翻译后修饰方式,其发生机制与泛素化类似,泛素样蛋白NEDD8在激活酶E1、结合酶E2和连接酶E3的介导下特异性地与底物蛋白相结合。大多数真核生物中NEDD8高度保守,而NEDDylation异常可以导致肿瘤和神经退行性疾病的发生,以上均提示NEDDylation对于细胞内生命活动具有重要调控作用。本课题组在前期研究发现PML/RARα融合蛋白存在类泛素化NEDDylation修饰,且该修饰对于PML/RARα的蛋白稳定性发挥了重要的调控作用。关于PML/RARα的NEDDylation翻译后修饰目前尚未见文献报道。因此,本课题进一步研究NEDDylation对于PML/RARα融合蛋白的调控作用及其分子机制,探讨抑制NEDDylation对于APL分化的诱导作用,为临床上治愈APL提供新的治疗方法。研究方法:选用人早幼粒细胞白血病细胞NB4和非洲绿猴SV40转化的肾细胞COS-7为主要研究对象,考察急性早幼粒细胞白血病细胞中PML/RARα融合蛋白发生NEDD yl ati o n修饰的分子机制及其对急性早幼粒细胞白血病细胞分化的作用研究。采用免疫沉淀技术考察PML/RARα的NEDDylation修饰水平;采用质粒瞬时过表达结合免疫沉淀技术考察PML/RARα的NEDDylation修饰水平的变化;采用shRNA干扰技术联合慢病毒感染沉默细胞中的NEDDylation E2酶;采用给予NEDDylation 抑制剂 MLN4924 和沉默 NEDDylation E2 酶的方法,通过 western blot检测PML/RARα的蛋白水平;采用免疫荧光法检测NEDDylation抑制剂MLN4924对核体形成的影响。采用血细胞计数板计数结合台盼蓝拒染法考察NEDDylation被抑制后对细胞增殖和存活的影响,描绘细胞增长曲线;采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达水平;采用硝基四氮唑蓝（NBT）还原实验检测PML/RARα的NEDDylation被抑制后对APL细胞的分化作用。研究结果:（1）PML/RARα能发生NEDDylation修饰:在COS-7细胞中过表达HA-PML/RARα,免疫沉淀结果显示PML/RARα能与NEDD8发生共价结合,给予NEDDylation特异性E1酶抑制剂MLN4924,PML/RARα与NEDD8的共价结合被明显抑制。相应地,在COS-7细胞中过表达HA-PML/RARα和deNEDDylation酶NEDP1,免疫沉淀结果显示NEDP1能使PML/RARα的NEDDylation发生下调。同时过表达PML/RARα和NEDDylation的E2结合酶UBC12,相比于单过表达PML/RARα组,质粒共同过表达组PML/RARα的NEDDylation明显增强,在此基础上,将UBC12发挥功能的酶活位点突变,PML/RARα的NEDDylation受到抑制。通过在COS-7细胞上单独过表达HA-PML和HA-RARα,免疫沉淀结果显示RARα存在NEDDylation修饰,PML不存在NEDDylation修饰。以上实验表明,PML/RARα能发生NEDDylation修饰,并且发生修饰的位置可能位于PML/RARα的RARα部分。（2）PML/RARα的NEDDylation对蛋白稳定性的影响:不同浓度的NEDDylation特异性抑制剂MLN4924作用NB4细胞0、24和48小时后,采用western blot技术检测PML/RARα的蛋白水平,结果表明PML/RARα蛋白水平在药物作用48小时后发生明显下降;采用shRNA干扰技术联合慢病毒感染沉默NB4细胞中NEDDylation 的 E2 结合酶,抑制 PML/RARα 的 NEDDylation。Western blot 结果显示shUBC12#1和shUBC12#3可以下调PML/RARα的表达,shUBC12#2相对较弱。以上实验表明,NEDDylation能稳定PML/RARα蛋白。（3）PML/RARα的NEDDylation对PML/RARα核体形成的影响:Hela细胞或COS-7外源性过表达HA-PML/RARα,给予不同浓度的MLN4924（0、0.125、0.25和0.5 μM）作用48小时后,采用免疫荧光检测核体形成,结果显示,0.25 μM和0.5 μM的MLN4924作用48小时后促进核体形成。相应地,给予0.5 μM的MLN4924作用不同时间点（0、12、24和48小时）后,核体形成逐渐明显。以上实验表明,抑制PML/RARα的NEDDylation会促进PML/RARα核体的形成。（4）PML/RARα的NEDDylation对急性早幼粒细胞白血病细胞的分化作用:采用shRNA干扰技术联合慢病毒感染沉默NB4细胞中的NEDDylation结合酶E2。台盼蓝和血细胞计数板计数结果显示,shUBC12#1和shUBC12#3可以明显抑制NB4细胞的增殖;流式细胞术检测CD11b的表达,结果表明,UBC12沉默第五天,shUBC12#1 和 shUBC12#3 的 CD11b 阳性率达到了 18.3±1.3%和 16.0±5.4%。硝基四氮唑蓝（NBT）还原实验的结果进一步证实了抑制NEDDylation能诱导NB4细胞分化。以上实验结果表明,抑制PML/RARα的NEDDylation促进急性早幼粒细胞白血病细胞的分化。研究结论:本研究发现APL的关键致病蛋白PML/RARα是NEDDylation的新底物蛋白,能与NEDD8发生相互作用。PML/RARα融合蛋白可发生NEDDylation修饰进而使蛋白稳定性增加;应用NEDDylation的特异性抑制剂MLN4924或者沉默shUBC12能下调PML/RARα蛋白的表达。此外,抑制PML/RARα的NEDDylation能明显促进核体的形成和APL的分化。本研究不仅发现了 PML/RARα新的翻译后修饰,而且提示抑制PML/RARα的NEDDylation可能可以作为急性早幼粒细胞白血病分化治疗的潜在策略。
李玉龙[8]（2016）在《融合蛋白PML-RARα对NRF2信号通路的调控及机理研究》文中研究说明研究背景NRF2（NF-E2 p45-related factor 2）-KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein 1）信号通路是机体重要的防御系统之一。KEAP1是NRF2的主要调控蛋白,介导其泛素化降解,从而维持了正常细胞中NRF2的稳态平衡。核受体作为一种不依赖于KEAP1的NRF2调控途径起作用。但在许多肿瘤细胞中,KEAP1的突变会引起NRF2的持续高表达。异常激活的NRF2可以通过调控其下游的抗氧化酶,二相解毒酶以及代谢相关的酶,促进肿瘤的恶性增殖和耐药,因此NRF2也被认为是一种癌基因。前期的研究发现,核受体维甲酸受体alpha（Retinoic acid receptor alpha,RARα）和视黄酸 X 受体 alpha（Retinoid x receptor alpha,RXRα）抑制 NRF2 的转录活性。在急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）中,早幼粒白血病蛋白（promyelocytic leukemia protein,PML）基因和RARα基因发生融合,产生了癌基因PML-RARα。融合蛋白PML-RARα的表达使得PML蛋白和RARα蛋白无法发挥正常作用,从而导致细胞分化停滞,凋亡受到抑制和自我更新能力增强。因此,PML-RARα也是急性早幼粒细胞白血病的分子标记物和致病基因。RARα对NRF2的活性具有抑制作用,还有研究报道PML也可以降解NRF2,说明PML-RARα与NRF2存在相关性,那么PML-RARα对NRF2的抑制作用是否存在;虽然融合蛋白在细胞内主要以长型（PML-RARα-Long iso form,PR-L）和短型（PML-RARα-Short isoform,PR-S）两种形式表达,但由于它们在细胞中的分布不同,它们对NRF2活性的影响是否有差别。目的基于上述科学问题,本课题拟通过建立PR-S、PR-L分别过表达的细胞模型,探究PML-RARα对NRF2的调控作用及其机制。方法1.载体构建a.以内源表达PR-L的NB4细胞的cDNA为模板进行PCR扩增,将编码PR-S或PR-L的序列分别克隆到p3XFLAG质粒载体和pFuipw慢病毒载体上。b.以NB4细胞的cDNA为模板进行PCR扩增,将编码PR-S、PR-L突变体的序列分别克隆到p3XFLAG质粒载体上。c.以mRARα全长序列为模板进行PCR扩增,将编码mRARα突变体的序列分别克隆到pET41a或pEGFP-C1载体上。2.细胞株构建将pFuipw-PR-S、pFuipw-PR-L以及pFuipw空载体分别与慢病毒包装质粒共转入HEK293T细胞中,收集含病毒的细胞上清液,通过超速离心浓缩,并利用免疫荧光的方法检测其感染效率。利用适量的细胞培养液感染Hela细胞后,再利用嘌呤霉素进行筛选,随后将单个细胞分离、扩增并鉴定。3.PR-S、PR-L对NRF2信号通路的影响研究方法a.利用SDS-PAGE和Western blot（WB）方法分析NRF2靶蛋白HO-1的表达。b.利用双荧光素酶报告基因系统分析NRF2转录活性变化。4.PR-S、PR-L对NRF2信号通路调控的机理研究方法a.利用重组蛋白表达、免疫共沉淀（IP）和WB方法研究PR-L与NRF2在细胞内的相互作用。b.利用人源真核细胞表达重组蛋白、免疫荧光方法分析PR-S、PR-L分别和NRF2在细胞内的共定位。c.利用人源真核细胞、大肠杆菌表达的重组蛋白,通过IP、GST沉降实验（GST pull-down）和WB的方法研究PR-S或PR-L和NRF2之间的相互作用及其位点。结果1.成功构建了 PR-S、PR-L分别表达的p3XFLAG质粒和pFuipw慢病毒质粒;成功构建了 PR-S、PR-L它们各自突变体分别表达的p3XFLAG质粒;成功构建了mRARα突变体分别表达的pET41a或pEGFP-C1质粒。通过对质粒进行测序分析,并将测序结果与发表序列比对,发现基因序列正确;为了进一步验证质粒能否正确、有效地表达,又将质粒过表达至原核或真核细胞中,WB结果显示重组蛋白的分子量正确。2.成功构建了对照、PR-S和PR-L分别过量表达的单克隆细胞株,它们分别为 Hela-Fuipw、Hela-PR-S2、Hela-PR-S7、Hela-PR-L14 以及 Hela-PR-L20。单克隆细胞株中的PR-S、PR-L蛋白在细胞中的定位与质粒瞬时表达所得结果一致。尽管单克隆细胞株中PR-S、PR-L蛋白表达水平差别较大,但利用多克隆、单克隆细胞株分别进行同一实验,所得结果相似;用同一种单克隆细胞株传代后的重复实验结果可比性好。综上所述,成功构建了表达重组融合蛋白的Hela细胞模型。3.PR-S和PR-L对NRF2信号通路有促进作用a.NRF2激活剂叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone,tBHQ）的处理可以显着增加多克隆细胞株（Hela-PR-S和Hela-PR-L）、单克隆细胞株（Hela-PR-S7和Hela-PR-L14）中NRF2靶蛋白HO-1的表达,且明显高于对照细胞株,呈剂量依赖效应。b.Hela-PR-S、Hela-PR-L、Hela-PR-S7 以及 Hela-PR-L14 细胞株在不同浓度（μM）的tBHQ处理24h后,相比于对照细胞株Hela-Fuipw,荧光素酶的活性都有更大的升高,说明融合蛋白促进NRF2的转录活性。4.PR-S、PR-L融合蛋白与NRF2相互作用a.细胞内相互作用IP和WB结果表明重组的长型融合蛋白与NRF2不仅形成复合体,而且随着NRF2的表达量增加,它们之间相互作用也更明显。b.细胞内共定位在HEK293T细胞中,重组PR-L融合蛋白和NRF2主要位于细胞核中,重组PR-S融合蛋白在细胞核中和细胞质中都有分布,但是融合蛋白PR-S、PR-L与NRF2的共定位都集中在细胞核内;在Hela细胞中,两种重组融合蛋白在细胞中的分布与HEK293T细胞一致,与NRF2共定位也只存在于细胞核中;在NB4细胞中,融合蛋白PR-L和NRF2的共定位也位于细胞核内,且随着NRF2的表达增加,共定位也显着增强。c.体外直接相互作用利用在真核细胞和大肠杆菌中分别表达的RARα全长和突变体重组蛋白,以及大肠杆菌中分别表达的NRF2全长和突变体重组蛋白,通过系统的相互作用分析,研究结果表明融合蛋白上RARα的中间区域（interfingerregion,IF）和C端Ⅱ号锌指结构（C-terminal CⅡ finger,CⅡ）区域与NRF2的N端结构域相互作用。结论本课题发现了无论是长型还是短型融合蛋白PML-RARα对NRF2信号通路不仅没有抑制作用,而且反过来具有激活作用;明确了融合蛋白与NRF2在细胞内的相互作用,并且确定了相互作用的位点是融合蛋白上RARα的IF和CII区域以及NRF2的N端结构域。该项研究在一定程度上解释了融合蛋白对NRF2调控的分子机制,并为进一步研究APL中耐药机制奠定了基础。
魏玉娜,黄亚男,胡流芳,王丽芳,霍海如,朱亚英,谭余庆[9]（2014）在《早幼粒细胞白血病-维A酸受体融合基因的研究进展》文中提出急性早幼粒细胞白血病是急性粒细胞白血病的一个亚型。它的分子生物学特征为15号染色体上的早幼粒细胞白血病（PML）基因与17号染色体上的维A酸受体α（RARα）基因发生易位,表达PML-RARα融合蛋白。PML-RARα融合蛋白在急性早幼粒细胞白血病的发生、发展、诊断和治疗中发挥着重要作用。本文主要综述PML蛋白的结构和生物学功能,PMLRARα的结构、功能及其降解途径。
王慧[10]（2014）在《NLS-RARα蛋白在电转质粒pCMV-HA-NE的NB4中定位的验证及初步应用研究》文中提出第一部分NLS-RARα蛋白在电转质粒pCMV-HA-NE的NB4中定位的验证目的：验证电转质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞中NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位。方法：用质粒pCMV-HA-NE电转NB4细胞,分别用RT-PCR和Western blot法在mRNA水平和蛋白水平验证转染成功;提取电转成功的NB4细胞的核蛋白, Western blot法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达;用FITC-Annexin V/DAPI双染色免疫荧光法和FITC-AnnexinV/PI双染色激光共聚焦法检测电转成功的NB4细胞中NLS-RARα的表达及定位。结果：电转质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞成功表达NE基因和NE蛋白,且有NLS-RARα蛋白表达。用细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测出电转NB4细胞中NLS-RARα蛋白的表达并推测其主要定位于胞核。结论：成功用质粒pCMV-HA-NE电转NB4细胞,并用Western blot法、免疫荧光法、激光共聚焦法验证了NLS-RARα蛋白的存在并推测其主要位于胞核。第二部分NLS-RARα蛋白在电转NB4细胞裸鼠皮下移植瘤中定位的研究目的：研究电转质粒pCMV-HA-NE成功的NB4细胞裸鼠皮下移植瘤中NLS-RARα蛋白的存在及定位。方法：将质粒pCMV-HA-NE电转进NB4细胞中，并用Western blot法验证其中NE蛋白的表达；建立电转NB4细胞裸鼠皮下移植瘤模型；提取成瘤细胞核蛋白,Western blot法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达；FITC-Annexin V/DAPI双染色免疫荧光法、FITC-Annexin V/PI双染色激光共聚焦法、免疫组化法检测成瘤细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位。设立电转质粒pCMV-HA-KZ的NB4细胞、未电转NB4细胞两个对照组。结果:电转成功，Western blot法检测到其中有NE蛋白表达。成功建立电转NB4细胞裸鼠皮下移植瘤模型；成瘤细胞中有NLS-RARα蛋白表达；FITC-Annexin V/DAPI双染色免疫荧光法、FITC-AnnexinV/PI双染色激光共聚焦法、免疫组化法成功检测到其中NLS-RARα蛋白的表达，并推测其中NLS-RARα蛋白的表达主要位于胞核。结论:成功用4种方法检测出成瘤细胞中的NLS-RARα蛋白的存在并推测其主要位于胞核。第三部分NLS-RARα蛋白在APL病人血中性粒细胞中定位的验证目的：验证急性早幼粒细胞白血病（APL）病人血中性粒细胞中NLS-RARα蛋白的存在并定位。方法：用Western blot法验证病人血中性粒细胞的NE酶；提取病人血中性粒细胞核蛋白， Western blot法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达；FITC-Annexin V/DAPI双染色免疫荧光法检测和FITC-Annexin V/PI双染色激光共聚焦法检测病人血中性粒细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位。以电转质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位作阳性对照，以正常人血中性粒细胞中野生型RARα的表达和定位作阴性对照。结果:阳性对照组设置成功。病人血中性粒细胞中存在NE酶且有NLS-RARα蛋白表达。根据细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测结果，推测病人血中性粒细胞中NLS-RARα蛋白的表达主要位于胞核。结论:成功用3种方法检测出APL病人血中性粒细胞中的NLS-RARα蛋白的存在并推测其主要位于胞核。
二、视黄酸依赖Fas/RARα融合蛋白表达及其定位研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、视黄酸依赖Fas/RARα融合蛋白表达及其定位研究（论文提纲范文）
（1）低剂量PRF诱导的人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞自噬与分化的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 一、中医对白血病的认识与研究 |
| 二、中药及中药提取物治疗白血病的研究 |
| 三、自噬在肿瘤中的研究概况 |
| 四、MEK/ERK信号通路 |
| 五、NB4细胞 |
| 第二部分 葛根总黄酮体外诱导NB4细胞自噬与分化作用的实验研究 |
| 一、实验材料与药物 |
| (一) 实验细胞株 |
| (二) 主要试剂及配制 |
| (三) 主要仪器设备 |
| 二、方法与步骤 |
| (一) NB4细胞培养和传代 |
| (二) 细胞周期的分析实验 |
| (三) 细胞表面分化抗原CD11b的检测 |
| (四) 瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学改变 |
| (五) 单丹磺酰尸胺(MDC)染色 |
| (六) 透射电镜检测细胞自噬形态 |
| (七) qReal-time PCR实验 |
| (八) Western Blot实验 |
| (九) 数据统计分析 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录一 主要缩略语中英文对照表 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）NLS-RARα的核转运机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 NLS-RARα抑制白血病细胞分化并在核中累积 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分 NLS-RARα依赖RARα部分的NLS入核 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第三部分 NLS-RARα通过KPNA2/KPNB1 途径入核 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 NLS-RARα在 APL中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
（3）低氧诱导精母细胞凋亡导致精子生成减少的机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 低氧通过HIF-1α介导的死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径诱导精母细胞凋亡 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 低氧经死亡受体凋亡途径caspase-8 抑制精母细胞巨自噬 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 过表达Beclin-1 促进精母细胞巨自噬、缓解凋亡,促进精子生成 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 自噬在精子生成减少中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬与细胞死亡的对话 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究结果 |
| 致谢 |
（4）ATRA介导组蛋白修饰调控PIM-1抑制HL-60细胞增殖及诱导分化机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 急性早幼粒细胞白血病的研究进展 |
| 1.1 造血干细胞 |
| 1.2 急性早幼粒细胞白血病 |
| 1.3 急性早幼粒细胞白血病的表观遗传学调控 |
| 1.4 ATRA治疗早幼粒细胞白血病的进展 |
| 第二章 ATRA对急性早幼粒白血病细胞HL-60的影响及机制研究 |
| 2.1 实验材料与仪器设备 |
| 2.1.1 实验所用细胞系 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HL-60细胞培养 |
| 2.2.2 ATRA药物稀释 |
| 2.2.3 RT-qPCR检测ATRA对PML/RARA融合基因表达的影响 |
| 2.2.4 蛋白质印记法检测ATRA对PML/RARA融合蛋白表达的影响 |
| 2.2.5 MTS法检测ATRA对HL-60细胞增殖能力的影响 |
| 2.2.6 流式细胞术检测ATRA对HL-60细胞分化的影响 |
| 2.2.7 流式细胞术检测ATRA对HL-60细胞周期的影响 |
| 2.2.8 Annexin V/PI双染法检测ATRA对HL-60细胞凋亡的影响 |
| 2.2.9 HL-60细胞转录组高通量测序 |
| 2.2.10 ChIP-PCR验证基因结合 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ATRA对HL-60细胞PML/RARA融合基因表达的影响 |
| 2.3.2 ATRA对HL-60细胞PML/RARA融合蛋白表达的影响 |
| 2.3.3 ATRA对HL-60细胞增殖能力的影响 |
| 2.3.4 ATRA对HL-60细胞分化的影响 |
| 2.3.5 ATRA对HL-60细胞周期的影响 |
| 2.3.6 ATRA对HL-60细胞凋亡的影响 |
| 2.3.7 HL-60细胞全基因组注释及靶基因分析 |
| 2.3.8 GO功能分析与KEGG信号通路分析 |
| 2.3.9 差异基因表达验证 |
| 2.3.10 染色质免疫沉淀验证基因结合 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）全反式视黄酸对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成和分泌的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 维生素A的代谢与功能 |
| 1.1 维生素A简介 |
| 1.2 维生素A的摄取、代谢与储存 |
| 1.3 维生素A的功能 |
| 第2章 视黄酸研究进展 |
| 2.1 视黄酸合成和降解 |
| 2.2 视黄酸的作用机制 |
| 2.3 视黄酸的功能 |
| 第3章 卵泡颗粒细胞系研究进展 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 小鼠卵泡颗粒细胞系KK- |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 视黄醇摄取转运、视黄酸合成相关基因及视黄酸受体在小鼠卵泡颗粒细胞KK-1中的表达 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 atRA对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1 孕酮合成和分泌的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 atRA通过改变mRNAs和 miRNAs表达图谱影响小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成分泌 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 atRA通过cAMP-PKA-CREB通路对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成分泌的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 atRA通过视黄酸受体RAR对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1 孕酮合成分泌的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）Z-10的衍生物Z-39抗APL的作用和Myrotoxin A诱导白血病细胞的凋亡研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略简表 |
| 第一部分 Z-10的衍生物Z-39抗APL的作用研究 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. APL简介及其发病机制 |
| 2. 视黄醇类X受体 |
| 2.1 RXRα的功能 |
| 2.2 RXRα与APL的功能 |
| 2.3 磷酸化的RXRα |
| 3. APL的治疗进展 |
| 3.1 全反式维甲酸 |
| 3.2 三氧化二砷 |
| 4. 硝基苯乙烯衍生物 |
| 5. 本课题研究的目的和意义 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验主要材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞株、菌株、质粒和化合物 |
| 1.4 主要溶液 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养与冻存 |
| 2.2 细胞铺板 |
| 2.3 细胞转染(PEI转染法) |
| 2.4 蛋白提取和制备 |
| 2.5 Western blot |
| 2.6 免疫共沉淀 |
| 2.7 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.8 双荧光报告基因 |
| 2.9 荧光滴定Kd值的计算方法 |
| 结果与分析 |
| 1. Z-10衍生物对核受体特异性的筛选和鉴定 |
| 1.1 Z-10衍生物对核受体的初步筛选 |
| 1.2 Z-39对NB4细胞的凋亡诱导作用 |
| 1.3 Z-39可以与RXRα结合 |
| 2. Z-39可以时间和浓度依赖性地诱导PML-RARα融合蛋白降解 |
| 2.1 Z-39可以浓度依赖性地诱导PML-RARα融合蛋白降解 |
| 2.2 Z-39时间依赖性地诱导PML-RARα融合蛋白降解 |
| 3. Z-39可以抑制PML-RARα与RXRα的相互作用 |
| 4. Z-39可以诱导RXRα发生磷酸化 |
| 5. Z-39可以诱导NB4细胞凋亡 |
| 结论 |
| 讨论与展望 |
| 1. Z-10衍生物的筛选 |
| 2. Z-39可以时间和浓度依赖性地诱导PML-RARα融合蛋白降解和细胞凋亡 |
| 3. Z-39可以抑制PML-RARα与RXRα的相互作用 |
| 4. Z-39可以诱导RXRα发生磷酸化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Myrotoxin A诱导白血病细胞的凋亡研究 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 白血病简介 |
| 1.1 急性髓性白血病 |
| 1.2 急性淋巴细胞白血病 |
| 1.3 慢性髓性白血病 |
| 2. 细胞凋亡信号通路简介 |
| 3. 单端孢酶烯族化合物A-S-4-i-4 |
| 3.1 单端孢酶烯族类 |
| 3.2 A-S-4-i-4 |
| 4. 研究的目的和意义 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验主要材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞株和化合物 |
| 1.4 主要溶液 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养与冻存 |
| 2.2 细胞铺板 |
| 2.3 蛋白提取和制备 |
| 2.4 Western blot |
| 2.5 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.6 WST-1检测细胞凋亡 |
| 结果与分析 |
| 1. A-S-4-i-4对细胞增殖作用的影响 |
| 1.1 A-S-4-i-4对血液瘤细胞增殖的影响 |
| 1.2 A-S-4-i-4对实体瘤细胞增殖的影响 |
| 2. A-S-4-i-4可以诱导Jurkat细胞凋亡 |
| 3. A-S-4-i-4可激活悬浮细胞的Caspase通路 |
| 4. A-S-4-i-4可以浓度和时间依赖性地激活Jurkat细胞和MOLT-4细胞的caspase通路 |
| 4.1 A-S-4-i-4可以浓度依赖性地激活Jurkat细胞和MOLT-4细胞的caspase通路 |
| 4.2 A-S-4-i-4可以时间依赖性地激活Jurkat细胞和MOLT-4细胞的caspase通路 |
| 5. Z-VAD-FMK可以抑制A-S-4-i-4激活的caspase通路 |
| 结论 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）PML/RARα的NEDDylation修饰及其在急性早幼粒白血病分化治疗中的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与仪器 |
| 2.1 细胞株和质粒 |
| 2.2 药物与主要试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 Western blot检测相关蛋白 |
| 3.3 质粒转染 |
| 3.4 免疫沉淀检测PML/RARα和NEDD8的共价结合 |
| 3.5 免疫荧光法观察MLN4924给予之后NB形成的情况 |
| 3.6 流式细胞术检测NB4细胞表面分化抗原CD11b表达情况 |
| 3.7 NBT细胞还原能力检测 |
| 3.8 PCDNA3.0-PML/RARα-L-HA质粒构建 |
| 3.9 PCDNA3.0-UBC12-C111S-Flag质粒点突变 |
| 3.10 慢病毒颗粒的包装 |
| 3.11 慢病毒转染细胞 |
| 3.12 数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 PML/RARα能发生NEDDylation修饰 |
| 4.1.1 PML/RARα能与NEDD8发生共价结合 |
| 4.1.2 MLN4924能抑制PML/RARα与NEDD8的共价结合 |
| 4.1.3 NEDP1使PML/RARα发生deNEDDylation |
| 4.1.4 UBC12能增强PML/RARα的NEDDylation |
| 4.1.5 UBC12酶活缺失抑制PML/RARα的NEDDylation |
| 4.1.6 PML/RARα的NEDDylation发生在RARα部分 |
| 4.2 PML/RARα的NEDDylation修饰对蛋白稳定性的影响 |
| 4.2.1 MLN4924能使PML/RARα稳定性发生下降 |
| 4.2.2 shUBC12能使PML/RARα稳定性发生下降 |
| 4.3 PML/RARα的NEDDylation修饰对NB形成的影响 |
| 4.3.1 MLN4924促进核体的重新形成 |
| 4.4 PML/RARα的NEDDylation对急性早幼粒细胞白血病细胞的分化作用 |
| 4.4.1 抑制PML/RARα的NEDDylation对APL细胞增殖的影响 |
| 4.4.2 抑制PML/RARα的NEDDylation对APL细胞分化的影响 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| APL的针对性治疗:PML/RARα的降解 |
| 参考文献 |
| 作者简历及硕士期间科研成果 |
（8）融合蛋白PML-RARα对NRF2信号通路的调控及机理研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 常用溶液配制 |
| 2.5 质粒 |
| 3 方法 |
| 3.1 感受态细胞制备 |
| 3.2 质粒构建 |
| 3.3 用于细胞转染的质粒提取 |
| 3.4 GST pull-down实验 |
| 3.5 细胞培养 |
| 3.6 转染 |
| 3.7 细胞蛋白质提取 |
| 3.8 免疫共沉淀 |
| 3.9 Western blot |
| 3.10 免疫荧光 |
| 3.11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.12 PR-S、PR-L分别过量表达细胞株的构建 |
| 4 结果 |
| 4.1 短型和长型PML-RARα质粒的构建与鉴定 |
| 4.2 构建PR-S、PR-L分别过量表达的细胞模型 |
| 4.3 PR-S、PR-L对NRF2转录活性具有促进作用 |
| 4.4 PR-S、PR-L融合蛋白与NRF2相互作用 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）早幼粒细胞白血病-维A酸受体融合基因的研究进展（论文提纲范文）
| 1 PML基因及其表达产物的结构和功能 |
| 1.1 PML基因及其表达产物的结构 |
| 1.2 PML蛋白的核体定位与核体的形成 |
| 1.3 PML蛋白的生物学功能 |
| 1.3.1 肿瘤抑制作用 |
| 1.3.2 维持白血病起始细胞自我更新的作用 |
| 1.3.3 凋亡诱导功能 |
| 1.3.4 调控细胞迁移 |
| 1.3.5 调节血管生成 |
| 2 RARα基因及其表达产物特点 |
| 3 PML-RARα融合基因 |
| 3.1 PML-RARα融合基因及表达产物的结构和类型 |
| 3.2 PML-RARα在APL中的作用 |
| 3.3 PML-RARα融合蛋白的降解途径 |
| 4 结语 |
（10）NLS-RARα蛋白在电转质粒pCMV-HA-NE的NB4中定位的验证及初步应用研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部 NLS-RARα蛋白在电转质粒 pCMV-HA-NE 的 NB4 细胞中定位的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 NLS-RARα蛋白在电转 NB4 细胞裸鼠皮下移植瘤中定位的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 NLS-RARα蛋白在 APL 病人血中性粒细胞中定位的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、视黄酸依赖Fas/RARα融合蛋白表达及其定位研究（论文参考文献）
- [1]低剂量PRF诱导的人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞自噬与分化的作用机制[D]. 李萌. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]NLS-RARα的核转运机制研究[D]. 叶娇. 重庆医科大学, 2020(12)
- [3]低氧诱导精母细胞凋亡导致精子生成减少的机制[D]. 殷骏. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [4]ATRA介导组蛋白修饰调控PIM-1抑制HL-60细胞增殖及诱导分化机制研究[D]. 倪佩娟. 内蒙古大学, 2019(09)
- [5]全反式视黄酸对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成和分泌的影响[D]. 刘卓. 吉林大学, 2019(10)
- [6]Z-10的衍生物Z-39抗APL的作用和Myrotoxin A诱导白血病细胞的凋亡研究[D]. 谢佩珍. 厦门大学, 2018(07)
- [7]PML/RARα的NEDDylation修饰及其在急性早幼粒白血病分化治疗中的作用[D]. 项丹艳. 浙江大学, 2018(01)
- [8]融合蛋白PML-RARα对NRF2信号通路的调控及机理研究[D]. 李玉龙. 浙江大学, 2016(11)
- [9]早幼粒细胞白血病-维A酸受体融合基因的研究进展[J]. 魏玉娜,黄亚男,胡流芳,王丽芳,霍海如,朱亚英,谭余庆. 国际药学研究杂志, 2014(03)
- [10]NLS-RARα蛋白在电转质粒pCMV-HA-NE的NB4中定位的验证及初步应用研究[D]. 王慧. 重庆医科大学, 2014(02)