脐带血干细胞可以用于成人吗？

一、脐血干细胞能否用于成人（论文文献综述）

于亚菲^[1]（2021）在《WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究》文中提出第一部分:利用全外显子组测序技术筛选ITP致病基因及亚组致病基因研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种病因尚未完全阐明的获得性出血性疾病。患者的共同特点是血小板计数低于正常参考值下限（100×109/L）,其临床表现具有异质性,患者可伴或不伴不同程度、不同部位的出血症状,近年来,乏力、焦虑甚至认知功能障碍等症状也逐渐引起重视。迄今为止,ITP的关键病因是免疫失耐受,导致血小板破坏增加或血小板产生不足。其中主要涉及体液和细胞免疫两大方面,涉及多种免疫细胞包括B细胞、T细胞、单核/巨噬细胞（Mφ）、树突状细胞（DCs）、间充质干细胞（MSCs）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）等。目前已证实患者免疫系统对自身血小板表面膜糖蛋白失耐受,机体产生血小板表面膜糖蛋白特异性抗体致敏血小板,进而导致单核巨噬系统吞噬破坏血小板能力增强;ITP患者体内杀伤性CD8+T细胞对自身血小板失耐受,可直接裂解血小板;ITP患者血小板表面糖蛋白（GP）去唾液酸化增加,易被肝脏捕获吞噬等多种途径导致血小板的破坏加速。另一方面,多种免疫细胞、细胞因子及血小板抗体的异常导致巨核细胞增殖、成熟和凋亡障碍,最终导致血小板产生不足。随着对ITP发病机制更深入更全面的研究,ITP患者与正常人体内复杂交错的微观差异也逐步被揭示,涉及多种分子、细胞、器官、系统,因此寻找ITP最本质的差异,探索最源头的病因,也日渐成为ITP领域研究者的重点攻坚问题。全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）与全外显子组测序（Whole Exome Sequencing,WES）是目前DNA水平高通量测序的主要研究内容,人类基因组包含约31.6亿脱氧核糖核苷酸碱基对,其中外显子组占1-2%。加州大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz,UCSC）提供的 hg19 版本人类参考基因组中有entrez gene ID号的基因是23056个,虽然外显子在人类所有基因中所占的比例不足2%,但是它却包含约85%的已知致病突变。因此检测基因组中所有的外显子,即全外显子组测序,对于筛选与所研究疾病有关的致病突变具有重要意义。高通量测序技术自诞生以来已成功应用于多个科研领域,医学研究涉及广泛,如食管鳞癌基因组变异研究,多发性肺癌基因组异质性研究,同步双侧卵巢癌的异质性和克隆进化研究,外显子测序揭示肝细胞-胆管癌的进化及起源,单细胞转录组测序探究示踪造血干细胞形成过程等。基于急性髓细胞白血病（Acute myeloidleukemia,AML）的基因测序研究改写了 2016年WHO分型指南,急性白血病、骨髓增生异常综合征（MDS）等疾病都已有应用于临床的基因检测panel,而ITP方面目前尚未有测序相关研究报道,本研究首次探索ITP患者的基因组特点及变异信息,筛选与正常健康对照的基因差异,并且探究ITP患者内部的基因差异,包括骨髓巨核细胞数量相对正常与显着增多患者、rhTPO治疗有效与无效患者的基因差异,从而探索寻找ITP的致病突变基因以及ITP内部异质性的基因根源。研究目的:（1）描述与统计本研究中ITP患者基因组测序数据的基本变异特点。（2）探究ITP患者与正常对照全外显子组的差异,包括突变位点、结构变异,并进行有害性分析,筛选ITP患者共有突变基因,得出致病候选基因,并进行基因富集分析和蛋白质交互作用预测。（3）探究疾病亚组间的基因差异,亚组包括骨髓巨核异常增多与骨髓巨核大致正常ITP患者、对rhTPO治疗有效与无效的ITP患者,旨在揭示ITP患者间骨髓巨核差异以及对rhTPO治疗反应差异的基因根源。研究方法:（1）ITP患者与健康对照样本:严格按照纳入与排除标准,筛选ITP患者,匹配同年龄、同性别的健康志愿者,采集患者和健康志愿者外周血,记录患者病例信息资料。（2）外周血DNA全外显子组测序:提取外周血DNA,经DNA样品检测、建库捕获、库检、采用Illumina Novaseq 6000测序平台进行测序。（3）测序数据质量评估:将获得的原始测序数据（Rawdata）进行精细过滤,得到cleanreads,有效测序数据通过BWA比对到人类参考基因组（GRCh37/hg19）上,初始比对结果为BAM格式,然后用SAMtools软件对其排序,再用Sambamba进行重复数据标记,最后进行覆盖度、深度等统计。（4）生物信息分析:将过滤后的高质量序列比对到人类参考基因组上,检测样本变异,并利用ANNOVAR对变异进行注释。筛选ITP相关有害变异位点与基因的步骤包括:1)筛选高质量ITP差异位点与基因;2)根据已有数据库进一步筛选突变位点;3)ACMG突变位点有害性分类;4)结构变异有害性分析;5)ITP共有突变基因筛选;6)候选基因相关性排序;7)候选基因富集分析;8)蛋白相互作用分析。另外对ITP患者内部巨核细胞显着增多与相对正常者、rhTPO有效与无效者进行基因组外显子区差异分析。（5）分析结果验证:从测序、生信分析后得到的候选致病基因中随机挑选,提取患者外周血单个核细胞（PBMC）RNA反转录,从cDNA水平进行候选致病位点的Sanger验证,以确定突变位点确实影响到mRNA,并随机挑选部分基因对应的mRNA进行差异表达检测与分析。研究结果:（一）测序标本统计信息:纳入55例ITP患者及55例同年龄、同性别的健康对照者。1、ITP患者:中位年龄为39（范围:18-80）岁,基线中位血小板计数为11（范围:1-47）×109/L,男性21人,女性34人。2、健康对照者:中位年龄为39（范围:18-80）岁,基线中位血小板计数为185（范围:161-239）×109/L,男性21人,女性34人。（二）送检标本质控信息:55例ITP患者外周血提取DNA后经全外显子组测序获得平均原始数据量11.6±0.97 G,所有测序标本比对到参考基因组上的总reads数量比例均达到99.9%。目标区域的中位覆盖率为99.6%（范围:99.6-99.9%）,目标区域平均测序深度112.0±9.12 X。（三）ITP测序标本基因变异结果:（1）基因组上各分区单核苷酸变异（SNV）结果显示:内含子变异数目最多70788±4827,其次是外显子区域22002±151.6和基因间区域20545±2430。而编码区上不同类型SNV结果为同义突变最多11261±82.8,其次是错义突变10199±88.59。其余区域和类型数目相对较少。（2）基因组上各分区插入缺失变异（InDel）结果显示:内含子变异数目最多10322±752.3,其次是基因间区域3026±388.6和非编码RNA内含子区域818.3 ±72.54,外显子区域为613.3±17.79。而编码区上不同类型InDel结果为非移码缺失最多198.6 ± 10.03,非移码插入183.1±10.49,未知功能位点90.62 ±3.325,移码缺失 76.56±6.215,移码插入 58.16±4.803。（3）基因组上各分区拷贝数变异（CNV）结果显示:CNV总数目较少,其中CDS区相对最多,其余区域CNV基本可忽略不计。（四）基因组检测结果生信分析:本研究共得到总变异位点数目SNV 778643个,InDel 147859个,从测得的变异结果中去除人群高频的SNP,利用现有数据库,软件等,结合ITP血小板减少特点,进行再筛选,最终得到总SNV 15054个,总InDel 1900个,合并相同位点后共得到428个候选致病位点,342个候选致病基因,并注释出ACMG分类为致病的159个已知致病基因。经数据库筛选以及经55例正常对照筛选的共有候选基因富集分析显示卟啉与叶绿素代谢通路、抗坏血酸和醛酸代谢通路、甾体激素生物合成、戊糖和葡萄糖酸酯的相互转化、视黄醇代谢、药物代谢等KEGG信号通路在ITP患者与正常对照间存在显着差异。另外还进行了巨核异常增多与巨核相对正常ITP患者、rhTPO治疗有效与无效ITP患者差异基因的筛选。（五）分析结果验证:随机抽取342个候选致病基因中的FHOD1基因的6个候选致病位点,设计引物扩大样本至200例进行Sanger测序得到各个SNV的变异频率为:rs200317614（0.5%）,rs6499118（3.0%）,rs1 17880323（0.5%）,rs199924523（0.5%）,rs539519503（0.5%）,67264047（0.5%）。另外对部分随机抽取的 7 个候选基因进行RT-qPCR相对表达定量检测,发现3个基因在ITP患者与正常对照间表达有显着差异,包括MMP9、ERCC6、NFIB,其余4个基因表达量与正常人无显着差异,但表达量的标准差要大于正常对照组。研究结论:（一）在对测序结果进行质控筛选后确保质量可靠的前提下,ITP患者与正常对照基因组确实存在差异,基因组上SNV在内含子区最多,其次为外显子区,而InDel在内含子区也最多,其次为基因间区域,而CNV数目很少。（二）经测序和生信分析共得到428个外显子区候选致病位点,342个候选致病基因,其中ACMG分类为致病的为159个已知致病基因。对候选基因富集分析显示ITP与正常对照之间在多个代谢相关的KEGG信号通路存在显着差异。（三）巨核异常增多与巨核相对正常ITP患者、rhTPO治疗有效与无效ITP患者间也存在差异基因,这些差异为探究ITP患者内部巨核细胞的异质性以及预测rhTPO效果可能具有重要指导意义。第二部分:rhTPO影响血小板抗体阳性ITP巨核产板的异质性研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种以血小板计数持续减低为特征状态的获得性自身免疫性疾病。迄今为止,ITP的发病机制尚未完全阐明,其中心学说为“免疫失耐受”,体液与细胞免疫异常导致机体对自身血小板表面抗原失耐受从而加速血小板的破坏,免疫异常还影响巨核细胞的发育、成熟和凋亡产板,免疫系统对自身血小板及巨核的失耐受导致血小板破坏增加,生成减少,从而形成机体血小板持续减低的状态。血小板表面膜糖蛋白（Glycoprotein,GP）特异性抗体是攻击血小板的主要分子,70%的ITP患者血浆中可检测到该类抗体（以抗GPⅡb/Ⅲa或GPⅠb/Ⅸ为主）,抗体作为体液免疫的重要组成部分,也是ITP最早发现的发病机制,是ITP发病机制的关键部分。已有多项研究表明,抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPⅠb/Ⅸ抗体对巨核细胞生成血小板具有不同影响:小鼠模型中发现,部分抗GPⅡb/Ⅲa抗体可以抑制巨核增殖,引起巨核数目减少,但抗GPIbα抗体对骨髓巨核计数影响较小;GPIbα可以影响血小板的体积,GPIbα敲除小鼠可以模拟巨血小板综合症,使其出现血小板增大和数量的减少。GPIbα胞内区域与细胞骨架细丝蛋白A相连接,调控生成血小板的大小,体外实验中发现,细丝蛋白A可以与PACSIN2（BAR/F-BAR蛋白的一种）相互作用,调控巨核胞内界膜系统生成,以及血小板内管状膜性结构生成。综合以往研究,抗GPⅡb/Ⅲa抗体主要阻碍巨核增殖,抗GPⅠbα抗体更多地影响血小板内部骨架结构,而TPO可特异性促进造血干细胞自我更新和增殖,还可以促进巨核祖细胞向巨核细胞的分化与增殖,rhTPO以及其他TPO-RAs已被证实可有效地促进ITP患者血小板提升,那么两种血小板抗体阳性ITP患者巨核产板障碍的情况是否都能被rhTPO纠正尚未阐明。研究目的:通过体外观察ITP患者血清在加入不同血小板表面膜糖蛋白纯化功能性抗体的作用下对巨核发育成熟、凋亡以及血小板生成的影响,以及探究rhTPO能否弥补或纠正这种影响,并通过体内动物实验,探究rmTPO对ITP小鼠在注射不同血小板表面膜糖蛋白功能抗体的作用下,恢复血小板水平的效果。为临床rhTPO应用前疗效预测提供基础研究依据。研究方法:（1）ITP患者和健康志愿者:收集外周血,无菌分离制备血清及血浆。（2）MAIPA检测:检测患者血浆两种血小板抗体的结果,并分组留取不同MAIPA结果患者的血清。（3）脐血诱导巨核细胞:采集健康的足月妊娠女性脐血80-100mL,无菌分离单个核细胞,并进一步磁珠分选CD34+细胞,培养基选择无血清培养基（Serum-Free Expansion Medium,SFEM）,其中加入重组人血小板生成素,重组人IL-3以及干细胞因子三种细胞因子,诱导培养脐血来源的CD34+细胞向巨核系方向分化。（4）体外细胞实验:第一部分:A组:抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者组,B组:抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者组,C组:抗体双阴组,D组:正常对照组。第二部分:A组:双阴血清对照组,B组:血清加抗GPⅡb抗体组,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组,D组:血清加双抗体组。CD34+细胞经以上处理分组培养,14天后采用流式细胞术检测各组巨核细胞生成比例和凋亡比例、多倍体巨核比例和产血小板数量等指标,比较不同处理对巨核发育、成熟及产板的影响。14天后向第二部分各组加入rhTPO,继续培养14天,再次流式细胞术检测各组巨核细胞比例和凋亡比例、多倍体巨核比例以及产血小板数量等指标,比较rhTPO对不同组巨核发育、成熟及产板的影响。（5）体内动物实验:构建C57BL/6背景的ITP被动小鼠模型:A组:小鼠+抗GPⅡb功能抗体+rmTPO,B组:小鼠+抗GPⅡb功能抗体+等量生理盐水,C组:小鼠+抗GPⅠbα功能抗体+rmTPO,D组:小鼠+抗GPⅠbα功能抗体+等量生理盐水。每周采集并检测不同组ITP小鼠的血小板变化情况。研究结果:（1）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清TPO水平之间无显着差异。本研究共纳入41例ITP患者和8例正常对照者,对49例样本外周血贫血小板血浆（PPP）进行MAIPA检测,得到抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者13人（A组）,抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者8人（B组）,抗体双阴患者13人（C组）,抗体双阳患者7人（D组）,抗血小板抗体阳性检测率为68.3%（28/41）,8例正常对照者MAIPA检测结果为双阴性（E组）。ELISA检测该49例外周血血清TPO水平,按照MAIPA结果对5组TPO水平进行统计分析显示各组TPO水平之间无统计学差异（P>0.05）。（2）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清对脐血诱导巨核细胞和血小板生成的影响具有异质性。向脐血来源的CD34+细胞诱导巨核体系中,加入不同MAIPA结果的ITP或正常对照者的血清,分为A组:抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者组（n=13）,B组:抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者组（n=8）,C组:抗体双阴组（n=13）,D:正常对照组（n=8）。四组培养体系中细胞总数之间无显着差异,而CD61+细胞比例以及CD61+巨核细胞数量抗GPⅡb/Ⅲa与抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性组都显着低于正常对照组,而抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性组水平最低,还显着低于抗体双阴性组,而各组ITP患者相比正常对照组血小板释放都显着减少。（3）抗血小板GPⅠbα与GPⅡb特异性抗体对血清孵育脐血诱导的巨核细胞生成、成熟、凋亡和血小板生成的影响不同。向脐血来源的CD34+细胞诱导巨核体系中,加入血小板抗体双阴性ITP患者血清以及纯化的抗人CD41a（GPⅡb）和/或CD42b（GPⅠbα）功能抗体,分为A组:双阴血清对照组（n=10）,B组:血清加抗GPⅡb抗体组（n=10）,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组（n=10）,D组:血清加双抗体组（n=10）。抗GPⅡb抗体组以及双抗体组CD61+细胞比例都显着低于抗体双阴性组,而≥4N多倍体巨核细胞比例双抗体组显着低于抗体双阴性组,各组巨核凋亡比例未见显着差异,加抗体各组血小板生成数量要显着低于抗体双阴组。（4）rhTPO对血清和血小板抗体孵育脐血诱导的巨核生成、成熟、凋亡和血小板生成的影响不同。脐血诱导巨核体系在与血小板抗体孵育后分为A组:双阴血清对照组（n=10）,B组:血清加抗GPⅡb抗体组（n=10）,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组（n=10）,D组:血清加双抗体组（n=10）。再应用rhTPO,检测培养体系CD61+细胞比例,发现抗体双阴性组与加抗GPⅡb抗体组要显着高于加双抗体组,而相比于应用rhTPO之前,抗GPⅡb抗体组CD61+细胞比例提升较抗GPⅠbα抗体组显着增加,提高抗体双阳性组≥4N多倍体巨核细胞比例至与其他组无显着差异水平,各组巨核凋亡比例仍未见显着差异。培养体系血小板释放增加,但GPⅠbα抗体组与双抗体组仍显着低于双阴组,而GPⅡb抗体组提升至与双阴组无显着差异水平。（5）rmTPO对抗GPⅠbα抗体诱导的小鼠血小板减少的治疗作用效果不佳。A组:抗GPⅡb功能抗体+rmTPO,B组:抗GPⅡb功能抗体+NS,C组:抗GPⅠbα功能抗体+rmTPO,D组:抗GPⅠbα功能抗体+NS。A组血小板计数比B组显着增高,但C组与D组相比无统计学差异,说明rmTPO对抗GPⅡb抗体诱导的ITP小鼠模型血小板的提升显着,但对于抗GPⅠbα抗体诱导的ITP小鼠模型血小板的提升作用不佳。结论:（1）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清TPO水平之间无显着差异。（2）体外不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清对脐血诱导巨核细胞和血小板生成的影响具有异质性,MAIPA阳性ITP患者与正常对照者相比巨核以及血小板生成显着受抑制,其中抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性ITP患者血清孵育的巨核细胞比例和数量最低,显着低于正常对照者和双阴性ITP患者。（3）体外抗GPⅡb抗体对血清孵育脐血诱导的巨核细胞生成数量影响较大,而抗GPⅠbα抗体可能对巨核细胞大小或成熟程度影响较大,两种抗体同时存在会显着降低≥4N多倍体巨核比例以及产板量。rhTPO的应用可以显着提升抗GPⅡb抗体组巨核细胞比例,并且提升双抗体组多倍体巨核比例。（4）体内小鼠模型也显示rmTPO对抗GPⅠbα抗体诱导的小鼠血小板减少的治疗作用效果不佳。第三部分:ITP患者血小板自身抗体特异性与对rhTPO反应性的相关性研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种获得性自身免疫性出血性疾病,其年发病率为2～5/10万成人,患者常有不同程度的出血症状。近年来,还发现乏力等症状也与ITP发病有关。糖皮质激素和静脉注射丙种球蛋白（intravenousimmunoglobulin,IVIG）目前仍然是我国成人ITP患者的一线治疗方案。然而,仍有15%～25%的患者对一线治疗无效,并且激素的长期使用甚至是不规范使用给ITP患者带来了严重的不良反应,因此,亟需寻找其他安全有效的ITP治疗药物。随着ITP患者巨核细胞生成障碍以及血小板产生不足的发病机制逐步被揭示,TPO受体激动剂类药物,包括rhTPO、艾曲泊帕、阿伐曲泊帕以及国外的罗米司亭等是近年来ITP领域的研究热点,并且大量高质量RCT研究证实其临床疗效可达60%～90%。而rhTPO作为我国的原研药,其应用于ITP也已近20年,具有大量丰富的临床应用数据,表现出良好的疗效性和安全性。但TPO-RAs与激素相比,价格更加昂贵,因此,寻找此类药物的获益人群,有针对性的个体化用药,对于提高ITP治疗效果,规避不良反应风险以及降低医疗费用具有重要意义。在ITP研究领域已有相关文献报道,ITP患者体内血小板自身抗体可以作为药物疗效的预测指标。改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原实验（modified monoclonal antibody specific immobilization of platelet antigen,MAIPA）是一种间接检测ITP患者血浆中游离抗血小板抗体的实验技术。其具有特异性较高,但灵敏度稍低的特点,是ITP辅助诊断的重要实验技术。已有多项基础和临床研究证实,抗GPIb/IX抗体阳性ITP患者对激素和IVIG的治疗反应不佳。目前国内外尚无研究证实,ITP患者体内血小板自身抗体与rhTPO治疗反应相关性的情况。研究目的:回顾性分析应用rhTPO的、一线治疗无效或复发的且检测过血浆血小板自身抗体的成人ITP患者,通过统计学分析,探究rhTPO疗效与自身抗体特异性的相关性,旨在寻找可以预测rhTPO疗效的指标,从而有益于ITP的个体化和精准治疗。研究方法:（1）患者入组:回顾性收集2010年8月至2019年4月山东大学齐鲁医院血液科入院患者信息。纳入标准:一线治疗无效或复发的ITP患者,入院应用rhTPO治疗,治疗前接受过血小板抗体检测。rhTPO治疗前至少4周未接受过其他ITP特异性治疗药物。排除标准:妊娠合并ITP患者等需排除。记录纳入患者基线统计学信息。（2）研究变量:MAIPA检测患者血浆血小板自身抗体。rhTPO用法用量为300U/kg皮下注射连续14天。总有效（OR）定义为:至少两次间隔7天及以上的血常规检测结果显示血小板计数大于30 × 109/L,并且至少高于两倍的基线血小板值且不存在出血症状。完全有效（CR）定义为:至少两次间隔7天及以上的血常规检测结果显示血小板计数大于100 × 109/L,并且至少高于两倍的基线血小板值且不存在出血症状。无效（NR）定义为:rhTPO治疗后,血小板仍低于30 × 109/L或仍存在出血症状。据此计算纳入患者起效时间（TTR）、总有效率（ORR）、完全有效率（CRR）等数据信息。（3）统计分析:根据变量为数值变量或分类变量选择统计分析方法,包括t检验、方差检验、非参数检验和卡方检验等,多组间的比较采用Bonferroni校正法,采用多因素logistic回归和析因设计分析全面评估可能影响rhTPO疗效的相关指标。P值为双侧检验,P<0.05被认为具有统计学意义。研究结果:（1）根据纳入和排除标准最终共有123例ITP患者纳入分析。女性72人,男性51人。中位年龄48（范围:16-92）周岁,中位病程3（范围0-368）个月,基线血小板中位值为8（范围0-37）× 109/L。58人抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性,其中单阳患者20人;50人抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性,其中单阳患者12人;38人抗体双阳性;53人抗体双阴性。（2）123人中有90人获得OR（73.2%）,其中53人为CR,37人部分有效。有效患者中位起效时间为7（范围2-13）天,抗GPIb/IX抗体阴性患者总有效率要显着高于抗体阳性患者:82.2%（60/73）vs.60.0%（30/50）,χ2=7.444,P=0.006。CR也具有同样的统计学差异趋势:47.9%vs.36.0%,χ2=5.448,P=0.020。而抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性或阴性患者的OR和CR均未见统计学差异。（3）多因素logistic回归分析显示年龄、性别、基线血小板值或抗GPⅡb/Ⅲa抗体都与rhTPO疗效无关,只有抗GPⅠb/Ⅸ抗体的存在与否与rhTPO疗效显着相关,抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者与其抗体阴性患者获得rhTPO反应的比值比为0.040（P=0.003,95%CI:0.005-0.336）,析因设计也同样证实抗 GPⅠb/Ⅸ 抗体是 rhTPO疗效的主要影响因子（F=12.826,P<0.001）。两种分析方法均表明两抗体间不存在交互作用。结论:（1）MAⅠPA检测血浆抗GPⅠb/Ⅸ阳性患者对rhTPO治疗反应差,而抗GPⅡb/Ⅲa抗体则无预测作用。（2）两种血小板抗体在影响rhTPO疗效方面无交互作用。（3）该研究提示rhTPO临床应用中,可优先推荐应用于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阴性患者,这部分患者可能更获益。

金林林^[2]（2020）在《脐血移植植入前综合征的发病机制及干预策略研究》文中指出脐血是异基因造血干细胞移植非常理想的干细胞来源,非血缘脐血移植后慢性移植物抗宿主病的发生率低,而移植物抗白血病效应依然较强,因此,患者复发率较低,生活质量较高。虽然非血缘脐血移植已得到广泛应用,但是在过去的几年里,脐血作为干细胞来源的使用率下降了。由于造血恢复和免疫重建的延迟,移植后早期非复发死亡率高导致了非血缘脐血移植广泛应用的放缓,降低移植相关死亡的风险具有重要意义。大量的研究表明,非血缘脐血移植后会发生植入前的免疫反应,也叫植入前综合征,重度植入前综合征患者的死亡率高,严重影响非血缘脐血移植的效率。而关于植入前综合征的发病机制还知之甚少,为了探究植入前综合征发生的免疫学机制,寻找重度植入前综合征的有效干预策略,我们展开了本研究,并取得了如下结果:1、重度植入前综合征患者预后不良我们采用竞争风险模型分析发现脐血移植患者易于发生植入前综合征,而外周血干细胞移植患者几乎不会发生植入前综合征。我们通过Cox回归分析发现了植入前综合征的3个独立高危因素,分别是发生时间早于非血缘脐血移植后+7天、临床症状多于两项和类固醇激素甲强龙治疗无效。利用积分法建立植入前综合征危险度分层的评分系统,并对不同评分的植入前综合征患者临床疗效进行比较。采用竞争风险模型和Kaplan-Meier生存分析的结果显示:重度植入前综合征患者2-4度急性移植物抗宿主病、3-4度急性移植物抗宿主病和3年非复发死亡率显着升高,导致3年总生存率以及3年无病生存率显着降低。这些结果说明,重度植入前综合征患者预后较差,死亡率较高,是非血缘脐血移植成功的一个重要障碍。2、植入前综合征患者单核细胞显着增多我们猜测,植入前综合征的发生与脐血移植物本身的特性有关。首先,我们对患者回输的移植物细胞数量进行分析,结果表明,植入前综合征患者与未发生植入前综合征患者回输的总有核细胞数、干细胞、T细胞、NK细胞、B细胞和单核细胞的数量均无统计学差异。继而我们利用流式细胞术对脐血移植后早期患者外周血的细胞进行动态监测,结果显示,在脐血移植后早期,患者外周血中几乎检测不到B细胞,T细胞和NK细胞在植入前综合征患者与未发生植入前综合征患者外周血中比例相似。值得注意的是,植入前综合征患者外周血中单核细胞比例显着多于未发生植入前综合征患者,对绝对数分析也得到了一致的结果。通过短串联重复序列PCR分析供者嵌合度,结果显示,在脐血移植后+7天供者嵌合度越高,植入前综合征的症状越严重。综上所述,脐血移植后早期植入前综合征患者体内单核细胞大量扩增,供者早期嵌合是发生植入前综合征的重要危险因素。3、脐血来源的单核细胞具有炎症性特征单核细胞在许多炎症性疾病中发挥重要的作用,因此,我们想了解植入前综合征这种炎症反应的发生是否与单核细胞有关。基因组表达谱芯片结果显示脐血来源的单核细胞不同于外周来源的单核细胞,两种细胞有大量基因差异表达,其中脐血单核细胞高表达促炎性细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等,实时荧光定量PCR和流式细胞术检测进一步验证了此现象。4、GM-CSF驱动脐血来源单核细胞的炎症性特征通过流式细胞术检测,我们发现脐血中具有一群表达GM-CSF的单核细胞,机采的外周血干细胞中几乎没有检测到表达GM-CSF的单核细胞,而且脐血单核细胞比外周单核细胞GM-CSF受体α（GM-CSFRα）表达水平更高。我们想知道脐血单核细胞促炎性细胞因子IL-6表达水平的升高是否与GM-CSF有关,因此,我们使用了 GM-CSF、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和脂多糖（LPS）进行体外刺激实验。结果表明,即使在未刺激的情况下,脐血单核细胞也表达较高水平的IL-6,加入GM-CSF刺激后,IL-6表达水平进一步升高,而G-CSF不能促进单核细胞IL-6的表达。这表明,脐血中具有一群炎症性的单核细胞,这些单核细胞表达GM-CSF,通过与单核细胞上的GM-CSF受体结合,从而活化更多的单核细胞,促进IL-6的表达。5、植入前综合征患者的单核细胞产生IL-6我们想知道GM-CSF是否在植入前综合症的病理生理学中发挥重要作用。我们用ELISA法动态监测脐血移植后早期患者外周血血浆中细胞因子的水平,结果表明IL-6浓度与GM-CSF浓度变化基本一致,这两种蛋白的水平在植入前综合症患者出现临床症状时达到顶峰,然后又回到基线水平。相关性分析显示血浆中IL-6与GM-CSF的水平呈正相关。发生植入前综合征时患者血浆IL-6水平显着高于未发生植入前综合征患者,IL-6水平越高,植入前综合征患者症状越严重。相比之下,未发生植入前综合征患者血浆中几乎检测不到GM-CSF和IL-6。通过胞内IL-6染色,我们发现植入前综合征患者外周血中含有大量产生IL-6的单核细胞,这表明单核细胞是植入前综合征患者体内IL-6的主要来源。6、阻断IL-6可以缓解植入前综合征本研究中,我们发现IL-6是植入前综合征患者的一个特征性细胞因子,我们猜想阻断IL-6的信号通路可以缓解植入前综合征,为了检验我们的研究在临床应用中的有效性,因此,我们在中国临床试验注册中心登记了临床试验,用特异性阻断IL-6受体（IL-6R）的人源化单克隆抗体—托珠单抗,治疗激素难治性的重症植入前综合征患者,本试验共招募11例患者。对符合条件的激素难治性重度植入前综合征患者静脉滴注4-8 mg/kg的托珠单抗注射液,动态监测体温、皮疹等临床指标。临床试验结果表明,激素难治性植入前综合征患者对托珠单抗应答,体温迅速恢复到正常水平,皮疹消退。所有患者均植入成功,造血功能恢复良好,且在治疗过程中没有出现明显药物不良反应,采用托珠单抗治疗的患者非复发死亡率显着提高。总的来说,这些结果表明托珠单抗治疗可以缓解激素难治性植入前综合征患者的临床症状。综上所述,我们证明脐血来源的单核细胞具有炎症性特征,可以产生GM-CSF和IL-6等促炎性的细胞因子,同时脐血单核细胞也表达高水平的GM-CSF受体,对GM-CSF应答产生更高水平的IL-6。脐血移植后,单核细胞在受者体内迅速扩增,植入前综合征患者血清中GM-CSF和IL-6水平均升高,导致植入前综合征的发生。值得注意的是,托珠单抗干预治疗可以有效缓解激素难治性植入前综合征。总之,本研究揭示了脐血移植后植入前综合征的病理机制,为重度植入前综合征患者提供了新的治疗策略,这些发现对降低脐血移植后早期移植相关死亡率,进一步提高非血缘脐血移植的安全性和有效性,扩大脐血移植的应用,具有重要的指导意义。

魏元凤^[3]（2020）在《重型再生障碍性贫血一线治疗的临床研究》文中研究指明背景:重型再生障碍性贫血（SAA）,简称重型再障,目前的一线治疗方案为强化免疫抑制治疗（IST）和同胞全合移植（MSD-HSCT）治疗,国内外文献报道同胞全合移植（MSD-HSCT）和IST的总体有效率和总体生存率相当。近年来,无关供者移植及单倍体移植发展迅速,有研究显示无关供者移植及单倍体移植作为SAA一线治疗方案时疗效与MSD-HSCT相似,优于IST。但无关供者移植及单倍体移植是否可以作为缺少同胞全相合供者的SAA患者的一线治疗方案,目前未达成共识。目的:探讨强化免疫抑制治疗和异基因造血干细胞移植治疗SAA的疗效。方法:回顾性分析2012年1月1日至2019年5月15日在我院行IST和allo-HSCT的19例SAA患者的临床资料,其中IST组7例,中位年龄30（19-67）岁,7例患者在抗胸腺细胞球蛋白/抗淋巴细胞球蛋白输注结束后的第一天均输注非血缘脐血;allo-HSCT组12例,中位年龄38.5（4-49）岁,其中同胞全合移植7例,单倍体移植4例,无关供者移植1例。4例单倍体移植患者及同胞全合移植中2例年龄大于40岁的患者均联合非血缘脐血输注。结果:（1）allo-HSCT组:所有患者移植后均获得造血重建,粒系>0.5×109/L的中位时间为移植后10.5（9-18）d,血小板>20×109/L的中位时间为移植后15.5（8-39）d,网织红>30×109/L的中位时间为移植后17（11-35）d;IST组:2例早期死亡,5例治疗有效。治疗有效的患者中性粒细胞及血小板计数恢复到和移植植入相同水平的中位时间41（9-80）d、157（61-400）d。两组造血功能恢复时间有统计学意义（P<0.05）。（2）allo-HSCT组和IST组3个月有效率分别为83.3%、57.1%（P>0.05）,12个月的完全缓解率分别为50%,28.6%（P>0.05）。（3）至随访终点,1例患者失访,可随访的18例患者中位随访21（2.1-91.2）个月,总体生存率（OS）达66.7%;allo-HSCT组OS为63.6%（其中MSD-HSCT组为100%,haplo-HSCT组为0%）,IST组OS为71.4%,allo-HSCT组和IST组、MSD-HSCT组和IST组之间总体生存率差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:MSD-HSCT是治愈SAA的首选方法,年龄大于40岁的患者在同胞相合移植中加入第三方脐血,植入快,移植物抗宿主病发生率低,可获得长期生存。短期内如果能找到人白细胞抗原（HLA）高度相合的无关供者,那么无关供者移植也可以作为SAA的一线治疗方案。缺少HLA全合供者时,应选择IST治疗,疗效优于单倍体移植。

刘婕^[4]（2017）在《局部移植HUCB-MNCs治疗脑出血大鼠疗效的microPET-CT评价及其治疗机制研究》文中研究指明目的:过去的研究表明,脐血干细胞移植能够显着改善大鼠脑缺血后神经功能。而对于实验性脑出血模型的研究却鲜有报道。为了进一步探讨移植干细胞治疗脑出血的疗效及其促进修复的机制,我们通过microPET-CT、Longa评分和RT-PCR观察人脐血单个核细胞（human cord blood mononuclear cells,HUCB-MNCs）移植后不同时间点脑出血大鼠功能恢复情况。方法:采用自体血二次注血/退针法制作大鼠脑出血模型。模型构建成功后24小时内,将从人脐血中分离出的新鲜人脐血单核细胞（human cord blood mononuclear cells,HUCB-MNCs）按照1×107/ml,经立体定位移植入血肿周围,对照组造模成功后,不予以任何治疗,自然转归。通过18F-FDG PET扫描和Longa评分法对HUCB-MNCs移植前后及移植后的3、7、14和21天脑出血大鼠模型脑损伤部位代谢变化和大鼠神经功能评分变化进行评估;通过RT-PCR对HUCB-MNCs移植后的3、7、14和21天脑出血大鼠模型大脑中神经元特异性标志物MAP2和NSE的表达进行测定。结果:1.移植组大鼠神经功能评分低于对照组,差异有显着性（F=22.352,p<0.0001）;脐血单个核细胞移植前和移植后第3天两组大鼠神经功能评分差异无显着性（P>0.05）;移植后第7、14、21天两组大鼠神经功能评分差异有显着性（P<0.05）。2.移植组血肿中心糖代谢（SUV%）水平明显高于对照组中心糖代谢（SUV%）水平,差异有显着性（F=49.69,p<0.001）;对照组大鼠血肿中心糖代谢水平不随时间而发生变化,差别无统计学意义（P=0.553>0.05）;移植组大鼠血肿中心糖代谢水平随时间变化而变化,差别有统计学意义（P=0.031<0.05）;除移植前和移植后第3天对照组与移植组糖代谢水平差异无统计学意义（P=0.209>0.05）,其余各个时间点两组大鼠血肿中心的糖代谢水平差异均有统计学意义（P<0.05）。3.移植组血肿周围糖代谢（SUV%）明显高于对照组,差异有显着性（F=7.668,p=0.024）;移植组血肿周围糖代谢水平随时间而发生变化,差别有统计学意义（P=0.007<0.05）;对照组血肿周围糖代谢水平随时间而变化,差别有统计学意义（P=0.018<0.05）;除移植前和移植后第3天两组糖代谢水平差异无统计学意义（P=0.209>0.05）,其余各个时间点两组大鼠血肿周围的糖代谢水平差异均有统计学意义,（P<0.05）。4.大鼠不同时间点PET-CT血肿及周围体积代逐步降低,差异有显着性（F=556.539,P=<0.0001）;各组大鼠在各时间点的变化趋势不相同,移植组体积减小的趋势较对照组明显（F=8.855,P=0.018）。5.移植组鼠源性MAP2和NSE表达量先逐步增高,于第7天达到高峰,而后又逐渐降低;对照组与移植组MAP2表达情况变化的差异无显着性（F=1.49,p=0.29>0.55）;移植组MAP2表达量随时间而产生变化,差别有统计学意义（P=0.033<0.05）;对照组MAP2表达量不随时间变化而变化,差别无统计学意义（P=1.00>0.05）;移植组内人源性MAP2表达量不随时间变化而变化,差异无统计学意义（P=0.42>0.05）;对照组与移植组NSE表达情况变化的差异无显着性（F=6.09,p=0.069>0.55）;移植组NSE表达量随时间而产生变化,差别有统计学意义（P=0.007<0.001）;对照组NSE表达量不随时间变化而变化,差别无统计学意义（P=1.00>0.05）。结论:本研究表明,移植脐血干细胞细胞有助于大鼠脑出血模型功能恢复,其治疗机制可能与促进内源性神经再生有关。

刘婕,张国华^[5]（2017）在《脐血干细胞治疗脑卒中的作用与机制》文中研究指明背景:研究证实,脐血干细胞可以改善脑卒中后神经功能,但脐血干细胞治疗脑卒中的机制尚不清楚。目的:综述脐血干细胞治疗脑卒中的效果与机制。方法:由第一作者应用计算机检索PubMed数据库、中国知网数据库2005年1月至2015年12月的文献,英文检索词为"umbilical cord blood stem cells,stroke",中文检索词为"脐血干细胞,脑卒中"。结果与结论:随着人们不断深入对脐血干细胞神经分化的研究,使得脐血干细胞成为神经系统疾病治疗领域的研究热点。目前,已有一些脑卒中细胞移植的实验性治疗,取得了理想效果。然而,脐血干细胞治疗脑卒中的机制尚不清楚。已知的治疗机制包括重组血管、神经环路等损伤组织结构,分泌各种营养因子,减少内源性细胞凋亡,促进内源性血管和神经再生等。但移植的细胞能否充分填充替代坏死的神经细胞促进神经功能的恢复;这些存活的干细胞是如何建立神经联系的;移植细胞是如何减少宿主细胞的凋亡、坏死,恢复受损细胞功能的仍需进一步探索与发现。

曲琦^[6]（2016）在《脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究》文中研究说明一.脐血源内皮祖细胞（cord blood derived endothelial progenitorcell,CB-EPC）的体外分离、培养及鉴定目的:探讨体外分离及扩大培养CB-EPC的方法,在本实验室建立稳定的CB-EPC培养体系。方法:以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）,将MNCs接种于纤连蛋白（Fibronectin,Fn）包被的培养瓶中,培养基为endothelial growth medium-2（EGM-2）,其中添加recombinant human fibroblast growth factor-β（rh FGF-β）,recombinant human epidermal growth factor（rh EGF）,R3-insulin-like growth factor（IGF）-1,vascular endothelial growth factor（VEGF）,ascorbic acid and GA-100)及10%FBS。采用贴壁培养培养72小时（hour,h）后弃未贴壁细胞的培养方式。2-3天半量换液一次并观察贴壁细胞生长状况。待细胞出现EPC形态特征并达到80%以上融合后,可传代培养。以流式细胞术检测所分离培养细胞表面CD34,CD45,CD133,CD31,KDR,及CD14抗原表达情况,鉴定是否为EPC表型。用CCK8法分析实验所选用的Passage（P）1-P5之间EPC的体外增殖能力,以成熟内皮细胞株人脐静脉内皮细胞（human umbilical veins endothelial cells,HUVECs）为对照。以Matrigel胶铺板,HUVEC为对照,分析EPC各代细胞之间体外成管能力及差异。采用Transwell小室,分析观察各代EPC细胞的迁移能力及与HUVEC迁移能力的差异。进一步通过荧光定量PCR（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）方法分析所培养细胞的内皮相关基因表达,确定其内皮系属性。结果:在特殊内皮系培养基的培养条件下,72h后去除未贴壁细胞继续培养,可于体外分离培养后约21-28天时出现典型EPC表现的克隆细胞团;继续培养,细胞团分裂增殖、克隆增大并逐渐融合;细胞生长速度较快,可经胰酶消化传代培养,约4-5天可传代一次,并可稳定传代约10代左右。流式细胞技术分析所分离培养细胞表面抗原的表达,和HUVECs相比,所培养EPC均不表达或极弱表达CD45（EPC vs.HUVEC,2.32%±1.56%vs.0.92%±0.77%,P=0.236）及CD14（EPC vs.HUVEC,3.44%±1.27%vs.1.29%±0.54%,P=0.054）;EPC上有干祖细胞标志的CD133阳性表达（26.12%±4.56%）,而HUVEC无此抗原表达（0.13%±0.11%）（P=0.001）;CD31（EPC vs.HUVEC,98.82%±1.33%vs.97.90%±1.50%,P=0.472）和KDR（EPC vs.HUVEC,34.21%±6.44%vs.30.78%±5.60%,P=0.524）,在脐血EPC及HUVEC上均有阳性表达,表达量相当;CD34在脐血EPC及HUVEC上均有表达,但在脐血EPC表面表达阳性率更高（EPC s.HUVEC,45.66%±6.81%vs.26.89%±4.91%,P=0.018）。以CCK8法对脐血EPC体外增殖能力分析,和HUVEC相比,脐血EPCs在体外培养第4天后增殖更为迅速,在P1,P3及P5之间,脐血EPC体外扩增趋势相当,无明显增殖差异,均较HUVEC扩增迅速。脐血EPC可于体外形成管腔样结构,成管能力较HUVEC弱,在40×镜下观察视野内脐血EPC成管数为P1,28.67±4.51个;P3,29.33±4.51个;P5,31.33±4.04个,而HUVEC为71.67±7.64个,各代脐血EPC和HUVEC成管数差异均具有统计学意义（P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000）,而各代EPC之间成管数无明显差异（P=0.749）。在细胞迁移能力上,于×100视野下,随机计数三个不同视野,脐血EPC细胞数为P1,208.67±13.05个;P3,204.33±16.17个;P5,203.00±16.37个,而HUVEC细胞计数为71.67±3.79,两两比较有统计学意义（P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000）,而各代之间迁移能力无统计学差异（P=0.925）。选取内皮细胞相关基因CDH5,VWF,VEGF,TIE1,TIE2,及SELE,通过RT-q PCR方法,进一步确认所培养细胞的内皮源性质,以HUVEC为对照,脐血EPC中基因转录水平CDH5增高1.64±0.32倍（P=0.025）,VWF增高4.49±0.50倍（P=0.000）,VEGF增高1.76±0.12倍（P=0.008）,TIE1增高2.08±0.28倍（P=0.021）,TIE2增高2.25±0.26倍（P=0.014）,SELE增高7.34±0.61倍（P=0.000）。结论:通过体外分离脐血MNCs,以特殊培养基贴壁、黏附蛋白包被培养器皿,培养72h弃未贴壁细胞进一步培养的方法,可于培养的21-28天获得典型EPC形态表现的细胞群。经流式鉴定该细胞群非造血系细胞,并带有部分阳性的祖细胞标记区别于成熟内皮细胞,表达内皮相关基因,符合目前对EPC的表型认知。实验中所用细胞,各代表型特征、基因表达及内皮功能稳定。从脐血中分离培养的细胞具备目前所知关于EPC的大部分特点,在本实验室已建立CB-EPC的分离、有效扩增体系,可进一步应用于后续实验。二.脐血源内皮祖细胞为基质对体外扩增造血干细胞的作用及机制探究目的:探究CB-EPC在脐血造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC）体外扩增中的作用。分析以CB-EPC为基质细胞,体外扩增脐血HSPC数量的有效性,干祖细胞数量及比例,并分析扩增后的脐血HSPC体内长期造血重建的作用及相应机制。为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法,为克服脐血造血干细胞移植（hematiopoietic stem cell transplantation,HSCT）因有核细胞数不足的临床应用限制提供一有效途径。方法:CB-EPC为常规分离、培养。用于HSPC获取的脐血标本,其来源与EPC分离所用脐血标本非同一供体。分离脐血MNCs后,以CD34+磁珠阳性分选法,分选其中的HSPCs并以流式分析CD34+细胞阳性率。脐血HSPC与EPC直接接触共培养或以Transwell小室的间接接触共培养,以不加EPC单纯培养的HSPC为对照,培养7天后计数扩增的细胞总数,结合流式术计数CD34+细胞数,及更原始祖细胞CD34+CD38-细胞数,各系祖细胞CD34+CD33+、CD34+CD19+、CD34+CD61+细胞数。流式细胞术检测扩增后HSPC的细胞周期,分析分裂各期细胞比例。比较扩增前后脐血HSPC的集落形成能力,行HSPC扩增后的功能学分析。建立人-非肥胖糖尿病、重症联合免疫缺陷小鼠（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice）NOD/SCID鼠异种移植模型,移植分组包括:经MACS后CD34+干细胞组;单纯培养7天后干细胞组;共培养7天后干细胞组及照射组;分析移植后小鼠的生存状况、外周血象的恢复及移植后的人类HSPC嵌合。以RT-q PCR方法分析EPC扩增脐血HSPC的分子机制,并取具有体外扩增HSPC作用的间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）为对照。结果:在培养7天后,直接接触共培养HSPC扩增6.75±0.84倍,单纯HSPC培养扩增3.76±0.60,二者之间存在统计学差异（P=0.003）;间接接触共培养体外扩增HSPC 7.56±0.80倍,较单纯HSPC培养扩增倍数存在显着性优势（P=0.001）;但直接接触共培养与间接接触共培养在HSPC的扩增倍数上,无明显差异（P=0.239）。直接接触共培养可扩增CD34+细胞5.38±0.61倍,单纯体外扩增培养有3.25±0.59倍CD34+细胞扩增,二者相比较具统计学差异（P=0.003）;间接接触共培养同样可有效扩增CD34+细胞,扩增倍数为4.06±0.43倍,较单纯培养具统计学差异（P=0.025）,与直接接触共培养之间无统计学差异（P=0.124）,表明EPC的体外支持脐血HSPC扩增作用主要来源于细胞因子的分泌,而细胞间的直接生理性接触对HSPC扩增作用有限;在单纯培养条件下,CD34+CD38-细胞群扩增79.12±19.77倍,与EPC的直接接触共培养后,该群细胞扩增倍数可达156.17±21.32倍,明显较单纯培养时扩增倍数增高（P=0.010）;在间接接触共培养条件时,该群细胞可获95.43±33.00倍扩增,亦较单纯培养时升高（P=0.026）;接种0天时,脐血HSPC中CD34+CD38-的细胞比例为2.13%±0.58%,经单纯共培养7天后该比例达到44.29%±7.30%;经直接接触共培养可将该群细胞比例升高至48.38%±5.07%,与单纯培养下该细胞群比例无明显统计学差异（P=0.392）;而间接接触共培养情况下CD34+CD38-群比例为24.58%±3.02%,较单纯培养（P=0.004）及直接接触共培养（P=0.002）条件下细胞比例均低;该部分结果显示,尽管EPC支持脐血HSPC体外扩增主要依靠EPC细胞因子的分泌,但是EPC与HSPC的细胞间直接接触有利于维持更原始造血细胞的比例。在直接接触共培养条件下,CD34+CD33+及CD34+CD61+细胞群较单纯培养或间接接触共培养均有更多倍数的扩增,而淋系CD33+CD19+在三种培养条件下扩增倍数相当。细胞周期结果显示,单纯培养后较培养前HSPC有G0/G1期细胞比例的下降（60.67%±1.68%,P=0.000）,S期细胞比例的升高（31.40%±3.50%,P=0.000）,而G2/M期细胞比例相当（5.94%±0.17%,P=0.120）;经接触共培养7天后的细胞群,也存在G0/G1期比例下降（59.77%±1.94%,P=0.000）,S期细胞比例上升（35.17%±2.75%,P=0.000）,但有相当的G2/M期细胞比例（5.62%±0.39%,P=0.851）,尽管以EPC为基质的体外共培养体系可较单纯培养提供更高倍数的HSPC扩增,却仍保证了足够的细胞处于分裂前期,有助于维持其干细胞特性;以EPC为基质共培养后的HSPC形成的CFU总数不仅比新鲜分离的HSPC多（446.33±6.66 vs.124.67±9.71,P=0.000）,且比单纯培养后的HSPC总数多（446.33±6.66 vs.257.33±6.67,P=0.000）。就CFU的种类而言,与EPC共培养后的HSPC形成的各类CFU,在CFU-GM,BFU-E以及CFU-E数量上均较新鲜分离后的HSPC和单纯培养后的HSPC所形成的CFU数量多。人-NOD/SCID小鼠移植实验中,可观察到EPC扩增培养HSPC移植组与未经培养组有相似的白细胞、血红蛋白及血小板的各系血细胞恢复趋势;在移植后5周内,EPC扩增培养HSPC移植组小鼠的血红蛋白及血小板水平较未经培养HSPC组小鼠更高;单纯培养HSPC移植组小鼠多在移植后5周内死亡,未到达观察终点,未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组到观察终点分别有50%,60%小鼠存活,在生存时间上经统计分析无明显统计学差异（P=0.892）。在移植后8周未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组小鼠中均有人CD45的成功植入,平均嵌合率分别为16.0%±14.3%,13.3%±11.0%（P=0.750）。分析其机制,RT-q PCR结果显示EPC中的造血相关细胞因子基因IL6（4.24±1.42倍,P=0.017）、ANGPT1（7.75±0.90倍,P=0.000）及CXCL12（8.25±2.03倍,P=0.025）基因的转录水平均较MSC高;信号通路相关分子基因WNT5A转录水平在EPC中有明显升高（11.76±2.11倍,P=0.013）;且经过体外共培养后的HSPC中,其WNT5A基因转录水平较培养前明显上调（3.49±0.54倍,P=0.001）。结论:人脐血源EPC可在体外有效扩增HSPC,提高细胞总数及具有原始造血、长期始动能力的细胞数量比例,提高各系祖细胞数量,并可保证一定数量处于静息期的HSPC数量,维持干细胞特性。经EPC为基质细胞扩增后的脐血HSPC具有良好的干细胞功能,可于体内植入及重建造血,在移植早期促进造血恢复。相关机制可能与EPC分泌多种造血相关因子及激活Wnt信号通路有关。脐血源EPC是良好的体外扩增HSPC的基质细胞,可为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法。三.脐血源内皮祖细胞联合造血干细胞移植在造血重建和移植物抗宿主病中的作用初探目的:通过联合脐血源EPC及HSC共移植的方式,分析其是否可通过修复移植过程中的内皮损伤,达到促进移植后的造血重建和减轻移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）的作用。方法:建立人-NOD/SCID鼠共移植（EPC+HSC）模型,以单纯移植HSC小鼠为对照,观察移植后的生存状况、造血重建及体内植入,观察移植后小鼠有无GVHD相关症状并记录评分,以病理实验进行GVHD的验证;以CD31免疫组化病理实验分析共移植EPC组小鼠的骨髓微血管恢复情况,并与单纯移植小鼠比较;以慢病毒转染的方式转染绿色荧光蛋白EGFP入EPC,并建立小鼠移植模型,分析移植后EGFP-EPC的归巢及分布,是否直接参与骨髓的微血管恢复。以MSC为对照,流式细胞术分析EPC的表面人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）抗原表达及行混合淋巴细胞实验对EPC免疫原性进行分析。结果:经单纯移植小鼠（n=10）的中位生存时间为51天,长期存活率为60%;经脐血EPC联合HSC共移植组小鼠（n=10）的中位生存时间为54天,长期存活率为70%;EPC联合HSC共移植组较单纯移植组在生存时间上有提高的趋势,但统计学比较无明显差异（P=0.314）。两移植处理组均随着时间延长有血细胞恢复趋势,在观察的各时间点可发现共移植组较单纯移植组在WBC、HBG及PLT上均恢复值高。单纯移植组骨髓中人CD45嵌合比例为（13.27%±6.36%）,共移植组骨髓中人CD45比例为（18.21%±10.57%）,无统计学差异（P=0.308）;在单纯移植组脾脏中的嵌合比为（4.91%±7.56%）,共移植组中该比例为（5.14%±2.97%）,无统计学差异（P=0.840）。单纯移植组中共有3只小鼠出现GVHD症状,主要表现为体重下降和（或）弓背姿势和（或）活动度下降和（或）耸毛,评分分别为2分、2分、6分;在共移植组中共观察到2只小鼠出现GVHD症状,该组的主要表现是体重下降和（或）轻中度活动度下降,评分分别为2分,1分;存在GVHD表现的小鼠存在不同程度的小肠和骨髓损伤,主要表现为腺体轻中度破坏和或骨髓增生度减低、骨小梁连续性差。EPC共移植组小鼠在观察终点时骨髓中有明显的、连续的CD31阳性染色,骨髓血管窦结构显示完整,提示其微血管恢复良好,而经单纯移植的小鼠骨髓血管内皮细胞有部分恢复但总体骨髓微血管恢复情况较共移植组为差。在将EPC转染EGFP并行移植实验后24h,骨髓中可检测到一定的呈聚集的染色阳性细胞,平均阳性比例占所有有核细胞比约为2.3%;移植后72h及7天,仍可见少量的阳性染色细胞分布于骨髓。实验中所用的EPC的免疫原性均较低,其表面HLA-I类抗原（HLA-ABC）的阳性率为（27.97%±3.60%）,MSC的HLA-I类抗原阳性率为（44.46%±7.18%）（P=0.024）;EPC表面HLAⅡ类抗原（HLA-DR）的阳性率为（6.37%±2.73%）,同样较MSC该类抗原（14.77%±1.96%）表达低（P=0.012）;与人淋巴细胞行混合淋巴细胞实验,以CFSE染色后未发现淋巴细胞过度增殖的现象。结论:本部分实验揭示了脐血EPC联合造血干细胞移植具有一定的促进移植后造血重建、减轻GVHD、延长生存时间的趋势,但因受样本量所限,仍需进一步扩大样本量进一步验证。修复骨髓微环境的髓窦内皮细胞损伤,可能是脐血源EPC促进移植后造血重建、减轻GVHD的机制之一。

张文艳^[7]（2018）在《植物来源的抗氧化物对CD34+细胞体外扩增的影响》文中指出体外扩增是解决脐血造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）移植过程中数量不足的有效方法。在HSCs的体外扩增过程中添加糖类、细胞因子等外源性物质,导致细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平急剧增加,破坏细胞内的氧化还原动态平衡,造成细胞功能损伤,影响HSCs的体外增殖。因此,有必要对HSCs体外培养过程中细胞内ROS水平进行调控。黄酮类、多酚类和蒽醌类化合物广泛存在于各种植物中,具有抗氧化活性,在一定的浓度范围内能够有效的清除自由基,有利于细胞的体外增殖。为此,本文以新鲜分离的脐血CD34+细胞为起始细胞,在无血清培养体系中考察了黄酮类抗氧化物（葛根素和金丝桃苷）浓度对CD34+细胞体外扩增的影响。结果发现:0.1μM葛根素能够有效地提高总细胞和CD34+细胞的扩增;与对照组相比,1μM金丝桃苷能够促进总细胞、CD34+细胞和CD34+CD38-细胞的扩增,并且两组之间CD34+细胞的再扩增能力无显着性差异。培养体系中添加1μM金丝桃苷培养14d后,总细胞、CD34+细胞和CD34+CD38-细胞的扩增倍数分别为54.9±9.6、9.1±1.8和8.1±0.9倍,显着高于对照组的42.0±7.7、5.8±1.5和5.8±1.3倍（p<0.05）。进而分析了 1μM金丝桃苷对CD34+细胞内ROS水平和细胞凋亡的影响,发现培养体系中添加1μM金丝桃苷后,培养物中凋亡细胞的比例显着降低,但是对细胞内的ROS水平没有影响。此外,考察了多酚类（儿茶素）和蒽醌类（芦荟大黄素）抗氧化物浓度对CD34+细胞体外扩增的影响。结果发现,培养体系中添加10μM儿茶素培养14d后,总细胞、CD34+细胞的扩增倍数分别为57.2±12.8和9.7±0.8倍,显着高于对照组42.7±9.7和7.1±0.2倍（p<0.05）;并且培养14d后CD34+细胞的再扩增能力与对照组相比无显着性差异。进一步考察了 10μM儿茶素对细胞内的ROS水平和凋亡细胞比例的影响,结果发现,在培养体系中,添加10μμM儿茶素培养CD34+细胞,显着降低培养物中凋亡细胞的比例,而对培养过程中细胞内ROS水平没有影响。添加1μM芦荟大黄素培养14d后,CD34+细胞和CD34+CD38细胞的扩增倍数分别为5.4±1.1和5.8±0.9倍,显着高于对照组的3.7±0.9和4.2±0.9倍（p<0.05）,但是培养14d后CD34+细胞的再扩增能力显着下降。在培养体系中,添加1μM芦荟大黄素培养CD34+细胞,显着降低培养物中凋亡细胞的比例,对培养过程中细胞内ROS水平没有影响。综上所述,植物来源的抗氧化物降低了 CD34+细胞体外培养时细胞凋亡比例,促进了 CD34+细胞的体外扩增。以上结果为应用植物来源的抗氧化物优化CD34+细胞体外培养条件提供了理论依据。

李雅娇^[8]（2013）在《脐血间充质干细胞治疗急性心肌梗死的研究》文中提出目的：研究经冠状动脉内注射人脐血间充质干细胞（MSCs）治疗急性心肌梗死（AMI）的疗效。材料与方法：1.实验研究：选用雄性大鼠，开胸后，缝扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型，观察24h后，存活者按心肌梗死造模次序随机分为实验组和对照组。自人脐带血中分离培养脐血间充质干细胞,制备脐血间充质干细胞（MSCs）的悬液，进行实验组的大鼠心梗模型移植；用PBS液进行对照组的大鼠心梗模型移植。4周后超声心动图检测两组大鼠心脏功能。2.临床研究：选取急性心肌梗死且发病在24小时内能够接受经皮冠状动脉介入治疗（PCI）,同时愿意接受脐血间充质干细胞移植治疗的患者共计78例，随机分为实验组和对照组，各39例患者。制备脐血间充质干细胞（MSCs）悬液，在AMI患者行PCI术的同时经心导管冠脉内注射脐血MSCs悬液，为MSCs实验组。同时仅行PCI术的AMI患者，为PCI对照组。两组患者均在术后7日及90日行心肌核素显像检查及心脏超声心动图检查，分别测定存活心肌和心室功能。结果：1.实验研究：人脐带血中可分离培养出间充质干细胞，并且脐血来源间充质干细胞注射后，和对照组比较，实验组大鼠的心功能得到明显改善。2.临床研究：MSCs组术后90日左心室射血分数持续改善，与术后7日及PCI对照组间差异显着。MSCs组术后90日SPECT测定的心肌灌注缺损面积显着低于PCI对照组。结论：1.脐血间充质干细胞注射治疗能够改善心梗后大鼠的心功能。2.经冠状动脉脐血间充质干细胞心肌内移植可以显着改善急性心肌梗死患者的心室功能，心肌核素显像存活心肌明显增加。3.脐血间充质干细胞是心血管疾病细胞移植治疗的有效细胞来源之一。

廖红群^[9]（2011）在《干细胞诱导分化为甲状腺细胞用于临床的可能性》文中认为背景:干细胞诱导分化为甲状腺细胞的研究较少,胚胎干细胞诱导分化为甲状腺细胞已经取得了一定的成果,但其他类型干细胞各有特点,能否诱导分化为甲状腺细胞仍待深入研究。目的:回顾分析各类干细胞的优缺点及诱导分化为甲状腺细胞的研究进展。方法:应用计算机检索1982-01/2011-04PubMed数据库相关文章,检索词"stemcell,thyroidcells,induction,differentiation",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索1982-01/2011-04万方数据库、1989-01/2011-04维普资讯网数据库和1994-01/2011-04中国知网数据库相关文章,检索词"干细胞,甲状腺细胞,诱导,分化",并限定文章语言种类为中文。共检索到文献1052篇,最终纳入符合标准的文献50篇。结果与结论:不可逆性甲状腺功能减退患者需终身服用甲状腺激素,对患者的生活带来很大不便,近年来干细胞研究有望解决这些医学难题。胚胎干细胞在体外环境可诱导分化为甲状腺细胞,但受伦理学困扰和出现细胞移植排斥反应等原因其应用受到限制。其他类型干细胞各有特点,在不同的诱导条件下能够向不同的谱系分化,已广泛的用于治疗各种疾病,但未见向甲状腺细胞分化的报道。

廖红群^[10]（2011）在《干细胞及组织移植治疗甲状腺功能减退症》文中指出背景:干细胞及甲状腺组织移植治疗甲状腺功能减退症已经取得了一定的成果。目的:回顾分析干细胞与组织移植治疗甲状腺功能减退症的基础和临床研究进展。方法:由作者检索1980/2010 PubMed数据库及万方数据库有关干细胞与甲状腺移植治疗甲状腺功能减退症的基础和临床研究。结果与结论:自体甲状腺组织移植治疗不可逆性甲状腺功能减退症的作用是肯定的,但存在不足之处,比如需要移植多少甲状腺组织才能使甲状腺功能保持在正常状态,移植后的长期效果还需要更多样本、更长期的跟踪随访来评价。胚胎干细胞在体外环境下可诱导分化为甲状腺细胞,但受伦理学和细胞移植排斥反应等原因困扰。脐血间充质干细胞具有来源丰富、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点,在不同诱导条件下能够向不同谱系分化,已被广泛用于治疗各种疾病,但能否通过多种途径诱导其分化为甲状腺细胞,并通过移植方法来治疗甲状腺功能减退症仍需深入研究。

二、脐血干细胞能否用于成人（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、脐血干细胞能否用于成人（论文提纲范文）

（1）WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究（论文提纲范文）

（2）脐血移植植入前综合征的发病机制及干预策略研究（论文提纲范文）

（3）重型再生障碍性贫血一线治疗的临床研究（论文提纲范文）

（4）局部移植HUCB-MNCs治疗脑出血大鼠疗效的microPET-CT评价及其治疗机制研究（论文提纲范文）

（5）脐血干细胞治疗脑卒中的作用与机制（论文提纲范文）

（6）脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究（论文提纲范文）

（7）植物来源的抗氧化物对CD34+细胞体外扩增的影响（论文提纲范文）

（8）脐血间充质干细胞治疗急性心肌梗死的研究（论文提纲范文）

（9）干细胞诱导分化为甲状腺细胞用于临床的可能性（论文提纲范文）

（10）干细胞及组织移植治疗甲状腺功能减退症（论文提纲范文）

四、脐血干细胞能否用于成人（论文参考文献）

• [1]WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究[D]. 于亚菲. 山东大学, 2021(11)
• [2]脐血移植植入前综合征的发病机制及干预策略研究[D]. 金林林. 中国科学技术大学, 2020(09)
• [3]重型再生障碍性贫血一线治疗的临床研究[D]. 魏元凤. 皖南医学院, 2020(01)
• [4]局部移植HUCB-MNCs治疗脑出血大鼠疗效的microPET-CT评价及其治疗机制研究[D]. 刘婕. 内蒙古医科大学, 2017(05)
• [5]脐血干细胞治疗脑卒中的作用与机制[J]. 刘婕,张国华. 中国组织工程研究, 2017(09)
• [6]脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究[D]. 曲琦. 苏州大学, 2016(11)
• [7]植物来源的抗氧化物对CD34+细胞体外扩增的影响[D]. 张文艳. 华东理工大学, 2018(01)
• [8]脐血间充质干细胞治疗急性心肌梗死的研究[D]. 李雅娇. 辽宁中医药大学, 2013(05)
• [9]干细胞诱导分化为甲状腺细胞用于临床的可能性[J]. 廖红群. 中国组织工程研究与临床康复, 2011(49)
• [10]干细胞及组织移植治疗甲状腺功能减退症[J]. 廖红群. 中国组织工程研究与临床康复, 2011(40)

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