一、A novel ubiquitin carboxyl terminal hydroase is involved in toad oocyte maturation（论文文献综述）
靳毅[1]（2021）在《肾透明细胞癌自噬相关多组学预后模型的构建研究》文中研究指明第一部分肾透明细胞癌患者自噬相关基因预后模型的构建目的:通过Cox回归模型构建与总生存相关的肾透明细胞癌（cc RCC）中心基因预后指数,获得自噬相关的临床生物标记物及预后判断模型。方法:从TCGA数据库下载cc RCC数据集,以识别cc RCC患者自噬相关基因（ARGs）的表达。功能富集分析GO和京都基因与基因组百科全书KEGG分析由Metacape数据库构建。中心基因由Cytoscape软件提供。然后,使用Cox比例危险回归模型来识别在cc RCC中与整体生存（OS）显着相关的中心基因cc RCC。然后构建了基于中心基因的预后指数（PI）,并应用单因素、多因素COX及KM生存曲线、多指标ROC等进行验证。结果:PI基于与OS相关的基因构建,并将cc RCC患者依据中位值分为高风险和低风险组,二者具有统计学差异,高风险组生存期明显下降。PI是多变量分析中一个独立的预测因子。小结:1.我们构建的预后指数对于肾透明细胞癌患者的预后具有一定的预测价值。2.在我们构建的预后模型中,风险基因为BECN1、ULK1,保护基因为PINK1、BNIP3、ZFYVE1。3.多因素COX分析显示,基于5种自噬相关m RNA（BECN1、PINK1、ULK1、BNIP3和ZFYVE1）开发的预后模型可以独立于经典TNM分期之外,可能成为临床患者预后预测方法的有力补充。第二部分肾透明细胞癌患者自噬相关lnc RNA预后模型的构建目的:通过联合应用Lasso与Random Forest算法,获得肾透明细胞自噬相关lnc RNA,应用多因素COX构建预后回归模型,并分别在训练集、测试集中进行验证,绘制预后判断列线图及进行GSEA相关通路分析。方法:从TCGA数据库下载cc RCC数据集,分离lnc RNA数据并进行差异分析。识别cc RCC患者自噬相关基因（ARGs）的表达。计算与ARGs共表达的lnc RNA作为自噬相关lnc RNA,联合应用Lasso与Random Forest算法,获得预后相关肾透明细胞自噬lnc RNA,应用多因素COX方法构建预后模型并绘制桑基图。然后在训练集中构建基于lnc RNA的预后指数（PI）,在测试集中进行验证,最后绘制预后判断列线图及GSEA相关通路分析。结果:PI基于与OS相关的lnc RNA构建,并将cc RCC患者依据中位值分为高风险和低风险组,高风险组的生存期明显降低。PI是多变量分析中一个独立的预测因子。获得了8个预后相关lnc NRA（CTD-2023M8.1、LINC00460、PROX1-AS1、RP11-19E11、RP11-191N8.2、AP000439.3、RP11-297L17.2、RP11-133F8.2）。构建了预后相关列线图。GSEA分析结果显示预后模型与PPAR,ERBB,TGF-β,RENAL CELL CARCINOMA通路相关。小结:1.我们利用TCGA-KIRC数据构建了肾透明细胞癌自噬相关lnc RNA预后模型。2.该模型具有可靠的预测效果,在训练集及测试集中均可得到较为满意的结果,可能成为TNM分期的有力补充,指导临床预后的判断。3.利用该模型,我们获得了2类8种lnc RNA,其中风险性lnc RNA 5种,分别为:CTD-2023M8.1、LINC00460、PROX1-AS1、RP11-19E11、RP11-191N8.2保护性lnc RNA3种,分别为:AP000439.3、RP11-297L17.2、RP11-133F8.2。4.我们开发了肾癌自噬相关lnc RNA预后的列线图,该图可以便捷的对患者预后进行预测,并且校准图显示,预测的生存率与实际生存率基本重合。第三部分肾透明细胞癌自噬相关lnc RNA验证目的:在构建了的肾透明细胞癌自噬相关lnc RNA预后模型后,我们最终获得了8种lnc RNA（AP000439.3、RP11-133F8.2、RP11-297L17.2,RP11-19E11.1,RP11-191N8.2,CTD-2023M8.1,PROX1.AS1,LINC00460）。为了结果的可靠性,进行了TCGA-KIRC TNM数据及实验室验证。方法:1.绘制8种lnc RNA在TCGA-KIRC数据中癌旁以及癌症不同TNM分期之间的表达情况图,分析在早期（Ⅰ、Ⅱ期）以及晚期（Ⅲ、Ⅳ期）中,以及肿瘤与正常对照组织中,8种lnc RNA是否存在差异表达;2.应用q RT-PCR检测8种lnc RNA在肾透明细胞癌细胞组织及癌旁组织中的表达情况,研究在组织中是否存在差异表达;3.应用q RT-PCR检测8种lnc RNA在肾透明细胞癌细胞系786-O、Caki-1、ACHN与永生化人肾近曲小管细胞HK-2中的表达情况,研究在细胞系中是否存在差异表达。结果:TCGA-KIRC TNM数据分析显示8种lnc RNA与预后相关,有5种风险性lnc RNA;RP11-19E11.1,RP11-191N8.2,CTD-2023M8.1,PROX1.AS1,LINC00460。3种保护性lnc RNA:AP000439.3、RP11-133F8.2、RP11-297L17.2。除RP11-297L17.2表达在组织及细胞系中均低,其余lnc RNA分析结果与TCGA-KIRC TNM分析数据一致。小结:1.通过TCGA-KIRC TNM分期及组织、细胞系q RT-PCR验证联合分析,7个lnc RNA与肾透明细胞癌预后密切相关,分别为:Linc00460、CTD-2023M8.1、PROX1-AS1、RP11-19E11.1、RP11-191N8.2和AP000439.3、RP11-133F8.2。2.其中Linc00460、CTD-2023M8.1、PROX1-AS1、RP11-19E11.1、RP11-191N8.2为疾病的风险因子,AP000439.3、RP11-133F8.2为疾病的保护因子。3.我们的预后模型筛选出来的lnc RNA在TCGA-KIRC独立的TNM数据中得到了很好的验证。4.新筛选出来的2种lnc NRA CTD-2023M8.1、RP11-19E11.1之前未见报道,可能成为新的肾透明细胞癌预后标志物。
吴比,梁珊珊,阮井玲,黄鑫,滕晓明,洪岭[2]（2020）在《泛素羧基末端水解酶1基因缺失对雌性小鼠生殖系统发育的影响》文中研究表明目的研究泛素羧基末端水解酶L1 （ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCH-L1）基因缺失对雌性小鼠生殖系统的影响。方法利用阴道涂片、免疫组织化学、蛋白质印迹和RNA干扰等方法,分析UCH-L1基因缺失对小鼠卵巢功能及卵泡发育的影响。结果 UCH-L1基因缺失纯合子成年雌性小鼠的体质量降低,运动困难,且子宫偏细。在UCH-L1基因缺失纯合子小鼠的卵巢和子宫中检测不到UCH-L1蛋白表达,卵巢体积明显小于杂合子小鼠,其卵巢皮质层存在一些原始卵泡或闭锁卵泡,没有成熟卵泡和黄体。雌激素受体（estrogenreceptor,ER）、卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone receptor,FSHR）、黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor,LHR）及孕酮受体（progesterone receptor,PR）等生殖关键受体在UCH-L1缺失纯合子小鼠和杂合子小鼠卵巢中都有表达,其中纯合子小鼠卵巢中ER的表达水平明显低于杂合子小鼠。通过RNA干扰的方法下调生发泡（germinal vesicle,GV）期卵母细胞中UCH-L1的表达,能明显降低卵母细胞的成熟率。结论 UCH-L1基因缺失雌性小鼠不具备形成成熟卵泡及排卵的能力,卵巢中ER表达量显着降低。推测UCH-L1有可能通过下调卵巢中ER的表达,影响卵母细胞成熟及排卵过程。
张仙玉[3]（2020）在《内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究》文中提出猪肉是我国居民肉类消费的主要来源。在现代养猪生产中,顶级种公猪通过人工授精技术可繁殖大量后代,对于提高养殖效益和经济效益发挥着重大作用。如何能大量复制顶级种公猪或其遗传物质?体细胞克隆是当前的主要技术手段,但由于克隆动物的效率低,限制了这一技术的规模化应用。将外源精原干细胞（SSCs）移植到自身无SSCs生精能力的受体睾丸中产生精子,这是一个类似于动物克隆技术,实现外源遗传物质完全复制的新途径。本文的目的是,研究制备自身SSCs消融但能利用外源SSCs生产精子的受体模型动物,为下一步建立替代克隆技术复制供体动物遗传物质的新体系打下坚实基础。全文主要研究内容包括:采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的ETV5基因,制备小鼠模型,将体外培养的正常SSCs移植到小鼠模型睾丸中,观察精子的发生,评估该技术的可行性,进一步制备ETV5基因敲除猪动物模型。全文主要结果如下:1、ETV5基因敲除小鼠的制备:（1）通过CRISPR/Cas9系统敲除了小鼠ETV5基因后,纯合敲除的公鼠(ETV5-/-),从3周龄开始,其睾丸明显比野生型（WT）要小,睾丸重也显着低于WT（P<0.01）。（2）ETV5-/-小鼠睾丸生殖细胞渐行性丢失,到12周龄生殖细胞丢失殆尽,出现唯支持细胞综合症。（3）性成熟后ETV5-/-小鼠睾酮含量显着低于WT（P<0.01）,附睾中精子在12周龄丢失殆尽,且丧失了繁殖后代的能力。（4）ETV5基因杂合敲除的小鼠,其睾丸形态和发育均与WT小鼠无差别,生育能力正常。2、小鼠SSCs体外培养体系的建立:（1）通过两步酶消化法能得到活力99%以上的睾丸单细胞悬液,通过差速贴壁法获得纯度79%以上的SSCs。（2）丝裂霉素C处理之后的小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层,Stem Pro-34（含SFM）作为基础培养基,添加GDNF、LIF、b FGF、IGF1生长因子的复合培养体系,能支持SSCs的体外增殖与长期培养。（3）小鼠SSCs能正常冻存与复苏,在体外培养与富集后用AKP免疫染色和PLZF免疫荧光均可观察到大量阳性克隆集落。用RT-PCR和Q-PCR检测SSCs中标志基因的表达水平,均显示SSCs可在体外稳定培养增殖并维持干性。3、小鼠SSCs移植:（1）幼鼠(3周龄的ETV5-/-小鼠)作为移植受体比成鼠(7周龄的ETV5-/-小鼠)易于重启外源精子的发生。移植后2个月,幼鼠睾丸中全部恢复了精子的发生,精子统计数约为9.58±5.05×104,而成鼠受体睾丸中无精子发生的恢复。（2）荧光显微镜下,幼鼠受体附睾中产生的精子头部发出绿光,说明精子来源于外源供体的SSCs（移植前用慢病毒感染使其带有EGFP报告基因）。精液中外源基因EGFP和ETV5的表达,进一步说明恢复的精子来源于外源供体的SSCs,而非内源产生。4、ETV5基因敲除猪动物模型探讨:（1）用构建成功的p X330-g RNA质粒转染莱芜猪胎儿成纤维细胞,敲除效率约为41.92%。（2）通过体细胞核移植得到8头新生克隆猪,基因型检测显示ETV5基因在靶位点被敲除,Western blot结果证实了ETV5蛋白的丢失。（3）睾丸组织切片的H.E.染色和UCHL-1蛋白的表达显示,1月龄的ETV5-/-公猪曲细精管的形态和生殖细胞与WT公猪几乎无差异。但2.5月龄的ETV5-/-公猪曲细精管管腔中央的生殖细胞有消融的趋势。另外,UCHL-1蛋白标记的阳性SSCs细胞比WT睾丸中要少。这些结果说明ETV5基因的敲除影响猪生殖细胞的发育。综上所述,本研究制备了ETV5基因纯合敲除后生殖细胞消融且无生育能力的受体小鼠;随后进行外源正常的精原干细胞移植,受体小鼠的生精能力得以恢复;最后将小鼠上构建的方法体系借鉴应用于猪受体模型的制备。目的为家畜优质个体遗传物质大量复制,物种的保种和精原干细胞研究等提供科学依据。
梁思佳[4]（2020）在《利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质》文中指出棉花害虫种类繁多,而且在整个生育时期均易遭受各种害虫危害。Bt抗虫棉的广泛种植有效的控制了棉铃虫的爆发,但由于杀虫剂使用量的大幅度减少,导致Bt非靶标害虫盲蝽象为害日益加重,并由次要害虫上升为主要害虫。盲蝽寄住范围广、飞行扩散能力强、爆发频率高,给盲蝽的防治带来了巨大的困难。目前喷洒化学杀虫剂是防治盲蝽的主要方法,但化学杀虫剂不但容易诱发盲蝽抗性的产生,而且给人类健康和环境安全带来威胁。因此迫切需要高效安全的盲蝽防治新策略。近年来,植物介导的RNAi技术由于其高效、特异,对环境无污染等特性被广泛应用于害虫的防治研究。本研究利用植物介导的RNAi技术创造了棉花抗盲蝽新种质,为盲蝽的防治提供了新的策略。主要研究内容如下:1.棉花抗中黑盲蝽新种质的创造本研究利用植物介导的RNAi技术,以影响中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis）生殖能力的As FAR基因为靶标,创造了能够高量表达As FAR基因ds RNA的转基因棉花。当中黑盲蝽取食该转基因棉花后,可以成功诱发其体内的RNAi效应,导致其内源As FAR基因的表达水平显着下降。田间抗虫鉴定结果显示,As FAR转基因棉花受中黑盲蝽危害较轻,平均每株棉花仅捕获中黑盲蝽12-14头。然而对照组棉花受中黑盲蝽危害非常严重,平均每株棉花捕获中黑盲蝽数量大于20头。以上结果表明As FAR转基因棉花可以成功抑制中黑盲蝽的生殖能力,导致其种群数量显着下降,有效减少中黑盲蝽的危害。非靶标害虫的抗性鉴定结果显示As FAR转基因棉花只对中黑盲蝽有抗性效果,对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的体重以及蚜虫（Aphis gossypii）的种群数量均无不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,As FAR转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不利影响。以上结果表明,As FAR转基因棉花对中黑盲蝽有较高的抗性,对非靶标害虫无不良影响,农艺性状良好且稳定,可以作为防治中黑盲蝽的理想种质资源。该研究为中黑盲蝽的防治提供了新的可替换策略策略。2.棉花抗绿盲蝽新种质的创造本研究选择绿盲蝽（Apolygus lucorum）Al LIM基因作为靶标基因,序列分析表明Al LIM基因具有高度特异性。随后将该基因转入棉花,成功创造了能够高量表达绿盲蝽Al LIM基因ds RNA的转基因棉花材料。室内饲喂结果显示,取食Al LIM转基因棉花后,绿盲蝽内源Al LIM基因的相对表达水平显着下降。在幼虫向成虫转化过程中蜕皮发生严重缺陷,最终因蜕皮失败,变态发育被阻断而死亡,死亡率高达33%-41%。此外有少量绿盲蝽可以羽化为成虫,但其翅膀、后腿出现畸形。对分别注射ds RNA-Al LIM（ds Al LIM）和ds RNA-GFP（ds GFP）的绿盲蝽样品进行转录组测序。数据分析结果显示,总共鉴定到4923个差异表达基因,其中有2484个基因在ds Al LIM处理后上调表达,2439个基因在ds Al LIM处理后下调表达。差异基因KEGG通路分析结果显示,与肌肉生长发育相关的信号通路被显着富集。根据KEGG通路分析结果鉴定到一些参与肌肉生长发育且在ds Al LIM处理后发生显着变化的差异基因。以上结果表明,Al LIM基因在绿盲蝽肌肉发育过程中发挥重要作用。肌肉结构和功能的完整性是昆虫变态发育的关键,因此推测绿盲蝽Al LIM基因的缺失会导致绿盲蝽羽化过程中蜕皮所需肌肉发育缺陷,最终导致蜕皮失败,羽化被阻断,死亡率增加。田间抗虫鉴定结果显示,转基因棉花受绿盲蝽危害较轻,每株转基因棉花平均捕获绿盲蝽8.1-10.1头。然而野生型对照组棉花受绿盲蝽危害却非常严重,每株平均捕获绿盲蝽高达21.5-24.1头。取食转基因棉花导致绿盲蝽死亡率增加,种群数量显着下降。此外,在田间依然观察到少量后腿及翅膀缺陷的绿盲蝽成虫。以上结果表明该转基因棉花对绿盲蝽具有较高的抗性水平。非靶标昆虫的生物测结果显示,Al LIM转基因棉对棉铃和蚜虫的生长发育没有负面影响,对有益昆虫瓢虫（Menochilus sexmaculatus）的生长发育没不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不良影响。以上结果充分表明Al LIM转基因棉花目标抗虫性状效果良好,对非靶标害虫、有益昆虫以及人类安全,农艺性状以及纤维品质良好,可以作为防治绿盲蝽的理想种质资源。
殷骏[5]（2019）在《低氧诱导精母细胞凋亡导致精子生成减少的机制》文中指出研究背景:高原低张性缺氧（低氧）对男性生殖功能有显着负面影响,其中,精子生成减少是高原男性生殖功能低下的中心环节。精子生成减少的形成是一个复杂的病理生理过程,体内研究表明,在生精细胞中,精母细胞对低氧最为敏感,但是低氧引起体内精母细胞凋亡的机制还不明确。缺氧引起细胞凋亡有两条重要途径:死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径,这两条凋亡途径在肿瘤中被广泛研究,然而这两条凋亡途径是否参与低氧引起的精母细胞凋亡还不清楚。在体内缺血性缺氧所引起的精子生成减少的疾病模型中,HIF-1α与精索静脉曲张、睾丸扭转、寡精症发生发展密切相关,但是HIF-1α是否参与高原低氧所引起的精母细胞凋亡,以及HIF-1α与两条凋亡途径间的调控机制更无从知晓。巨自噬（简称自噬）开始形成于以Beclin-1连接的自噬起始复合物,复合物相互连接形成双层膜结构,双层膜进一步延长形成闭合环装的自噬小体,自噬小体包裹细胞内破坏的细胞器和损伤的蛋白并与溶酶体融合,最终细胞得以存活。自噬与凋亡是两个紧密联系的病理生理学过程,自噬先于凋亡出现,当外界刺激出现时,自噬出现并抑制凋亡;当外界刺激超过一定限度时,凋亡反过来抑制自噬并正反馈加强凋亡。阐明低氧下精母细胞自噬与凋亡相互作用的分子机制,对于研究低氧引起的精子生成减少有着重要的现实意义。本研究旨在查明低氧引起精母细胞凋亡的内在机制,明确低氧对精母细胞自噬的影响,以及探讨自噬和凋亡在精母细胞中相互作用的分子机制。为防治低氧引起的精子生成减少提供新策略和新靶点。研究方法与内容:1.建立低氧（1%氧浓度）诱导小鼠精母细胞系GC-2凋亡模型,并使用TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡。2.缺氧处理GC-2细胞48h后,酶标法检测LDH含量、Caspase-8含量;WesternBlot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas等死亡受体（Death Receptor/DR）凋亡途径相关基因表达,RT-qPCR法检测DR凋亡途径各相关基因mRNA表达。低氧下加入caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK,酶标法检测细胞增殖活性。探讨DR凋亡途径在低氧诱导GC-2细胞凋亡模型中的作用。3.低氧结束后,酶标法检测Caspase-3/9含量;JC-1探针法检测线粒体跨膜电位;检测p53、Bcl-2、Bax等线粒体凋亡途径相关基因蛋白表达,RT-qPCR法检测线粒体凋亡途径各相关基因mRNA表达。低氧下特异性抑制caspase-9和同时抑制caspase-8和caspase-9后,酶标法检测细胞增殖活性。探索线粒体凋亡途径在低氧诱导GC-2细胞凋亡模型中的作用。4.低氧条件下转染HIF-1α特异性siRNA,采用流式细胞术检测GC-2凋亡,酶标法检测caspase-3/8/9含量,Western Blot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas、p53、Bcl-2、Bax等凋亡途径相关基因蛋白表达;研究HIF-1α在低氧激活DR凋亡途径和线粒体凋亡途径中的作用。5.建立低氧抑制小鼠精母细胞系GC-2自噬模型,并使用mCherry-GFP-LC3B法标记自噬小体与自噬性溶酶体并观察自噬流;流式细胞术检测自噬;Western Blot法检测Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-II、p62、mTOR、LAMP2、VMA等自噬途径相关基因蛋白表达。6.低氧下转染Caspase-8特异性siRNA,采用酶标法检测GC-2细胞Caspase-3/8含量;mCherry-GFP-LC3B法观察自噬流;Cyto-ID法和吖啶橙法检测自噬;Western Blot法检测caspase-3/8、cleaved caspase-8、Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-II、p62、mTOR、LAMP2、VMA等蛋白表达。7.低氧下过表达Beclin-1,运用Cyto-ID法检测GC-2细胞自噬;TUNEL法和Annexin V-FITC法检测凋亡;JC-1法检测线粒体跨膜电位;Western Blot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas、p53、Bcl-2、Bax蛋白表达。8.睾丸注射Puro-Beclin 1慢病毒,模拟海拔5000米低压低氧暴露30天,建立小鼠精子生成减少模型;HE染色和透射电镜观察生精小管结构变化;TUNEL法检测生精细胞凋亡。研究结果:1.与常氧对照组比较,1%氧暴露24h可诱导GC-2细胞凋亡增加,并且凋亡增加呈时间依赖性。2.低氧处理48h后,GC-2细胞DR5、TRAIL、Fas的mRNA水平和蛋白表达均显着增加,c-FLIP和DcR2的mRNA水平和蛋白表达均显着减少,DcR1的mRNA水平显着下降;LDH和caspase-8含量显着升高;与低氧对照组比较,特异性抑制caspase-8后,细胞增殖活性显着增加。3.低氧处理后,GC-2细胞Bax和p53的mRNA水平和蛋白表达均显着增加,Bcl-2的mRNA水平和蛋白表达均显着下降;caspase-3/9含量显着增加;线粒体去极化占极化比例显着增加;与低氧对照组比较,特异性抑制caspase-8后,细胞增殖活性显着增加;与常氧对照组比较,同时特异性抑制caspase-8和caspase-9后,细胞增殖活性无显着差异。4.低氧暴露下转染HIF-1α特异性siRNA后,GC-2细胞凋亡和caspase-3/8/9含量显着下降;DR5、TRAIL、Fas、Bax和p53的蛋白表达显着下降,c-FLIP、DcR2和Bcl-2的蛋白表达显着增加。5.与常氧对照组GC-2细胞比较,1%氧暴露24h可抑制自噬,并且自噬呈时间依赖性降低;GC-2细胞Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-II、LAMP2、VMA蛋白表达显着下降,p62和mTOR的蛋白表达显着增加。6.低氧暴露48h和60h后,转染GC-2细胞caspase-8特异性siRNA,caspase-3/8含量显着下降;GC-2细胞自噬显着增加;Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-II、LAMP2、VMA蛋白表达显着升高,caspase-8、p62和mTOR的蛋白表达显着降低。7.1%氧暴露48h和60h后,过表达Beclin-1的GC-2细胞自噬显着升高,细胞凋亡显着下降,线粒体去极化占极化比例显着下降;caspase-3/8、cleaved caspase-8、DR5、TRAIL、Fas、Bax和p53的蛋白表达显着下降,c-FLIP、DcR2和Bcl-2的蛋白表达显着增加。8.模拟海拔5000米低压低氧暴露小鼠30天后,Puro-Beclin 1慢病毒转染后的小鼠睾丸中自噬流显着增加,生精小管病损程度减轻,生精细胞凋亡率显着降低。研究结论:1.低氧通过DR凋亡途径和线粒体凋亡途径诱导GC-2细胞凋亡。2.在低氧诱导的GC-2细胞凋亡中,DR凋亡途径和线粒体途径可能是由HIF-1α调控的。3.低氧通过促进caspase-8的活化,抑制GC-2细胞自噬,使低氧诱导的GC-2细胞凋亡进一步增强。4.低氧下过表达Beclin-1可降低线粒体外膜通透和精母细胞凋亡,并且缓解精子生成减少。5.精母细胞中的Beclin-1和caspase-8基因在精子生成减少的形成中发挥重要作用,有望成为治疗精子生成减少的有效靶点。
李新宇[6]（2019）在《SMAD4与SIVA1、USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制》文中指出SMAD4作为SMAD家族的重要成员和细胞核质间的穿梭蛋白,在介导TGF-β通路信号转导和调控靶基因转录过程中发挥关键性作用,并参与生物体内多种细胞过程。本实验室前期研究证实SMAD4是猪卵泡闭锁和颗粒细胞功能的重要调节因子,不仅可以促进颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡,而且还参与颗粒细胞类固醇激素合成的调控。进一步分析发现SMAD4可通过调控微小RNAs（miRNAs）生成和长链非编码RNAs（lncRNAs）表达等表观遗传途径调控猪卵巢颗粒细胞功能。本文利用猪卵巢颗粒细胞SMAD4敲减的转录组数据鉴定了一个猪的新基因SIVA1,其编码蛋白为泛素连接酶。同时,发现去泛素化酶USP9X受其底物SMAD4调控。因此,本文以泛素连接酶SIVA1和去泛素化酶USP9X为研究对象,分析SMAD4与SIVA1、USP9X间的相互调控机制,以及协同调控猪卵巢颗粒细胞凋亡的机制,在实验室前期研究的基础上继续探索SMAD4通过泛素化/去泛素化这一表观遗传途径调控猪卵巢颗粒细胞凋亡的机制。本文主要研究结果如下:1、SMAD4与泛素连接酶SIVA1互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡本文对实验室前期获得的猪卵泡颗粒细胞SMAD4敲减的转录组数据进行分析,结果发现一个SMAD4敲减的猪卵泡颗粒细胞中显着上调的新转录本,qRT-PCR证实SMAD4是新转录本的抑制者。利用RACE技术获得了新转录本的全长mRNA序列（长度为646 by）,包括101bp的5’-UTR、379 by的编码区序列和166 bp的3’-UTR。同源性比对发现新转录本编码区核苷酸序列与人SIVA1基因的相似度为81.79%,编码蛋白氨基酸序列的相似度为77.14%,因此将其命名为猪SIVA1。组织表达谱分析发现SIVA1基因存在于猪卵巢、肌肉、大脑、肝脏、胃、心肌、大肠和脾脏等组织中,并且在卵巢组织中高表达。荧光原位杂交和免疫组化分析发现SIVA1在不同发育阶段的猪卵泡壁层和游离的颗粒细胞中表达,特别是在闭锁卵泡中表达增强。qRT-PCR和Western blot方法证实SIVA1基因mRNA和蛋白在猪闭锁卵泡中表达水平显着高于健康卵泡。FACS分析发现敲减SIVA1后猪卵泡颗粒细胞凋亡率下降,而过表达SIVA1后颗粒细胞凋亡率上升。这些结果说明新基因SIVA1是猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的促进因子。为了分析SMAD4抑制猪卵泡颗粒细胞中SIVA1基因转录的分子机制,本文克隆了猪SIVA1基因5’调控区序列,并成功鉴定了其核心启动子区。结果在猪SIVA1基因核心启动子区发现了 4个SMAD结合元件（SBE）,荧光素酶报告基因系统和染色质免疫沉淀技术（ChIP）证实SMAD4可与猪SIVA1基因核心启动子区SBE结合,抑制SIVA1基因的启动子区活性。FACS分析和Western blot进一步证实SMAD4可抑制猪卵泡颗粒细胞中SIVA1蛋白表达及其介导的颗粒细胞凋亡。同时,过表达和敲减SIVA1后,猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白水平显着下调或上调,说明SIVA1可反馈调控SMAD4。SIVA1具有泛素连接酶作用,染色质免疫共沉淀技术（Co-IP）显示过表达SIVA1增加猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白泛素化水平,相反敲减SIVA1降低猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白泛素化水平,说明SIVA1通过泛素化机制调控SMAD4蛋白表达。上述结果表明在猪卵泡颗粒细胞中SMAD4与SIVA1形成一个负反馈调控环路即SMAD4-SIVA1环路。FACS结果发现SMAD4-SIVA1环路能够调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。为了进一步探索SMAD4-SIVA1环路调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的分子机制,本文对SMAD4和SIVA1下游因子进行了分析,结果发现凋亡标志基因BCL2是两者共同下游因子,且在猪卵泡闭锁过程中下调,因此被选作目标基因（蛋白）进行深入研究。Western blot证实过表达或敲减SMAD4和SIVA1,猪卵泡颗粒细胞中BCL2蛋白水平发生显着变化。ChIP分析显示SMAD4能够直接与猪BCL2基因启动子区SBEs结合,促进BCL2基因转录。Co-IP分析显示过表达SIVA1可上调猪卵泡颗粒细胞中BCL2蛋白的泛素化水平,而敲减SIVA1可下调BCL2蛋白的泛素化水平。另外,SMAD4-SIVA1环路调控猪卵泡颗粒细胞BCL2的表达,从而通过BCL2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。这些结果表明,BCL2是SMAD4-SIVA1环路的共同靶标,SMAD4-SIVA1环路可通过BCL2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。2、SMAD4与去泛素化酶USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡实验室前期研究证实去泛素化酶USP9X能够促进猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白表达,但作用机制尚不清楚。本文利用Co-IP技术分析发现敲减USP9X基因后猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白泛素化水平升高;FACS分析发现过表达SMAD4可抑制USP9X敲减诱导的猪卵泡颗粒细胞凋亡,说明USP9X通过促进SMAD4蛋白去泛素化提高其蛋白水平,进而影响猪卵泡颗粒细胞凋亡。另外,SMAD4过表达或敲减后猪卵泡颗粒细胞中内源性USP9X基因mRNA表达量和蛋白表达量显着上调或下调,说明在猪卵泡颗粒细胞中SMAD4和USP9X可以形成一个新的调控环路即SMAD4-USP9X环路。进一步分析发现SMAD4可作为转录因子直接与猪USP9X基因启动子区上的SBE结合调控USP9X基因的转录活性。FACS分析显示特异性敲减USP9X后可有效降低SMAD4过表达抑制的猪卵泡颗粒细胞凋亡率,说明去泛素化酶USP9X可介导SMAD4对猪卵泡颗粒细胞凋亡起到调控作用。实验室前期研究证实LRH-1可通过CYP19A1调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。本文进一步发现LRH-1可与CYP19A1基因启动子区直接结合,在猪卵泡颗粒细胞中形成LRH-1/CYP19A1轴。生物信息学分析发现猪LRH-1基因启动子区含有SBEs,利用荧光素酶报告基因系统、染色质免疫沉淀技术（ChIP）、qRT-PCR和western blot证实SMAD4可与LRH-1基因启动子区上SBE结合,上调LRH-1基因转录活性,促进猪卵巢颗粒细胞中LRH-1表达。同时,敲减USP9X可抑制猪卵泡颗粒细胞中LRH-1/CYP19A1轴,Co-IP发现LRH-1蛋白泛素化水平升高,说明USP9X通过促进LRH-1蛋白去泛素化激活LRH-1/CYP19A1轴。SMAD4和去泛素化酶USP9X可通过对方调控LRH-1/CYP19A1轴,并且都可以通过LRH-1对猪卵泡颗粒细胞凋亡起到调控作用。这些结果表明LRH-1/CYP19A1轴是SMAD4-USP9X环路的共同靶标,SMAD4-USP9X环路通过LRH-1/CYP19A1轴调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。miRNAs作为一类重要的表观调控因子,能够在猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法分别预测到214个和320个调控USP9X基因和SMAD4基因的潜在靶向miRNAs,其中在猪卵泡闭锁过程中差异表达的分别为14个和16个,其中有11个为两者共同的潜在miRNAs。荧光素酶活性分析发现9个在猪卵泡闭锁过程中上调的miRNAs中,miR-26b/27b/30c/195/320a同时靶向SMAD4和USP9X。功能分析发现miR-26b靶向抑制猪卵泡颗粒细胞中SMAD4-USP9X环路,及其介导的猪卵泡颗粒细胞功能（细胞凋亡）。进一步分析发现miR-26b通过靶向抑制SMAD4-USP9X环路,从而抑制猪卵泡颗粒细胞中LRH-1/CYP1 9A1轴。上述结果表明在猪卵泡颗粒细胞中SMAD4和USP9X拥有共同的调控miRNAs,这些miRNAs可通过靶向抑制SMAD4-USP9X环路和LRH-1/CYP19A1轴,促进猪卵泡颗粒细胞凋亡。综上所述,本文鉴定了一个猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡相关新基因SIVA1,其具有泛素连接酶作用,并发现SMAD4可与泛素连接酶SIVA1形成负反馈环路,通过凋亡标志基因BCL2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。同时,本文还证实SMAD4可与去泛素化酶USP9X形成正反馈环路,通过LRH-1/CYP19A1轴调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制。
王富轩[7]（2019）在《凡纳滨对虾不同免疫组织在弧菌和WSSV免疫刺激早期的响应机制》文中研究表明白斑综合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是引发对虾流行性疾病的两种主要病原微生物,系统开展对虾针对这两种病原的免疫响应特征研究是发展对虾病害防治技术的重要基础。本论文以凡纳滨对虾为研究对象,通过比较转录组分析其重要免疫组织包括血细胞（Hc）、淋巴器官（Oka）和肝胰腺（Hp）在WSSV和Vp免疫刺激早期的响应特征,以解析凡纳滨对虾不同免疫组织对不同病原早期响应的分子机制。研究结果不仅可丰富甲壳动物免疫学的基础理论,也可为对虾的健康养殖与病害防治提供新思路。具体进展如下:（1）对虾三种重要免疫组织在Vp和WSSV免疫刺激早期的转录组分析:通过Illumina测序获得1,288,985,148条clean reads;通过de novo组装,得到59,583条Unigenes,其中有17,721（29.74%）条有注释信息。GO富集分析发现,代谢过程（metabolic process）、细胞过程（cellular process）和单有机体过程（single-organism process）是富集基因最多的生物学过程;KEGG pathway 分析发现大量与免疫相关的通路,包括内吞（Endocytosis）、溶酶体（Lysosome）、吞噬体（Phagosome）和过氧化物酶体（Peroxisome）等,表明了三个组织的生物学功能与免疫密切相关;通过WGCNA分析,将基因划分成17个模块,为后续关键基因的挖掘提供了重要参考。（2）对虾血细胞对Vp和WSSV免疫刺激的早期响应特征分析:从Vp刺激前后的血细胞（VHc）转录组中获得2454个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中上调基因1935个,下调基因519个;从WSSV感染前后的血细胞（WHc）转录组中获得3444个DEGs,其中上调基因3240个,下调基因204个。GO富集分析显示,这两种病原刺激均影响了血细胞的RNA代谢（RNA metabolism）、细胞酰胺生物合成（amide biosynthetic process）及基因表达（gene expression）等生物学过程。KEGG pathway富集分析表明,真核生物核糖体的生物合成（Ribosome biogenesis in eukaryotes）和氨酰 tRNA 的生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis）通路在两种病原刺激时均显着富集,暗示血细胞的蛋白合成过程受到影响。对差异表达基因的进一步分析与聚类发现,Vp和WSSV刺激引起对虾血细胞的代谢、翻译、内吞、转运、免疫及神经内分泌等多种生理过程的改变。特别地,WSSV感染显着激活了对虾血细胞介导的神经内分泌免疫系统,引起18种神经肽前体基因表达水平的明显上调,并广泛改变该系统的相关过程,涉及神经肽前体加工过程、氨基酸神经递质代谢过程、生物胺合成途径及乙酰胆碱信号通路。与WSSV感染不同,Vp刺激对神经内分泌免疫系统的影响相对较小,仅有四种神经肽前体及其加工相关基因发生变化。这是第一个有关甲壳动物血细胞介导的神经内分泌免疫系统参与免疫刺激响应的报道,为对虾疾病的防治提供了新的思路。（3）对虾淋巴器官对Vp和WSSV免疫刺激的早期响应特征分析:从Vp感染前后的淋巴器官（VOka）转录组中获得2127个DEGs,其中上调基因809个,下调基因1318个;从WSSV感染前后的淋巴器官（WOka）转录组中获得1569个DEGs,其中上调基因138个,下调基因1431个。GO富集分析显示,氨基聚糖代谢过程（aminoglycan metabolic process）在两种病原刺激时均显着富集,其中涉及到大量几丁质结合蛋白。KEGG pathway富集显示,溶酶体（Lysosome）通路仅在Vp刺激的转录组中显着富集,表明淋巴器官溶酶体在Vp刺激时入可能发挥重要的清除作用;而与碳水化合物代谢相关的三条通路,包括肌醇磷酸代谢（Inositol phosphate metabolism）、丙酸代谢（Propanoate metabolism）和糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）只在WSSV刺激的转录组中显着富集,表明WSSV刺激明显影响了对虾淋巴器官的代谢过程。对差异表达基因的进一步分析与聚类发现,Vp和WSSV刺激均可影响淋巴器官的proPO激活系统、溶酶体、细胞外基质、细胞骨架蛋白、几丁质结合蛋白等。进一步,鉴定了两类特异性响应Vp刺激的关键免疫分子,包括组织蛋白酶和卵黄膜外层蛋白I,它们在受到Vp刺激时表达水平均明显上调,暗示了其在淋巴器官抗细菌免疫应答中的重要作用。（4）对虾肝胰腺对Vp和WSSV免疫刺激的早期响应特征分析:从Vp感染前后的肝胰腺（VHp）转录组中获得373个DEGs,而从WSSV感染前后的肝胰腺（WHp）转录组中仅获得86个DEGs。GO富集分析发现,丙酮酸代谢过程（pyruvate metabolic process）在Vp和WSSV两种免疫刺激下均显着富集。KEGG pathway分析显示,糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）通路在两个转录组中均显着富集,进一步证实了上述结果。另外,谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）、药物代谢-细胞色素 P450（Drugmetabolism-cytochrome P450）和外源物质代谢-细胞色素 P450（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）也被显着富集,表明了肝胰腺的关键解毒功能。对差异表达基因的进一步分析与聚类发现,Vp刺激引起一些免疫相关基因发生明显变化,包括模式识别受体、丝氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶抑制剂等。另外,鉴定了一些转运及解毒相关的分子,如ABC转运体和细胞色素P450,它们可能在肝胰腺的免疫过程中扮演重要角色。（5）对虾重组激活基因和免疫致敏相关分子的鉴定:首次在对虾中鉴定了脊椎动物抗体基因重排过程中起关键作用的重组激活基因RAGs的同源基因,即LvRAG1L和LvRAG2L,它们在蛋白序列、表达模式及可变剪接等方面与几种已报道的高等无脊椎动物和头索动物RAGs具有明显的相似性,为RAGs的起源与进化提供新的分子证据。另外,鉴定了对虾中免疫致敏相关分子DSCAMs和FREPs,分析了它们的基因结构及对病原感染的响应特征,结果显示:对虾DSCAMs具有多个旁系同源基因,参与对免疫刺激的响应;对虾FREPs可能通过多个基因座、可变剪接来增加其多样性,且广泛参与对Vp和WSSV免疫刺激的响应。上述结果可为对虾免疫致敏的分子机制研究提供重要参考。
陈劲松[8]（2019）在《尼罗罗非鱼对丽鱼三代虫感染的免疫机制研究》文中研究指明尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）原产于非洲,是一种重要的世界性经济养殖鱼类。自1978年从苏丹引入我国以来,一直在我国南方广泛养殖。但是随着高密度集约化养殖的发展,各种病害的频发严重制约了罗非鱼养殖业的发展,隶属于扁形动物门单殖亚纲的单殖吸虫可导致罗非鱼幼鱼大量死亡。本研究通过实验感染和转录组测序等手段,对尼罗罗非鱼感染丽鱼三代虫（Gyrodactylus cichlidarum）后,免疫相关通路及基因表达的变化进行了生物信息学分析;根据转录组分析结果,对主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）家族基因在三代虫感染后的表达进行了详细研究;并进一步对MHCⅡα和MHCⅡβ基因的多态性以及等位基因型与罗非鱼对三代虫易感性/抗感染性的关系进行了关联分析与验证,研究主要获得如下结果。转录组测序共完成76个二代样品测序及1个三代样品全长测序,其中三代测序首次获得尼罗罗非鱼全长转录本,使用7个cells获得18.32 Gb的有效数据,得到插入序列485040条,其中全长非嵌合序列256476条;经聚类后获得一致性转录本序列74013个,经非全长序列校正后的高质量转录本序列56926个。利用二代数据对低质量序列进行校正,对去冗余后的32551个转录本进行可变剪接分析,共检测到基因位点16239个,其中新基因位点4259个,新发现转录本26405个。对新发现的转录本进行序列结构分析,共预测出36338个SSR、17614个完整开放阅读框（ORF）序列和4111个长链非编码RNA（lncRNA）,完成了23048个新转录本的功能注释。在三代虫感染之后的第2天（感染初期）,罗非鱼部分免疫相关基因出现表达变化,在感染后第5天（感染高峰期）,表达上调的基因数最多（1443）,在感染后第10天（感染消退期）,表达上调的基因最少（169）。在罗非鱼的三个免疫组织中,肝脏中差异表达基因最多,其次是尾鳍,脾脏中差异表达基因最少;从不同易感性的罗非鱼各组样品中,分析共得到13642个差异表达基因。表达显着上调的基因主要包括MHC类基因、泛素羧基末端水解酶、补体基因、Toll样受体、趋化因子、T细胞受体、白介素等免疫应激相关基因;这些基因显着富集于抗原加工呈递、Toll样受体信号、细胞粘附分子以及肠组织免疫系统IgA生成等重要免疫通路,其中MHC类基因在多个通路中都有富集。表达显着下调的基因主要包括胶原蛋白、层粘连蛋白、机制重塑关联蛋白、肌球结合蛋白、胰岛素生长因子结合蛋白、G蛋白偶联受体、麦角甾醇生物合成蛋白以及乙酰辅酶A合成酶等,这些基因的差异表达变化与感染后尼罗罗非鱼生长、运动、细胞间信号转导、以及固醇类合成等多项生理及病理变化相关联。本研究首次克隆得到了MHCⅢ类基因中的补体B因子（OnBf）、补体C2（OnC2）以及补体C4（OnC4）基因的全长。OnBf基因cDNA序列全长2505bp,开放阅读框可编码684个氨基酸,OnC2基因开放阅读框全长2385bp,共编码794个氨基酸,OnC4基因cDNA序列全长5360bp,开放阅读框编码1693个氨基酸;OnBf、OnC2和OnC4都在罗非鱼各组织中广泛表达,并且在肝脏、胃及脾脏中表达量普遍较高。感染实验表明,三代虫在感染6天后开始对罗非鱼产生明显影响,个别鱼出现皮肤溃烂,游动缓慢和鳍残缺等症状,相对于皮肤来说,三代虫更容易寄生在罗非鱼的鳍上,并且在面积最大的尾鳍及背鳍上感染丰度最高;在整个感染过程中,三代虫感染率与平均感染强度变化趋势具有一定一致性,都是先上升后下降,在感染第10天时达到峰值。三代虫感染罗非鱼后,MHC家族基因都有不同程度的表达上调,特别是MHCⅡ类基因,其表达趋势与三代虫感染丰度的动态变化趋势有一定一致性,在感染强度较高的8-10 d时间段,其表达上调的幅度更为显着并达到峰值,并且在三代虫与罗非鱼直接接触的皮肤组织以及主要免疫器官头肾组织中的表达上调幅度要远大于肝脏以及脾脏中。这些结果表明MHC基因在尼罗罗非鱼免疫单殖吸虫感染过程中发挥了重要作用。通过连续两次强度递增的三代虫感染实验获得了罗非鱼易感群体46尾,中间群体40尾和抗感染群体50尾。MHCⅡ类基因的多态性分析结果表明MHCⅡα与MHCⅡβ基因在尼罗罗非鱼中都有很高的多态性,抗感染群体MHC的多态性要明显高于易感群体,新发现MHCⅡα等位基因50个,MHCⅡβ等位基因40个,分别命名为Orni-DAA*0101-5001与Orni-DAB*1001-4901。这些等位基因在不同易感性的罗非鱼群体中的分布差异很大,其中Orni-DAA*0701、OrniDAA*1001、Orni-DAA*1901、Orni-DAA*3601、Orni-DAB*0901、Orni-DAB*1401、Orni-DAB*1801、Orni-DAB*2901、Orni-DAB*0701、Orni-DAB*0601和OrniDAB*3501在各群体中分布差异显着（P<0.05）,Orni-DAA*0101、OrniDAA*0201、Orni-DAA*1601与Orni-DAA*1801在各群体中分布差异极显着（P<0.01）。独立验证实验证实:等位基因Orni-DAA*0201,Orni-DAA*0701,OrniDAB*0901和Orni-DAB*3501与易感性显着相关（P<0.05）,等位基因OrniDAA*3601和Orni-DAB*1401与抗感染显着相关（P<0.05）,这些等位基因有望作为分子标记应用于罗非鱼抗病（寄生虫）育种工作中。
张金勇[9]（2019）在《雌性金乌贼脑亚脚叶/嗅叶-视腺-性腺轴转录组及其生殖后死亡的调控机制》文中研究指明金乌贼（Sepia esculnta Hoyle,1885）是乌贼科中重要的经济种类,曾是我国渤黄海重要捕捞对象,然而,上世纪80年代以来,由于过度捕捞、栖息地破坏和全球变化等原因,金乌贼资源急剧衰退。金乌贼具有营养丰富、生长迅速、个体大（均重700g）、生命周期短（约1年）、世代更新快和洄游规律性强等特点,为恢复和利用金乌贼资源,人们开始攻克金乌贼人工繁育和增殖放流技术,并在2010年前后取得突破。为发展金乌贼生殖调控技术,亟待揭示其生长、繁殖和死亡的遗传基础和分子机制。金乌贼繁殖生物学研究表明,性成熟的雌性金乌贼怀卵量约2500枚,排卵期持续约一个月,产卵数为怀卵量的1/3,排卵结束后亲体相继死亡,死亡的亲体卵巢中还残留大量成熟卵子未排出,可见,金乌贼的繁殖能力受到了某种因素的制约。金乌贼的生殖与死亡是否受脑亚脚叶/嗅叶-视腺-性腺轴的调控?金乌贼不同发育时期该调控轴的遗传物质是否存在时空差异?金乌贼生殖后快速死亡的调控机制是什么?为了回答上述问题,本研究拟采用转录组测序技术对雌性金乌贼不同时期脑亚脚叶/嗅叶-视腺-性腺轴的转录组表达调控变化规律开展研究,以填补金乌贼衰老死亡过程分子机理研究的空白,为认识金乌贼生殖策略和死亡调控机制研究提供基础资料。主要结果如下:1.雌性金乌贼全长转录本构建与质量评价提取金乌贼不同时期的脑、视腺、卵巢和缠卵腺组织样本的总RNA并建立cDNA文库,采用PacBio单分子实时（single-molecule real-time,SMRT）测序技术结合Illumina RNA-Seq技术,获取了金乌贼的全长转录本。SMRT测序数据共14.16 Gb,组装成94,635条转录本;Illumina数据共35.15 Gb,组装成177,226条非冗余转录本。通过合并SMRT和Illumina测序组装数据,生成高质量的金乌贼转录组,包含177,951条全长转录本。将合并后的全长转录本序列与Nr、Nt、Swiss-Port、Interpro、GO、COG、KEGG（E-value<1.0E-5）等数据库进行比对和功能注释,其中有81,459条转录本获得功能注释,并鉴定出49,189条含编码区（CDS）的核苷酸序列。此外,基于简单重复序列标记（SSR）分析鉴定了 161,327个SSR,分布在64,933条转录本中。所获得金乌贼全长转录本将为研究脑亚脚叶/嗅叶-视腺-性腺轴调控金乌贼生殖后死亡机制奠定基础。2.雌性金乌贼脑亚脚叶/嗅叶转录组分析及生殖后死亡调控信号通路的筛选头足类的脑部结构复杂,在无脊椎动物中最为发达,甚至可以与脊椎动物相媲美。位于中枢神经系统食道上神经团垂直叶下方的脑亚脚叶及其附近区域,对视腺的分泌活动具有抑制性作用,而视腺是与生殖调控相关的重要内分泌器官,能够调节性腺发育和成熟。脑亚脚叶/嗅叶相当于脊椎动物中的下丘脑,能分泌产生多种神经内分泌因子,直接或间接参与生殖轴的调控。对于金乌贼,脑亚脚叶/嗅叶在生殖前后基因的表达调控模式有何变化?哪些信号通路参与调控视腺的分泌活动?为了回答这些问题,本研究采用Illumina HiSeq测序平台,对金乌贼生长（BG）、产卵（BS）和产后濒死（BA）三个关键时期的脑组织进行了转录组测序,获得了 66.19 Gb clean data（Q20>96%）。两两比较分析三个关键时期脑组织转录组数据,结果发现,BG-vs-BS和BG-vs-BA组的差异基因数目较多（分别为2,609和3,333）,而BS-vs-BA组差异基因数目很少（170）,三个时期的脑组织比较组间共有4,419条差异表达基因（DEGs）。对DEGs进行GO显着性富集分析发现,共有30条GO条目的富集程度达到显着水平,其中细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节,氧化磷酸化,NADH脱氢酶（泛醌）活性和呼吸链等GO条目显着富集。KEGG通路显着性富集分析鉴别出了与调控死亡相关的通路,如mTOR信号通路、AMPK信号通路、氧化磷酸化和细胞周期。上述结果表明,金乌贼生殖后死亡受一个复杂的信号通路网络所调控,mTOR分子作为神经中枢-脑的能量感受器,在机体能量稳态的调控中起着非常关键的作用。3.雌性金乌贼视腺转录组分析及神经肽基因的筛查对金乌贼产卵（OS）和产后濒死（OA）两个时期的视腺组织进行Illumina转录组测序,总计获得了 45.21 Gb的clean data（Q20>96%）。比较分析金乌贼产卵和产后濒死时期视腺组织的转录组数据,在OS-vs-OA组发现DEGs 94条,其中53条为上调基因,41条为下调基因。对OS-vs-OA组DEGs进行GO显着性富集分析发现,共有35条GO条目的富集程度达到显着水平,其中细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节,氧化磷酸化,线粒体内膜和呼吸链等GO条目显着富集。KEGG通路分析发现,OS-vs-OA组涉及95种代谢途径,表达上调的序列有53条;表达下调的序列有61条。进一步分析,获得了金乌贼产卵和产后濒死时期视腺显着性富集程度最高的相关通路,如氧化磷酸化、氨基酸代谢（色氨酸代谢）、脂质代谢（酮体的合成和降解）、雌激素信号通路、泛素介导的蛋白水解通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路。头足类的视腺及其分泌物与其生殖和死亡相关,但最重要的是,金乌贼的视腺分泌物是否为类神经肽物质,对机体有神经激素样的作用?为回答这个问题,本研究利用BLAST的Tblastn程序结合Openoffice软件的查找程序,基于其他甲壳类和无脊椎动物神经肽的同源性和保守性的结构特点,在金乌贼视腺转录组数据中进行全面的筛查,在OS视腺转录组数据中共获得17个神经肽基因家族,包括51个神经肽基因;OA视腺转录组数据中获得19个神经肽基因家族的56个神经肽基因。可见,金乌贼视腺转录组拥有丰富的神经肽基因,为研究视腺内分泌功能奠定了基础。4.金乌贼卵巢转录组分析及关键信号通路和关键基因的筛选分别对金乌贼生长（IG）、产卵（IS）和产后濒死（IA）三个关键时期的卵巢组织进行Illumina转录组测序,总计获得了 66.65 Gb的clean data（Q20>96%）。对三个时期的卵巢组织转录本数据进行两两比较分析,在IG-vs-IS组发现有10,290个DEGs,包含4,997个上调基因和5,293个下调基因;IG-vs-IA组发现17,107个DEGs,其中5,490个基因为上调基因,1 1,617个基因为下调基因;而在IS-vs-IA组仅发现380个DEGs,上下调基因个数分别为303和77,三个时期的卵巢组织比较组间共有20,931个DEGs。对DEGs进行GO显着性富集分析发现,氧化磷酸化,NADH脱氢酶（泛醌）活性和呼吸链等GO条目显着富集。KEGG代谢通路数据库比对和注释,发现IG-vs-IS涉及317种代谢途径;IG-vs-IA涉及317种代谢途径;IS-vs-IA涉及161种代谢途径。结合差异表达基因的KEGG功能注释结果,进行Pathway显着性富集分析。共得到显着富集的Pathway包括运输和分解代谢、信号转导、折叠,分类和降解、转录、氨基酸代谢、内分泌系统、免疫系统、疾病等代谢通路。结果表明,除氧化磷酸化通路外,还有细胞周期、mTOR信号通路、AMPK信号通路、泛素介导的蛋白水解通路等信号通路相互联系、相互作用,金乌贼生殖后死亡受一个复杂的信号网络作用系统所调控。5.金乌贼缠卵腺转录组分析及关键信号通路和关键基因筛选对金乌贼生长（NG）、产卵（NS）和产后濒死（NA）三个关键时期的缠卵腺组织进行Illumina转录组测序,总计获得了 65.59 Gb的clean data（Q20>96%）。比较分析金乌贼缠卵腺组织三个时期的转录组数据,得到了大量的DEGs。在NG-vs-NS组发现有 1,889 条 DEGs;在 NG-vs-NA 组,有 6,574 条 DEGs,而在 NS-vs-NA 组,发现95条DEGs,三个时期的缠卵腺组织比较组间共有7,021条DEGs。三个时期缠卵腺中DEGs的GO分类最丰富的功能分类分别是“绑定”和“催化活性”。KEGG通路分析,结果发现NG-vs-NS涉及295种代谢途径,NG-vs-NA涉及318种代谢途径,NS-vs-NA涉及90种代谢途径,可以看出金乌贼各个时期之间差别较大,涉及的代谢途径也较多。进一步分析,结合KEGG功能注释结果,进行Pathway显着性富集分析。得到显着富集的Pathway包括蛋白质消化吸收、细胞周期、p53信号通路、mTOR信号通路、PI3K-Akt信号通路、代谢途径、溶酶体等。结果发现,缠卵腺作为生殖附腺,在金乌贼三个关键时期,与能量代谢相关的信号通路（蛋白质消化吸收和其它代谢途径）富集程度显着,这可能与金乌贼生殖活动的营养需求密不可分。综上,本项研究获得了金乌贼生长、产卵和产后濒死三个关键时期的脑亚脚叶/嗅叶、视腺、卵巢和缠卵腺转录组测序数据（245.843 Gb clean data）。通过综合分析金乌贼不同组织三个关键时期的差异表达基因数据和显着性富集结果,绘制出调控金乌贼生殖后死亡相关信号通路模式图,提出了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因mTOR在金乌贼机体能量稳态调控中的作用,明确了氧化磷酸化对其生殖过程细胞能量代谢调控的重要性,揭示了雌性金乌贼生殖后快速死亡受一个复杂的能量稳态调控网络系统所控制。
高洁[10]（2013）在《拟穴青蟹性腺差异的转录组学分析》文中提出拟穴青蟹（Scylla paramamosain）在我国东南沿海分布较广泛,是主要的养殖蟹类之一,雌雄个体间存在显着不同的生物学特性和经济性状,因此关于青蟹性别决定和性腺发育的分子机制的研究一直是该领域的热点。随着下一代测序技术的广泛应用,本课题采用454 GS FLX技术对拟穴青蟹精巢和卵巢组织进行高通量转录组测序,在此基础上筛选并分析重要功能基因,以期为青蟹雌雄分化和性腺发育分子机制的进一步研究提供参考资料。通过Roche 454测序,两个文库共产生365116 reads（精巢171962,卵巢193154）,平均长度为285.4 bp。经过拼接组装,共生成21791 isotigs（精巢12439,卵巢9352）和22814singlets（精巢14241,卵巢8573）。通过与Nr蛋白数据库进行blastx比对,共有3471 unique转录子序列（精巢1718,卵巢1753）获得注释。Gene Ontology和KEGG分析表明共有224条unique转录子序列注释上224个酶分类学编号（EC number）,参与了174条代谢通路。生物信息学分析发现有4199条共有转录子在精巢和卵巢中的表达具有显着差异（Fisher P<0.05）,卵巢文库中共获得10522条特异表达转录子,精巢文库中共获得19013条特异表达转录子。经过半定量PCR和实时定量PCR验证,我们确认了33条转录子在卵巢特异表达,13条转录子在精巢特异表达,17条转录子在精巢和卵巢中的表达具有显着差异。此外,我们鉴定了8610个潜在的SSR位点和23879个潜在的SNP位点。Sp-OTUB基因cDNA全长1261 bp,开放阅读框804 bp,编码267个氨基酸。该蛋白序列中包含一个OTU样的半胱氨酸蛋白酶催化结构域和一个由半胱氨酸（C）、天冬氨酸（D）和组氨酸（H）组成的催化三联体。实时定量PCR结果显示,Sp-OTUB在成熟拟穴青蟹各组织器官中均有表达,其中在血淋巴中的表达量最大,精巢中表达量最低。在卵巢发育过程中,Sp-OTUB的表达量在卵巢增殖期为最大,与其他各时期具有显着差异;在精巢发育各阶段,Sp-OTUB表达量在精子细胞期达到最大,显着高于精母细胞期和成熟精子期。同源系统进化分析Sp-OTUB与大多数物种的OTUB1聚为一支,与肩突硬蜱（Ixodes scapularis）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）亲缘关系最近。Sp-wds基因cDNA全长1433 bp,开放阅读框975 bp,编码325个氨基酸。该蛋白包含7个WD重复基序,形成一个高度对称的环状“螺旋桨”样结构。荧光定量PCR结果显示,Sp-wds基因在成熟青蟹各组织器官中均有表达,在卵巢的表达量显着高于其他各组织（P<0.5）,其次在精巢的表达水平也较高,与其他各组织具有显着差异。卵巢发育过程中,Sp-wds基因的表达呈现先上升后下降的趋势,在卵黄生成中期表达量最高并显着高于其他各时期（P<0.5）;在精巢发育各时期,Sp-wds的表达水平随着精巢的成熟表达水平渐渐降低,在成熟精子期降至最低,显着低于其余两个时期（P<0.5）。
二、A novel ubiquitin carboxyl terminal hydroase is involved in toad oocyte maturation（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、A novel ubiquitin carboxyl terminal hydroase is involved in toad oocyte maturation（论文提纲范文）
（1）肾透明细胞癌自噬相关多组学预后模型的构建研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 肾透明细胞癌患者自噬相关基因预后模型的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肾透明细胞癌自噬相关lncRNA预后模型的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肾透明细胞癌自噬相关lncRNA表达验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 自噬在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 精原干细胞的起源与精子发生 |
| 1.2.2 精原干细胞的应用 |
| 1.2.3 精原干细胞的移植 |
| 1.2.4 受体的制备 |
| 1.2.5 CRSPR/Cas9 技术的应用 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 内源性精子发生消融的小鼠模型制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验设备与耗材 |
| 2.1.3 主要试剂与配置 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 F_0代小鼠获得及基因型鉴定 |
| 2.2.2 F_1代新生小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 Western blot鉴定ETV5 蛋白的缺失 |
| 2.2.4 不同基因型小鼠体重的检测 |
| 2.2.5 不同基因型小鼠睾丸重的检测 |
| 2.2.6 睾丸组织形态学比较 |
| 2.2.7 附睾中精子的检测 |
| 2.2.8 精子发生相关基因的表达 |
| 2.2.9 睾酮水平检测 |
| 2.2.10 繁殖能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小鼠精原干细胞的分离培养与检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验设备与耗材 |
| 3.1.3 主要试剂与配置 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 用小鼠胎儿成纤维细胞制备饲养层细胞 |
| 3.2.2 两种饲养层培养SSCs细胞体外增殖的比较 |
| 3.2.3 精原干细胞的分离与纯化 |
| 3.2.4 添加不同生长因子对精原干细胞体外增殖的影响 |
| 3.2.5 精原干细胞体外增殖的碱性磷酸酶染色 |
| 3.2.6 精原干细胞体外增殖的免疫荧光染色 |
| 3.2.7 精原干细胞的标志基因表达检测 |
| 3.2.8 精原干细胞标志基因表达水平的实时定量检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 精原干细胞移植与精子来源的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验设备与耗材 |
| 4.1.3 主要试剂与配制 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SSCs的移植 |
| 4.2.2 移植后睾丸重量的检测 |
| 4.2.3 睾丸的组织形态观察(H.E.染色) |
| 4.2.4 睾丸切片的免疫组织化学分析 |
| 4.2.5 附睾精子的检测 |
| 4.2.6 精子来源的检测 |
| 4.2.7 精子发生相关基因的表达 |
| 4.2.8 繁殖能力评估 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因敲除猪受体模型的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验设备与耗材 |
| 5.1.3 主要试剂与配制 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pX330-gRNA质粒的构建 |
| 5.2.2 质粒电转猪胎儿成纤维细胞 |
| 5.2.3 电转后单克隆细胞团的收取 |
| 5.2.4 单克隆细胞团敲除方式的鉴定 |
| 5.2.5 ETV5 基因纯合敲除细胞系的获得 |
| 5.2.6 SCNT制备ETV5 基因敲除克隆猪 |
| 5.2.7 新生克隆猪的基因型鉴定 |
| 5.2.8 新生克隆猪ETV5 蛋白Western blot鉴定 |
| 5.2.9 睾丸发育的组织形态检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 全文总结与主要结论 |
| 6.2 主要创新点与后续工作 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要英文对照缩略表 |
| 附录2 全文 RT-PCR(Q-PCR)引物序列 |
| 附录3 细胞系测序结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.1.1 形态抗虫育种 |
| 1.1.2 生化抗虫育种 |
| 1.1.3 分子标记辅助选择抗虫育种 |
| 1.1.4 转外源抗虫基因抗虫育种 |
| 1.1.5 利用RNAi技术沉默昆虫靶标基因抗虫育种 |
| 1.2 盲蝽的危害特点及抗盲蝽研究的必要性 |
| 1.2.1 盲蝽的种类及形态特征 |
| 1.2.2 盲蝽的生活习性以及危害特点 |
| 1.2.3 开展棉花抗盲蝽研究的重要性和必要性 |
| 1.3 RNAi的研究进展及在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.3.1 RNAi现象的发现及定义 |
| 1.3.2 RNAi的作用机理及特点 |
| 1.3.3 RNAi的种类 |
| 1.3.4 昆虫摄取dsRNA的方式 |
| 1.3.5 植物介导的RNAi技术在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.4 FAR基因研究进展 |
| 1.5 LIM基因研究进展 |
| 1.6 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.6.1 本研究的目的与意义 |
| 1.6.2 本研究的技术路线 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 植物表达载体 |
| 2.1.3 基因的来源 |
| 2.1.4 供试的昆虫材料 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 棉花遗传转化 |
| 2.2.3 棉花DNA提取与Southern杂交 |
| 2.2.4 棉花RNA提取,表达量分析以及Northern杂交 |
| 2.2.5 盲蝽RNA提取,反转录以及RT-qPCR基因表达量分析 |
| 2.2.6 盲蝽的田间抗虫鉴定 |
| 2.2.7 转基因棉花大田农艺性状评价 |
| 2.2.8 非靶标昆虫的室内抗性鉴定 |
| 2.2.9 绿盲蝽的室内抗性鉴定 |
| 2.2.10 dsAl LIM和 dsGFP处理后绿盲蝽的转录组分析 |
| 第三章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质 |
| 3.1 结果与分析 |
| 3.1.1 AsFAR转基因棉花的获得与分子检测 |
| 3.1.2 AsFAR转基因棉花的表达量检测 |
| 3.1.3 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽种群数量的影响 |
| 3.1.4 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 3.1.5 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽的抗性显着增强 |
| 3.1.6 AsFAR转基因棉花对非靶标害虫的影响 |
| 3.1.7 不同世代AsFAR转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 3.2 讨论 |
| 第四章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗绿盲蝽新种质 |
| 4.1 结果与分析 |
| 4.1.1 基因序列分析及载体构建 |
| 4.1.2 AlLIM转基因棉花的获得 |
| 4.1.3 AlLIM转基因棉花的阳性检测及拷贝数分析 |
| 4.1.4 AlLIM转基因棉花的表达量检测 |
| 4.1.5 AlLIM转基因棉花对绿盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 4.1.6 AlLIM转基因棉花的室内饲喂效果检测 |
| 4.1.7 ds Al LIM处理后绿盲蝽转录组分析 |
| 4.1.8 AlLIM转基因棉花的田间抗绿盲蝽效果检测 |
| 4.1.9 不同世代AlLIM转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 4.1.10 AlLIM转基因棉花对非靶标昆虫的影响 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 AlLIM转基因棉花的抗虫性研究 |
| 4.2.2 绿盲蝽AlLIM基因的功能研究 |
| 4.2.3 AlLIM转基因棉花的环境安全性评价 |
| 4.2.4 RNAi转基因作物与Bt转基因作物的叠加是未来抗虫育种发展的新方向 |
| 4.2.5 植物介导的RNAi技术面临的挑战 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 载体构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 Sourthern杂交(地高辛标记法) |
| 附录5 棉花RNA提取 |
| 附录6 Northern杂交(地高辛标记法) |
| 附录7 AsFARDNA序列 |
| 附录8 AlLIMDNA序列 |
| 附表 |
| 附表1 本研究所用的引物序列 |
| 已发表和待发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（5）低氧诱导精母细胞凋亡导致精子生成减少的机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 低氧通过HIF-1α介导的死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径诱导精母细胞凋亡 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 低氧经死亡受体凋亡途径caspase-8 抑制精母细胞巨自噬 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 过表达Beclin-1 促进精母细胞巨自噬、缓解凋亡,促进精子生成 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 自噬在精子生成减少中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬与细胞死亡的对话 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究结果 |
| 致谢 |
（6）SMAD4与SIVA1、USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 SMADs蛋白家族 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 SMAD家族生物学功能 |
| 2 凋亡诱导因子SIVA1 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 SIVA1主要作用机制 |
| 3 去泛素化酶USP9X |
| 3.1 去泛素化酶 |
| 3.2 USP家族 |
| 3.3 USP9X对Smad4泛素化和去泛素化机制的研究进展 |
| 3.4 USP9X与细胞凋亡 |
| 第二章 SMAD4与泛素连接酶SIVA1互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪新基因SIVA1的鉴定与序列分析 |
| 2.2 SIVA1与猪卵泡闭锁有关 |
| 2.3 SIVA1过表达促进猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.4 SIVA1干扰抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.5 SMAD4调节猪卵泡颗粒细胞中SIVA1表达和功能 |
| 2.6 SMAD4通过直接结合SIVA1基因启动子调节其转录 |
| 2.7 SMAD4与SIVA1形成调控环路 |
| 2.8 SIVA1通过SMAD4调控猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.9 BCL2是SMAD4-SIVA1环路的共同靶标 |
| 2.10 BCL2是SMAD4-SIVA1环路的直接靶标 |
| 2.11 SMAD4-SIVA1环路通过BCL2控制猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 SMAD4与去泛素化酶USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.2 寡核苷酸的合成 |
| 1.3 质粒构建 |
| 1.4蛋白质印迹分析 |
| 1.5 染色质免疫沉淀分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 去泛素化酶USP9X参与猪卵泡闭锁和卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.2 USP9X通过SMAD4去泛素化增强SMAD4的表达 |
| 2.3 USP9X和SMAD4形成正反馈环路 |
| 2.4 LRH-1/CYP19A1轴是SMAD4-USP9X环路的潜在靶标 |
| 2.5 SMAD4通过与LRH-1启动子结合调节LRH-1/CYP19A1轴 |
| 2.6 LRH-1是USP9X的直接功能靶标 |
| 2.7 SMAD4-USP9X环路调控LRH-1/CYP19A1轴 |
| 2.8 USP9X和SMAD4拥有共同的调节miRNA |
| 2.9 miR-26b靶向SMAD4-USP9X环路 |
| 2.10 miR-26b通过SMAD4-USP9X环调节LRH-1/CYP19A1途径 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（7）凡纳滨对虾不同免疫组织在弧菌和WSSV免疫刺激早期的响应机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 对虾常见病害 |
| 1.2.1 白斑综合征 |
| 1.2.2 急性肝胰腺坏死病 |
| 1.3 对虾的免疫防御机制 |
| 1.3.1 模式识别 |
| 1.3.2 免疫信号通路 |
| 1.3.3 RNA干扰 |
| 1.3.4 酚氧化酶原激活系统 |
| 1.3.5 细胞免疫 |
| 1.3.6 其他重要免疫分子 |
| 1.4 免疫致敏与免疫记忆 |
| 1.5 转录组测序技术及其在非模式物种中的应用 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第2章 凡纳滨对虾免疫样品的制备及转录组测序 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 病原制备 |
| 2.2.4 病原注射及样品收集 |
| 2.2.5 总RNA的提取 |
| 2.2.6 文库构建与二代测序 |
| 2.2.7 转录组数据的分析 |
| 2.2.8 WGCNA分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 数据质控 |
| 2.3.2 组装统计 |
| 2.3.3 差异分析 |
| 2.3.4 基本注释 |
| 2.3.5 WGCNA分析 |
| 2.3.6 小结 |
| 第3章 凡纳滨对虾血细胞响应不同病原刺激的表达特征分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 |
| 3.2.2 半定量PCR |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 差异表达基因统计与验证 |
| 3.3.2 差异表达基因的功能分析 |
| 3.3.3 参与血细胞免疫刺激的差异表达基因的深入分析 |
| 3.3.4 血细胞神经内分泌免疫系统在WSSV感染早期的激活 |
| 3.3.5 小结 |
| 第4章 凡纳滨对虾淋巴器官响应不同病原刺激的表达特征分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 差异表达基因统计与验证 |
| 4.3.2 差异表达基因的功能分析 |
| 4.3.3 参与淋巴器官免疫过程的差异表达基因的深入分析 |
| 4.3.4 小结 |
| 第5章 凡纳滨对虾肝胰腺响应不同病原刺激的表达特征分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂与仪器 |
| 5.2.2 实时荧光定量PCR |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 差异表达基因统计与验证 |
| 5.3.2 差异表达基因的功能分析 |
| 5.3.3 免疫相关基因的深入分析 |
| 5.3.4 小结 |
| 第6章 凡纳滨对虾重组激活基因和免疫致敏相关分子的初步探究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要试剂与仪器 |
| 6.2.2 实验动物 |
| 6.2.3 对虾组织及发育时期样品的收集 |
| 6.2.4 总RNA的提取及cDNA合成 |
| 6.2.5 基因克隆 |
| 6.2.6 生物信息学分析 |
| 6.2.7 载体构建 |
| 6.2.8 无内毒素质粒提取 |
| 6.2.9 亚细胞定位 |
| 6.2.10 实时荧光定量PCR |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 LvRAGs基因的初步探究 |
| 6.3.2 LvDSCAMs基因的初步探究 |
| 6.3.3 LvFREPs基因的初步探究 |
| 6.3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 主要试剂 |
| 附录Ⅱ 主要仪器 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）尼罗罗非鱼对丽鱼三代虫感染的免疫机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 单殖吸虫概述 |
| 1.1.1 单殖吸虫生物学特性 |
| 1.1.2 单殖吸虫研究现状 |
| 1.1.3 单殖吸虫对罗非鱼的危害 |
| 1.2 转录组测序技术的研究进展 |
| 1.2.1 转录组和转录组学 |
| 1.2.2 转录组测序技术发展与研究现状 |
| 1.2.3 转录组测序技术在水产上的应用 |
| 1.3 主要组织相容性复合体(MHC)的研究进展 |
| 1.3.1 MHC基因结构及特点 |
| 1.3.2 MHC的功能 |
| 1.3.3 MHC基因的多态性 |
| 1.3.4 MHC基因在水产动物研究中的应用 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 尼罗罗非鱼感染丽鱼三代虫后的转录组分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 三代虫感染实验 |
| 2.2.5 样品采集与RNA提取 |
| 2.2.6 转录组测序 |
| 2.2.7 转录组数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 三代虫感染统计结果 |
| 2.3.2 转录组三代全长测序结果 |
| 2.3.3 转录组二代测序结果 |
| 2.3.4 三代虫感染过程中差异表达基因分析 |
| 2.3.5 抗感染组与易感组差异表达基因比较分析 |
| 2.3.6 主要免疫相关基因在感染过程中表达变化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 感染丽鱼三代虫后尼罗罗非鱼MHC家族基因的时空表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 MHCⅢ类基因的克隆及序列分析 |
| 3.2.5 三代虫感染实验 |
| 3.2.6 RNA提取与逆转录 |
| 3.2.7 MHC基因时空表达分析 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 MHCⅢ类基因的克隆及序列分析 |
| 3.3.2 MHCⅢ类基因的组织表达分析 |
| 3.3.3 三代虫的感染动态变化 |
| 3.3.4 MHC家族基因在感染三代虫后的表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 尼罗罗非鱼MHC基因多态性与其对丽鱼三代虫易感性的关系 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 强度递增的三代虫感染实验 |
| 4.2.5 样品采集与RNA提取 |
| 4.2.6 多态性片段扩增 |
| 4.2.7 MHC多态性分析 |
| 4.2.8 MHC多态性与丽鱼三代虫易感性关联分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 尼罗罗非鱼易感性群体与抗感染群体的筛选 |
| 4.3.2 MHC多态性片段扩增 |
| 4.3.3 MHC多态性分析 |
| 4.3.4 选择压力检测 |
| 4.3.5 MHC多态性与丽鱼三代虫易感性关联分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 尼罗罗非鱼对丽鱼三代虫易感性相关的MHC等位基因型验证 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.2.4 高强度三代虫感染实验 |
| 5.2.5 MHC等位基因与丽鱼三代虫易感性关联分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 易感群体与抗感染群体的筛选 |
| 5.3.2 MHC等位基因与三代虫易感性的关联分析验证 |
| 5.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 缩略词 |
| 附录2 补充数据 |
| 附录3 在读期间发表的论文与参加的学术会议 |
| 致谢 |
（9）雌性金乌贼脑亚脚叶/嗅叶-视腺-性腺轴转录组及其生殖后死亡的调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 衰老生物学 |
| 2 衰老动物模型 |
| 3 头足类生殖与衰老策略 |
| 3.1 头足类基础生物学 |
| 3.1.1 头足类资源概况 |
| 3.1.2 头足类衰老现象 |
| 3.2 头足类生殖神经内分泌调控研究 |
| 3.2.1 脑亚脚叶/嗅叶-视腺轴的结构与功能 |
| 3.2.2 头足类生殖神经肽种类及其生理作用 |
| 3.2.3 头足类生殖的神经内分泌调控模型 |
| 3.2.4 头足类生殖神经内分泌调控与衰老 |
| 3.3 金乌贼生殖生物学特征 |
| 3.3.1 金乌贼资源概述 |
| 3.3.2 金乌贼人工增养殖 |
| 3.3.3 金乌贼生殖生物学 |
| 4 转录组学概述及其测序技术进展 |
| 4.1 转录组学 |
| 4.2 测序技术的发展进程 |
| 4.3 转录组学测序技术的应用分类 |
| 4.4 头足类的转录组学研究进展 |
| 4.5 转录组学技术及其发展趋势 |
| 5 研究目的与意义 |
| 5.1 目的意义 |
| 5.2 研究内容 |
| 5.3 技术路线 |
| 第二章 雌性金乌贼全长转录本构建与质量评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样本采集和总RNA提取 |
| 1.2 SMRT测序和Illumina测序 |
| 1.2.1 SMRT测序 |
| 1.2.2 Illumina测序 |
| 1.3 SMRT测序数据预处理 |
| 1.4 整合PacBio SMRT测序数据和Illumina测序数据 |
| 1.5 使用BUSCO评估转录组组装质量 |
| 1.6 转录组功能注释、CDS和SSR分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 转录组从头组装 |
| 2.2 BUSCO评估转录组组装结果 |
| 2.3 整合后转录组的注释 |
| 2.4 预测转录本结构 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 雌性金乌贼脑亚脚叶/嗅叶转录组分析及生殖后死亡调控信号通路的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 RNA提取,cDNA文库构建和Illumina深度测序 |
| 1.3 转录组测序装配和注释 |
| 1.4 差异表达基因(DEGs)筛选、GO和KEGG Pathway显着性富集分析 |
| 1.5 定量实时PCR (qRT-PCR)验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 Illumina测序和序列读数装配 |
| 2.2 金乌贼发育过程中脑组织差异表达基因(DEGs) |
| 2.3 差异基因表达模式的聚类分析 |
| 2.4 DEGs的GO功能注释和显着性富集分析 |
| 2.5 DEGs的KEGG注释和显着性富集分析 |
| 2.6 金乌贼不同时期脑组织差异基因的表达验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 金乌贼生活史关键时期脑组织基因表达规律 |
| 3.2 金乌贼生殖后与调控死亡相关的信号通路及关键基因 |
| 3.2.1 泛素介导的蛋白水解 |
| 3.2.2 氧化磷酸化 |
| 3.2.3 mTOR信号通路 |
| 4 小结 |
| 第四章 雌性金乌贼视腺转录组分析及神经肽基因筛查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 RNA提取,cDNA文库构建和Illumina深度测序 |
| 1.3 视腺转录组注释 |
| 1.4 视腺DEGs筛选、GO和KEGG Pathway显着性富集分析 |
| 1.5 qRT-PCR验证 |
| 1.6 金乌贼视腺转录组数据挖掘 |
| 2 结果 |
| 2.1 Illumina测序和序列读数组装 |
| 2.2 金乌贼产卵和产后濒死时期视腺DEGs |
| 2.3 视腺DEGs的GO功能分类和显着性富集分析 |
| 2.4 视腺DEGs的KEGG注释和显着性富集分析 |
| 2.5 金乌贼视腺组织差异基因的表达验证 |
| 2.6 金乌贼视腺神经肽基因的特点 |
| 3 讨论 |
| 3.1 金乌贼产卵和产后濒死时期视腺组织基因表达规律 |
| 3.2 金乌贼视腺神经肽基因家族序列保守性 |
| 4 小结 |
| 第五章 金乌贼卵巢转录组分析及关键信号通路和关键基因筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 RNA提取,cDNA文库构建和Illumina深度测序 |
| 1.3 卵巢转录组注释 |
| 1.4 卵巢DEGs筛选、GO和KEGG Pathway显着性富集分析 |
| 1.5 qRT-PCR验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 卵巢转录组测序结果分析 |
| 2.2 金乌贼卵巢发育过程中DEGs |
| 2.3 卵巢DEGs的GO功能分类和显着性富集分析 |
| 2.4 卵巢DEGs的KEGG注释和显着性富集分析 |
| 2.5 qRT-PCR在金乌贼不同时期卵巢组织中的表达验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 金乌贼生活史三个关键时期卵巢组织基因表达规律 |
| 3.2 与生殖调控有关的信号通路及关键基因 |
| 3.3 与死亡调控有关的信号通路及关键基因 |
| 4 小结 |
| 第六章 金乌贼缠卵腺转录组分析及关键信号通路和关键基因筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 RNA提取,cDNA文库构建和Illumina深度测序 |
| 1.3 缠卵腺转录组注释 |
| 1.4 缠卵腺DEGs筛选、GO和KEGG Pathway显着性富集分析 |
| 1.5 qRT-PCR验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 Illumina测序数据的拼接与组装 |
| 2.2 金乌贼关键时期缠卵腺组织各比较组DEGs |
| 2.3 缠卵腺DEGs的GO分类和富集分析 |
| 2.4 缠卵腺DEGs的KEGG显着性富集分析 |
| 2.5 qRT-PCR在金乌贼不同时期缠卵腺组织中的表达验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 金乌贼三个关键时期缠卵腺组织基因表达规律 |
| 3.2 缠卵腺分泌物中蛋白质消化吸收通路 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（10）拟穴青蟹性腺差异的转录组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 转录组测序的发展与应用 |
| 1.1.1 转录组与转录组学 |
| 1.1.2 测序技术的发展 |
| 1.1.3 转录组测序的应用 |
| 1.2 拟穴青蟹性腺发育相关基因研究进展 |
| 1.2.1 拟穴青蟹简介 |
| 1.2.2 性腺发育研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 1.4 本课题的研究内容与技术路线 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 主要技术路线 |
| 第2章 基于 454 GS FLX高通量测序的拟穴青蟹的性腺转录组分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 样品准备与高通量测序 |
| 2.1.4 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 EST序列分析及拼接组装 |
| 2.2.2 Unigene序列功能注释 |
| 2.2.3 基于Gene Ontology和KEGG分析的功能分类 |
| 2.2.4 分子标记的鉴定 |
| 2.2.5 差异表达基因和特异表达基因的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 拟穴青蟹转录组数据的生物信息学分析 |
| 2.3.2 性腺差异/特异表达基因的分析 |
| 2.3.3 与性腺发育相关的通路 |
| 第3章 性腺发育相关基因的克隆和表达分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 青蟹材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 总RNA的提取及基因组DNA的去除 |
| 3.2.2 SMART-RACE技术获取基因cDNA全长 |
| 3.2.3 割胶回收目的片段 |
| 3.2.4 与载体连接 |
| 3.2.5 转化 |
| 3.2.6 单克隆检测 |
| 3.2.7 生物信息学分析 |
| 3.2.8 实时荧光定量PCR（real-time PCR）反应体系及条件 |
| 3.2.9 石蜡切片 |
| 3.2.10 HE染色 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Sp-OTUB基因克隆与表达分析 |
| 3.3.2 Sp-wds基因克隆与表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 OTUB |
| 3.4.2 wds |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的学术论文和研究成果 |
四、A novel ubiquitin carboxyl terminal hydroase is involved in toad oocyte maturation（论文参考文献）
- [1]肾透明细胞癌自噬相关多组学预后模型的构建研究[D]. 靳毅. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]泛素羧基末端水解酶1基因缺失对雌性小鼠生殖系统发育的影响[J]. 吴比,梁珊珊,阮井玲,黄鑫,滕晓明,洪岭. 实验动物与比较医学, 2020(04)
- [3]内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究[D]. 张仙玉. 湖南农业大学, 2020
- [4]利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质[D]. 梁思佳. 华中农业大学, 2020(01)
- [5]低氧诱导精母细胞凋亡导致精子生成减少的机制[D]. 殷骏. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [6]SMAD4与SIVA1、USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制[D]. 李新宇. 南京农业大学, 2019
- [7]凡纳滨对虾不同免疫组织在弧菌和WSSV免疫刺激早期的响应机制[D]. 王富轩. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2019(01)
- [8]尼罗罗非鱼对丽鱼三代虫感染的免疫机制研究[D]. 陈劲松. 中山大学, 2019(01)
- [9]雌性金乌贼脑亚脚叶/嗅叶-视腺-性腺轴转录组及其生殖后死亡的调控机制[D]. 张金勇. 南京农业大学, 2019
- [10]拟穴青蟹性腺差异的转录组学分析[D]. 高洁. 集美大学, 2013(08)