一、弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究（论文文献综述）
郭晶晶[1]（2019）在《弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究》文中研究说明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种专性细胞内寄生原虫,可感染全世界将近30%的人口。当免疫功能正常的人感染弓形虫后一般没有明显的症状,通常为隐性感染。但它可以由隐性感染状态转变成急性弓形虫病导致免疫功能受损的个体（如艾滋病患者）出现严重症状。另一个弓形虫的致命威胁是对胎儿的垂直传播,这可能导致自然流产、新生儿畸形等严重后果。由于没有合适的药物可以杀死包囊内的缓殖子,而磺胺嘧啶等西药也只能对急性感染后14天的虫体起作用,所以目前还没有办法控制这种疾病的传播。因此,先发制人的疫苗具有比现有的抗虫药物极为明显的优势。迄今为止,传统弓形虫疫苗的开发策略主要集中在亚单位疫苗和DNA疫苗上。但这两者都有一些问题,比如亚单位疫苗稳定性差并且可能引起不必要的免疫反应,而DNA疫苗具有整合到宿主细胞基因组中的理论风险。基于肽的疫苗可以克服这些弱点。他们使用最小的抗原表位来诱导所需的免疫反应,因此不太可能会引发过敏或自身免疫反应。因此,近年来基于肽的疫苗引起了越来越多人的关注。由于刚地弓形虫是一种生活史非常复杂的胞内寄生虫,因此合成含有多个不同表位的多抗原肽疫苗（Multiple antigenic peptide,MAP）可能是开发弓形虫疫苗一个有效的手段。理想的抵抗弓形虫的疫苗首先应该包括可以引发宿主Th1型免疫反应的抗原表位,该免疫反应的特征在于可以产生干扰素IFN-y,并对被感染的宿主细胞产生持久稳定的细胞毒性作用。小鼠CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CD8+cytotoxic T lymphocyte,CTL）介导的对脑内弓形虫包囊的抵抗作用,取决于其主要组织相容性复合体MHC Ⅰ类分子的Ld等位基因。弓形虫的分泌蛋白质如致密颗粒（Dense granules,GRAs）和棒状体蛋白（Rhoptry proteins,ROPs）是被小鼠 CD8+T淋巴细胞所识别的抗原蛋白,同时也是抗虫疫苗重要的候选抗原蛋白。来源于GRA6 的肽（HPGSVNEFDF）（HF10）,和来源于 ROP7 的肽（IPAAAGRFF）,是小鼠的保护性免疫显性Ld限制性表位。抗体在宿主对弓形虫的免疫中也起着重要作用,它们能直接阻断速殖子并损害其与宿主细胞的附着。SAG1是在速殖子的侵袭过程中最早与宿主细胞黏附的表面抗原蛋白,其免疫原性非常强,是B细胞表位最合适的抗原蛋白来源。SAG182-103是一个具有高度免疫原性的构象B细胞表位,但由于之前缺乏合适的载体来维持其原有的空间构象,因此一直以来未被视为疫苗候选分子。SAG1301-320是一个线性B细胞表位,可以保护小鼠免受弓形虫致命的攻击感染,而且能被弓形虫病患者的血清强烈识别出来。此外,CD4+T细胞也是感染弓形虫后机体免疫应答的重要组成部分。研究发现AS15是一个Ab限制性的CD4+T细胞表位,可以激发机体产生针对弓形虫特异性的免疫反应。弓形虫根据其毒力的差异可主要分为三个克隆谱系。Ⅰ型、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅱ型虫株通常与人类疾病有关,Ⅲ型虫株似乎在动物身上更为常见。上述这几个表位中的大多数在Ⅰ型和Ⅱ型虫株之间是高度保守的。弓形虫的生活史非常复杂,因此我们选择了 B细胞表位（SAG1 82-102或SAG1 301-320）,CD8+T 细胞表位（HF10 或 ROP7）和 CD4+T 细胞表位（AS15）作为弓形虫多抗原肽疫苗的候选表位肽。虽然MAP疫苗具有诸多优势,但是也并非没有缺点。例如,肽段本身的免疫原性不是很强,需要递送系统或佐剂的帮助。而且它们跟天然折叠的蛋白质相比,非常容易受到酶促降解的影响,缺乏稳定性。因此,为上述多抗原肽疫苗寻找合适高效的载体变的尤为重要。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是由病毒的结构蛋白形成的多种纳米颗粒（大小为20-100nm直径）,并且可以在体外自我组装。它们类似于病毒,但是由于缺乏病毒的遗传物质,不能在机体内复制,因而没有传染性。VLPs模拟了天然病毒的三维构象,可在其表面递呈高密度重复的外源抗原表位,从而诱导机体产生所需的体液和细胞免疫反应。近年来,VLPs已是生产传染病疫苗载体的绝佳选择,已经有多种VLPs疫苗投入市场使用。然而,目前对弓形虫的VLPs疫苗的研究还非常少,需要更多的努力来填补这一具有广阔发展前景的研究领域的空白。乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBc）作为VLPs平台已被广泛应用多年。它可在许多重组基因表达系统中高度表达,包括原核表达系统,并且易于在体外自我组装。HBc颗粒的表面具有位于“刺突”顶端的主要免疫显性区域（Major immune dominant region,MIR）,作为载体这种结构不仅能保持外源B细胞构象表位正确的空间构象,而且可以通过高度重复、适当间隔的方式呈现外源的构象和线性表位,能够极大地改善其颗粒表面上递呈的外源抗原表位的免疫原性。多种来自细菌、病毒和原生动物的外源抗原已被插入到HBc颗粒中构建了 HBc-抗原融合蛋白,其中的一些已达到临床试验阶段。鉴于此,将弓形虫多抗原肽加载到HBc颗粒上构建的嵌合VLPs疫苗,有望发展成一种经济高效的抗虫疫苗。研究目的1、将构象B细胞表位,Ld限制性CD8+T细胞表位和Ab限制性CD4+T细胞表位加载到HBc病毒样颗粒上,以探索这种新型弓形虫疫苗制剂方案的可行性。2、通过急性和慢性弓形虫小鼠感染模型全方面地评估此嵌合HBc病毒样颗粒疫苗产生的抵抗弓形虫感染的免疫保护力。研究方法1、构建、纯化及鉴定嵌合HBc病毒样颗粒本研究将弓形虫CD8+T细胞表位（HF10或ROP7）和B细胞表位（SAG182-102或SAG1301-320）的基因序列插入到截断HBc颗粒HBcΔ 78和79位氨基酸的基因序列之间,两端加上谷氨酰胺（Q）和天冬氨酸Asp（D）的连接子,再将CD4+T细胞表位（AS15）加在HBcΔ的C端末尾,这些复合基因与原核表达质粒pET-30a（+）连接后,构建了嵌合HBc病毒样颗粒的重组质粒:pET-30a（+）/HBcΔ,HBcAH82,HBcAH301,HBcAR82和HBcΔR301。重组质粒经过扩增和鉴定后,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导表达后,收集嵌合的HBc病毒样颗粒蛋白（HBcΔ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcΔR82和HBcΔR301）。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定目的蛋白,并分析是可溶性蛋白还是包涵体沉淀。诱导嵌合HBc病毒样颗粒大量表达后,对以可溶性状态存在的HBcΔ蛋白直接通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化,透析浓缩后收集目的蛋白;而对以包涵体沉淀状态存在的嵌合蛋白HBcΔH82,HBcAH301,HBcAR82和HBcΔR301,则先要通过含有尿素的裂解液溶解包涵体沉淀,通过镍柱纯化后,再进行梯度透析复性,从而得到正确折叠组装的嵌合HBc病毒样颗粒。嵌合HBc病毒样颗粒都含有His-Tag标签蛋白,可以与His单克隆抗体结合,并通过蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）鉴定出来。最后通过透射电镜观察分析嵌合HBc病毒样颗粒是否形成二十面体的病毒结构。2、评估嵌合HBc病毒样颗粒疫苗的免疫原性使用凝胶法鲎试剂检测嵌合蛋白中内毒素的含量。合成含有CD8+T细胞表位（HF10 或 ROP7）,B 细胞表位（SAG182-102 或 SAG1301-320）和 CD4+T 细胞表位（AS15）的四个复合抗原表位肽,即H82,H301,R82和R301。将BALB/c实验小鼠随机分成10组,每组23只小鼠,分别在小鼠皮下多点注射50μg重组蛋白（HBcΔ,H82,HBcΔH82,H301,HBcΔH301,R82,HBcΔR82,R301,HBcΔR301）或者50μl的PBS缓冲液。疫苗接种每隔两周加强一次,一共进行3次接种。在首次免疫后0,2,4和6周分别采集免疫小鼠的血清,通过ELISA检测其血清中IgG抗体水平,利用第一次免疫后6周收集的血清测定小鼠IgG1和IgG2a水平。同时每组取3只小鼠制备脾细胞悬液,通过流式细胞术检测其脾细胞中CD4+和CD8+T淋巴细胞分别占的比例,另外将脾细胞经过重组蛋白或ConA刺激后,收集细胞的培养上清液,用ELISA试剂盒检测其细胞因子IL-2和IL-4（培养24h）,IL-10（培养 72h）,IFN-γ（培养 96h）的浓度。在末次免疫后2周,将每组10只小鼠腹腔注射200个弓形虫RH株速殖子攻击感染,每日密切观察实验小鼠的状态,准确记录各组小鼠的死亡日期,并绘制相应的生存曲线。每组另外的10只小鼠以灌胃的方式口饲感染30个PRU株包囊,每天观察小鼠的状态,45日后,取出它们的脑组织制备脑匀浆,光学显微镜下观察并估算出每只小鼠脑内的包囊数。结果1、嵌合HBc病毒样颗粒构建成功通过重组质粒（pET-30a（+）/HBcΔ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcΔR82 和 HBcΔR301）的双酶切和琼脂糖凝胶电泳实验的鉴定,发现复合的嵌合HBc病毒样颗粒的基因片段已经正确地插入到原核表达质粒pET-30a（+）中,表明重组质粒构建成功。无论是可溶性蛋白HBcΔ,还是包涵体蛋白HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82和HBcΔR301,都通过Ni-NTA琼脂糖凝胶获得了较高纯度的嵌合HBc病毒样颗粒蛋白。通过Western Blot和透射电镜分析,表明携带His标签的弓形虫嵌合HBc VLPs在原核表达系统中表达成功,并且可以在体外组装成完好的病毒样颗粒,嵌合的HBc病毒样颗粒蛋白（HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82和HBcΔR301）形成了类似于原始非嵌合HBc病毒样颗粒（HBcΔ）的二十面体形态,保证了弓形虫的B细胞表位维持了其正确的空间构象,并且密集均匀地在颗粒表面呈现了虫体来源的所有抗原表位,这为接下来其诱导小鼠产生弓形虫特异性的体液和细胞免疫应答打牢物质基础。2、嵌合HBc病毒样颗粒疫苗具有很强的免疫保护性早在第二次免疫接种后,用HBcΔH82和HBcΔR82蛋白免疫的小鼠就可以检测到明显升高的IgG抗体水平（p<0.01）;在第三次接种后,这两种蛋白质更是诱导了最高的IgG抗体水平（p<0.001）。与对照组相比,只有用HBcΔH82蛋白免疫的小鼠同时具有较高的IgG1和IgG2a抗体滴度（p<0.05）。此外几乎所有的免疫组小鼠的血清中IgG1/IgG2a的比值都小于1,以上结果说明嵌合HBc病毒样颗粒疫苗在实验小鼠体内诱导了以Th1型为主的特异性免疫应答。用含有弓形虫CD4+T细胞表位（AS15）的重组蛋白（H82,HBcΔH82,H301,HBcAH301,R82,HBcΔR82,R301和HBcAR301）免疫的小鼠脾细胞中CD4+T细胞的数量较对照组都有明显的增高（P<0.05）,尤其是当其加载到HBc病毒样颗粒上之后（p<0.01）。除了接种PBS和HBcΔ的小鼠,其它重组蛋白免疫的小鼠体内CD8+T细胞的含量都有不同程度的增加,特别是对于用含有HF10表位的嵌合HBc病毒样颗粒（HBcAH82和HBcΔH301）免疫的小鼠（p<0.001）。用重组蛋白 HBcΔH82 和 HBcAH301（p<0.001）,HBcΔR82 HBcΔR301（p<0.01）以及复合抗原表位肽（H82,H301,R82和R301）（p<0.05）免疫的小鼠脾细胞培养上清液中IFN-y的水平均明显高于对照组。用HBcΔH82（p<0.001）和HBcΔH301（p<0.01）疫苗接种的小鼠具有更高的IL-2水平。而对于IL-4和IL-10,仅在用HBcΔH82蛋白免疫的小鼠中观察到了轻微升高的细胞因子浓度。用嵌合 HBc 病毒样颗粒 HBcΔH82（15.6±3.8 天）（χ2=20.13,p<0.001）,HBcΔH301（8.1±1.5 天）（χ2=14.09,p<0.01）,HBcΔR82（8.8±1.3 天）（χ2=17.83,p<0.001）和HBcΔR301（6.6±1.2天）（χ2=4.32,p<0.05）接种的小鼠的生存时间较对照组小鼠均有一定程度的延长,尤其是HBcAH82蛋白,甚至观察到最长20天的存活时间。用 HBcAH82（1454±239;p<0.01）和 HBcAH301（173 0±230;p<0.05）蛋白接种的小鼠具有比对照组小鼠（2091±263）显着减少的脑内包囊数量,包囊的减少率分别为30.5%和17.3%。结论1、嵌合 HBc 病毒样颗粒（HBcδ,HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82 和 HBcδR301）可以在大肠杆菌中成功表达出与非嵌合得HBc病毒样颗粒（HBcΔ）相似的二十面体的病毒结构,正确且密集地在病毒颗粒表面呈现弓形虫的构象B细胞表位和线性T细胞表位。2、嵌合 HBc 病毒样颗粒（HBcδ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcδR82 和 HBcΔR301）疫苗具有很强的免疫原性。特别是用HBcΔH82蛋白免疫接种的小鼠体内产生了强烈的虫体特异性的体液和细胞免疫应答,起到了抵抗急性和慢性弓形虫病的作用,是一种全新有效的抵抗弓形虫感染的疫苗制剂方案。创新性和意义创新性:本研究首次构建了含有弓形虫SAG1构象B细胞表位的疫苗,并且首次将含有构象B表位,Ld限制性CD8+T细胞表位和Ab限制性CD4+T细胞表位的多抗原肽疫苗加载到乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒上,证明了弓形虫的这种新型疫苗制剂是可以构建成功的。意义:本研究提供了一种全新有效的对抗弓形虫感染的疫苗制剂方案,可以对研发安全、有效、经济、保护力强的弓形虫疫苗提供重要参考,为弓形虫病的防治奠定理论和实验基础。
刘亭岐[2]（2018）在《巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究》文中研究指明鸡球虫病是家禽的肠道胞内寄生原虫病。该病严重影响饲料转化效率,所以造成严重的损失。鸡球虫病目前基本通过使用化学药物进行预防治疗,然而,随着耐药性的产生和食品安全问题日益突出,有效的疫苗预防措施备受关注。本研究选取了四种巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）侵入过程相关的蛋白,进行克隆、表达并评价其免疫保护力,旨在为发现新抗原以及评价其对宿主在抗巨型艾美耳球虫感染过程中所产生的免疫保护力,提供新型疫苗候选保护性抗原。1.巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的分子特性研究及免疫保护性研究评估本章研究成功扩增了E.maxima表面蛋白（EmSAG）的开放阅读框（ORF）,序列分析后发现该基因由645对碱基所组成,编码214个氨基酸。随后,将EmSAG基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。激光共聚焦试验结果证实,EmSAG在巨型艾美耳球虫的子孢子表面分布,试验结果同时发现EmSAG也存在于裂殖子的表面。动物实验证实,rEmSAG和pVAX1-SAG都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmSAG疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmSAG免疫组中CD4+T和CD8+T细胞的百分含量均显着增高（P<0.05）。试验发现,与PBS,pET-32a（+）和pVAX1对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡血清中抗EmSAG特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IL-4、IL-17、IFN-y与TGF-β含量显着增加（P<0.05）。本章研究结果表明,EmSAG可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供参考。2.巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima延伸因子2（elongation factor 2,EmEF2）完整的开放阅读框（ORF）,序列分析后发现该基因由2499对碱基组成,编码832个氨基酸。随后,将EmEF2基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmEF2和pVAX1-EF2都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmEF2疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmEF2免疫组中CD4+T细胞的百分含量显着增高（P<0.05）。试验发现,与PBS、pET-32a（+）和pVAX1对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡血清中抗EmEF2特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ,TGF-β含量显着增加（P<0.05）。这些结果表明,EmEF可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供备选抗原。3.巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima14-3-3基因（Em14-3-3）完整的开放阅读框（ORF）,序列分析发现该基因由861bp对碱基组成,编码286个氨基酸。随后,将Em14-3-3基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。使用激光共聚焦试验对Em14-3-3进行亚细胞定位,试验结果表明Em14-3-3在巨型艾美耳球虫的子孢子和裂殖子阶段都有表达。动物试验证实,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。Em14-3-3疫苗可增加雏鸡的卵囊减少率,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组相比,Em14-3-3免疫组中CD4+T细胞的百分含量显着增高（P<0.05）。与 PB S、pET-32a（+）和 pVAX 1 对照组雏鸡相比,rEm 14-3-3 和 pVAX 1-14-3-3免疫组的雏鸡,抗Em14-3-3特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ和TGF-β水平显着增加（P<0.05）。这些结果表明,Em14-3-3可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为新型巨型艾美耳球虫疫苗的研发打下基础。4.巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因分子特性及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima棒状蛋白（EmRON）的开放阅读框（ORF）,序列分析发现该基因由2475对碱基组成,编码824个氨基酸。随后,将EmRON基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmRON和pVAX1-RON都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmRON疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组雏鸡相比,EmRON免疫组中CD4+T细胞的的百分含量显着增高（P<0.05）。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1对照相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,抗EmRON特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IFN-γ,TGF-β和IL-4水平显着增加（P<0.05）。这些结果表明,EmRON可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为巨型艾美耳球虫疫苗的研发提供候选抗原。
蒋子阳,董锴,戴红,王梦秋,刘灿,陈建平[3]（2018）在《弓形虫疫苗研究进展》文中认为弓形虫是一种有核细胞专性寄生虫,可引起人兽共患病——弓形虫病,弓形虫疫苗是防控此病的关键。本文就国内外研究的现状,简要介绍了弓形虫排泄分泌抗原（E/SA）疫苗、全虫疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗和基因工程疫苗的研究情况,希望可为有效控制弓形虫病提供参考。
王帅[4]（2015）在《鸡源弓形虫治疗药物的筛选及弓形虫排泄分泌抗原巨噬细胞结合分子的鉴定和功能研究》文中研究指明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生虫,能够感染多种哺乳动物和鸟类,并引发弓形虫病（Toxoplasmosis）。全世界有近三分之一的人感染弓形虫。免疫功能不全的病人感染弓形虫后将会引起生命危险,先天性感染会引起胎儿流产或死胎。此外,一些精神疾病的发生也与弓形虫感染有关。弓形虫病对畜牧业的危害也很大,怀孕期间的羊和猪感染弓形虫后,经常导致流产、死胎,造成相当大的经济损失。鸡作为弓形虫的一种不敏感宿主,一直以来鸡弓形虫病因为其大多数为隐性感染而未受到足够的重视。然而,散养鸡群的弓形虫感染率极高,加上弓形虫能够在鸡体内长时间存活,摄入被弓形虫污染的鸡肉可能会导致人和其他动物的感染。目前,有关鸡弓形虫病的研究主要集中在流行病学调查和基因型分析等方面。然而,鸡的日龄与弓形虫感染之间的关系很少有报道。同时,有关鸡弓形虫病的药物治疗几乎没有报道。为了寻找最合适的日龄用于鸡弓形虫病模型的建立,在此基础上再进行治疗鸡弓形虫病的药物筛选,为鸡弓形虫病模型的建立和鸡弓形虫病的防治奠定基础,特进行了如下研究:1.两种不同来源弓形虫虫株对不同日龄雏鸡的致病性比较本研究拟通过弓形虫虫株对不同日龄雏鸡的致病性比较,探讨弓形虫的致病性与感染日龄的关系,确定用于急、慢性鸡弓形虫病模型建立最合适的日龄。分别用RH和JS两个弓形虫虫株的速殖子按照1×108个/羽的剂量腹腔感染7、14、21、28日龄雏鸡,同时设阴性对照组,仅注射生理盐水;攻虫后每日观察实验鸡的临床症状,记录每组鸡的死亡情况;利用ELISA方法检测各组实验鸡的弓形虫循环抗原（T.gondii circulating antigens,TCA）和弓形虫循环抗体（T.gondii circulating antibodies,TCAb）,PCR方法对53天未死亡的鸡进行检测,对急性死亡和53天未死亡的鸡进行病理组织切片,观察组织病变。结果发现,7日龄组雏鸡感染弓形虫后多呈急性死亡,JS株的死亡率（100%）显着高于RH株（70%）;14日龄组雏鸡感染后有轻微临床症状,但无死亡;21、28日龄组实验鸡感染JS株和RH株后均未出现临床症状和死亡。所有实验组的TCA和TCAb分别在感染后第4天和第11天转为阳性。21日龄组（RH株）和28日龄组的（RH株和JS株）的TCA和TCAb早于其它实验组降到阴性水平。7、14、21日龄组存活的鸡均可检测到弓形虫特异性DNA。28日龄组,RH株和JS株分别有3只和1只为PCR阴性。研究结果表明,雏鸡的日龄对弓形虫的致病性具有重要的影响,且日龄越小,弓形虫的致病性越强。7至14日龄的雏鸡可用于急性鸡弓形虫病模型的建立;14至28日龄的雏鸡可用于慢性鸡弓形虫病模型的建立。2.鸡源弓形虫治疗药物的筛选为了筛选能有效治疗鸡弓形虫病的药物,本研究首先利用ICR品系小鼠模型进行药物初筛,在此基础上,挑选抗小鼠弓形虫感染效果最好、中等、较差的三种药物或药物配伍治疗鸡弓形虫感染并做出合理评价。用刚地弓形虫RH和JS株速殖子,按1×104/鼠和1×108/鸡分别腹腔接种小鼠和鸡,接种后4 h用药组通过灌服或饮水给药,连续用药5d,接种后20d或10d结束实验,根据存活率、平均存活时间等指标得出疗效。结果发现,在抗小鼠弓形虫感染试验中,磺胺氯吡嗪钠+甲氧苄啶组治疗效果最佳,阿奇霉素次之,其余药物抗弓形虫作用不明显。在抗鸡弓形虫感染试验中,阿奇霉素和磺胺氯吡嗪钠+甲氧苄啶组均能显着提高雏鸡的存活率,前者（44.4%）略高于磺胺氯吡嗪钠+甲氧苄啶组（33.3%）,但两者无明显差异（P>0.05）。研究结果表明,阿奇霉素和磺胺氯吡嗪钠联合甲氧苄啶对鸡弓形虫感染有明显治疗效果。弓形虫排泄分泌抗原（excretory/secretory antigens,ESA）在弓形虫入侵宿主的早期就开始分泌,在入侵过程中发挥重要作用。由于排泄分泌抗原具有很好的免疫原性,现已广泛用于弓形虫病的诊断。免疫排泄分泌抗原可诱导机体产生强烈的体液、细胞免疫应答反应,可用于弓形虫病的免疫预防。此外,ESA还具有抗肿瘤等重要作用。到目前为止,有关弓形虫排泄分泌抗原对宿主细胞的调节作用的研究还相对较少,对巨噬细胞的调节作用研究几乎没有;同时分析和鉴定结合宿主细胞的排泄分泌抗原,对于进一步理解排泄分泌抗原的功能以及其如何发挥作用的机制是至关重要的。因此,我们进行了以下研究:3.弓形虫排泄分泌抗原对小鼠巨噬细胞免疫功能调节研究本部分研究旨在观察弓形虫排泄分泌抗原对小鼠单核巨噬细胞Ana-1免疫功能的影响。用不同浓度的弓形虫排泄分泌抗原分别与小鼠巨噬细胞Ana-1共培养,观察不同处理对Ana-1细胞增殖和吞噬的影响,用ELISA检测不同处理后的Ana-1细胞上清中IL-1β、IL-10、TNF-α和TGF-β1的表达,并用流式细胞术检测作用后的Ana-1细胞表面Toll样受体分子表达水平的变化以及是否促进细胞的凋亡。结果显示,弓形虫排泄分泌抗原能够显着抑制小鼠巨噬细胞的增殖和吞噬功能,并显着诱导细胞产生凋亡。ESA作用Ana-1巨噬细胞后,下调了细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌,同时上调了细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌。ESA作用Ana-1巨噬细胞后,Ana-1细胞表面的Toll样受体2和4的活化受到抑制,NO的分泌也受到抑制。此外,弓形虫ESA可以抑制LPS诱导的Ana-1巨噬细胞中NF-κB的激活。结果表明,弓形虫ESA在体外可显着调节Ana-1细胞的免疫功能。4.弓形虫排泄分泌抗原小鼠巨噬细胞结合分子的鉴定本研究的目的是鉴定刚地弓形虫排泄分泌抗原中能与小鼠巨噬细胞（Ana-1细胞）结合的分子,并分析其蛋白功能。ESA与Ana-1细胞孵育后,免疫荧光试验检测ESA与Ana-1细胞的结合情况。通过免疫共沉淀试验来收集与Ana-1细胞结合的ESA,用鸟枪法--液相色谱质谱/质谱联用（shotgunLC-MS/MS）进行蛋白的质谱鉴定,并用生物信息学分析其功能。结果表明,ESA能够结合到Ana-1细胞的表面,其中共有109种弓形虫蛋白被鉴定。生物信息学分析显示,共有57种蛋白被成功功能注释,其中40种（70.2%）蛋白有结合活性,31种（54.4%）蛋白有催化活性。这些蛋白可能参与到宿主细胞的入侵以及宿主细胞的功能调节过程中。这些研究结果为我们进一步了解弓形虫和宿主细胞--巨噬细胞之间的相互作用关系奠定基础,同时也为更好的阐明弓形虫致病的分子机制提供依据。5.刚地弓形虫TgEF-1α和TgESA10基因的克隆、表达及免疫保护性研究从上述鉴定的蛋白中选取弓形虫延伸因子-1α（elongation factor-1 alpha,EF-1α）和10 kDa排泄分泌抗原（10 kDa excretory-secretory antigen,ESA10）,进行TgEF-1α和TgESA10基因的克隆、表达及免疫保护性研究。利用PCR技术扩增到TgEF-1α基因（GenBank accession:XM002370208.1）和TgESA10基因（GenBank accession:HM014013.1）。序列分析表明TgEF-1α基因的ORF含1347 bp,编码448个氨基酸,理论分子量49.04 kDa;TgESA10基因的OR/F含390 bp,编码130个氨基酸,理论分子量14.69kDa。构建原核表达质粒pET32a（+）-EF-1α和pET32a（+）-ESA10,均在大肠杆菌BL21（DE3）中成功获得了表达,重组蛋白rTgEF-1α以包涵体形式存在,重组蛋白rTgESA10存在于上清中。Western印迹显示表达的重组蛋白rTgEF-1α和rTgESA10,均能被感染弓形虫的鸡血清所识别,并且能检测到天然状态下这两种蛋白的存在。小鼠分别被动免疫抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗体后感染弓形虫速殖子,小鼠的存活时间均显着延长。分别用抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗体作用过的弓形虫速殖子感染小鼠后,小鼠的存活时间均显着延长;分别用抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗体作用过的弓形虫速殖子感染小鼠巨噬细胞,阳性巨噬细胞感染数和细胞内速殖子量均显着减少。动物保护实验的结果显示,BALB/c小鼠免疫重组蛋白rTgEF-1α和rTgESA10后,小鼠体内均产生高水平的抗弓形虫抗体、干扰素-γ、白细胞介素-4;CD4+和CD8+T细胞的百分比以及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的表达水平显着增加（P<0.05）;感染弓形虫RH株速殖子后,对照组小鼠均在8天之内死亡,rTgEF-1α蛋白免疫组小鼠的存活时间显着延长至14.53±1.72天（P<0.05）,rTgESA10蛋白免疫组小鼠的存活时间显着延长至14.13±1.63天（P<0.05）。这些结果表明,TgEF-1α和TgESA10均在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥重要作用,并能够激起小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答,可以作为预防治疗弓形虫病的蛋白疫苗候选分子。6.刚地弓形虫TgEF-1α基因和TgESA10基因DNA疫苗的构建及免疫保护性研究本部分研究分别构建了弓形虫pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10 DNA疫苗,并评价了其对急性弓形虫病的免疫保护性。结果发现,单独免疫pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10的小鼠,体内均产生高水平的抗弓形虫抗体、干扰素-γ、白细胞介素-4和白细胞介素-17;CD4+和CD8+T细胞的百分比以及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的表达水平均显着增加（P<0.05）。感染弓形虫RH株速殖子后,对照组小鼠均在8天之内死亡,pVAX-EF-1α免疫组小鼠的存活时间显着延长至14.1±1.7天（P<0.05）,pVAX-ESA10免疫组小鼠的存活时间显着延长至14.3±1.7天（P<0.05）。这些结果表明,DNA疫苗pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10均能够激起小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答,并且对小鼠急性弓形虫感染产生部分免疫保护力,这表明TgEF-1α和TgESA10可以作为预防治疗弓形虫病的DNA疫苗候选分子。7.四种弓形虫重组蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1调节小鼠巨噬细胞免疫功能的研究本部分研究先进行了弓形虫钙依赖蛋白激酶1（calcium-dependent protein kinase 1,CDPK1）和14-3-3蛋白（14-3-3）的基因克隆、表达和纯化,然后观察四种弓形虫重组蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1对小鼠单核巨噬细胞Ana-1免疫功能的影响。分别用不同浓度的rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1与小鼠巨噬细胞Ana-1共培养,观察不同处理对Ana-1细胞增殖和吞噬的影响,用ELISA检测不同处理后的Ana-1细胞上清中IL-1β、IL-10、TNF-α和TGF-β1的表达,并用流式细胞术检测作用后的Ana-1细胞表面Toll样受体分子表达水平的变化以及是否促进细胞的凋亡。结果显示,rTgESA10、rTg14-3-3和rTgCDPK1刺激Ana-1细胞后,细胞的增殖均受到显着抑制;rTgEF-1α对Ana-1细胞的增殖活性几乎没有影响。Ana-1细胞经rTgESA10刺激后,细胞呑噬FITC-dextran的能力显着增加;经rTg14-3-3和rTgCDPK1刺激后,细胞吞噬FITC-dextran的能力均显着下降;rTgEF-1α对Ana-1细胞吞噬功能的影响较小。高浓度的rTgESA10和不同浓度的rTg14-3-3和rTgCDPK1均可以显着诱导Ana-1细胞发生早期凋亡和晚期凋亡;rTgEF-1α对细胞凋亡没有明显影响。高浓度的rTgESA10和不同浓度的rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1作用Ana-1巨噬细胞后,均促进了细胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β1和IL-10的分泌。除个别剂量组外,四种重组蛋白均能活化Ana-1细胞表面的TLR2,rTgESA10和rTgEF-1α均能活化Ana-1细胞表面的TLR4。结果表明,四种弓形虫重组蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1在体外均可显着调节Ana-1细胞的免疫功能。
赵盛,张奇雪,张保德,王圆圆,苑文英[5]（2014）在《弓形虫复合基因疫苗研究进展》文中研究说明弓形虫疫苗包括全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、DNA疫苗、基因工程疫苗,现阶段研究较多的是后两种,由原来的单一疫苗向复合疫苗发展,复合疫苗有多种联合方式:表面抗原联合、表面抗原与分泌抗原联合、其他类型抗原联合,疫苗免疫效力低下的缺点可采用有效免疫方式或使用佐剂提高效果。
闵娟[6]（2012）在《弓形虫致密颗粒抗原GRA7疫苗初免—加强免疫策略增强小鼠抗弓形虫感染的免疫保护性研究》文中研究表明弓形虫是一种细胞内寄生的原虫,可感染包括人在内所有温血脊椎动物的有核细胞,引起人兽共患弓形虫病,严重威胁着人类健康和畜牧业生产。目前为止,尚无有效的治疗药物。鉴于疫苗防治多种疾病的经验,研制安全有效的抗弓形虫疫苗不失为一种具有潜力的防治措施。为此,本研究制备了弓形虫致密颗粒抗原GRA7的DNA疫苗和蛋白疫苗,将其接种于BALB/c小鼠,评价疫苗的免疫效果,并观察异质性prime-boost免疫策略对小鼠免疫应答的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗及优化免疫方案奠定基础。目的：构建编码弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核表达质粒pEGFP-GRA7和原核表达质粒pET30-GRA7,分别制备弓形虫GRA7的DNA疫苗和蛋白质疫苗,评价疫苗的免疫效果,观察prime-boost免疫策略对小鼠免疫应答的影响。方法：采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增弓形虫致密颗粒抗原GRA7基因,回收PCR产物,将其连接至克隆载体pEASY-T1中,构建克隆载体pEASY-GRA7,分别进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。采用亚克隆技术将GRA7基因分别克隆至真核表达载体pEGFP-C1和原核表达载体pET-30a（+）中,分别构建能表达GRA7的重组真核表达载体pEGFP-GRA7和重组原核表达载体pET30-GRA7,并对它们进行鉴定。将pEGFP-GRA7转染HFF细胞,经荧光显微镜观察、SDS-PAGE和Western blotting分析、鉴定后,大量提取重组质粒pEGFP-GRA7用于制备弓形虫GRA7DNA疫苗。将pET30-GRA7转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,采用镍柱亲和层析法纯化GRA7蛋白,SDS-PAGE和VWestern blotting分析鉴定后,制备弓形虫GRA7重组蛋白疫苗。动物实验观察疫苗的免疫效果,同时评价异质性prime-boost免疫策略对BALB/c小鼠免疫应答的影响。结果：经PCR体外扩增获得GRA7基因片段,大小为708bp。重组真核表达质粒pEGFP-GRA7经菌落PCR、双酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示在708bp处有一特异性条带,与预期GRA7目的基因片段大小一致；DNA测序结果显示目的基因片段GRA7准确插入真核表达质粒中。pEGFP-GRA7转染的HFF细胞经荧光显微镜观察、SDS-PAGE和Western blotting分析,均能检测到GRA7蛋白的表达。重组原核表达质粒pET30-GRA7经菌落PCR、双酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示在708bp处有一特异性条带,与预期GRA7目的基因片段大小一致；DNA测序结果显示目的基因片段GRA7准确插入原核表达质粒中。pET30-GRA7转入E.coli BL21诱导产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,可检测到GRA7蛋白的表达。采用异质性prime-boost免疫策略接种BALB/c小鼠,其中DNA疫苗初免-蛋白加强免疫组小鼠抗弓形虫IgG、IgG2a和IFN-γ水平均高于其它实验组（P<0.05）,而各组间IL-4和IL-10水平差异无显着性。结论：体外扩增弓形虫致密颗粒抗原GRA7基因并亚克隆到表达载体中,成功制备了弓形虫GRA7的DNA疫苗和蛋白疫苗。采用DNA疫苗初免-蛋白加强免疫策略可诱导小鼠较强的抗GRA7的体液免疫和细胞免疫,显着增强小鼠抗弓形虫感染的保护作用。
白杨,何深一[7]（2011）在《弓形虫主要抗原及核酸疫苗研究进展》文中研究说明弓形虫分布广泛,且人畜感染弓形虫会带来很严重的后果,所以弓形虫病的防治一直困扰着各国学者。近年来,随着对弓形虫研究的深入以及分子生物学的发展,弓形虫核酸疫苗的研究也取得了较大的进展。本文综述了弓形虫主要抗原以及弓形虫核酸疫苗的研究现状,探索弓形虫疫苗的发展前景,并对核酸疫苗的优缺点进行讨论。
李运娜,黄金贵,张西臣[8]（2011）在《弓形虫病疫苗研究进展概述》文中研究表明弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,能引起人畜共患弓形虫病,严重威胁着人类健康且对畜牧业的发展造成巨大的经济损失。研制安全有效的疫苗是防制弓形虫病的策略之一。目前,弓形虫病疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗和卡介苗。本文对弓形虫病疫苗的研究现状进行了综述。
芦赟,付宝权,赵晋军,蔡元,田斌,张德林[9]（2011）在《弓形虫疫苗的研究进展》文中指出结合国内外对弓形虫疫苗的最新研究结果,对各种弓形虫疫苗（包括全虫疫苗、排泄分泌抗原疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗）及其优缺点进行了综述,旨在为有效控制弓形虫病提供参考。
曹丽艳[10]（2009）在《弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定》文中研究表明弓形虫（Toxoplasma gondii）为专性细胞内寄生原虫,能引起人兽共患弓形虫病,严重危害人类健康和畜牧业发展。弓形虫表面抗原1 （surface antigen 1,SAG1）是位于弓形虫速殖子表面的特异性蛋白,也是最早被克隆测序的弓形虫表面蛋白,SAG1因为在诊断和免疫中具有双重价值而得到广泛研究。根据GenBank数据库中的弓形虫RH株表面抗原1（SAG1）基因序列设计1对引物,应用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增SAG1基因片段,克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-SAG1。测序结果表明获得1011 bp的SAG1基因片段,编码336个氨基酸,与已知的SAG1基因核苷酸序列（序列号S76248）及其编码氨基酸序列的同源性分别为98.9%、97.3%。重新设计一对从SAG1蛋白强抗原表位开始的引物,将SAG1基因片段定向亚克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒pET-SAG1转化至E. coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达。表达产物用SDS-PAGE进行鉴定,结果表明SAG1基因片段在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,分子量大小约为35 kD,Western-blot鉴定结果表明,表达产物可以被羊抗弓形虫阳性血清所识别。重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,间隔两周,免疫三次,最后一次免疫后1W对小鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染。对抗血清进行间接ELISA检测,结果小鼠免疫后产生了较高滴度的特异性抗体,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显着性。为了获得与天然SAG1蛋白构型接近的重组蛋白,另外设计一对引物扩增SAG1的基因片段。PCR产物经纯化、酶切后定向插入pcDNA3.1真核表达载体,转化至大肠杆菌DH5α,经酶切及PCR鉴定后进行测序。结果表明,从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增出1008 bp的特异SAG1片段,大小与预测值相符。pcDNA-SAG1的成功构建,为进一步在细胞中的表达及弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。
二、弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究（论文提纲范文）
（1）弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 弓形虫疫苗的研究现状 |
| 1.1.1 研究弓形虫疫苗的必要性 |
| 1.1.2 弓形虫疫苗的研究现状 |
| 1.2 多抗原肽疫苗 |
| 1.2.1 疫苗的原理 |
| 1.2.2 基于肽的疫苗 |
| 1.2.3 多抗原肽疫苗的表位设计 |
| 1.3 挑选弓形虫抗原表位 |
| 1.3.1 弓形虫的生活史 |
| 1.3.2 弓形虫的形态特点 |
| 1.3.3 弓形虫的致病机制 |
| 1.3.4 弓形虫的基因型 |
| 1.3.5 宿主对弓形虫的免疫应答 |
| 1.3.6 本研究确定的弓形虫表位 |
| 1.4 HBc病毒样颗粒 |
| 1.4.1 病毒样颗粒 |
| 1.4.2 HBc病毒样颗粒 |
| 1.5 选题意义及研究内容 |
| 第二章 嵌合HBc病毒样颗粒的构建、纯化与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料与仪器 |
| 2.2.2 嵌合HBc病毒样颗粒表达质粒的构建 |
| 2.2.3 嵌合HBc病毒样颗粒的表达 |
| 2.2.4 嵌合HBc病毒样颗粒的纯化 |
| 2.2.5 嵌合HBc病毒样颗粒的Western Blot鉴定 |
| 2.2.6 嵌合HBc病毒样颗粒的透射电镜分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 嵌合HBc病毒样颗粒表达质粒的构建 |
| 2.3.2 嵌合HBc病毒样颗粒的表达 |
| 2.3.3 嵌合HBc病毒样颗粒的纯化 |
| 2.3.4 嵌合HBc病毒样颗粒的Western Blot鉴定 |
| 2.3.5 嵌合HBc病毒样颗粒的透射电镜分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 嵌合HBc病毒样颗粒的免疫保护性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 嵌合HBc病毒样颗粒蛋白接种小鼠 |
| 3.2.3 免疫小鼠的血清抗体分析 |
| 3.2.4 免疫小鼠的淋巴细胞分型分析 |
| 3.2.5 免疫小鼠的细胞因子水平分析 |
| 3.2.6 弓形虫强弱毒株攻击感染实验 |
| 3.2.7 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平 |
| 3.3.2 免疫小鼠的CD4~+CD8~+T淋巴细胞分型情况 |
| 3.3.3 免疫小鼠的细胞因子水平 |
| 3.3.4 弓形虫强弱毒株攻击感染后小鼠的生存率和脑包囊数 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及所获奖励 |
| 英文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 巨型艾美耳球虫的危害及防控现状 |
| 1 巨型艾美耳球虫(Eimeria. maxima)生活史 |
| 2 巨型艾美耳球虫的流行情况 |
| 3 巨型艾美耳球虫病的症状及病理变化 |
| 4 鸡球虫病的防治现状 |
| 5 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 巨型艾美耳球虫4种侵入相关抗原研究进展 |
| 1 鸡艾美耳球虫表面蛋白 |
| 2 鸡艾美耳球虫延伸因子2 |
| 3 鸡艾美耳球虫14-3-3蛋白 |
| 4 鸡艾美耳球虫棒状体蛋白 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的克隆表达以及免疫保护性研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmSAG基因的生物信息学分析 |
| 2.2 EmSAG基因的克隆结果 |
| 2.3 重组质粒pMD19-T-SAG的鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒pET-32a(+)-SAG的构建和鉴定 |
| 2.5 重组SAG蛋白的诱导表达以及纯化 |
| 2.6 Wester blot分析 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX-EmSAG的构建和鉴定 |
| 2.8 DNA疫苗pVAX-EmSAG在鸡体内表达的检测 |
| 2.9 EmSAG蛋白在E.maxima各阶段的定位分析 |
| 2.10 EmSAG基因免疫保护试验结果 |
| 2.11 EmSAG免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.12 EmSAG免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.13 EmSAG免疫诱导鸡脾脏T淋巴细胞亚类变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文章 |
| 第四章 巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆表达以及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmEF2基因的生物信息学分析 |
| 2.2 EmEF2基因PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-EF2的构建和鉴定 |
| 2.4 重组EF2蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX-EmEF2的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX-EmEF2在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmEF2免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmEF2免疫诱导血清抗体、细胞因子及脾脏T淋巴细胞亚群变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达以及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Em14-3-3基因的生物信息学分析 |
| 2.2 14-3-3 PCR扩增和克隆 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-14-3-3的构建 |
| 2.4 重组14-3-3蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX-Em14-3-3的构建和鉴定 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX-Em14-3-3在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 Em14-3-3蛋白在E.maxima各阶段的定位分析 |
| 2.9 Em14-3-3的免疫保护试验结果 |
| 2.10 Em14-3-3免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.11 Em14-3-3免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.12 Em14-3-3刺激鸡脾脏T淋巴细胞百分含量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmRON基因的克隆和序列分析 |
| 2.2 EmRON基因PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-RON的构建和鉴定 |
| 2.4 重组RON蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 真核表达质粒pVAX-EmRON的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX-EmRON在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmRON免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmRON免疫诱导血清抗体和细胞因子 |
| 2.10 鸡脾脏T淋巴细胞亚类变化检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文章发表情况 |
| 致谢 |
（3）弓形虫疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 抗弓形虫免疫机制 |
| 2 排泄分泌抗原 (E/SA) 疫苗 |
| 3 全虫疫苗 |
| 3.1 死疫苗 |
| 3.2 弱毒或减毒活疫苗 |
| 4 基因工程疫苗 |
| 4.1 亚单位疫苗 |
| 4.2 核酸疫苗 |
| 4.2.1 单基因核酸疫苗 |
| 4.2.2 复合基因疫苗 |
| 4.2.3 混合基因疫苗 |
| 5 活载体疫苗 |
| 5.1 细菌介导的活载体疫苗 |
| 5.2 病毒介导的活载体疫苗 |
| 5.3寄生虫介导的活载体疫苗 |
| 6 初免-加强 (Prime-boost) 免疫策略 |
| 7 疫苗的免疫评价 |
| 8 总结与展望 |
（4）鸡源弓形虫治疗药物的筛选及弓形虫排泄分泌抗原巨噬细胞结合分子的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡弓形虫病的研究进展 |
| 1 弓形虫的生活史 |
| 2 鸡是弓形虫重要的中间宿主 |
| 3 鸡弓形虫病的流行情况 |
| 4 自然感染的鸡弓形虫病临床症状 |
| 5 鸡弓形虫病实验模型的建立 |
| 6 鸡弓形虫病的诊断方法 |
| 6.1 血清学诊断 |
| 6.2 分子生物学诊断方法 |
| 7 鸡源弓形虫虫株的分离及基因型分析 |
| 7.1 鸡源弓形虫虫株的分离 |
| 7.2 基因型分析方法 |
| 7.3 基因型的变异性 |
| 8 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 弓形虫排泄分泌抗原研究进展 |
| 1 ESA的制备 |
| 1.1 从实验感染鼠的腹水中分离 |
| 1.2 弓形虫的细胞培养 |
| 1.3 弓形虫的无细胞培养 |
| 2 ESA的组成和免疫原性 |
| 2.1 体内排泄分泌抗原 |
| 2.2 体外排泄分泌抗原 |
| 3 ESA应用于弓形虫病的诊断 |
| 4 ESA的免疫功能及应用 |
| 5 ESA对宿主细胞的调节作用 |
| 5.1 树突状细胞 |
| 5.2 T细胞 |
| 6 ESA的抗肿瘤作用 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 两种不同来源弓形虫虫株对不同日龄雏鸡的致病性比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 攻虫后试验动物死亡情况 |
| 2.2 触片检查结果 |
| 2.3 循环抗原(TCA)与循环抗体(TCAb)的变化 |
| 2.4 PCR检测结果 |
| 2.5 脏器组织病理学变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡源弓形虫治疗药物的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RH株感染小鼠试验 |
| 2.2 JS株感染小鼠试验 |
| 2.3 JS株感染雏鸡试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 弓形虫ESA对小鼠巨噬细胞的免疫功能调节研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 弓形虫速殖子的纯化 |
| 2.2 ESA的SDS-PAGE结果分析 |
| 2.3 细胞增殖试验 |
| 2.4 ESA对细胞吞噬功能的影响 |
| 2.5 ESA促进Ana-1细胞的凋亡 |
| 2.6 ELISA分析弓形虫ESA对Ana-1巨噬细胞炎性细胞因子分泌的影响 |
| 2.7 NO的检测 |
| 2.8 TLR2和TLR4的检测 |
| 2.9 弓形虫ESA对巨噬细胞NF-κB信号通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 弓形虫排泄分泌抗原小鼠巨噬细胞结合分子的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western blot分析 |
| 2.2 ESA与Ana-1细胞的结合 |
| 2.3 LC-MS/MS分析和鉴定结合Ana-1细胞的弓形虫ESA蛋白 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 刚地弓形虫TgEF-1α和TgESA10基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR的扩增 |
| 2.2 质粒pMD19-T-TgEF-1α和pMD19-T-TgESA10的构建和鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒pET-32a(+)-EF-1α和pET-32a(+)-ESA10的构建和鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.5 Western Blot分析 |
| 2.6 抗体中和试验结果 |
| 2.7 被动免疫试验结果 |
| 2.8 BALB/c小鼠的免疫保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 刚地弓形虫TgEF-1α基因和TgESA10基因DNA疫苗的构建及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 DNA疫苗pVAX-TgEF-1α和pVAX-TgESA10的构建和鉴定 |
| 2.2 Western Blot检测 |
| 2.3 小鼠血清中抗弓形虫特异性抗体的检测 |
| 2.4 小鼠血清中细胞因子的检测 |
| 2.5 小鼠脾脏淋巴细胞中CD4~+、CD8~+T细胞和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表达水平的检测 |
| 2.6 攻虫试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 刚地弓形虫钙依赖蛋白激酶1和14-3-3蛋白的基因克隆及原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR的扩增 |
| 2.2 质粒pMD19-T-TgCDPK1和pMD19-T-Tg14-3-3的构建和鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒pET-32a(+)-CDPK1和pET-32a(+)-14-3-3的构建和鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.5 Western Blot分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十章 四种弓形虫重组蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1调节小鼠巨噬细胞免疫功能的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 rTgESA10、rTgEF-1α、rTgCDPK1和rTg14-3-3与小鼠巨噬细胞Ana-1的结合 |
| 2.2 细胞增殖试验 |
| 2.3 rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1对细胞吞噬功能的影响 |
| 2.4 rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1对Ana-1细胞凋亡的影响 |
| 2.5 ELISA分析rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1对Ana-1巨噬细胞炎性细胞因子分泌的影响 |
| 2.6 TLR2和TLR4的检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文 |
（5）弓形虫复合基因疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 表面抗原联合的复合疫苗 |
| 2 表面抗原与细胞器分泌抗原联合的复合疫苗 |
| 2.1 表面抗原与棒状体蛋白 (ROP) 联合的复合疫苗 |
| 2.2 表面抗原与致密颗粒蛋白 (GRA) 联合的复合疫苗 |
| 2.3 表面抗原与微线体蛋白 (MIC) 联合的复合疫苗 |
| 3 其他类型抗原组合构建的复合基因疫苗 |
| 4 基因疫苗的不足及应对方法 |
| 4.1 采用不同免疫途径对免疫效果的影响 |
| 4.2 应用免疫佐剂提高免疫效果 |
（6）弓形虫致密颗粒抗原GRA7疫苗初免—加强免疫策略增强小鼠抗弓形虫感染的免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 弓形虫致密颗粒抗原GRA7 DNA疫苗的构建及其鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 弓形虫致密颗粒抗原GRA7重组蛋白疫苗的构建及其鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 弓形虫致密颗粒抗原GRA7疫苗prime-boost免疫策略的效应研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论着 |
| 附件 |
（7）弓形虫主要抗原及核酸疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 弓形虫主要抗原蛋白 |
| 1.1 棒状体蛋白 |
| 1.2 主要表面抗原 |
| 1.3 微线体蛋白 |
| 1.4 致密颗粒蛋白 |
| 2 弓形虫病核酸疫苗 |
| 2.1 单基因疫苗 |
| 2.2 复合基因疫苗 |
| 2.3 鸡尾酒疫苗 |
| 2.4 佐剂与疫苗 |
| 3 弓形虫病核酸疫苗研究前景 |
（8）弓形虫病疫苗研究进展概述（论文提纲范文）
| 1 灭活疫苗 |
| 2 弱毒或减毒活疫苗 |
| 3 核酸疫苗 (DNA疫苗) |
| 3.1 棒状体蛋白核酸疫苗 |
| 3.2 表面抗原核酸疫苗 |
| 3.3 致密颗粒蛋白核酸疫苗 |
| 3.4 微线体蛋白核酸疫苗 |
| 3.5 其他核酸疫苗 |
| 4 亚单位疫苗 |
| 5 卡介苗 |
| 6 结语 |
（9）弓形虫疫苗的研究进展（论文提纲范文）
| 1 弓形虫全虫疫苗 |
| 1.1 弓形虫灭活疫苗 |
| 1.2 弱毒或减毒活疫苗 |
| 2 排泄分泌抗原 (E/SA) 疫苗 |
| 3 基因工程疫苗 |
| 3.1 重组单价疫苗 |
| 3.2 复合多价疫苗 |
| 3.3 混合多价疫苗 |
| 4 核酸疫苗 |
| 4.1 单基因疫苗 |
| 4.2 复合基因疫苗 |
| 4.3 混合基因疫苗 |
| 5 重组活载体疫苗 |
| 6 其他新型疫苗 |
| 7 存在的问题和展望 |
（10）弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 弓形虫表面抗原1(SAG1)的研究进展 |
| 1 SAG1(P30)基因和蛋白结构 |
| 2 SAG1(P30)与弓形虫侵入细胞的关系 |
| 3 SAG1(P30)蛋白诱导的免疫作用 |
| 4 SAG1(P30)在弓形虫病诊断方面的应用 |
| 5 SAG1(P30)在弓形虫疫苗研制中的应用 |
| 6 结语 |
| 第二章 弓形虫GJS 株表面蛋白1（SAG1）基因的克隆、表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 弓形虫GJS 株速殖子 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 质粒和菌株 |
| 1.4 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫基因组 DNA 的提取 |
| 2.2 目的基因 SAG1 的扩增 |
| 2.3 克隆载体的构建 |
| 2.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组质粒的鉴定 |
| 2.7 重组质粒的诱导表达 |
| 2.8 表达产物的SDS－PAGE 电泳检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的片断的扩增 |
| 3.2 pMD-SAG1 重组质粒的鉴定 |
| 3.3 重组质粒的测序鉴定及序列分析 |
| 3.4 物理化学特性分析 |
| 3.5 弓形虫SAG1 蛋白分子的结构预测 |
| 3.6 pET-SAG1 重组质粒的鉴定 |
| 3.7 SAG1 基因表达产物SDS-PAGE 分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 重组蛋白的纯化及功能分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 SAG1 基因的大量表达 |
| 2.2 包涵体的提取 |
| 2.3 包涵体的纯化 |
| 2.4 重组蛋白rSAG1 的Western Blot 鉴定 |
| 2.5 动物试验及攻击感染 |
| 2.6 ELISA 检测抗融合蛋白血清 |
| 3 结果 |
| 3.1 表达产物的定性分析 |
| 3.2 重组蛋白包涵体的纯化 |
| 3.3 重组蛋白rSAG1 抗原性分析 |
| 3.4 弓形虫GJS 株速殖子攻击感染后免疫小鼠存活时间 |
| 4 讨论 |
| 第四章 弓形虫GJS 株表面抗原1 基因的真核表达质粒的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 弓形虫GJS 株速殖子 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 质粒和菌株 |
| 1.4 酶和试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫基因组DNA 的提取 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 目的片段的扩增 |
| 2.4 PCR 产物的回收与纯化 |
| 2.5 目的片段与pCDNA3.1 载体的酶切回收 |
| 2.6 目的片段与表达载体的连接转化 |
| 2.7 重组质粒的提取与鉴定 |
| 2.8 序列测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 SAG1 基因获得结果 |
| 3.2 pcDNA3.1- SAG1 重组质粒的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.3 pcDNA3.1- SAG1 重组质粒的测序结果及分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究（论文参考文献）
- [1]弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究[D]. 郭晶晶. 山东大学, 2019(02)
- [2]巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究[D]. 刘亭岐. 南京农业大学, 2018(07)
- [3]弓形虫疫苗研究进展[J]. 蒋子阳,董锴,戴红,王梦秋,刘灿,陈建平. 热带医学杂志, 2018(02)
- [4]鸡源弓形虫治疗药物的筛选及弓形虫排泄分泌抗原巨噬细胞结合分子的鉴定和功能研究[D]. 王帅. 南京农业大学, 2015(06)
- [5]弓形虫复合基因疫苗研究进展[J]. 赵盛,张奇雪,张保德,王圆圆,苑文英. 医学研究与教育, 2014(06)
- [6]弓形虫致密颗粒抗原GRA7疫苗初免—加强免疫策略增强小鼠抗弓形虫感染的免疫保护性研究[D]. 闵娟. 山东大学, 2012(02)
- [7]弓形虫主要抗原及核酸疫苗研究进展[J]. 白杨,何深一. 中国病原生物学杂志, 2011(09)
- [8]弓形虫病疫苗研究进展概述[J]. 李运娜,黄金贵,张西臣. 中国病原生物学杂志, 2011(04)
- [9]弓形虫疫苗的研究进展[J]. 芦赟,付宝权,赵晋军,蔡元,田斌,张德林. 中国兽医科学, 2011(04)
- [10]弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定[D]. 曹丽艳. 甘肃农业大学, 2009(06)