一、隐孢子虫的体外培养和感染动物模型的研究进展（论文文献综述）
崔朝辉[1]（2020）在《微小隐孢子虫与HCT-8细胞互作蛋白质组学及相关蛋白生物学功能研究》文中提出微小隐孢子虫是一种重要的人兽共患肠道寄生原虫,宿主范围广泛,是世界范围内导致人和动物腹泻性疾病的主要病原之一。由微小隐孢子虫引起的隐孢子虫病通常以自限性为特征,但对于免疫低下的人群则可发展为慢性和致死性的腹泻。目前,关于微小隐孢子虫与宿主细胞相互作用的分子机制以及涉及疾病病理过程的机制尚不清楚。因此,本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学的方法,分别对微小隐孢子虫与HCT-8细胞相互作用过程中的分泌蛋白及HCT-8细胞膜蛋白进行定量和生物信息学分析。根据组学分析结果,筛选出3个入侵相关基因进行重组表达,并探究了其在微小隐孢子虫入侵HCT-8细胞过程中相关生物学功能,以期为研究隐孢子虫入侵宿主细胞机制和抗隐孢子虫疫苗的筛选奠定理论基础。（1）C.parvum卵囊纯化与子孢子制备。隐孢子虫脱囊释放子孢子被认为是衡量卵囊活力和感染性的重要指标,从卵囊中分离纯化出子孢子也是隐孢子虫体外研究中的基础和关键环节。本研究采用单密度蔗糖离心法和氯化铯（Cs Cl）法相结合对传代卵囊进行纯化,共得到了7.2×1010个卵囊。通过对比4种实验室常用的卵囊脱囊方法,最终确定了方法4为最佳卵囊体外脱囊释放子孢子的方案。利用Percoll密度梯度离心法对C.parvum子孢子进行纯化,纯化得到的子孢子纯净单一。基于PCR和Time-course方法,确定了C.parvum子孢子在感染HCT-8细胞0-3 h时处于滑行运动状态,而在3.5-6 h时处于粘附/入侵状态。（2）C.parvum感染HCT-8细胞分泌蛋白组学研究。C.parvum子孢子在宿主细胞表面进行滑行运动期间,会分泌一些蛋白帮助其粘附/入侵宿主细胞。目前,关于隐孢子虫子孢子粘附/入侵宿主细胞过程中的分泌蛋白组成并不完全清楚。本研究在对C.parvum子孢子感染HCT-8细胞过程中分泌蛋白组进行解析的同时,运用TMT标记定量蛋白质组学技术,对隐孢子虫子孢子滑行运动状态时（3 hpi）和粘附/入侵HCT-8状态时（6 hpi）的分泌蛋白组进行比较及生物信息学分析。鉴定到了一些可能在虫体与宿主细胞互作过程中的重要分子,为C.parvum入侵关键功能基因的筛选及入侵机制的研究提供了基础数据。对C.parvum差异表达分泌蛋白功能进行了生物信息学分析发现,C.parvum含CAP结构域蛋白在子孢子处于滑行运动时表达量较高,对这些蛋白结构和功能的进一步研究可能为开发抗隐孢子虫病药物靶标和疫苗筛选提供新的思路。（3）C.parvum感染HCT-8细胞膜蛋白组学研究。隐孢子虫在入侵宿主细胞过程中,与细胞膜上一系列受体蛋白相结合,进而引起细胞膜表面受体蛋白以及介导信号通路相关蛋白发生变化来发挥相关生物学功能。目前,还未有关于C.parvum感染HCT-8细胞膜蛋白组学的相关研究的报道。本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学方法,对微小隐孢子虫感染和未感染HCT-8细胞膜蛋白质组进行比较分析,以1.5倍为差异表达变化的阈值,共鉴定到714个差异表达蛋白,其中上调蛋白625个,下调蛋白116个。通过对差异表达蛋白以及部分膜蛋白进行功能分析发现,C.parvum的感染主要参与了对HCT-8细胞屏障功能的破坏,以及引起宿主细胞骨架蛋白的改变;整合素（integrins）可能作为受体蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中具有重要作用。相关HCT-8细胞膜蛋白的鉴定与功能分析,为C.parvum与宿主细胞互作机制相关研究奠定了理论基础。（4）Cp Trap/Cp Crisp/Cp Carp蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能研究。本研究通过对C.parvum含CAP结构域蛋白进行功能分析,并对Cp Crisp、Cp Carp以及含TSP结构域的Cp Trap等三个蛋白进行了原核表达和多克隆抗体制备。从基因表达模式、内生发育阶段蛋白定位及体外中和特性等方面探究了Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能。q RT-PCR结果显示,Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp在检测时间过程中（0-72 h）均有表达,且在72 hpi时达到最大值。免疫荧光结果显示,Cp Trap蛋白定位在卵囊腔内和子孢子膜表面;Cp Crisp蛋白定位在卵囊腔内、子孢子中后部及裂殖子胞质中,而Cp Carp则定位在卵囊腔内,子孢子和裂殖子胞质中。与对照组相比,抗Cp Trap/Cp Crisp/Cpcarp多克隆抗体分别对C.parvum入侵HCT-8细胞都具有一定的阻断作用。综上所述,本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学方法,对C.parvum与HCT-8细胞互作过程中的分泌蛋白组和HCT-8细胞膜蛋白组进行鉴定和定量分析。通过对差异表达蛋白的生物信息学分析,为C.parvum入侵关键功能基因的筛选及研究C.parvum与宿主细胞互作机制奠定理论基础。此外,对Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp三个蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能进行了探究,并证实其可作为抗隐孢子虫疫苗的候选靶标。
原亚杰[2]（2020）在《C5a/C5aR信号在微小隐孢子虫感染中的作用研究》文中认为隐孢子虫病是由隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）感染引起的一种人兽共患原虫病,严重威胁人和多种畜禽的健康和生命。目前,已在100多个国家的包括哺乳动物、鸟类、爬行类和鱼类等240多种动物和人体内发现了隐孢子虫,造成了较为严重的经济影响和社会效应。隐孢子虫感染可导致免疫缺陷畜禽和人、幼龄宿主和移植个体持续性水样或致命性腹泻,健康动物或成年动物虽为无或轻微感染,表现一过性、自限性腹泻,但可成为潜在的传染源。鉴于隐孢子虫的宿主广泛性和严重危害,国内外学者在病原生物学、致病特征、疫苗和药物方面做了大量工作,然而,还没有开发出有效的预防性措施和药物防控隐孢子虫病。前人研究发现,宿主抵御隐孢子虫感染主要依靠细胞免疫,尤其是CD4+T细胞,同时研究发现补体裂解片段C5a通过与其受体C5a R结合调节CD4+T细胞的分化和效应,参与抗感染免疫反应。但是,C5a/C5a R信号在隐孢子虫感染中的作用尚不清楚。基于此,本研究以人兽共患微小隐孢子虫（C.parvum）为研究对象,以C.parvum感染BALB/c乳鼠为模型,研究了C5a/C5a R信号在C.parvum感染中对宿主CD4+T细胞亚群主效应细胞因子和转录因子的调节作用,获得了以下结果:1. 建立了C.parvum感染BALB/c乳鼠模型:将1×107个C.parvum卵囊脱囊后经口感染5 d的BALB/c乳鼠,在感染后（post infection,pi）6 h、12 h、24 h、36 h、48h、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、15 d、20 d、25 d和30 d采集回肠组织,利用基于隐孢子虫HSP70基因的Real-time PCR进行感染情况检测,利用HE染色进行组织病理学观察,利用抗酸染色法检测大肠内容物中的卵囊。研究发现,在6 hpi即可检测到HSP70基因的表达,直至25 dpi,高峰在7 dpi;在5 dpi和7 dpi,可见感染乳鼠回肠绒毛寄生有隐孢子虫,回肠绒毛脱落、萎缩,回肠末端黏膜结构完整性破坏、细胞间隙明显变宽,有中性粒细胞及炎性细胞浸润;在7 dpi的乳鼠大肠内容物中可发现大量玫瑰红色或暗红色C.parvum卵囊。2. C.parvum感染引起BALB/c乳鼠回肠组织C5a和C5a R的m RNA显着上调表达:在C.parvum感染后采集乳鼠回肠组织,利用Real-time PCR测定了回肠组织的C5a和C5a R m RNA的表达水平,发现C5a在3 dpi、4 dpi、20 dpi和30 dpi显着升高;C5a R在12 hpi、36 hpi、4 dpi、5 dpi、7 dpi、15 dpi和30 dpi显着高于对照组,并在5 dpi达到高峰。3. C.parvum感染诱发了BALB/c乳鼠回肠组织中Th1型免疫效应:利用Real-time PCR测定和分析感染乳鼠回肠组织中CD4+T细胞亚群Th1、Th2、Th17和Treg主效应细胞因子及其相应的转录因子的相对表达情况发现,Th1细胞主效应因子IFN-γ在2dpi、4 dpi、5 dpi、6 dpi、7 dpi、9 dpi、10 dpi、20 dpi、25 dpi和30 dpi显着上调表达,在6 dpi达到高峰,其转录因子T-bet也在3 dpi、7 dpi、10 dpi、20 dpi和30 dpi显着上调表达;Th2细胞主效应因子IL-4及其转录因子GATA-3的m RNA相对表达水平均呈现动态变化,但在多数时间点显着下调表达;Th17细胞主效应因子IL-17仅在3 dpi显着上调表达,而在5 dpi、6 dpi和8 dpi显着下调表达,其转录因子RORγt的表达水平也在多数时间点显着下调;Treg细胞亚群主效应因子TGF-β也在多数时间点显着下调表达,仅在20 dpi上调表达,其转录因子Foxp3在3 dpi和4 dpi也显着下调表达。4. C5a/C5a R信号可通过调节CD4+T细胞免疫效应参与C.parvum与乳鼠回肠组织的互作:本研究在C.parvum感染乳鼠前6 h,依据乳鼠体重经口灌喂3 mg/kg C5a R抑制剂（即PMX 205）,乳鼠感染C.parvum卵囊后,每隔3 d依体重灌喂PMX 205,利用Real-time PCR对不同时间点的回肠组织检测分析发现,与单纯感染组相比,抑制剂组感染乳鼠回肠组织中的Th1细胞主效应因子IFN-γ在多数时间（2 dpi、4 dpi、6dpi、7 dpi、9 dpi和10 dpi）显着下调,其转录因子T-bet在感染后7 d、9 d、10 d和30d显着下调表达;抑制剂组感染乳鼠回肠组织中的Th2细胞主效应因子IL-4在多数时间显着下调表达,其转录因子GATA-3在感染后5 d和7 d显着下调表达;抑制剂组感染乳鼠回肠组织中的Th17细胞主效应因子IL-17在多数时间（2 dpi、3 dpi、4 dpi、5dpi、8 dpi和9 dpi）显着上调表达,但其转录因子RORγt在感染后多数时间表达显着下调,仅在25 d显着上调表达;抑制剂组感染乳鼠回肠组织中的Treg细胞主效应因子TGF-β在4 dpi、6 dpi、7 dpi和25 dpi显着下调表达,其转录因子Foxp3在7 dpi和10dpi显着下调表达,仅在3 dpi显着上调表达;采集单纯感染组和抑制剂组6 dpi的回肠组织进行组织病理学观察发现,C5a/C5a R信号显着改善C.parvum感染引起的乳鼠回肠组织绒毛直径和黏膜厚度变化,但不影响绒毛长度与隐窝深度比值;隐孢子虫HSP70基因的m RNA检测发现,C5a/C5a R信号能显着影响C.parvum在回肠组织细胞中的增殖。综上所述,C.parvum感染活化了BALB/c乳鼠回肠组织C5a/C5a R信号,且该信号通过影响乳鼠回肠组织中CD4+T细胞Th1、Th2、Th17和Treg亚群主效应细胞因子及其转录因子的表达参与C.parvum与乳鼠回肠组织的互作。这些研究结果为深入探讨宿主防御隐孢子虫感染的免疫机理,筛选用于有效防控隐孢子虫病的新思路提供了理论依据。
王璐阳[3]（2020）在《微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白组学分析及诊断标识蛋白鉴定》文中研究说明隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种世界范围内常见的能够引起水源性及食源性腹泻疾病爆发的寄生性原虫。全球肠道中心研究确定隐孢子虫病是导致2岁以下儿童中重度腹泻的首要原因之一,仅次于轮状病毒,能够引起免疫功能低下、营养不良的儿童持续性的腹泻,并导致生长缓慢、认知障碍,甚至死亡。目前可以有效治疗隐孢子虫病的药物和疫苗尚未研制出来,因此研究隐孢子虫的致病机制具有重要的公共卫生学意义。基于此,建立人和动物隐孢子虫病的早期诊断方法至关重要。关于直接检测隐孢子虫卵囊和间接检测虫体的ELISA检测方法已经有很多种,但是用隐孢子虫卵囊壁蛋白作为免疫原的ELISA检测方法尚未被研究,由于体外检测技术无法检测到子孢子抗原,因此使用卵囊壁上某一特定蛋白作为免疫原可能会使检测方法更具敏感性、高效性。本研究采用C.parvum和C.andersoni卵囊,进行体外脱囊收集纯化其卵囊壁,运用Label-free全蛋白定性组学分析卵囊壁蛋白组成,通过蛋白组学数据和隐孢子虫卵囊壁分子组成特性预测出可能定位于卵囊壁表面蛋白进行重组表达,以期筛选出微小隐孢子虫卵囊壁表面和安氏隐孢子虫卵囊壁表面可以用来作为检测的潜在靶标蛋白,进而实现隐孢子虫的体外快速检测。1.微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁的分离纯化本研究利用实验室保存的微小隐孢子虫和收集的安氏隐孢子虫卵囊,采用胆酸盐、脱囊液和37℃水浴加热的方式刺激隐孢子虫脱囊,脱囊完成后,显微镜下观察到两种隐孢子虫脱囊率均达80%以上,活性良好,随后采用梯度Percoll细胞分离液对隐孢子虫卵囊壁进行分离纯化,纯化后的隐孢子虫卵囊壁视野干净,无杂质,有个别完整卵囊掺杂其中,符合后续蛋白组学试验要求。本研究通过对隐孢子虫卵囊壁分离方法的改进,可以快速获得大量高纯度的隐孢子虫卵囊壁,为进一步研究隐孢子虫卵囊壁的结构及其分子组成奠定基础。2.微小隐孢子虫卵囊壁和安氏隐孢子虫卵囊壁定性蛋白组学鉴定本研究使用非标定性,高效液相色谱分级分离和基于质谱的定性蛋白质组学技术,分别对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的卵囊壁进行蛋白组质组学鉴定,蛋白质定性结果显示在微小隐孢子虫卵囊壁阶段鉴定到798种蛋白质,在安氏隐孢子虫卵囊壁阶段鉴定到1032种蛋白,分别占整个预测蛋白组的20%（798/3876）和26%（1032/3876）。基于试验中鉴定到的蛋白质组学数据结果,结合系统的生物信息学预测分析,包括蛋白功能注释、亚细胞定位、COG/KOG功能分类以及蛋白功能富集,并且对所有差异表达蛋白进行了功能分类、功能富集。在微小隐孢子虫卵囊壁组分和安氏隐孢子虫卵囊壁组分中都发现了大量的核糖体和蛋白酶体相关蛋白的表达,表明核糖体和蛋白酶体在隐孢子虫脱囊过程中的重要作用。此外,本研究在微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁提取物中均鉴定出一系列经典卵囊壁蛋白（COWP1-9）,从而验证了本试验所用的纯化和提取方法。3.微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁相关蛋白的克隆表达与定位通过蛋白质组学数据和隐孢子虫卵囊壁结构特性,本研究分别筛选出由cgd75140基因编码的微小隐孢子虫富含半胱氨酸基序的表面蛋白和由cand020680基因编码的富含半胱氨酸结构域的安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白,推测这两种蛋白可能是位于隐孢子虫卵囊壁表面,可以用来作为体外检测潜在靶标蛋白。本研究根据NCBI公布的基因序列,针对性的设计特异性引物,采用PCR扩增Cpcgd75140和Cacand020680基因,构建完成重组克隆质粒和表达质粒后进行原核表达。最终两个重组目的蛋白均以包涵体形式表达,目的蛋白通过高浓度尿素和脱盐柱结合的方法进行纯化,最终纯化得到高浓度蛋白Cpcgd75140-GST蛋白（1.98mg/mL）和Cacand020680-GST蛋白（2.02mg/mL）,可用于后续蛋白定位试验。将最终纯化的重组目的蛋白做为抗原,免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,得到的anti-Cacand020680（1.56mg/mL）和anti-Cpcgd75140（1.50mg/mL）抗体效价均≥512K。为了进一步验证体外表达的目的蛋白分别在微小隐孢子虫卵囊和安氏隐孢子虫卵囊上的表达定位,本研究采用间接免疫荧光法对目的蛋白进行定位发现,Cacand020680重组蛋白定位于安氏隐孢子虫卵囊壁,卵囊壁周围观察到特异性红色荧光;Cpcgd75140重组蛋白定位于卵囊表面,在卵囊表面可观察到特异性红色荧光,两种重组蛋白制备的多克隆抗体均有较好的免疫荧光效果。由此推测,Cacand020680蛋白和Cpcgd75140蛋白分别可以作为安氏隐孢子虫和微小隐孢子虫的体外检测靶标。
牛子文,常艳凯,王克,张龙现[4]（2020）在《隐孢子虫体外培养模型研究进展》文中研究说明隐孢子虫是一种重要的人兽共患寄生原虫,主要寄生于肠上皮细胞并可引起人和动物腹泻。目前尚无有效针对隐孢子虫病的防控药物和疫苗。建立高效培养模型可为研究隐孢子虫入侵宿主细胞机制、抗隐孢子虫疫苗和药物的研发提供试验基础。与常见的动物感染模型相比,体外培养系统成本较低,可以模拟宿主生理状况,便于筛选抗隐孢子虫药物。本文对隐孢子虫鸡胚及鸡胚器官培养模型、细胞培养模型、无细胞培养模型、三维培养模型以及肠道类器官培养模型的研究进展进行综述,为深入了解隐孢子虫致病机制及抗隐孢子虫的药物研发提供参考。
匡德宣[5]（2018）在《CRISPR/Cas9技术高效构建与鉴定恶性疟原虫基因修饰虫株及对树鼩感染的初步研究》文中研究说明恶性疟原虫引起的恶性疟疾是一种严重威胁人类生命健康的传染性疾病。由于缺乏有效的基因编辑手段,缺乏合适的动物模型,导致疟原虫致病机制、疟疾疫苗、药物研发以及抗药性虫株等研究进展缓慢。从基因水平分析疟原虫的耐药性可以加速抗疟疾疫苗和药物的研究,也是恶性疟原虫研究的一个热点和重点。恶性疟原虫的基因组编辑受限于有限的工具和转染与整合效率低。CRISPR/Cas9技术可以快速、经济、高效、特异性地改变疟原虫基因,从而加速新药靶点的确证和特定基因或者基因家族功能的阐明,以及补充全基因组范围的相关研究,促进疟原虫疫苗及新型抗疟药的研制。酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase Ⅱ,CK2）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase,STK）均为蛋白激酶。CK2 在细胞生长、增殖、凋亡和癌变等过程中发挥重要的作用。CK2是一个双向特异性的激酶,其中CK2β1、CK2a亚基蛋白可以作为疟疾药物治疗的候选靶标。STK与细胞的生长、分裂、代谢、分化、毒力、致病性密切相关。同时,STK也是一种重要的抗原,可用于开发研制疟疾新型疫苗。在恶性疟原虫中的研究中,STK蛋白和CK2蛋白可能与恶性疟原虫生理功能和致病性相关。本研究选择了 CK2的两个亚基蛋白（CK2β1,CK2α）以及STK蛋白进行加标签基因修饰,并引入突变位点,构建重组虫株,并进行树鼩感染初步实验。实现在没有疟原虫蛋白相应的商业化抗体条件下,利用标签对疟原虫的特定蛋白进行筛选和基因定点突变编辑,从而为深入研究基因功能奠定基础,为疟原虫的其它相关蛋白基因编辑提供技术手段。采用Percoll同步化培养法,获得P.falciparum 3D7环状体期虫体。以P.falciparum 3D7的基因组DNA为模板,PCR扩增获得CK2β1/CK2α/STK基因同源臂,以无模板方式PCR扩增获得HA、HA-Ty1标签,再使用搭桥法将CK2β1/CK2α/STK基因同源臂分别和HA、HA-Ty1、HA-Ty1标签进行融合,引入同义突变的核酸序列,获得 HA-CK2β1,HA-Ty1-CK2α,HA-Ty1-STK 突变基因。以PL6CS质粒为载体,成功构建PL6CS-hDHFR质粒。将HA-CK2β1、HA-Ty1-CK2α及HA-Ty1-STK突变基因分别插入PL6CS-hDHFR质粒,成功构建了 PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK 融合质粒。将 CK2β1/CK2α/STK 基因表达的 sgRNA 序列分别插入对应的PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK融合质粒,成功获得PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK 整合质粒。以PUF1-Cas9质粒为载体,成功构建PUF1-BSD-Cas9质粒。用电击转化的方法将 pUF1-BSD-Cas9 质粒、PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK 整合质粒同时转染进恶性疟原虫3D7虫株,加药筛选,进行PCR鉴定、DNA测序鉴定、Western blotting鉴定和细胞免疫荧光分析（IFA）,成功获得电转的PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK基因重组虫株。结果表明,首次利用CRISPR/Cas9技术能成功且快速地构建恶性疟原虫转基因虫株。PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK基因重组虫株用树鼩血清或血浆进行体外性培养,成功获得能体外感染树鼩红细胞的基因重组虫株。并用CK2β1/CK2α/STK基因重组虫株分别对未切脾和脾脏切除树鼩进行体内感染实验,结果表明,树鼩不会被3个基因修饰虫株感染。本研究发展及完善了利用CRISPR/Cas9方法快速进行恶性疟原虫基因组改造的方法,为进一步在基因水平研究恶性疟原虫奠定了基础。CK2β1、CK2α、STK重组虫株在树鼩红细胞中进行体外培养获得成功,可为开展其它人疟原虫和动物疟原虫的体外培养研究提供借鉴方法。虽然最终体内实验结果表明恶性疟原虫并不能感染树鼩,但也是恶性疟原虫动物模型研究的尝试和补充。
王臣荣[6]（2017）在《微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对细胞miRNAs和TLRs的影响》文中研究说明隐孢子虫是重要的人兽共患原虫之一,也是导致儿童腹泻的第二大病原。目前,未见针对隐孢子虫病有效的药物及疫苗,唯一被FDA批准的硝唑尼特对隐孢子虫的效果也是有限的。miRNAs是一类内源性非编码小RNA分子,其通过调控基因的表达,进而影响机体许多生物学过程,如细胞的增殖、分化、凋亡以及生物体的发育等。研究表明,miRNAs可以调节超过60%的哺乳动物蛋白编码mRNAs,在调控隐孢子虫感染和宿主防御中发挥重要作用。TLRs（Toll-like receptor,TLRs）是一种常见的病原模式识别受体,其在病原体入侵细胞期间起着非常重要的作用。研究表明,宿主细胞TLRs在隐孢子虫的识别和宿主对隐孢子虫免疫应答方面起着重要作用。小肠作为微小隐孢子虫的主要寄生部位,然而关于微小隐孢子虫感染对肠道上皮细胞miRNAs和TLRs的影响尚未见报道。本研究旨在分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对细胞miRNAs和TLRs的影响。牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊分离纯化。本试验通过感染未食初乳荷斯坦奶牛,成功的对微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊进行了体外传代,感染第三天,出现拉稀症状,并开始排微小隐孢子虫卵囊,感染后第五到九天为排卵囊高峰期,排卵囊期为十五天;利用改良饱和食盐水漂浮法（饱和食盐水漂浮法+氯化铯密度梯度离心法）,成功分离纯化了牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊,最终得到了牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型高纯度的3.5×108个卵囊,其脱囊率为76%,可用于下一步细胞感染试验。微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染对HCT-8细胞miRNAs的影响。本实验室利用miRNA芯片技术,分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染（4 h和12 h）对HCT-8细胞miRNAs的影响,结果发现感染4 h共有7个表达差异显着miRNAs（1个显着上调和6个显着下调）;感染12 h共有13个表达差异显着miRNAs（3个显着上调和10个显着下调）。挑选6个miRNA芯片分析表达差异显着的miRNAs:hsa-miR-122-5p（4 h显着上调）、hsa-miR-3591-3p（4 h显着下调）、hsa-miR-454-5p（4 h显着下调）、hsa-miR-5580-3p（12 h显着上调）、hsa-miR-181d-3p（12 h显着下调）和hsa-let-7b-3p（12 h显着下调）,利用qPCR相对定量方法分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对上述6个miRNAs的影响。结果显示,qPCR技术相对定量方法与miRNA芯片技术分析的结果相吻合,证明miRNA芯片分析的结果可靠。miRNAs靶基因预测及GO分类和KEGG通路分析。利用Targetscan human7.1和miRDBR分别预测20个表达差异显着的miRNAs的靶基因,只有18个表达差异显着miRNAs能被TargetScanHuman7.1和miRDB进行靶基因预测并取交集,结果显示,表达差异显着miRNAs的靶基因数量从10个到1034不等。利用DAVID分析方法对靶基因进行注释,并用GO分类的方法对每个miRNA靶基因进行功能分析,发现表达差异显着miRNAs参与的生物学过程有调节转录过程、细胞黏附、调节细胞凋亡、参与炎症应答、天然免疫反应、适应性免疫反应、钙离子的平衡、钾离子的转运、调节蛋白磷酸化/去磷酸化、调节干扰素的合成和酪氨酸激酶跨膜蛋白信号通路等（P<0.05）;细胞组成成分主要有细胞膜、顶端质膜、线粒体膜等（P<0.05）;分子功能主要有蛋白质结合、ATP激活、RNA聚合酶Ⅱ转录因子激活、肿瘤坏死因子受体激活、蛋白运输、钙离子通道激活、丝氨酸激酶激活、蛋白酶K激活等（P<0.05）,hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-942-5p、hsa-miR-6721-5p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-3976和hsa-miR-3121-5p可以调节细胞凋亡过程,hsa-let-7b-3p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-6721-5p和hsa-miR-3121-5p可以调节小肠上皮细胞免疫反应。对表达差异显着的miRNAs进行KEGG通路分析,发现表达差异显着miRNAs可以调节与免疫相关的肿瘤坏死因子信号通路、趋化因子受体相互作用、炎症介质的TRP的调控信号通路和干扰素信号通路;与凋亡相关的p53信号通路、MAPK和ErbB信号通路;与细胞骨架重排相关的的肌动蛋白细胞骨架和Wnt信号通路;与入侵相关的细胞粘附分子;与离子转运调节相关的钙/钾离子信号通路等。利用Cytoscape 3.4.0建立miRNAs-靶基因网络图,发现hsa-miR-34b-5p和hsa-miR-3591-3p为感染4 h表达差异显着的核心miRNAs,hsa-miR-942-5p、hsa-let-7b-3p和hsa-miR-6721-5p为感染12h表达差异显着的核心miRNAs。微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染对HCT-8细胞TLRs的影响及生物信息学分析表达差异显着的miRNAs和TLRs的关系。微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊感染HCT-8细胞后,提取感染4 h和12h细胞的总RNA,利用qPCR相对定量方法对TLR1TLR10的表达情况进行分析。结果显示TLR1TLR10 mRNA在HCT-8细胞中均有表达,且TLR2和TLR4 mRNA在微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊感染4 h和12 h均显着上调。通过生物信息学分析发现,下调的miR-34b-5p、miR-454-5p、miR-3591-3p、miR-4685-3p、miR-18b-3p miR-3976、miR-1256、miR-1287-3p、miR-3121-5p、miR-6721-5p和let-7b-3p会通过上调TLR信号通路相关靶基因,进而可能会增加IFNα、IFNβ、IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌量,有利于宿主清除微小隐孢子虫;上调的miR-942-5p会抑制TLR信号通路相关靶基因CHUK、MAPK10、PIK3CD及TAB2的表达,进而可能会减少IFNα、IFNβ、IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌量,有利于虫体的入侵。通过分析表达差异显着miRNA与TLR2和TLR4互作蛋白的关系,免疫相关的TRAF3为miR-6721-5p的靶基因,DNA结合蛋白HMGB1为let-7b-3p的靶基因。综上所述,微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊感染会导致小肠上皮细胞miRNAs表达谱改变;表达差异显着的miRNAs在微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊感染宿主细胞早期可能发挥重要的生物学功能,并影响微小隐孢子虫在宿主细胞内早期的繁殖;TLR2和TLR4的显着上调可能与小肠上皮细胞对微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊的识别和免疫反应有关;表达差异显着的miRNAs对TLR信号通路可能发挥着重要的免疫调控作用。
刘利敏[7]（2015）在《微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞相关microRNAs表达图谱分析》文中指出隐孢子虫（Cryptosporidium）是一类重要的专性胞内寄生的机会性致病原虫,能够引起包括人类在内多种脊椎动物胃肠道疾病。目前,隐孢子虫有27个有效虫种,超过90%人类感染隐孢子虫病是由微小隐孢子虫（C.parvum）和人隐孢子虫（C.hominis）引起。据报道,C.parvum是全世界研究最为最广泛虫种,其中Ⅱa为国外优势亚型,而在我国其Ⅱd亚型流行最为广泛,具有独特性。然而,目前对隐孢子虫病尚无有特效的治疗药物和预防疫苗,而且对其致病机制缺乏了解,所以研究微小隐孢子虫具有重要的公共卫生意义。微小RNA（micro RNA）是一类非常重要的非编码小分子且对细胞具有调节功能的内源性调节因子,其在转录后水平调控基因的表达,参与调控细胞的增殖、分化、凋亡以及生物体的发育。研究发现,micro RNA在物种间具有高度保守性、发育时序性和组织特异性。目前对于微小隐孢子虫感染宿主细胞时,micro RNAs表达情况研究相对较少,探明宿主内micro RNA表达情况更有助于揭示微小隐孢子虫与宿主间的相互作用关系。本试验建立了微小隐孢子虫卵囊纯化方法,通过构建HCT-8细胞体外培养模型观察了微小隐孢子虫Ⅱd亚型的内生发育过程,利用基因芯片技术检测了微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后micro RNA表达谱特征。一、牛源微小隐孢子虫卵囊纯化方法建立为获得大量纯净的微小隐孢子虫卵囊以用于其更深一步研究,本试验建立了分离纯化大量微小隐孢子虫卵囊的方法。通过微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染新生荷斯坦公犊牛进行卵囊扩增,对排卵囊规律和临床表现进行观察,结果显示排卵高峰期在第5-7天,显露期为17天;收获的卵囊量高达数十亿,初步摸索了微小隐孢子虫动物感染特征;由于犊牛粪便内含有脂类,影响阳性粪便中卵囊的获取量,因此对粪便中脂肪的处理方法进行优化,采用水-乙醚沉淀法和水-乙酸乙酯沉淀法按照不同体积比例进行除脂,结果显示水-乙醚沉淀法比水-乙酸乙酯沉淀法除脂效果好,水-乙醚沉淀法所形成脂肪层稳定,两种沉淀法所得沉淀中的卵囊量差异不显着,但是在显微镜观察,水-乙醚沉淀法所收集的卵囊要比水-乙酸乙酯沉淀法纯净、杂质少,且当水与乙醚体积比是1︰1时,所得沉淀中卵囊数量与水与乙醚体积比是1︰2比较,所得沉淀中卵囊数量差异不显着（P?0.05）且杂质少而且有利于下一步试验进行;将所获得卵囊用1︰2蔗糖溶液梯度离心法和Cs Cl梯度离心法进行纯化,结果卵囊的回收率分别为71.57%和89.69%,所纯化卵囊的数量大、杂质少,通过卵囊活性鉴定,平均达到77.78%,可直接用于细胞体外培养、抗体制备、基因组测定等研究。二、牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型在HCT-8细胞中的内生发育研究为研究牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型在宿主细胞HCT-8中的内生发育过程,本试验将纯化后的C.parvum Ⅱd卵囊按照细胞:卵囊=1︰2的比例进行接种,在试验设定的时间点取出细胞进行Giemsa染色和基于gp60基因扩增。结果在HCT-8细胞质观察到微小隐孢子虫Ⅱd亚型裂殖子、裂殖体、大配子母细胞、小配子母细胞、合子和卵囊的不同发育阶段且基于gp60基因的PCR扩增进行检测,各个时间点均能检测到微小隐孢子虫Ⅱd亚型。本试验对于牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型内生发育过程的研究为抗隐孢子虫药物的筛选提供了理论基础,为其他种类的隐孢子虫的体外培养提供技术支持。三、牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞相关mi RNA表达谱分析为探究微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染宿主细胞micro RNA表达变化,从而为微小隐孢子虫侵入机制、筛选药物作用靶点提供基础。本试验运用μParaflo?微流体芯片技术,对微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后,感染4 h和12 h细胞的总RNA高通量序列（2555个成熟micro RNA）进行测定,结果发现微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞4 h,试验组与对照组micro RNA差异表达对比,在∣log2（OI/OC）∣>2且p-value≤0.05水平范围内,hsa-mi R-122-5p表达显着上调;hsa-mi R-3591-3p、hsa-mi R-6074、hsa-mi R-454-5p、hsa-mi R-34b-5p、hsa-mi R-4685-3p、hsa-mi R-1908-3p表达显着下调;微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞12 h,试验组与对照组micro RNA差异表达对比,在∣log2（OI/OC）∣>2且p-value≤0.05水平范围内,hsa-mi R-942-5p、hsa-mi R-5580-3p、hsa-mi R-6763-5p表达显着上调;hsa-mi R-181d-3p、hsa-mi R-18b-3p、hsa-mi R-4689、hsa-mi R-1256、hsa-mi R-3976、hsa-let-7b-3p、hsa-mi R-6721-5p、hsa-mi R-3118、hsa-mi R-3121-5p表达显着下调;应用生物信息学软件Target Scan、mi Randa、Pic Tar对部分表达显着的micro RNA进行靶基因预测,共得到46个可能靶基因,比如靶基因MAPRE1、METTL9、CCDC6、ALDOA、CNOT6、ATP2A2、LGR4等,这些表达显着的micro RNA调控的靶基因可能与微小隐孢子虫入侵宿主细胞机制有关,为阐明微小隐孢子虫病发病机理、筛选药物作用靶点奠定理论基础。
郭亚琼[8]（2015）在《隐孢子虫和环孢子虫的全基因组测序及其在分型工具建立中的应用》文中认为隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）和环孢子虫（Cyclospora spp.）是新发的食源性和水源性病原。每个属内均有多个虫种/基因型。其中,大多数虫种/基因型具有宿主特异性,但少数虫种宿主范围广,为人兽共患虫种。并且在同一虫种内部,不同分离株的毒力也有差异。但人们对虫种宿主范围差异、高毒力虫株产生的原因、新发的感染人的虫种的人兽共患性以及一些引起大规模暴发虫种的地理隔离性并不清楚。为此,本文针对这些问题开展了如下研究：1.针对目前这两个属已经测序的基因组少（隐孢子虫）或无（环孢子虫）是由于难以大量获得纯化病原和DNA的现状,我们首先建立了一种可用于隐孢子虫和环孢子虫全基因组测序的DNA分离、富集和质控方法。该方法采用蔗糖密度梯度离心、氯化铯梯度离心以及免疫磁分离（隐孢子虫）或流式细胞仪分选（环孢子虫）相结合的方法对粪便样品中的卵囊进行纯化,之后采用全基因组扩增（WGA）对从纯化卵囊中提取的DNA进行富集,最后采用qPCR和克隆Sanger测序的方法对WGA产物进行质控分析。通过对隐孢子虫6个虫种/基因型和卡耶塔环孢子虫的共25份粪便样品的WGA产物进行全基因组测序,证明了该方法的有效性。2.进一步采用以上方法,对人隐孢子虫（Cryptosporidium hominis）中常引起暴发的高毒力虫株（IbA10G2和IaA28R4的暴发株各两个）进行了测序,并与已报道的低毒力虫株（IaA25R3的TU502分离株）的基因组进行了比较,发现高毒力与低毒力虫株在所有染色体上都有明显的序列差异,但高毒力亚型分离株之间主要在6号染色体上有差异。进一步分析发现尽管在6号染色体的gp60位点（亚型区分位点）上,每个亚型都表现出各自亚型的特征,但在该位点之前和之后的位点,高毒力亚型常表现出其它亚型的特征,这表明遗传重组可能是人隐孢子虫高毒力亚型产生的遗传基础。3.由于人隐孢子虫主要感染人,而微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）为隐孢子虫属中最主要的人兽共患虫种,可感染人和反刍动物等,所以进一步对本课题中新测序的4个人隐孢子虫的分离株和已报道的这两个虫种基因组进行了比较,发现尽管两个虫种的基因组有97%的相似度,但还是存在一些虫种特异性基因。微小隐孢子虫在3条染色体（5,6和8号）上都有虫种特异性的基因,且这些基因都是属于近端粒区的多拷贝家族,包括MEDLE家族和类胰岛素酶。而人隐孢子虫只在3号染色体上有一个虫种特异性片段。这两个虫种基因组的高度相似性以及端粒区MEDLE家族和类胰岛素酶基因拷贝数的不同,表明端粒基因的重复可能是导致微小隐孢子虫宿主范围扩大的原因。4.隐孢子虫花栗鼠基因型I（Cryptosporidium chipmunk genotype Ⅰ）近年来在一些感染人的散发病例中被报道,但该基因型此前主要发现于啮齿类动物中,也偶尔在水源中被检出。为了解该该基因的人兽共患性,本课题在对该虫种测序的基础上,从其基因组中筛选出了gp60基因和mucm基因,建立了亚型区分方法,并对32个人源、野生动物源和水源的分离株进行了亚型区分,发现了15个gp60亚型,而且它们均属于同一家族。发现了2个mucin亚型,二者也仅相差一个重复序列的拷贝。人源和动物源分离株的遗传相似性说明该基因型具有人兽共患性。因此,该基因型感染人有可能是源于啮齿动物,并通过水源性途径进行传播。5.卡耶塔环孢子虫（Cyclospora cayetanensis）是环孢子虫属中唯一可感染人的虫种,该虫种近年来已引起了多起食源性暴发。为了建立可用于溯源的分子工具,本课题首先对来自我国的一个分离株进行了全基因组测序,进一步筛选出5个多态性的位点,建立了具有高分辨率的多位点序列分型（MLST）工具。采用该工具对来自多个国家的64个样品进行分型,鉴定出了25个多位点序列类型（MLSTs）,并发现这些MLSTs之间存在地理隔离。因此,本课题中建立的MLST方法有望被用于该虫种的地理来源追踪。综上,本课题建立了可用于隐孢子虫和环孢子虫全基因组测序的DNA的富集和质控方法,获得的全基因数据提高了我们对隐孢子虫宿主特异性和毒力差异的认识,同时还促进了高分辨率的分子溯源工具的建立。以上结果有助于了解隐孢子虫和环孢子虫的其它生物学特性,群体遗传结构,以及其它难培养病原的测序,从而为隐孢子虫病和环孢子虫病的防控提供理论依据。
张国恩,米荣升,周鹏,黄燕,秦培兰,呼高伟,曹薇,陈兆国[9]（2012）在《微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察》文中指出利用人回盲肠癌（HCT-8）细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo和Sporo-Glo进行染色,观察不同发育阶段的隐孢子虫形态。结果显示,在六孔培养板中接种10×105个细胞后,24h后长成80%～100%单细胞层,可以用来接种微小隐孢子虫。培养72h后观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。结果表明,成功建立了微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型。
张国恩[10]（2011）在《隐孢子虫rP23间接ELISA诊断方法及体内瞬时转染系统的构建》文中认为隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）感染动物和人引起的一种寄生虫病,以自限性水样腹泻为主要症状。隐孢子虫能感染170多种动物,其中哺乳动物至少有79种。隐孢子虫卵囊在环境中普遍存在,人类可以通过多种途径获得感染。但目前隐孢子虫病还没有特效的治疗药物,因而对其进行检测与预防很重要。本实验利用酶切法从重组质粒pMD18-T-P23中获得隐孢子虫鼠基因型（Cryptosporidium mouse genotype）P23基因,克隆到pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX-P23。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果发现rP23可分别与兔隐孢子虫感染兔阳性血清、贝氏隐孢子虫感染鸡阳性血清、微小隐孢子虫感染牛阳性血清、隐孢子虫鼠基因型感染鼠阳性血清特异性反应,而不与兔、鸡、牛、鼠阴性血清反应,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。以纯化的重组蛋白rP23为抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,对其敏感性、特异性和重复性进行观察;利用建立的方法,对临床血清样品进行检测。结果成功地建立了隐孢子虫间接ELISA检测技术,其最适抗原包被浓度为2μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:800,酶标二抗最佳稀释倍数为1:2000,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用建立的rP23-ELISA检测方法,对23份临床血清样品进行了检测,并与Sheather’s蔗糖漂浮法、nested PCR法检测结果进行比较。结果显示,建立的rP23-ELISA方法检出率高于Sheather’s蔗糖漂浮法和nested PCR法。表明该方法具有敏感性高、特异性强,重复性好、价格低廉、操作简单、能批量检测等特点,可用来对临床样品进行检测,为研制隐孢子虫病ELISA检测试剂盒打下了基础。为建立微小隐孢子虫体外感染模型,并对其在细胞内的生长发育过程进行观察,利用人回盲肠癌细胞（HCT-8细胞）作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养。结果,在6孔培养板中接种1×106、5×105、1×105个细胞后,在24 h、48 h、72 h后长成7080%单细胞层,可以用来接种1×105个微小隐孢子虫。用含有1%血清浓度的培养基来培养微小隐孢子虫,培养72 h后,通过Crypt-a-Glo?和Sporo-Glo?抗体荧光染色,成功观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。为探索绿色荧光蛋白（EGFP）在隐孢子虫中的瞬时表达情况,分别扩增了微小隐孢子虫自身蛋白子孢子表面抗原CP15、热激蛋白70、组蛋白H4、肌动蛋白、微管素蛋白和ATP酶的启动子序列,并将外源蛋白EGFP基因置于其启动子中,共构建了30个穿梭转染质粒。通过电转染导入微小隐孢子卵囊中,培养72 h后,用流式细胞仪、荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP表达情况。结果pSEI和pAET两个质粒转染组流式细胞仪和荧光显微镜检测均观察到EGFP荧光,RT-PCR检测扩增出了特异性条带,表明本研究建立了隐孢子虫体内瞬时转染系统,可以在隐孢子虫体内表达绿色荧光,为下一步稳定表达外源蛋白打下了基础。
二、隐孢子虫的体外培养和感染动物模型的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、隐孢子虫的体外培养和感染动物模型的研究进展（论文提纲范文）
（1）微小隐孢子虫与HCT-8细胞互作蛋白质组学及相关蛋白生物学功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| 第一篇 文献综述 微小隐孢子虫与宿主细胞相互作用机制研究进展 |
| 引言 |
| 1.1 隐孢子虫分类地位 |
| 1.2 隐孢子虫生活史及体外培养 |
| 1.3 隐孢子虫基因组及生物学特性 |
| 1.4 隐孢子虫蛋白组学研究进展 |
| 1.5 隐孢子虫与宿主细胞相互作用分子机制 |
| 1.6 隐孢子虫感染的细胞生物学研究 |
| 1.7 隐孢子虫病治疗策略和药物研发 |
| 1.8 亟待解决的问题与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 C.parvum卵囊纯化及子孢子的制备 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫株及实验动物 |
| 1.1.2 主要实验仪器和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 C.parvum卵囊的传代及纯化 |
| 1.2.2 C.parvum卵囊不同脱囊方法比较 |
| 1.2.3 C.parvum子孢子的制备 |
| 1.2.4 C.parvum子孢子感染HCT-8 细胞时间过程 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 C.parvum卵囊及子孢子纯化结果 |
| 2.2 不同脱囊方法效果比较 |
| 2.3 C.parvum子孢子感染HCT-8 细胞时间过程探究 |
| 3 结论与讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 C.parvum感染HCT-8 细胞分泌蛋白组学研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫株 |
| 1.1.2 试剂与试剂盒 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 C.parvum子孢子的制备 |
| 1.2.2 HCT-8细胞无血清培养 |
| 1.2.3 分泌蛋白的收集与处理 |
| 1.2.4 分泌蛋白浓度测定 |
| 1.2.5 SDS-PAGE分析 |
| 1.2.6 酶解及TMT标记 |
| 1.2.7 数据库搜索 |
| 1.2.8 生物信息学分析方法 |
| 1.2.9 TMT验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 分泌蛋白蛋白浓度测定 |
| 2.2 SDS-PAGE分析 |
| 2.3 质控分析 |
| 2.4 C.parvum子孢子分泌蛋白分析 |
| 2.4.1 蛋白定性和定量结果 |
| 2.4.2 定性分泌蛋白GO注释和亚细胞定位分析 |
| 2.4.3 定性蛋白GO富集 |
| 2.4.4 定性分泌蛋白KEGG富集 |
| 2.5 差异分泌蛋白的总体分析 |
| 2.5.1 COG/KOG分析 |
| 2.5.2 GO注释和亚细胞结构定位分析 |
| 2.5.3 GO、KEGG和 domain富集分析 |
| 2.6 TMT验证试验 |
| 3 讨论与结论 |
| 4 小结 |
| 第三章 C.parvum感染HCT-8 细胞膜蛋白组学研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 子孢子的制备 |
| 1.2.2 HCT-8细胞无血清培养 |
| 1.2.3 HCT-8细胞膜蛋白的提取 |
| 1.2.4 膜蛋白富集及浓度测定 |
| 1.2.5 SDS-PAGE分析及Western blot鉴定 |
| 1.2.6 基于TMT定量蛋白质组学及生物信息学分析 |
| 1.2.7 qRT-PCR验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 膜蛋白的富集及浓度测定 |
| 2.2 SDS-PAGE分析及Western blot鉴定 |
| 2.3 蛋白鉴定总览 |
| 2.4 样品质控分析 |
| 2.5 差异蛋白COG/KOG功能分类分析 |
| 2.6 差异蛋白GO聚类分析 |
| 2.7 差异表达蛋白GO富集 |
| 2.8 差异表达蛋白KEGG富集 |
| 2.9 差异表达蛋白结构域富集 |
| 2.10 KEGG富集聚类分析 |
| 2.11 部分差异表达膜蛋白功能分析 |
| 2.12 TMT组学验证 |
| 2.13 C.parvum感染对HCT-8 细胞E-cadherin蛋白的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 CpTrap/CpCrisp/CpCarp蛋白在C.parvum入侵HCT-8 细胞过程中的生物学功能研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫株与细胞系 |
| 1.1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 1.1.3 主要试验仪器 |
| 1.1.4 SDS-PAGE胶配制 |
| 1.1.5 Western Blot所需溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 C.parvum含 CAP结构域蛋白功能分析 |
| 1.2.2 CpTrap/CpCrisp/CpCarp基因的克隆与表达 |
| 1.2.3 CpTrap/CpCrisp/CpCarp重组蛋白多克隆抗体制备及效价检测 |
| 1.2.4 CpTrap/CpCrisp/CpCarp在卵囊和子孢子中定位分析 |
| 1.2.5 CpTrap/CpCrisp/CpCarp在内生发育阶段定位分析 |
| 1.2.6 CpTrap/CpCrisp/CpCarp基因不同发育阶段表达量检测 |
| 1.2.7 抗体阻断试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 C.parvum含 CAP结构域蛋白功能分析 |
| 2.2 CpTrap/CpCrisp/CpCarp基因序列分析 |
| 2.3 目的基因克隆 |
| 2.4 转化克隆及PCR鉴定 |
| 2.5 重组表达质粒PCR鉴定 |
| 2.6 重组表达质粒酶切鉴定 |
| 2.7 重组蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.8 重组蛋白Western Blot鉴定 |
| 2.9 重组蛋白多克隆抗体效价检测 |
| 2.10 CpTrap、CpCrisp和 CpCarp天然蛋白鉴定 |
| 2.11 CpTrap/CpCrisp/CpCarp蛋白亚细胞定位分析 |
| 2.12 CpTrap/CpCrisp/CpCarp基因表达模式分析 |
| 2.13 抗体阻断试验 |
| 3 结论与讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结与创新点 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 个人简介 |
（2）C5a/C5aR信号在微小隐孢子虫感染中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 隐孢子虫病免疫学研究进展 |
| 1.1 隐孢子虫病概述 |
| 1.1.1 隐孢子虫的种类 |
| 1.1.2 隐孢子虫的生活史 |
| 1.1.3 隐孢子虫的感染状况 |
| 1.1.4 隐孢子虫病的临床症状及病理变化 |
| 1.1.5 隐孢子虫病的诊断 |
| 1.1.6 隐孢子虫病的治疗 |
| 1.2 宿主抗隐孢子虫感染免疫研究 |
| 1.2.1 隐孢子虫感染动物模型研究概况 |
| 1.2.2 固有免疫 |
| 1.2.3 获得性免疫 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 C.parvum感染乳鼠模型的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 C.parvum感染乳鼠回肠组织中隐孢子虫HSP70 相对表达情况 |
| 2.2.2 C.parvum感染乳鼠回肠组织病理学观察结果 |
| 2.2.3 C.parvum感染乳鼠大肠内容物的改良抗酸染色结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 C.parvum感染乳鼠回肠组织中C5a和 C5a R的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 C.parvum感染乳鼠回肠组织中C5a的 m RNA表达结果 |
| 3.2.2 C.parvum感染乳鼠回肠组织中C5a R的 m RNA表达结果 |
| 3.2.3 C.parvum感染乳鼠回肠组织中C5a R的分布和表达结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 C5a/C5a R信号对C.parvum感染乳鼠CD4+T 细胞亚群相关因子的调节作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 C.parvum感染乳鼠CD4+T 细胞亚群相关因子的表达结果 |
| 4.2.2 C.parvum感染C5a R抑制乳鼠回肠组织中CD4+T 细胞亚群相关因子的表达结果 |
| 4.2.3 C.parvum感染C5a R抑制乳鼠回肠组织的病理观察结果 |
| 4.2.4 C.parvum感染C5a R抑制乳鼠回肠组织的HSP70 表达结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白组学分析及诊断标识蛋白鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中英文缩略语表 |
| 摘要 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1. 隐孢子虫概述 |
| 1.1 隐孢子虫概述 |
| 1.2 隐孢子虫生活史 |
| 2 隐孢子虫卵囊纯化及体外脱囊 |
| 2.1 隐孢子虫卵囊纯化分离 |
| 2.2 隐孢子虫体外脱囊 |
| 3. 隐孢子虫卵囊壁研究进展 |
| 4. 隐孢子虫蛋白质组学研究 |
| 5. 隐孢子虫检测和诊断研究进展 |
| 第二部分 微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁分离纯化 |
| 1. 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 粪便样品来源 |
| 2.1.2 主要生物试剂 |
| 2.1.3 耗材与仪器 |
| 2.1.3.1 耗材 |
| 2.1.3.2 主要仪器 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 隐孢子虫卵囊收集 |
| 2.2.2 安氏隐孢子虫虫种鉴定 |
| 2.2.3 隐孢子虫卵囊纯化 |
| 2.2.4 隐孢子虫体外脱囊 |
| 2.2.5 隐孢子虫卵囊壁分离纯化 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 隐孢子虫卵囊纯化结果 |
| 3.2 隐孢子虫脱囊率 |
| 3.3 隐孢子虫卵囊壁分离结果 |
| 4 结论和讨论 |
| 第三部分 微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁定性蛋白组学 |
| 1. 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 卵囊壁来源 |
| 2.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 生物信息学分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品准备 |
| 2.2.2 卵囊壁蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.3 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.4 胰酶降解和HPLC分级 |
| 2.2.5 液相色谱-质谱联用分析 |
| 2.2.6 数据库搜索 |
| 2.2.7 蛋白注释及功能富集 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 蛋白提取质控 |
| 3.2 蛋白鉴定结果统计 |
| 3.3 鉴定到蛋白功能注释 |
| 3.3.1 鉴定到蛋白的功能分类 |
| 3.3.2 鉴定到蛋白的亚细胞定位分类 |
| 3.3.3 鉴定到蛋白的COG/KOG功能分类 |
| 3.4 鉴定到蛋白功能富集 |
| 3.4.1 KEGG通路富集 |
| 3.4.2 蛋白结构域富集 |
| 4 结论和讨论 |
| 第四部分 微小隐孢子虫cgd7_5140和安氏隐孢子虫cand_020680基因的克隆表达与定位 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫株、质粒和菌株 |
| 2.1.2 试验试剂与试剂盒 |
| 2.1.2.1 主要试验试剂 |
| 2.1.2.2 主要试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 C.parvum和C.andersoni全基因组DNA提取 |
| 2.2.2 基因序列分析及引物设计合成 |
| 2.2.3 目的基因的PCR扩增 |
| 2.2.4 重组克隆载体的构建 |
| 2.2.4.1 Cpcgd7＿5140和Cacand＿020680PCR产物回收纯化 |
| 2.2.4.2 链接pMD18-T载体 |
| 2.2.4.3 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞 |
| 2.2.4.4 单菌落PCR验证及测序 |
| 2.2.4.5 重组克隆质粒的提取与双酶切鉴定 |
| 2.2.4.5.1 重组克隆质粒的提取 |
| 2.2.4.5.2 重组克隆质粒双酶切鉴定 |
| 2.2.5 重组表达载体的构建 |
| 2.2.5.1 pGEX-4T-1表达载体双酶切 |
| 2.2.5.2 目的基因与pGEX-4T-1表达载体的连接 |
| 2.2.5.3 重组表达载体的鉴定 |
| 2.2.6 重组蛋白的表达与验证 |
| 2.2.6.1 重组表达载体转化E.coli Rosetta |
| 2.2.6.2 单菌落PCR验证及测序 |
| 2.2.6.3 重组蛋白的体外诱导表达 |
| 2.2.6.4 重组蛋白SDS-PAGE检测 |
| 2.2.6.4.1 蛋白样品处理 |
| 2.2.6.4.2 SDS-PAGE胶的配制 |
| 2.2.6.4.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.6.5 Western-blot验证重组蛋白 |
| 2.2.7 重组蛋白的纯化及浓度测定 |
| 2.2.8 多克隆抗体的制备与检测 |
| 2.2.8.1 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.8.2 多克隆抗体效价检测 |
| 2.2.9 目的蛋白在隐孢子虫卵囊上的表达定位 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 蛋白序列分析预测 |
| 3.2 Cpcgd7＿5140和Cacand＿020680序列扩增 |
| 3.3 重组克隆质粒验证与鉴定 |
| 3.4 重组表达质粒验证与鉴定 |
| 3.5 重组蛋白质的诱导表达、鉴定与纯化 |
| 3.6 多克隆抗体效价检测 |
| 3.7 隐孢子虫卵囊中目的蛋白的表达定位 |
| 4 结论和讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 蛋白表达系统选择及纯化分析 |
| 4.3 抗血清的制备 |
| 4.4 重组蛋白在隐孢子虫卵囊上表达定位分析 |
| 第五部分 结论和创新点 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（4）隐孢子虫体外培养模型研究进展（论文提纲范文）
| 1 鸡胚及鸡胚器官培养模型 |
| 2 细胞培养模型 |
| 3 无细胞培养模型 |
| 4 3D培养模型 |
| 5 肠道类器官培养模型 |
| 6 结语 |
（5）CRISPR/Cas9技术高效构建与鉴定恶性疟原虫基因修饰虫株及对树鼩感染的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、疟原虫简介 |
| 二、恶性疟原虫的基因组及重要功能基因 |
| 三、恶性疟原虫基因转染的载体和方法及相关研究 |
| 四、CRISPR/Cas9系统的结构原理及在恶性疟原虫中的相关研究 |
| 五、酪蛋白激酶Ⅱ的生物学功能及其致病性 |
| 六、丝氨酸/苏氨酸激酶的生物学功能及其致病性 |
| 七、脾脏切除在恶性疟原虫动物模型中的研究 |
| 八、本研究的目的意义 |
| 第一部分 CRISPR/Cas9技术高效地构建恶性疟原虫pL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK重组虫株研究 |
| 一、材料与仪器 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 主要仪器 |
| 二、实验方法 |
| 1. 恶性疟原虫复苏、培养及冻存 |
| 2. Percoll同步化培养 |
| 3. 恶性疟原虫基因组提取 |
| 4. 通用质粒pL6CS-hDHFR和PUF1-BSD-Cas9以及标签整合质粒pL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK的构建 |
| 5. 恶性疟原虫电击转染(Pre-load法) |
| 6. pL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK重组虫株的PCR鉴定与测序 |
| 7. pL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK重组虫株Western blotting鉴定 |
| 8. 免疫荧光分析(IFA) CK2β1/CK2α/STK在细胞中的定位 |
| 三、实验结果 |
| 1. 恶性疟原虫体外同步化培养结果 |
| 2. 通用质粒pUF1-BSD-Cas9和pL6CS-hDHFR的鉴定结果 |
| 3. 标签整合相关质粒pL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK鉴定 |
| 4. 恶性疟原虫电击转染获得重组虫株 |
| 5. 重组恶性疟原虫的PCR鉴定结果 |
| 6. 重组恶性疟原虫的DNA测序结果 |
| 7. 重组恶性疟原虫的western blotting鉴定结果 |
| 8. 免疫荧光分析CK2α/CK2β1/STK虫株在细胞中的定位结果 |
| 四、小结 |
| 五、讨论 |
| 第二部分 pL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK基因修饰重组虫株对感染树鼩实验研究 |
| 一、材料与仪器 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 主要仪器 |
| 二、实验方法 |
| 1. 基因重组恶性疟原虫在树鼩红细胞中体外适应性培养方法 |
| 2. 基因重组恶性疟原虫树鼩体内感染实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 基因重组恶性疟原虫在树鼩红细胞中体外适应性培养结果 |
| 2. 基因重组恶性疟原虫树鼩体内感染结果 |
| 四、小结 |
| 五、讨论 |
| 创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 恶性疟原虫体内外感染动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 CK2β1/CK2α/STK基因序列 |
| 附录三 引物序列 |
| 致谢 |
| 研究生简历 |
（6）微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对细胞miRNAs和TLRs的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 隐孢子虫的研究进展 |
| 2 microRNA和 TLRs的研究进展 |
| 3 miRNA和 TLRs参与隐孢子虫感染和宿主防御的平衡 |
| 3.1 miRNA和 TLRs参与隐孢子虫的感染 |
| 3.2 miRNA和 TLRs参与宿主抑制或者清除隐孢子虫 |
| 3.3 miRNA和 TLRs参与寄生与宿主的保护机制的平衡 |
| 4 小结 |
| 第二部分 牛源微小隐孢子虫IId亚型卵囊分离纯化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 第三部分 牛源微小隐孢子虫IId亚型卵囊早期感染对HCT-8 细胞miRNAs影响及生物信息学分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 第四部分 牛源微小隐孢子虫IId亚型卵囊早期感染对HCT-8 细胞TLRs影响及生物信息学分析表达差异显着的miRNAs和 TLRs的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 第五部分 全文结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 个人简历 |
（7）微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞相关microRNAs表达图谱分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.隐孢子虫研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 隐孢子虫分类学及主要有效虫种 |
| 1.2.2 隐孢子虫虫种/基因型和基因亚型分型 |
| 1.2.3 卵囊形态及生活史 |
| 1.3 微小隐孢子虫卵囊收集与纯化研究 |
| 1.3.1 卵囊获取方法 |
| 1.3.2 卵囊纯化研究 |
| 1.3.3 卵囊活性鉴定研究 |
| 1.4 体外细胞培养研究 |
| 2.MicroRNA研究进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 MicroRNA的生物合成及作用机制 |
| 2.3 MicroRNA表达水平的检测技术 |
| 2.4 MicroRNA在寄生虫学方面的研究 |
| 2.5 MicroRNA靶基因预测与生物信息学 |
| 3.小结 |
| 第二部分 牛源微小隐孢子虫卵囊纯化方法建立 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 卵囊传代结果与分析 |
| 3.2 卵囊除脂结果与分析 |
| 3.3 卵囊纯化结果与分析 |
| 4.结论与讨论 |
| 第三部分 牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型在HCT-8细胞中的内生发育研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 Giemsa染色法观察细胞中C.parvum的内生发育过程 |
| 3.2 HCT-8 细胞中不同时间点 C. parvum 检测 |
| 4.结论与讨论 |
| 第四部分 牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞相关microRNA表达谱分析 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 总RNA浓度、纯度及质量控制测定 |
| 3.2 试验组与试验对照组差异表达microRNA筛选及聚类分析 |
| 3.3 靶基因预测结果 |
| 4.结论与讨论 |
| 第五部分 全文结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 个人简介 |
（8）隐孢子虫和环孢子虫的全基因组测序及其在分型工具建立中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 隐孢子虫和环孢子虫概述 |
| 1.1.1 临床症状和易感人群 |
| 1.1.2 隐孢子虫和环孢子虫在我国人群中的分布 |
| 1.1.3 主要的传播途径和感染来源 |
| 1.1.4 对公共卫生的影响及防控策略 |
| 1.2 隐孢子虫和环孢子虫的生物学特性 |
| 1.2.1 隐孢子虫的分类学地位、形态和生活史 |
| 1.2.2 环孢子虫的分类学地位、形态和生活史 |
| 1.2.3 隐孢子虫的虫种和基因型 |
| 1.2.4 环孢子虫的虫种和基因型 |
| 1.3 隐孢子虫和环孢子虫的卵囊分离纯化技术 |
| 1.3.1 漂浮法 |
| 1.3.2 密度梯度离心 |
| 1.3.3 免疫磁分离法 |
| 1.3.4 流式细胞仪技术 |
| 1.4 隐孢子虫和环孢子虫分子流行病学检测和分型工具 |
| 1.4.1 基于隐孢子虫和环孢子虫的SSU rRNA基因的分子诊断工具 |
| 1.4.2 基于隐孢子虫和环孢子虫的内转录间隔区的分子诊断工具 |
| 1.4.3 基于隐孢子虫的gp60基因的分子诊断工具 |
| 1.4.4 基于隐孢子虫的微卫星和小卫星序列的多位点序列分型工具 |
| 1.5 隐孢子虫基因组学研究进展 |
| 1.5.1 微小隐孢子虫和人隐孢子虫的基因组 |
| 1.5.2 微小隐孢子虫和人隐孢子虫的比较基因组学研究 |
| 1.6 本课题主要的研究内容和意义 |
| 第2章 用于全基因组测序的隐孢子虫基因组DNA的分离、富集和质控方法 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 数据分析软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 卵囊纯化 |
| 2.3.2 DNA提取和全基因组扩增 |
| 2.3.3 检验WGA产物中隐孢子虫基因组含量 |
| 2.3.4 检验WGA产物中隐孢子虫基因组DNA的纯度 |
| 2.3.5 采用第二代测序技术对WGA产物进行全基因组测序 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 全基因组扩增的效率 |
| 2.4.2 采用克隆-Sanger测序法检测WGA产物的纯度 |
| 2.4.3 采用第二代测序技术检测WGA产物的纯度 |
| 2.4.4 WGA产物的基因组覆盖度 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 比较基因组学分析揭示人隐孢子虫高毒力亚型产生的遗传基础以及微小隐孢子虫广宿主的可能原因 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 样品采集 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 数据分析软件 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 卵囊纯化和全基因组扩增 |
| 3.3.2 全基因组扩增产物的质量控制 |
| 3.3.3 全基因组测序 |
| 3.3.4 比较基因组学分析 |
| 3.3.5 PCR验证 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 人隐孢子虫的全基因组测序数据以及从头拼接 |
| 3.4.2 测序基因组的覆盖度 |
| 3.4.3 人隐孢子虫的基因组与微小隐孢子虫Iowa分离株的基因组的序列相似度及其物理结构特征 |
| 3.4.4 微小隐孢子虫和人隐孢子虫特异性的序列 |
| 3.4.5 与已报道的人隐孢子虫TU502分离株基因组的序列相似度 |
| 3.4.6 人隐孢子虫高毒力亚型的基因组之间的序列相似性以及遗传重组的出现 |
| 3.4.7 gp60位点重复序列区的样品内序列多样性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 微小隐孢子虫和人隐孢子虫的基因组之间的相似性、基因的缺失和种特异性基因 |
| 3.5.2 人隐孢子虫基因组间的序列相似性以及高毒力的人隐孢子虫亚型中的遗传重组 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 隐孢子虫花栗鼠基因型Ⅰ的亚型区分工具的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 样品采集 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 数据分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 卵囊纯化和全基因组扩增 |
| 4.3.2 全基因组扩增产物的质量控制 |
| 4.3.3 全基因组测序 |
| 4.3.4 gp60基因和cgd1_470 mucin基因的PCR |
| 4.3.5 PCR扩增产物检验 |
| 4.3.6 PCR扩增产物测序 |
| 4.3.7 PCR产物序列分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 全基因组测序数据 |
| 4.4.2 gp60基因特性 |
| 4.4.3 gp60基因和cgd1_470 mucin基因的PCR扩增效率 |
| 4.4.4 gp60亚型和mucin亚型 |
| 4.4.5 gp60亚型间的进化关系 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 环孢子虫全基因组测序以及多位点序列分型方法的建立 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 样品采集 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 数据分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 卵囊纯化 |
| 5.3.2 卵囊DNA提取和全基因组扩增 |
| 5.3.3 检验全基因扩增产物中环孢子虫基因组的含量 |
| 5.3.4 检验WGA产物中环孢子虫基因组DNA的纯度 |
| 5.3.5 全基因组测序 |
| 5.3.6 微卫星和小卫星位点的PCR检测 |
| 5.3.7 PCR产物检验 |
| 5.3.8 PCR产物测序 |
| 5.3.9 PCR产物序列分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 全基因组扩增的效率 |
| 5.4.2 卡耶塔环孢子虫的全基因组序列 |
| 5.4.3 微卫星和小卫星序列的初筛 |
| 5.4.4 初筛的遗传位点的扩增效率 |
| 5.4.5 多态性遗传位点的扩增效率 |
| 5.4.6 多态性位点的序列特征 |
| 5.4.7 5个位点上不同序列类型之间的系统进化关系 |
| 5.4.8 多位点序列类型 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 结论和创新点 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）隐孢子虫rP23间接ELISA诊断方法及体内瞬时转染系统的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 隐孢子虫病研究概况 |
| 1.1 隐孢子虫病原学与分类学研究进展 |
| 1.2 隐孢子虫病的分子流行病学研究进展 |
| 1.3 隐孢子虫检测方法的研究进展 |
| 1.4 隐孢子虫体外培养研究进展 |
| 1.5 隐孢子虫转基因技术研究进展 |
| 1.6 隐孢子虫病的治疗与预防 |
| 1.7 展望 |
| 第二章 隐孢子虫P23 基因的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 血清 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒pMD18-T-P23 的鉴定 |
| 2.2.2 原核表达质粒pGEX-P23 的构建与鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒pGEX-P23 的表达与表达产物的纯化 |
| 2.2.4 rP23 的Western blot分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒pMD18-T-P23 的鉴定 |
| 2.3.2 原核表达质粒pGEX-P23 的鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒 pGEX-P23 转化菌的表达及表达产物的纯化 |
| 2.3.4 rP23 的 Western blot 分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 隐孢子虫抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 质粒与菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 血清及粪便样品 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 rP23-ELISA间接诊断方法的建立 |
| 3.2.2 田间样品检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.2 田间样品检测及敏感性、特异性试验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 微小隐孢子虫在HCT-8 细胞上的培养研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞与菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要溶液的配制 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HCT-8 细胞的培养 |
| 4.2.2 HCT-8 细胞培养方法的优化 |
| 4.2.3 微小隐孢子虫卵囊收集与纯化 |
| 4.2.4 微小隐孢子虫的体外培养 |
| 4.2.5 微小隐孢子虫体外培养各阶段形态的免疫荧光观察 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 HCT-8 细胞培养方法的优化 |
| 4.3.2 微小隐孢子虫收集与纯化 |
| 4.3.3 微小隐孢子虫卵囊活力检测 |
| 4.3.4 微小隐孢子虫体外培养各阶段形态的免疫荧光观察 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 微小隐孢子虫体内瞬时转染系统的初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞与菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要溶液的配制 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 启动子序列的克隆 |
| 5.2.2 EGFP表达盒转染质粒（含有TUB-3'UTR）的构建 |
| 5.2.3 EGFP表达盒转染载体（除TUB-3'UTR）的构建 |
| 5.2.4 电穿孔转染 |
| 5.2.5 转染隐孢子虫EGFP表达检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 启动子序列的克隆 |
| 5.3.2 EGFP表达盒转染载体的构建 |
| 5.3.3 转染隐孢子虫EGFP表达检测 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 1.隐孢子虫 P23 基因的原核表达 |
| 2.隐孢子虫抗体间接 ELISA 诊断方法的建立 |
| 3.微小隐孢子虫在 HCT-8 细胞上的培养研究 |
| 4.微小隐孢子虫体内瞬时转染系统的初步研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、隐孢子虫的体外培养和感染动物模型的研究进展（论文参考文献）
- [1]微小隐孢子虫与HCT-8细胞互作蛋白质组学及相关蛋白生物学功能研究[D]. 崔朝辉. 河南农业大学, 2020
- [2]C5a/C5aR信号在微小隐孢子虫感染中的作用研究[D]. 原亚杰. 西北农林科技大学, 2020
- [3]微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白组学分析及诊断标识蛋白鉴定[D]. 王璐阳. 河南农业大学, 2020
- [4]隐孢子虫体外培养模型研究进展[J]. 牛子文,常艳凯,王克,张龙现. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020(03)
- [5]CRISPR/Cas9技术高效构建与鉴定恶性疟原虫基因修饰虫株及对树鼩感染的初步研究[D]. 匡德宣. 北京协和医学院, 2018(02)
- [6]微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对细胞miRNAs和TLRs的影响[D]. 王臣荣. 河南农业大学, 2017(05)
- [7]微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞相关microRNAs表达图谱分析[D]. 刘利敏. 河南农业大学, 2015(04)
- [8]隐孢子虫和环孢子虫的全基因组测序及其在分型工具建立中的应用[D]. 郭亚琼. 华东理工大学, 2015(10)
- [9]微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察[J]. 张国恩,米荣升,周鹏,黄燕,秦培兰,呼高伟,曹薇,陈兆国. 中国兽医科学, 2012(02)
- [10]隐孢子虫rP23间接ELISA诊断方法及体内瞬时转染系统的构建[D]. 张国恩. 中国农业科学院, 2011(10)