一、胚胎移植牛剖腹产保障犊牛成活的技术探讨（论文文献综述）
程磊[1]（2013）在《体细胞克隆技术的若干改进及其在转基因克隆牛中的应用》文中研究表明自从1997年世界首例体细胞克隆绵羊多莉诞生以来,体细胞核移植技术在多个物种中得以成功实践。转基因技术与体细胞克隆技术相结合是目前制备转基因大动物的主要手段。但由于克隆技术体系并不完善,至今仍未克服克隆效率低的问题。而转基因技术的介入,使得转基因克隆技术又增加了更多的变数。在转基因动物制备过程中出现了很多问题,如胚胎移植后妊娠率低、流产率高、胎儿发育异常、出生死亡率高等。而外源基因整合效率低,以及外源基因的沉默或丢失等现象更加制约了这项技术的实际应用。在总结了大量的前期工作的基础上,我们对以牛为主的体细胞克隆体系进行了系统的改进与调整。包括卵母细胞的成熟、去核时间段的选择、重构胚激活处理方式、胚胎培养、受体母牛的发情状态与胚胎发育时期的匹配等都进行了改进,形成了一套较为完整的牛体细胞克隆技术体系。利用改进的技术体系开展了大规模的转基因克隆牛生产。共完成对33043枚卵母细胞的去核与注核操作,得到融合胚胎26548枚,生产出各种转基因克隆囊胚7519枚,规模化克隆囊胚效率为28.3%。共移植受体牛1523头,妊娠414头,妊娠率为27.2%。通过将体细胞克隆技术的系统改进与大规模的转基因克隆牛生产实践相结合,发现并尽可能地解决了克隆技术产业化过程中的存在的一些问题,对克隆及转基因克隆技术的产业化应用具有较强的指导意义。1、牛体细胞克隆技术的若干改进与优化本研究对牛体细胞核移植的技术程序进行了以下几个方面的改进和优化：两步法培养卵母细胞、优化了激活时间点、两步激活处理等。结果显示：1)在成熟培养的第16h去除卵丘细胞后,继续培养至20-22h后进行核移植操作,相比传统的20-22h去除卵丘的一步培养法能显着的提高去核率（95.1%vs74.3%,P<0.05）和克隆胚胎的囊胚发育率（46.9%vs36.5%,P<0.05）,并显着降低了囊胚细胞的异常核型的比例（P<0.05）。2)对融合后的重构胚胎进行免疫组化分析显示,融合后的1h和2h,分别有96%和80%的胚胎染色体会出现早期染色体凝集。而3h至4h后这一比例会降至50%以下,染色体也会渐渐扩散或成拉长的带状分布。当时间延长至5h-6h时,超过80%的胚胎会出现染色体四散漂移或分成几部分的现象。因此我们将融合和激活的间隔时间控制在2h以内。3)从成熟时间算起第22、24、25、26、27、28小时开始激活重构胚,发现26小时激活可以获得最高的囊胚率。4)使用离子霉素对融合胚的两次激活,显着提高了克隆胚胎的发育率和后期妊娠率（50.5%vs35.6%,P<0.05）。2、克隆胚胎的选择与受体母牛发情状态的匹配本研究试图通过选择适宜发育阶段的转基因克隆胚胎与同期发情的受体合理匹配来提高妊娠率,降低流产率。研究结果显示：1)试验中胚胎的发育速度不尽相同,在发育6、7、8、9天得到的囊胚中,发育六天的囊胚有着最高的孵化率（82.4%vs46.2%vs16.1%vs7.1%,P<0.01）,囊胚质量显着提高。胚胎移植后的妊娠率也显着高于其他组。2)为了探讨转基因克隆胚胎与受体最佳的匹配方式,将不同胚龄的胚胎移植到发情6、7、8天的受体中,发现发情6天的受体移植早期囊胚和紧缩桑葚胚的妊娠率最高,发情7天的受体早期囊胚和囊胚的妊娠率最高,而发情8天的受体则更适合移植扩张囊胚和孵化囊胚。3)为了找到最适合的移植胚胎数量,我们将1枚、2枚或3枚胚胎移植到同期发情受体中,45天妊检发现移植1枚胚胎的妊娠率明显偏低（57.9%vs69.8%vs71.4%, P<0.05）,而移植2枚和3枚胚胎的受体会出现较高的早期流产率（P<0.05）,从而造成其妊娠到期率反而会低于移植1枚胚胎组（45.4%vs29.5%vs25.0%,P<0.05）。4)对于冷冻胚胎的选择结果显示,玻璃化冷冻后相对于其他发育阶段的胚胎,孵化囊胚的复苏率最高可达到100%,而且还有着最高的移植妊娠率。3、多不饱和脂肪酸去饱和酶基因（fat-1）的转基因克隆牛制备从线虫中分离筛选出fat-1基因,人源化处理后构建成无筛选标记的安全转基因表达载体。转染奶牛胎儿成纤维细胞后,筛选出阳性细胞作为核供体,通过体细胞克隆技术生产出fat-1转基因奶牛ZK002。对转基因奶牛进行检测显示,fat-1基因已成功整合到其基因组内。耳皮肤组织的脂肪酸含量分析显示,所有ω-3PUFAs含量明显上升,ω-6PUFAs含量则显着下降。在自然交配产犊后,我们分析了乳汁中的脂肪酸含量,相比对照组ZK002乳汁中的ω-3PUFAs含量明显上升,ω-6/ω-3PUFAs的比率也大幅下降至1左右。
朱化彬[2]（2011）在《奶牛体外胚胎生产技术的研究》文中研究指明体外受精和体细胞克隆技术是提供牛胚胎移植胚胎来源的重要技术方法。本试验（论文）研究了影响牛体外性控胚胎影响因素（试验一）和体细胞克隆的影响因素（试验二）,研究了不同冷冻方法对牛体外受精和体细胞克隆胚胎ATP含量和ROS水平的影响（试验三）,利用实时定量PCR研究了马-牛异种体细胞克隆胚胎线粒体DNA情况（试验四）,得到以下试验结果:试验一:本实验研究了卵母细胞体外成熟后卵丘细胞脱除程度、种公牛个体以及性控精液受精滴体积、性控精子密度等对牛体外性控胚胎生产的影响。试验结果表明:1、卵丘细胞部分脱除组的卵裂率（67±4.74%）显着性高于不脱除组（41±2.23%）、完全脱除组（37.50±2.88%）（P<0.05）;2、种公牛B的性控精液进行体外受精,囊胚率（26.53±3.31%）要显着高于A公牛（17.65±3.65%）和C公牛（16.67±2.36%）（P<0.05）;3、50μL～100μL受精滴囊胚率（20.41±4.33%～23.38±4.47%）无显着性差异（P>0.05）,但显着性高于40μL、30μL的囊胚率（13.79±2.02%、12.12±3.73%）（P<0.05）;4、精子密度0.5×106个/ mL～1×106个/mL的囊胚率（22.58±2.17%～27.27±3.49%）相比无显着性差异（P>0.05）,但显着性高于0.3×106个/mL-1组的囊胚率（16.13±3.46%）（P<0.05）。试验二:本试验研究了奶牛克隆重构胚不同化学激活方法、克隆重构胚体外培养条件和公牛和母牛供体细胞等对奶牛手工克隆和显微注射克隆效率的影响。试验结果表明:（1）建立了优秀种公牛体细胞系20个,高产奶牛体细胞系4个;（2）A23187+6-DMAP和A23187+放线菌酮组合处理激活体细胞克隆重构胚卵裂率（82.62% VS 78.15%）和囊胚率（34.15% VS 30.21%）差异不显着,但是A23187+6-DMAP囊胚质量较好;（3）克隆重构胚在mCR1aa培养液卵裂率（83.65%）和囊胚率（34.36%）,均显着高于SOF和CR1aa两种培养液;（4）血清饥饿处理供体细胞的克隆重构胚融合率（90.52%±2.62）、卵裂率81.27%±3.68和囊胚率（31.46%±2.42）和接触抑制的克隆重构胚（89.25%±1.92）、（82.44%±4.42）、（30.44%±2.77）差异不显着;（5）种牛克隆胚胎移植妊娠率37.0%（10/27）,其中青年荷斯坦母牛移植妊娠率（46.2%）显着高于经产西门塔尔杂交受体母牛（28.6%）。西门答尔杂交受体母牛移植克隆胚胎后分别在妊娠的70～90d内流产,1头荷斯坦母牛妊娠受体101天后屠宰,1头荷斯坦母牛妊娠155天流产2个胎儿,1头荷斯坦妊娠149天流产2个胎儿。试验三:本实验采用常规法或玻璃化法（OPS法）冷冻保存牛IVF囊胚和SCNT囊胚,利用ATP Bioluminescence Assay Kit HS II和GENMED ROS Assay Kit检测冷冻-解冻后囊胚ATP含量和ROS水平。试验结果表明:1、IVF和SCNT囊胚OPS法冷冻-解冻后存活率（92.24±4.54%,78.71±5.91%）均显着高于常规冷冻法（81.56±2.33%、47.89±5.83%）（P<0.05）;2、IVF囊胚和SCNT囊胚OPS法冷冻-解冻后ATP含量（0.62±0.04 pmol, 0.30±0.01 pmol）均显着高于常规冷冻法（0.43±0.06 pmol, 0.21±0.02 pmol）（P<0.05）;但是均显着低于相应的IVF或SCNT对照组新鲜囊胚（0.74±0.05 pmol,0.39±0.01 pmol）;3、玻璃化冷冻IVF囊胚（72.14±4.31 cps）、SCNT囊胚（40.11±5.73 cps）ROS水平高于新鲜IVF囊胚（47.33±3.56 cps）、SCNT囊胚（26.44±1.49 cps）（P<0.05）,常规冷冻组则与此相反（34.41±3.32 cps vs.47.33±3.56 cps;15.46±2.45 cps vs.26.44±1.49 cps）（P<0.05）。试验四:本试验研究了手工克隆和显微注射方法对马-牛异种克隆效率的影响,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测马-牛异种克隆胚胎不同发育阶段线粒体编码基因细胞色素B的转录水平。试验结果表明:（1）手工方法克隆马-牛异种重构胚融合率（95.12%）、卵裂率（97.07%）显着高于显微注射法的融合率（70.25%）和卵裂率（85.21%）,但两者之间的囊胚率差异不显着（2.64%±1.68 vs2.36%±1.59）;（2）供体马CYBT基因的表达水平在1-细胞期的重构胚中表达量最高,而在囊胚期,却没有检测到该基因的转录本。牛CYBT基因,在1-细胞期到8-细胞期,其表达量逐渐下降,而在16-细胞期的异种克隆胚中,该基因的表达量急剧升高到最高值,比1-细胞期增加了11倍,随后囊胚期表达水平锐减到为起始水平的2倍。
辛晓玲[3]（2011）在《特定转录因子诱导新生牛成纤维细胞为多能性干细胞的研究》文中进行了进一步梳理胚胎干细胞（ESCs）一般由胚胎的内细胞团分离而来,具有无限增殖和多向分化潜能,但人类ESCs的分离由于需要损坏早期胚胎,受到法律和伦理道德的约束。最近,应用几种转录因子诱导小鼠体细胞转变为诱导型多能干细胞（iPSCs）获得成功,这种iPS细胞与小鼠ES细胞在形态、增殖、基因表达和体内外分化等方面基本一致。人类体细胞随后也被成功诱导为iPS细胞,这种方法不需要破坏人类胚胎,这些人类iPS细胞可分化为患者自体的各种细胞,在细胞治疗和再生医学方面具有重大意义。之后,猕猴、大鼠、猪等物种也得到iPS细胞。动物iPS细胞除可用于建立动物疾病模型和药物筛选等医学领域,对于家畜遗传育种和基因改良等畜牧业生产亦意义重大,但牛iPS细胞的诱导研究迄今未见报道。本试验应用人和小鼠诱导iPS细胞的方法,将几种转录因子通过反转录病毒载体导入牛体细胞,诱导产生牛iPS细胞,并对其特性加以检测。经过试验,取得了如下结果：（1）本试验成功地从胎牛原始生殖嵴中克隆出963 bp的牛sox2基因开放阅读框序列,与发表的牛sox2基因序列（NM-001105463）比对,其核苷酸同源性为99.6%,对应氨基酸同源性为99.7%；以生长接触抑制的胎牛肾上皮细胞（MDBK）为材料,克隆出1434bp的牛Klf4基因开放阅读框序列,经测序并与发表的牛Klf4基因序列（NM-001105385）比对,其核苷酸与对应氨基酸序列同源性达99.9%。（2）将基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo,成功构建pMSCV-sox2 （pMS）和pMSCV-klf4 （pMK）真核表达载体。将pMS和pMK分别转染包装细胞PT67,分布得到稳定的产毒细胞株,MSCV-sox2病毒滴度达8.16×107CFU/mL, MSCV-klf4病毒滴度达7.16×107CFU/mL。电镜下观察病毒上清,可看到典型的反转录病毒颗粒形态。（3）本试验应用四转录因子组合Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4,以反转录病毒载体为介导,诱导新生奶公牛成纤维细胞（NBF）,以人羊膜（HAM）为饲养层,成功得到ESCs样的细胞集落,诱导所得到的细胞被命名为iPS-NBF细胞。（4）牛iPS-NBF细胞AKP染色阳性,Nanog、Oct4、Sox2、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、TERT的免疫荧光染色阳性,而SSEA-1免疫荧光染色为阴性。经实时定量PCR分析,牛iPS-NBF细胞的有关多能性基因nanog、oct4、sox2已被有效激活,表达量接近牛PGCs。经核型分析发现传代至第15代的牛iPS-NBF细胞仍保持正常的二倍体核型。（5）用类胚体介导方法,牛iPS-NBF细胞自发分化为多种形态的细胞,通过免疫荧光染色和RT-PCR分析,证明牛iPS-NBF细胞在体外可以分化为三个胚层类型的细胞。（6）将牛iPS-NBF细胞注入免疫缺陷鼠皮下成功得到畸胎瘤,HE染色显示,肿瘤包含有中胚层（肌肉、血管、软骨等）和内胚层（内脏上皮）组织,而外胚层组织在切片中未找到。（7）把10-15个牛iPS-NBF细胞注射入小鼠的8-细胞胚或桑椹胚内,成功得到6只成活的牛-鼠嵌合体小鼠,经牛特异性线粒体D-loop序列检测,证实牛iPS-NBF细胞参与了嵌合体小鼠多种组织的发育,包括心脏、血液、肺、胃肠道、胃、肾、神经组织、骨骼肌和性腺等。（8）采用Nanog、Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4和Lin28六个转录因子,以不同的组合（2因子SO；3因子NOS；4因子OSCK和NOSL;5因子NOSKL;6因子NOSCKL）来诱导牛NBF细胞重编程,结果显示,几种组合都可以成功诱导体细胞重编程获得干细胞样集落,与4因子组比较,5因子和6因子组诱导效率显着提高,而2因子和3因子组诱导细胞集落少,且不典型,可能是体细胞未能被完全重编程。
郑聪颖[4]（2010）在《山羊胎儿成纤维细胞的培养鉴定及其转基因核移植效率的研究》文中研究表明实验一:本实验主要利用了SRY-PCR技术对四株奶山羊胎儿成纤维细胞系进行了性别鉴定,并检测了细胞周期抑制剂roscovitine,DMSO对山羊供体细胞的同期化作用,以确定它们是否可用于山羊供体细胞的同期化处理。SRY-PCR结果显示,有三株细胞为雌性细胞,一株细胞为雄性细胞。同期化检验的结果表明,与传统的血清饥饿法相比,阻断药物的处理都显着提高了供体细胞的同步化程度。其中15uM roscovitine处理48h显着增加了G0+G1期细胞比例（87.70%）,但G0期细胞比例并未显着增加（6.84%）。1% DMSO处理48h诱导32.54%的细胞进入G0期。TUNEL细胞凋亡法分析发现,与血清饥饿法处理相比,周期阻断药物roscovitine（1.42%）,DMSO（0.9%）与正常增殖的细胞（1.12%）相比并没有增加凋亡率。这表明SRY-PCR技术可运用于成纤维细胞的性别鉴定,roscovitine和DMSO也可用于核移植过程中的供体细胞同期化处理。实验二:本实验主要检测了四株不同个体来源的胎儿成纤维细胞GFF1, GFF2, GFF3和GFF4对外源基因的转染效率,以及对核移植重构胚发育能力的影响。利用四株胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,并对重构胚囊胚率进行比较。实验结果表明,利用四组胎儿成纤维细胞作为供体细胞,其重构胚囊胚率存在显着差异（16.46±0.42%, 16.13±1.26%, 17.02±1.54% VS 7.69±0.28%.）。对四株胎儿成纤维细胞进行PEGFP-C1转染,G418筛选后比较转基因阳性细胞克隆数和可扩增的阳性细胞克隆数,实验结果表明,GFF1和GFF2的G418阳性克隆数和可扩增单克隆细胞数目都显着高于GFF3和GFF4（P<0.05）。实验结果表明,供体细胞的遗传背景,对核移植重构胚发育能力,以及对外源基因的转染效率的也有所影响。实验三:为了优化山羊核移植胚胎体外培养体系,提高核移植效率,本研究检测了山羊体细胞核移植（SCNT）胚胎在序贯培养液G1/G2中的发育率和囊胚细胞凋亡,以及核移植胚胎移植后的妊娠率,以传统mSOF-FBS培养液作为对照组,评估序贯培养液G1/G2支持山羊核移植胚胎的发育能力。结果显示,G1/G2组的囊胚发育率与对照组差异不显着（27.7±3.1% vs 25.3±1.0%,P>0.05）;囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡率mSOF-FBS组显着高于G1/G2组（分别为109.1±6.2 vs 93.2±4.5和11.3±0.1% vs 4.9±0.2%,P<0.05）,但移植后的妊娠率G1/G2组显着高于mSOF-FBS组（21.4% vs 8.0%,P<0.05）。结果表明,与传统的培养液mSOF-FBS相比,序贯培养液G1/G2能更好地支持山羊核移植胚胎的发育。
黄雅琼[5]（2008）在《猪体细胞核移植相关技术研究》文中研究指明1.探讨了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程和卵母细胞的发育潜力。（1）不同直径卵泡内的卵母细胞的成熟进程及各时相出现的时间存在差异。直径＞2mm的卵泡内的卵母细胞体外培养16 h,大部分发生GVBD（germinal vesicle breakdown）;卵母细胞GV期的比率由0h的68.00%下降到16h的15.38%;成熟培养20h时,终变期（diakinesis,DK）的比率达到峰值（27.06%）,而MⅠ的峰值（69.69%）出现在培养后28h;成熟培养32～44h时,Ana-Ⅰ/Tel-Ⅰ期的比率达到最高（53.33%）;成熟培养48h时,MⅡ期的比率达到最大值（63.64%）。（2）不同直径卵泡的卵母细胞体外成熟后的孤雌发育能力不同。直径＜2mm、直径2～6mm、直径＞6mm的卵泡的卵母细胞的成熟率分别为5.12%,66.63%和46.72%;分裂率分别为1.42%,72.19%和58.54%;囊胚率分别为0、28.76%和23.13%。直径＜2mm和＞6mm卵泡内的卵母细胞的卵裂率明显低于直径2～6mm卵泡的卵母细胞的卵裂率（P＜0.05）。直径2～6mm卵泡内的卵母细胞体外成熟较快,体外发育潜能较高。2.探讨了激素和生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母细胞成熟率显着高于添加0.01IU/mL人绝经期促性腺激素（hMG）的卵母细胞成熟率（P＜0.05）,但两组间的分裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。猪卵母细胞分别在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生长因子（EGF）的成熟液中成熟培养后进行孤雌激活,50ng/mL EGF组的成熟率达到66.89%,孤雌激活的分裂率达到84.90%,囊胚率达到30.20%,成熟率显着高于其余各组,分裂率和囊胚率高于对照组。在成熟液中添加10ng/mL胰岛素样生长因子（IGF-I）显着提高猪卵母细胞的第一极体排出率。在成熟液中同时添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I显着提高猪卵母细胞的孤雌发育能力（P＜0.05）。分别使用以TCM-199、NCSU-23（North Carolina State University-23,北卡大学胚胎培养液）和PZM-3为基础液的成熟液进行成熟培养猪卵母细胞,各组间在分裂率,成熟率和囊胚率方面差异不显着（P＞0.05）,表明均可用于猪卵母细胞的体外成熟和体外培养。3.系统探讨了孤雌激活方法对猪卵母细胞孤雌发育效果的影响。结果发现:（1）浓度为9%的乙醇（EH）激活处理10min效果好于15min;（2）用9%EH激活处理10min后,再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养处理3～4h的卵母细胞分裂率及囊胚率分别为82.86%和22.86%,显着高于再用10μg/mL放线菌酮（CHX）+10mmol/L SrCL2(Sr2+)、10 mmol/L Sr2++2μmol/L 6-DMAP、10μ/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10μg/mL CHX+2μmol/L 6-DMAP+10 mmol/L Sr2+培养处理3～4h的卵母细胞。（3）比较几种激活方法（5μmol/L Ion激活处理5min,9%乙醇激活处理10min,50 v/mm和50μs的电脉冲2次）的猪卵母细胞孤雌激活效果发现,离子霉素（Ion）的猪卵母细胞孤雌激活效果最好,囊胚率达到37.50%。（4）卵母细胞周围的卵丘细胞层数对其成熟后的孤雌发育有显着影响,4～6层和6层以上卵丘-卵母细胞复合体成熟后的孤雌激活分裂率（68.99%和75.36%）和囊胚率（32.56%和37.68%）显着高于其它组（p＜0.05）。4.对猪卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和睾丸间质细胞的分离和传代培养进行了系统研究。结果发现,猪卵丘细胞单层的生长需要5～6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。酶消化法和钢网过滤筛选法可获得猪睾丸间质细胞,猪睾丸间质细胞单层生长需要3～5d。猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后,复苏率为68.36%。通过培养和观察,猪胎儿成纤维细胞的生长形成有规则的生长曲线。5.对猪体细胞核移植的方法及影响因素进行了探索。（1）猪卵母细胞体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后,分别进行去核构建重构胚,结果发现,成熟44h和48h的卵母细胞核移植后的融合率（58.99%和56.51%）、卵裂率（67.52%和65.73%）和囊胚率（22.78%和15.96%）较高,其中卵龄为44h的分裂率与囊胚率显着高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞（P＜0.05）。卵龄为48h的融合率高于卵龄为52h的卵母细胞（P＜0.05）。（2）盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系统去核法的去核率分别为76.33%,100.00%,98.40%,前者低于后两者（P＜0.05）;三种去核方法去核的卵母细胞核移植后,分裂率以Hoechest染色法较低（P＜0.05）,但融合率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同注核方法（细胞质内注射法和透明带下注射法）的核移植效果研究结果显示,细胞质内注射和透明带下注射法的分裂率为（68.13%和60.37%）与囊胚率（6.44%和8.08%）差异均不显着（P＞0.05）。6.探讨了供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响。（1）比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现,胎儿成纤维细胞的融合率（64.74%）高于颗粒细胞（51.05%）和卵丘细胞（56.89%）,但三种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（2）不同代数的胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现,6～9代的融合率显着高于3～5代和＞10代的成纤维细胞（P＞0.05）,但卵裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同性别猪胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现:雄性胎儿成纤维细胞核移植的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞相比差异不显着（P＞0.05）,但囊胚率显着低于雌性胎儿成纤维细胞（P＜0.05）。（4）100%长满汇合的胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70～80%汇合的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,但囊胚率差异不显着。（5）猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后的核移植分裂率和囊胚率均显着低于新鲜和4℃冷藏的细胞（P＜0.05）,虽然融合率无显着差异（P＞0.05）,表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植。（6）表面光滑的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率均显着高于表面粗糙的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率（P＜0.05）,虽然融合率差异不显着（P＞0.05）。（7）直径＜15μm的供体细胞核移植后的融合率显着低于直径＞30μm的供体细胞（P＜0.05）,直径20～3μm供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率（63.73%和21.54%）较高。（8）组织块法和酶消化法分离得到的供体细胞所构建的重构胚在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显着差异（P＞0.05）。
吕培茹[6]（2008）在《巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴—猪异种体细胞核移植相关问题的初步研究》文中研究表明本研究主要探讨巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴-猪异种核移植的相关技术问题。本论文包括两大部分,第一部分是文献综述,第二部分是试验研究。试验研究包括:（一）猪和食蟹猴体细胞培养体系的建立;（二）巴马小型猪体细胞核移植体系的建立;（三）PHA对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育的影响;（四）猪体细胞核移植胚胎移植方法的建立;（五）食蟹猴-猪异种核移植的初步研究。试验研究的方法和结果可归纳为如下几点:1.建立巴马小型猪睾丸成纤维细胞、耳部成纤维细胞、普通猪胎儿成纤维细胞和颗粒细胞的体外培养体系,并探讨其作为猪体细胞核移植供体的可能性。使用酶消化和组织块法成功分离培养了睾丸成纤维细胞,鉴定了其细胞类型,并且对其细胞周期与核心组蛋白（H3K9）乙酰化的关系进行了研究。结果表明,该培养体系可以支持上述几种细胞的体外生长。免疫荧光染色鉴定所分离到的细胞为睾丸成纤维细胞。两种同期化方法（血清饥饿和接触抑制）的结果显示:随着血清饥饿时间的延长G0+G1细胞的比例急剧升高后又趋于稳定,2d、4d组与70-80%汇合组差异显着（75.9%,95.9%vs.95.2%,P＜0.05）,但2d、4d组差异不显着;细胞随着汇合度的增加G0+G1细胞的比例开始上升,接触抑制两天后基本趋于稳定,2d组、4d和6d组显着高于70-80%汇合组和100%汇合组（97.3%,95.0%,97.4%vs.74.7%,84.2%,P＜0.05）。流式细胞仪分析显示:无论是血清饥饿还是接触抑制处理,G0/G1期供体细胞组蛋白乙酰化水平变化趋势基本相同,基本上是先升高后又降低。2.建立了食蟹猴耳部成纤维细胞的体外培养体系,并探讨其作为猴同种体细胞核移植或异种体细胞核移植供体的可能性。分别使用酶消化和组织块法分离到了食蟹猴耳部成纤维细胞,间接免疫荧光法鉴定了其细胞类型并进行了核型分析。结果表明:该培养体系可以很好地支持该种细胞的体外生长,目前已传代到43代,生长仍旺盛;免疫荧光染色鉴定分离到的细胞为耳部成纤维细胞;对21代的细胞进行核型分析,核型正常。3.本试验的目的是:A.掌握猪卵母细胞成熟过程中第一极体的位置随时间发生偏移的规律,为提高盲吸法去核效率提供依据;B.初步探讨胎儿成纤维细胞和颗粒细胞核移植效率;C.胚胎培养时添加胰岛素对孤雌激活和颗粒核移植胚胎发育率的影响;D.探讨简易融合仪对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育能力的影响。结果表明:在44-46h,有84.7%的极体位置偏移不超过30°,盲吸法的去核率基本与之对应,平均在88.1%,适于在本段时间进行去核。胎儿成纤维细胞、颗粒细胞核移植胚胎的囊胚率分别为9.9%和8.7%。Insulin无论对于颗粒细胞核移植胚胎（8.0%vs.2.4%,P＞0.05）,还是孤雌激活胚胎均无显着促进作用（47.3%vs.44.3%,P＞0.05）,但孤雌激活胚胎的囊胚显着高于核移植胚胎（47.3%和44.3%vs.8.0%和2.4%,P＜0.05）。简易融合仪下,对于核移植胚胎,场强为200v/mm组的桑椹胚发育率均高于220v/mm组（33.3%,29.6%vs.17.1%,13.8%,P＞0.05）;场强一定时,20μs组的桑椹胚率均高于40μs组。随着场强的升高和脉冲时间的延长,桑椹胚发育率呈下降趋势。对于孤雌激活胚胎,20μs组的分裂率和囊胚率均高于40μs组,但差异不显着。;4.对睾丸成纤维细胞进行血清饥饿和接触抑制处理,寻找适宜的同期化方法,同时探讨了高代睾丸成纤维细胞重构胚胎的核重塑的规律,并比较了高代、低代睾丸成纤维细胞和耳部成纤维细胞重构胚胎的发育率。结果显示:接触抑制法处理供体,核移植胚胎融合率显着高于血清饥饿法（68.6%vs.55.3%,P＜0.05）,胚胎囊胚率也高于后者（21.1%vs.14.1%;P＞0.05）,但差异不显着;重构胚胎激活后3h,供体核的大小基本不发生变化,激活后6h,绝大多数重构胚形成膨大的类原核,到12h时,几乎所有重构胚形成膨大的类原核,并开始观察到重构胚分裂现象;低代睾丸成纤维细胞和耳部成纤维作为供体细胞时,重构胚胎的融合率均显着高于高代睾丸成纤维细胞（84.4%,79.1%vs.69.2%,P＜0.05）,前两者的重构胚融合率也差异显着（84.4%vs.79.1%,P＜0.05）,低代睾丸成纤维细胞作为供体细胞时重构胚胎的囊胚率显着高于高代睾丸成纤维细胞和耳成纤维细胞（13.9%,8.9%vs.6.4%,P＜0.05）。5.探讨了植物凝集素（PHA）对于化学激活、电激活孤雌激活胚胎和体细胞核移植胚胎发育能力的影响。结果表明:添加适量PHA可以提高化学激活胚胎的囊胚率,10μg/mlPHA可以使囊胚率提高到54.1%;加入量大则有害;添加10μg/ml,20μg/ml的PHA可以显着提高体细胞核移植囊胚发育率（13.0%,5.6%vs.5.0%,P＜0.05）,10μg/ml组的囊胚率比对照组提高1倍多。总之,PHA对于化学激活、电激活和体细胞核移植胚胎的作用呈剂量依赖性,适量添加有助于三种胚胎的发育,过量则有害。6.以胎儿成纤维细胞和新生巴马小型猪睾丸成纤维细胞为供体构建的重构胚胎,利用刺入式胚胎移植法将其分别移入两头巴马小型猪和两头陆川猪的输卵管内。其中两头巴马小型猪和一头陆川猪返情,一头陆川猪怀孕到期,产下一头健康的雄性巴马小型猪。说明新生巴马小型猪睾丸成纤维细胞核移植胚胎可以发育到期。7.采用食蟹猴耳部成纤维细胞作为核供体构建猴-猪异种核移植胚胎,研究其核重编机制并寻找适宜的培养基,初步建立食蟹猴-猪异种核移植体系。结果显示:（1）重构胚胎激活后3h,供体核的大小基本不发生变化,但在激活后6h大部分形成膨大的类原核。（2）食蟹猴-猪异种核移植胚胎融合率为74.2%,有70.5%的重构胚胎发生卵裂,29%的卵裂胚胎发育到桑椹胚阶段。（3）NCSU23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中,重构胚突破4-细胞阻滞发育到8-细胞以上的比例分别为23.5%和17.0%,NCSU23培养基为19.9%,但是只有在NCSU23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中重构胚胎可以发育到囊胚阶段（1.4%vs.1.1%,P＞0.05）,尽管差异不显着。
黄伟伟[7]（2007）在《牛体细胞核移植的研究》文中研究表明本研究以牛卵母细胞为材料,体外成熟培养牛卵母细胞,同时分离牛耳皮肤成纤维细胞和颗粒细胞为供核细胞,对牛卵母细胞体外成熟培养和核移植的影响因素进行了探讨,优化了牛体细胞核移植技术方案,为进一步进行转基因牛和分离牛ntESCs的研究奠定了基础。实验主要结果如下:1.供核细胞的准备从两头荷斯坦奶牛采取耳组织块,采用组织块法分离得2株成纤维细胞株BEF422和BEF274,并取第13代BFF422进行核型分析,核型正常（2n=60,XX）,证明细胞在传代培养过程中染色体数目未发生异常。可以作为供核细胞使用。利用成熟后的COCs的颗粒细胞,可以简单快速的分离得到颗粒细胞。2.牛卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集牛卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:⑴在基础培养液(TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/L HEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mL ITS+0.1 IU/mL hMG+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF中分别添加FBS, NBS, BSA和PVA四种血清或血清替代物,其中添加10mg/ml BSA和10%FBS的成熟率无显着差异,但均显着高于10%NBS和1.0%PVA（P < 0.05）;激活后,添加10mg/ml BSA的分裂率显着高于其他三组（P < 0.05）, 10%FBS与1.0%PVA之间差异不显着,10%NBS分裂率最低。囊胚率1.0%PVA显着高于其他组,10mg/ml BSA和10%FBS之间囊胚率差异不显着,10%NBS囊胚率最低。表明添加10mg/ml BSA和10%FBS对牛卵母细胞成熟率和激活后胚胎发育率差异不大,二者可以相互代替用于牛卵母细胞体外成熟。⑵在无血清体外成熟培养体系中添加50μg/ml的尿嘧啶能提高牛卵母细胞的成熟率和囊胚率,与添加0,100,150μg/ml时的牛卵母细胞成熟率间存在差异显着（P < 0.05）,表明在成熟培养液中添加50μg/ml的尿嘧啶,既能促进牛卵母细胞的体外成熟,又能提高牛孤雌胚囊胚发育率。⑶在无血清体外成熟培养体系中添加不同浓度的ATP均不能提高牛卵母细胞的成熟率,但添加500,750μg/ml的ATP能提高牛卵母细胞激活后的囊胚发育率,与添加0,250μg/ml组相比存在差异显着（P <0.05）, 500,750μg/ml组间差异不显着（P >0.05）,但以添加500μg/ml时的囊胚发育率最高。表明在成熟培养液中添加ATP不能促进牛卵母细胞的体外成熟,但能提高牛孤雌胚囊胚发育率,尤其是添加500μg/mlATP的效果最佳。因此,使用TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/L HEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mL ITS+0.1 IU/mL hMG+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF+10mg/ml BSA+50μg/ml尿嘧啶的无血清体外成熟培养体系比较有利于牛卵母细胞体外成熟和激活后胚胎发育。3.牛体细胞核移植⑴比较不同融合方案对牛重构胚融合及胚胎发育的影响。方案③（1.9KV/cm,10μs,一次电脉冲）的融合率（70.05%vs 59.48%,59.24%,33.07%, P <0.05）和激活后囊胚率（37.6%vs 20.24%,32.53%,18.92%, P <0.05）显着高于其他三组,表明方案③的融合效果最好,并能够促进重构胚的发育,提高囊胚率。⑵筛选最佳融合电压和脉冲时间。以方案③为基础方案,对融合电压和脉冲时间进行优化。结果显示1.9KV/cm的融合率,分裂率,囊胚率均高于1.8KV/cm和2.0 KV/cm组（P < 0.05）;10μs和15μs组之间的融合率,分裂率及囊胚率均高于20μs组（P < 0.05）,但二者之间差异不显着（P>0.05）,15μs囊胚率稍高于10μs。表明1.9KV/cm和15μs是较为适宜的融合电压和脉冲时间。⑶筛选最佳激活方法。离子酶素+6-DMAP的分裂率（91.6%vs 88.04%,87.5%,89.91%, P <0.05）和囊胚率（37.61%vs 34.93%,26.37%,32.65%, P <0.05）显着高于其他三组,表明离子酶素+6-DMAP能显着提高牛重构胚地发育率,是一种良好的激活方法。⑷筛选最佳激活时间。重构胚经电融合后间隔3h激活的分裂率（90.75% vs 83.51%,86.27%, P <0.05）和囊胚率（32.41% vs 27.28%vs16.05%, P <0.05）显着高于间隔1h和2h,表明延迟3h激活对牛重构胚体外发育有利。⑸筛选最佳重构胚培养体系。牛重构胚在序贯培养液G-1/G-2中分裂率（90.91%vs85.95%vs73.50%,P<0.05）和囊胚发育率（36.67%vs 27.88%vs18.60%,P<0.05）要显着高与SOFaa和CR1aa,而CR1aa培养液也也显着高与SOFaa,表明在三种胚胎培养液中序贯培养液G-1/G-2能更好的支持牛重构胚的发育。⑹共培养效果比较。牛重构胚在序贯培养液G-1/G-2和牛颗粒细胞共培养体系中无论是分裂率,还是囊胚率均显着高于单独使用G-1/G-2序贯培养液（P<0.05）。表明在与牛颗粒细胞共培养条件下,G-1/G-2序贯培养液才能更好的支持牛重构胚的发育。⑺不同供核细胞对牛体细胞核移植的影响。三种牛体细胞（颗粒细胞、成年成纤维细胞BEF422和BEF274）中,颗粒细胞的融合率（70.35%）,分裂率（94.07%）和囊胚率（40.94%）均显着高于成年成纤维细胞BEF422和BEF274 （P<0.05）。不同个体来源的成年成纤维细胞BEF422和BEF274之间融合率和分裂率无显着差异（P>0.05）,但BEF422的囊胚率显着高于BEF274（P<0.05）。表明颗粒细胞重构胚发育率要高于成年成纤维细胞,而不同个体来源的成年成纤维细胞重构胚发育率也有差异。⑻不同代数供核细胞对牛体细胞核移植的影响。BEF422的P20～21的融合率低于P6～7细胞（68.02% vs 73.72%）,但是分裂率（92.86%）和囊胚率（38.46%）显着高于P6～7细胞（P<0.05）。表明高代数的细胞作供核的核移植效率高于低代数的细胞。⑼不同品种受体对牛体细胞重构胚妊娠率的影响。进行了23次胚胎移植试验,214枚重构桑椹胚或早期囊胚移植给43头自然发情7d的受体牛,其中荷斯坦奶牛32头,秦川牛11头。移植75d后直检34头,7头妊娠,妊娠率20.59%。荷斯坦奶牛细胞重构胚移植的荷斯坦奶牛和秦川牛受体中,妊娠率无显着差异（P>0.05）。表明胚胎移植受体的品种差异对牛核移植胚胎的妊娠率影响不大。
宋继梅[8]（2007）在《东北虎体细胞异种核移植》文中研究说明1.本研究用两种不同的组织块培养法进行了东北虎体细胞的原代培养,并比较了不同培养基、不同血清浓度及不同浓度的表皮生长因子（EGF）和胰岛素（insulin）对第7代东北虎皮肤成纤维细胞生长的影响,结果表明,用组织块培养法、冷消化过夜后组织块培养法,均能成功地进行东北虎皮肤成纤维细胞的原代培养;培养基DMEM/F-12及以DMEM/F-12为基础培养基添加20% （V/V）FBS更适于东北虎皮肤成纤维细胞的培养;以含10% FBS的DMEM/F-12为基础培养基添加1ng/mL EGF、10ng/mL EGF均能显着促进细胞生长,而添加5μg/mL、50μg/mL insulin对细胞生长无促进作用。2.用组织块直接培养法和冷消化过夜处理后组织块培养法,均能成功地分离培养东北虎耳皮肤成纤维细胞。培养的细胞具有正常的成纤维细胞形态和正常的生长曲线及染色体数目;通过流式细胞仪检测细胞周期发现,随着汇合程度的增加,G0/G1期细胞所占的比例也升高。40%～50%与80%～90%、95%～100%汇合程度的细胞间G0/G1期和S期所占比例显着差异;80%～90%与95%～100%两汇合程度的细胞间G0/G1期和S期所占比例差异不显着。对相同汇合度（80%～90%）的细胞进行0.5%血清饥饿处理组与未处理组比较,饥饿处理组G0/G1期细胞比例略高,但差异不显着。95%～100%汇合组G0/G1期细胞比例稍高于饥饿组,但差异不显着。所以在核移植中,供体细胞不必进行常规血清饥饿处理,当细胞达到80%～90%以上汇合时,单就G0/G1期细胞比例而言,血清饥饿处理完全可以由接触抑制来代替。3.在基础成熟液中,添加20%（V/V）发情当天、3天牛血清（OCSD0、OCSD3）能显着提高牛卵母细胞的成熟率;添加20%（V/V）发情第5天、7天牛血清（OCSD5、OCSD7）与对照组（添加20%FBS）相比无显着差异。添加30ng/mL EGF、50μg/mL insulin及50μg/mL insulin+30ng/mL EGF,与对照组相比,30ng/mL EGF组极显着地提高了牛卵母细胞成熟率,而添加50μg/mL insulin及50μg/mL insulin+30ng/mL EGF组牛卵母细胞成熟率稍低于对照组,但差异不显着。添加0.1μg/mL孕酮,成熟率显着降低;添加有溶血和无溶血的OCSD3,无溶血组显着提高牛卵母细胞成熟率,溶血组则显着降低。4.用离子酶素联合6D激活牛卵母细胞,卵裂率和囊胚率分别为79%和20%以上,可以满足体细胞核移植的需要。用7%乙醇、7%乙醇联合6D及用离子酶素联合6D激活兔卵母细胞其卵裂率分别为75.6%、76.3%、77.8%;囊胚率分别为18.4%、14.3%、18.6%,差异均不显着,三种方法都可有效地激活兔卵母细胞。5.本研究比较了在成熟液中添加发情当天的牛血清（OCSD0）、在胚胎培养液中添加EGF、insulin及孕酮、不同时期的发情牛血清对孤雌激活胚胎发育潜力的影响。结果显示,成熟培养液中添加OCSD0与FBS组相比,囊胚发育率无显着差异;培养液中添加EGF、insulin、孕酮与对照组相比,卵裂率和囊胚发育率均有显着提高。其中,添加孕酮组,卵裂率最高,为87.9%;添加insulin组,囊胚发育率最高,为61.3%。培养液中添加不同时期发情牛血清与对照组相比,卵裂率无显着差异,发情当天、3天、5天、7天牛血清组囊胚发育率显着高于对照组,7天组为最高,为65.8%。6.分别以处于40%～50%汇合、80%～90%汇合、95%～100%汇合及经0.5%的血清饥饿3天处理的东北虎皮肤成纤维细胞（80%～90%汇合）为供体细胞时,四组的重组胚卵裂率、囊胚发育率均无显着差异, 95%～100%汇合组,卵裂率和囊胚发育率均稍高于其它各组。在比较注核与重组胚激活的不同时间间隔（0.5h、1h、2h、3h）对重构胚卵裂和囊胚发育的影响时,结果发现,重组胚激活前供体细胞在受体卵母细胞胞质内停留的时间越长,重组胚的卵裂率越高;而囊胚发育率则均无显着差异,但随着间隔时间的延长,囊胚发育率有增加的趋势。表明在核移植时,延长核质相互作用时间,可以提高重组胚的卵裂率和囊胚发育率。7.用培养的东北虎皮肤成纤维细胞以每次1×106细胞/只的量腹腔注射免疫小鼠,每2周1次,共免疫2次。4周后尾静脉采血分离血清,测定效价为1:256。早期传代东北虎成纤维细胞及对照牛成纤维细胞以免疫血清为一抗,荧光标记兔抗鼠IgG为二抗,原位染色,荧光显微镜观察,结果显示免疫血清对东北虎皮肤成纤维细胞具有特异性,而牛成纤维细胞无特异性反应。东北虎成纤维细胞免疫小鼠血清作为一抗,荧光标记兔抗鼠IgG为二抗,进行荧光染色,检测不同时期重组克隆胚表面抗原,结果显示,桑葚胚之前着色不明显,桑葚胚以后着色明显,而对照成熟牛卵母细胞则染色不明显,说明供体东北虎体细胞表面抗原在重组胚细胞中表达,重组胚中遗传物质来自供体东北虎皮肤成纤维细胞。8.采用生物软件DNASTAR分析牛东北虎线粒体基因组,利用PCR反应延伸过程中,3′端碱基不配对,PCR反应不能启动的PCR原理,以牛虎线粒体基因组中碱基差异较大的位点作为引物的3′端来设计引物,进行PCR扩增,从而分析牛-虎异种克隆胚中线粒体的变化情况。结果表明,重构胚发育到囊胚时期,来自东北虎的线粒体已经检测不到。
高国龙[9]（2007）在《牛体细胞克隆中供体和受体细胞制备及重构胚构建的影响因素研究》文中指出体细胞克隆技术是哺乳动物胚胎工程的组成部分，它不仅有利于缩短动物繁殖育种时间和提高优良种畜的利用率，也有利于精卵受精机制的研究。在哺乳动物体细胞克隆研究中，从受体卵母细胞培养、供体细胞制备、受体细胞去核、重构胚构建、重构胚激活、重构胚培养、胚胎移植到胎儿出生，每个技术环节都会影响克隆的效率。在这些环节中，供体细胞和受体卵母细胞制备以及重构胚构建尤为关键。本试验进行了牛体细胞克隆中供体和受体细胞生产及重构胚构建的影响因素研究。研究了牛卵巢颗粒细胞和输卵管上皮细胞制备过程中细胞培养代数、血清饥饿浓度和饥饿时间对细胞周期和凋亡的影响，同时研究了血清饥饿诱导细胞产生凋亡的机理和抗氧化剂对细胞凋亡的抑制；通过提前去除培养液中的微量元素铁和铜，得到不含微量元素铁和铜的培养液，然后在培养液中分别添加定量的微量元素铁和铜，通过体外受精技术研究微量元素铁和铜对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育的影响；研究了低渗液处理供体颗粒细胞对胞质直接注射克隆研究中重构胚构建和随后重构胚发育的影响。1．研究了体细胞克隆中供体细胞制备过程中细胞培养代数、血清饥饿浓度和饥饿时间对体细胞周期的影响。体细胞为牛卵巢颗粒细胞和输卵管上皮细胞，细胞以碘化丙啶染色法处理，用流式细胞仪检测细胞周期。细胞传代培养至第2代、10代和25代，在0.5％和0.05％的血清饥饿浓度下诱导处理2d、3d、4d和5d。实验结果如下：第2代、10代和25代的细胞在G0／G1期的比例没有显着差异（P＞0.05）。培养液中添加0.5％FCS和0.05％FCS较对照组（10％FCS）显着提高了细胞G0／G1期的比例（P＜0.05），0.5％FCS和0.05％FCS实验组获得了相近的细胞G0／G1期比例（P＞0.05）。血清饥饿至第5d的细胞较第2d的细胞有高的G0／G1期的比例（P＜0.05）。从结果得知体外培养至不同代的牛卵巢颗粒细胞和输卵管上皮细胞对G0／G1期的比例没有影响，血清饥饿和延长血清饥饿时间能够有效诱导体细胞进入G0／G1期。2．研究了克隆的供体细胞制备过程中细胞培养代数、血清饥饿和血清饥饿时间对体细胞凋亡的影响，同时研究了血清饥饿诱导细胞产生凋亡的机理。体细胞为牛卵巢颗粒细胞和输卵管上皮细胞，细胞以Annexin V／FITC双染色法染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡。细胞传代培养至2代、10代和25代，在0.5％和0.05％的FCS饥饿浓度下诱导2d、3d、4d和5d。Caspase抑制剂z-VAD-fmk用来检测血清饥饿诱导细胞产生的凋亡是否由caspase介导。实验结果如下：第2代和第10代的细胞在凋亡率上差异不显着（P＞0.05），第25代的细胞较第2代和第10代的细胞有高的凋亡率（P＜0.05）。0.5％FCS和0.05％的FCS处理组显着提高了细胞凋亡率（P＜0.05），而且0.05％FCS较0.5％FCS有更高的细胞凋亡率（P＜0.05）。血清饥饿处理4d和5d的细胞显着提高了细胞的凋亡率（P＜0.05）。培养液中添加z-VAD-fmk能够显着降低0.5％和0.05％FCS诱导细胞产生的细胞凋亡率（P＜0.05），但对10％FCS实验组的细胞差异不显着（P＞0.05）。从结果得知牛颗粒细胞和输卵管上皮细胞体外长期培养可提高细胞凋亡率，降低血清饥饿的浓度和延长血清饥饿的时间均可造成细胞高水平的凋亡。血清饥饿诱导牛颗粒细胞和输卵管上皮细胞产生凋亡的过程包括caspase的激活。3．研究了不同抗氧化剂对在体细胞血清饥饿诱导过程中产生凋亡的影响。体细胞为牛卵巢颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞，细胞以AnnexinV／FITC双染色法染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡。10％FCS培养的细胞和0.5％FCS血清饥饿诱导处理的第5代细胞在添加抗氧化剂维生素E、硒和谷胱苷肽后培养2d，然后检测细胞凋亡率。实验结果如下：添加有维生素E、硒和谷胺酰胺的10％FCS培养的牛卵巢颗粒细胞较对照组降低了细胞凋亡率，但差异不显着（P＞0.05）。在0.5％FCS饥饿诱导处理的颗粒细胞实验组，对照组的细胞凋亡率显着高于维生素E、硒和谷胺酰胺实验组（P＜0.05）。在10％FCS培养的牛输卵管上皮细胞实验组，抗氧化剂处理组的细胞凋亡率低于实验对照组但差异不显着（P＞0.05）。在0.5％FCS饥饿诱导的牛输卵管上皮细胞实验组，维生素E、硒和谷胺酰胺处理组之间的细胞凋亡率差异不显着（P＞0.05），但较对照组显着降低了细胞的凋亡率（P＜0.05）。这些结果显示通过在培养过程中分别添加抗氧化剂维生素E、硒和谷胱苷肽能够有效抑制因血清饥饿诱导而产生的细胞凋亡，而抗氧化剂不能抑制10％FCS实验组细胞的凋亡。4．研究铁和铜对牛卵母细胞体外成熟、早期胚胎生长发育以及囊胚期细胞凋亡的影响。培养液中铁的浓度为：0（对照组），0.45mg／L，0.81mg／L，1.96mg／L和3.26mg／L；铜的浓度为：0mg／L（对照组），0.093mg／L，0.27mg／L，0.46mg／L和0.68mg／L。在卵母细胞成熟培养的22h、受精卵培养的48h、96h、144h和192h检测培养液中铁浓度（1.96mg／L）和铜浓度（0.46mg／L）的变化。在实验结果中，铁的不同添加组在卵母细胞成熟和卵裂率方面与对照组差异不显着（p＞0.05），但是铁显着提高了8细胞胚胎、桑椹胚和囊胚的发育率（p＜0.05），1.96mg／L的铁浓度显着提高了囊胚率（p＜0.05）。铜和铁对卵母细胞成熟和卵裂有相似的影响，0.46mg／L和0.68mg／L的铜显着提高了桑椹胚和囊胚的发育率（p＜0.05）。和对照组相比，铁和铜显着降低了囊胚期细胞的凋亡率（p＜0.05）。在卵母细胞体外成熟的22h和受精卵培养的48h，培养中铁浓度分别下降了3.6％和9.2％，铜浓度分别下降了6.5％和10.9％。在受精卵培养的96h，144h和192h，培养液中铁浓度分别下降21.4％，25.5％和27.0％，铜浓度分别下降了23.9％，28.3％和30.4％。本试验结果说明：培养液中的铁和铜对早期胚胎培养至8细胞、桑椹胚和囊胚有重要的作用；长期的缺铁或缺铜造成囊胚期细胞凋亡率的上升；在早期胚胎培养至8细胞后，早期胚胎对微量元素铁和铜需求的主体可能由细胞本身转向培养液。5．研究了0.075 M KCl的低渗处理液在胞质直接注射的克隆研究中对供体细胞质膜破裂的影响，通过判定随后重构胚的形成、重构胚后期发育和囊胚期细胞的凋亡来评价低渗处理液对供体细胞破膜处理的影响。根据0.075 M KCl低渗液对供体颗粒细胞处理的不同时间，将用于克隆的去核卵母细胞分为五组：0s（对照组），30s，60s，90s和180s。细胞核荧光染色用Hoechst 33342。实验结果如下：0.075 M KCl低渗液对供体颗粒细胞的不同处理时间较对照组显着提高了重构胚的形成，但180 s的实验处理组显着抑制了重构胚发育至囊胚的比例（P＜0.05），而且180s实验处理组的囊胚期细胞显示出典型的凋亡特征。这些结果显示：在胞质直接注射的克隆研究中，可以通过低渗液处理供体细胞促使供体细胞质膜的破裂来提高重构胚的构建效率，但对供体细胞长时间的低渗处理降低了重构胚发育后期囊胚的发育率，而且提高了囊胚期细胞的凋亡率。
Richard Remillard[10]（2007）在《性控胚胎和性控精液的产业化生产和应用》文中指出近年来,我国牛业得到了快速发展,特别是奶牛业的发展,取得了长足进步。在奶牛繁育、饲养管理、奶牛保健、牛奶生产、牧场建造以及相关领域均取得了较大的发展和提高,为我国奶牛业健康稳步发展提供了科技保障和坚实基础。本刊将针对奶牛业的各个领域的发展进行系列的深入报道,以促进经验交流与技术合作,促进奶牛业健康持续快速发展。在奶牛繁育领域,其先进技术得到了广泛的应用,正确的生产模式已经进入了比较成熟的生产阶段,本期内容将重点介绍我国牛业发展趋势和方向、奶牛遗传品种改良的正确途径和最优育种方案,以及奶牛胚胎移植产业化发展的成功模式。
二、胚胎移植牛剖腹产保障犊牛成活的技术探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎移植牛剖腹产保障犊牛成活的技术探讨（论文提纲范文）
（1）体细胞克隆技术的若干改进及其在转基因克隆牛中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 研究论文 |
| 第一章 牛体细胞核移植技术的改进与优化 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 克隆胚胎的选择与受体母牛发情状态的匹配 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多不饱和脂肪酸去饱和酶基因转基因克隆牛的制备 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第二部分 文献综述 |
| 第一章 体细胞核移植研究进展 |
| 1 体细胞核移植的发展历程 |
| 2 牛体细胞核移植的研究进展 |
| 3 体细胞核移植技术在应用中存在的问题 |
| 4 体细胞核移植技术的应用前景 |
| 第二章 转基因动物研究概论 |
| 1 转基因动物研究进展 |
| 2 转基因动物的制作方法 |
| 3 转基因动物的后期检测 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（2）奶牛体外胚胎生产技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 牛卵母细胞体外受精技术研究新进展 |
| 前言 |
| 1.1 影响牛卵母细胞体外受精效率的主要因素 |
| 1.2 牛卵母细胞体外受精技术研究新进展 |
| 1.3 奶牛体外性控胚胎生产 |
| 1.4 其他研究进展 |
| 1.5 牛卵母细胞体外受精存在的问题及对策 |
| 第二章 动物体细胞克隆研究进展 |
| 前言 |
| 2.1 体细胞克隆技术研究的主要成就 |
| 2.2 体细胞克隆技术程序与方法 |
| 结语 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 第一章 奶牛体外性控胚胎生产影响因素的研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 奶牛体细胞克隆技术的研究 |
| 前言 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.2 试验结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 不同冷冻方法对牛体外胚胎ATP 含量与ROS 水平的影响 |
| 3.1 试验材料与试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 第四章 马-牛异种克隆胚胎线粒体遗传分析 |
| 前言 |
| 4.1 试验材料与试验方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 第五章 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
（3）特定转录因子诱导新生牛成纤维细胞为多能性干细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 胚胎干细胞分离与体细胞核重编程策略 |
| 1.1 小鼠与人胚胎干细胞分离的研究 |
| 1.1.1 小鼠胚胎干细胞的分离 |
| 1.1.2 人胚胎干细胞的分离 |
| 1.2 牛胚胎干细胞的研究概况 |
| 1.3 由体细胞核重编程为多能干细胞的策略 |
| 1.3.1 核移植策略 |
| 1.3.2 体细胞与ES细胞融合策略 |
| 1.3.3 体细胞培养条件下自发重编程策略 |
| 1.3.4 转录因子诱导策略 |
| 1.4 胚胎干细胞应用中存在的问题及展望 |
| 第二章 诱导型多能干细胞(iPSCs)的研究进展 |
| 2.1 转录因子的选择 |
| 2.2 导入外源基因的途径 |
| 2.3 靶细胞的选择 |
| 2.4 iPS细胞的基因表达及表观遗传修饰 |
| 2.5 iPS细胞诱导和培养条件 |
| 2.6 iPS细胞的鉴定 |
| 2.7 体细胞重编程效率 |
| 2.8 iPS细胞在医学方面的应用前景 |
| 第三章 sox2基因和klf4基因的研究进展 |
| 3.1 sox2基因的发现及功能研究 |
| 3.1.1 sox2基因的发现 |
| 3.1.2 sox基因家族与SOX蛋白 |
| 3.1.3 sox2基因在体内外的表达情况 |
| 3.1.4 Sox2转录因子在干细胞维持与增殖中的作用 |
| 3.1.5 Sox2转录因子在iPSCs研究中的作用 |
| 3.2 klf4基因的发现及功能研究 |
| 3.2.1 klf基因家族及klf4基因的发现 |
| 3.2.2 klf4基因及其蛋白序列 |
| 3.2.3 KLF4的分子作用机制 |
| 3.2.4 KLF4在干细胞自我更新及体细胞核重编程中的作用 |
| 第四章 羊膜脱细胞基质的特性与应用进展 |
| 4.1 羊膜的来源 |
| 4.2 羊膜的组织结构 |
| 4.3 羊膜的生物学特性 |
| 4.3.1 羊膜的物理特性 |
| 4.3.2 羊膜的抗炎与抗菌性 |
| 4.3.3 羊膜的低免疫原性 |
| 4.4 羊膜生物支架的制备与保存 |
| 4.4.1 新鲜完整羊膜的制备 |
| 4.4.2 脱细胞羊膜的制备 |
| 4.4.3 新鲜完整羊膜与脱细胞羊膜的比较 |
| 4.4.4 羊膜的保存与使用前处理 |
| 4.4.5 保存方法对羊膜特性的影响 |
| 4.5 羊膜作为生物支架的应用 |
| 试验研究 |
| 第五章 牛sox2和klf4基因的克隆及重组反转录病毒载体的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试验仪器 |
| 5.1.3 牛sox2和klf4基因的引物设计与克隆 |
| 5.1.4 重组pMD18-T载体的构建、鉴定与测序 |
| 5.1.5 重组反转录病毒载体的构建与鉴定 |
| 5.1.6 PT67和NIH3T3的G418最小致死量测定 |
| 5.1.7 病毒颗粒的包装及产毒细胞株的建立 |
| 5.1.8 测定重组病毒滴度 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 牛sox2和klf4基因的克隆 |
| 5.2.2 重组pT-sox2质粒和pT-klf4质粒的构建、酶切鉴定与测序 |
| 5.2.3 重组反转录病毒载体pMS和pMK的构建与鉴定 |
| 5.2.4 产毒细胞株的建立 |
| 5.2.5 重组病毒滴度测定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 转录因子诱导新生牛皮肤成纤维细胞为牛iPS细胞 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要试验仪器与试剂及其配制 |
| 6.1.2 新生牛皮肤成纤维细胞分离培养 |
| 6.1.3 NBF细胞生长曲线绘制 |
| 6.1.4 人羊膜脱细胞基质的制备 |
| 6.1.5 转录因子OSCK组合诱导新生牛皮肤成纤维细胞 |
| 6.1.6 病毒感染后的细胞培养与集落形成 |
| 6.1.7 牛iPS-NBF生长行为测定 |
| 6.1.8 AKP活性及分子标记检测 |
| 6.1.9 定量PCR方法分析牛iPS-NBF细胞特定因子表达 |
| 6.1.10 减少或增加转录因子对诱导效率的影响 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 新生牛皮肤成纤维(NBF)细胞分离培养及特性 |
| 6.2.2 羊膜支架的制备 |
| 6.2.3 病毒感染后细胞形态与集落形态 |
| 6.2.4 牛iPS-NBF细胞的生长曲线、核型 |
| 6.2.5 分子标记检测结果 |
| 6.2.6 定量PCR分析有关基因的表达水平 |
| 6.2.7 不同因子组合诱导效率比较 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 关于饲养层的选择与iPS细胞的扩增 |
| 6.3.2 牛iPS-NBF细胞与牛ES细胞表面特异分子标记的比较 |
| 6.3.3 关于减少或增加转录因子对诱导效率的影响 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 牛iPS-NBF细胞多能性检测研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 主要试剂与材料 |
| 7.1.2 主要仪器 |
| 7.1.3 牛iPS-NBF细胞体外分化能力检测 |
| 7.1.4 牛iPS-NBF细胞体内分化能力检测 |
| 7.1.5 牛iPS-NBF细胞嵌合能力检测(牛-小鼠嵌合) |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 牛iPS-NBF细胞的体外分化能力 |
| 7.2.2 牛iPS-NBF细胞形成畸胎瘤的能力 |
| 7.2.3 牛-鼠嵌合体的形成 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新之处和进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）山羊胎儿成纤维细胞的培养鉴定及其转基因核移植效率的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物核移植研究概述 |
| 1.1 核移植的程序 |
| 1.1.1 受体细胞的准备 |
| 1.1.2 供体细胞的准备 |
| 1.1.3 重构胚的构建 |
| 1.1.4 重构胚的激活 |
| 1.1.5 重构胚的体外培养 |
| 1.2 体细胞核移植技术的应用 |
| 1.3 结语 |
| 第二章 山羊胎儿成纤维细胞的分离培养鉴定及细胞周期分析 |
| 2.1 试验材料和方法 |
| 2.1.1 原代细胞的分离，传代和冻存 |
| 2.1.2 细胞的性别鉴定 |
| 2.1.3 roscovitine 和DMSO 对供体细胞的同期化处理 |
| 2.1.4 实验设计 |
| 2.1.5 数据处理 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 细胞增殖 |
| 2.2.2 性别鉴定结果 |
| 2.2.3 roscovitine 和DMSO 对供体细胞的同期化处理 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 不同个体来源的胎儿成纤维细胞对转染效率和重构胚发育的影响 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 质粒的准备 |
| 3.1.2 细胞筛选药物浓度的优化 |
| 3.1.3 细胞转染及筛选 |
| 3.1.4 核移植程序 |
| 3.1.5 重构胚的激活和体外培养 |
| 3.1.6 试验设计 |
| 3.1.7 数据分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 筛选药物浓度 |
| 3.2.2 不同遗传背景的胎儿成纤维细胞株对重构胚发育能力的影响 |
| 3.2.3 不同遗传背景的胎儿成纤维细胞抗筛选能力的差异 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 序贯培养液G1/G2 对山羊核移植胚胎发育和质量的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 山羊卵母细胞的采集 |
| 4.1.2 卵母细胞的体外成熟 |
| 4.1.3 供体细胞的准备 |
| 4.1.4 核移植程序 |
| 4.1.5 重构胚的激活和体外培养 |
| 4.1.6 囊胚凋亡染色 |
| 4.1.7 胚胎移植 |
| 4.1.8 克隆羊微卫星鉴定 |
| 4.1.9 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同培养液对山羊核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.2.2 不同培养液对囊胚细胞凋亡的影响 |
| 4.2.3 不同培养液中核移植囊胚移植后的妊娠率 |
| 4.2.4 流产胎儿微卫星鉴定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）猪体细胞核移植相关技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植技术研究进展 |
| 1.核移植研究历史回顾 |
| 2.核移植技术程序 |
| 3.核移植胚胎的发育机理 |
| 4.影响核移植效果的因素 |
| 5.不同动物的核移植发展现状 |
| 6.核移植技术当前面临的问题 |
| 7.体细胞核移植的发展前景 |
| 8.核移植技术所生产的转基因食品安全性 |
| 9.体细胞核移植技术展望 |
| 10.结束语 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪卵母细胞体外成熟培养体系建立与优化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 激活方法对猪卵母细胞孤雌发育的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 猪核移植供体细胞分离与传代培养 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第六章 猪体细胞核移植方法的摸索 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第七章 供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写—中文对照表 |
| 图片与说明 |
| 个人简历 |
| 文献发表情况 |
| 致谢 |
（6）巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴—猪异种体细胞核移植相关问题的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 猪体细胞核移植国内外研究现状 |
| 2 异种体细胞核移植研究进展及存在问题 |
| 3 影响猪体细胞核移植效率的几个关键因素 |
| 3.1 供体细胞的类型及准备方案 |
| 3.2 胚胎重构策略 |
| 3.3 供体细胞的细胞周期与受体卵母细胞胞质的状态是否相协调 |
| 3.4 供体细胞重编程是否完全 |
| 4 研究的背景、目的和意义 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第一章 体细胞培养体系的建立 |
| 第一节 猪体细胞培养体系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要药品 |
| 1.2 材料获取 |
| 1.3 细胞传代培养方法 |
| 1.4 冷冻保存及复苏 |
| 1.5 细胞类型鉴定 |
| 1.6 睾丸成纤维细胞组蛋白免疫荧光染色 |
| 1.7 流式细胞仪分析细胞周期与组蛋白乙酰化水平 |
| 1.8 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原代培养 |
| 2.2 细胞冻存、解冻、复苏 |
| 2.3 细胞类型鉴定 |
| 2.4 细胞周期同期化与组蛋白乙酰化分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞培养体系的建立 |
| 3.2 细胞同期化与组蛋白乙酰化 |
| 3.3 细胞的增殖潜力和寿命 |
| 第二节 食蟹猴体细胞培养体系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要药品 |
| 1.2 材料获取 |
| 1.3 细胞传代培养方法 |
| 1.4 冷冻保存及复苏 |
| 1.5 细胞类型鉴定 |
| 1.6 细胞周期同期化 |
| 1.7 核型分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原代和传代培养 |
| 2.2 细胞冻存、解冻、复苏 |
| 2.3 细胞类型鉴定 |
| 2.4 细胞周期同期化 |
| 2.5 细胞核型分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 猪体细胞核移植体系的建立 |
| 第一节 普通猪体细胞核移植体系的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要药品及溶液 |
| 1.2 卵母细胞的收集及体外成熟 |
| 1.3 核移植 |
| 1.4 融合/激活 |
| 1.5 孤雌激活 |
| 1.6 胚胎培养 |
| 1.7 试验设计 |
| 1.8 统计方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 极体偏移情况及盲吸法去核效率 |
| 2.2 胎儿成纤维细胞和颗粒细胞核移植效率 |
| 2.3 insulin对孤雌激活胚胎和颗粒细胞核移植胚胎发育能力的影响 |
| 2.4 简易融合仪下巴马小型猪耳部成纤维细胞核移植胚胎和孤雌激活胚胎的发育能力 |
| 3 讨论 |
| 第二节 巴马小型猪体细胞核移植体系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要药品及溶液 |
| 1.2 卵母细胞的收集及体外成熟 |
| 1.3 核移植 |
| 1.4 融合/激活 |
| 1.5 胚胎培养 |
| 1.6 试验设计 |
| 1.7 统计 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 巴马小型猪睾丸成纤维细胞不同细胞同期化方法对体细胞核移植胚胎发育能力的影响 |
| 2.2 探讨高代巴马小型猪睾丸成纤维细胞核在去核卵母细胞中形态学重塑规律 |
| 2.3 供体细胞类型和代数对于体细胞核移植胚胎发育能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 PHA对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要药品及溶液 |
| 1.2 卵母细胞的收集及体外成熟 |
| 1.3 核移植 |
| 1.4 融合/激活 |
| 1.5 孤雌激活 |
| 1.6 胚胎培养 |
| 1.7 试验设计 |
| 1.8 统计 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PHA对于化学激活孤雌激活胚胎发育能力的影响 |
| 2.2 PHA对于电激活孤雌激活胚胎发育能力的影响 |
| 2.3 PHA对于巴马小型猪体细胞核移植胚胎发育能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 第四章 猪体细胞核移植胚胎移植方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要药品及溶液 |
| 1.2 卵母细胞的收集及体外成熟 |
| 1.3 核移植 |
| 1.4 融合/激活 |
| 1.5 孤雌激活 |
| 1.6 胚胎培养 |
| 1.7 胚胎移植 |
| 1.8 试验设计 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 食蟹猴-猪异种体细胞核移植的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要药品及溶液 |
| 1.2 卵母细胞的收集及体外成熟 |
| 1.3 供体细胞准备 |
| 1.4 核移植 |
| 1.5 融合/激活 |
| 1.6 胚胎培养 |
| 1.7 试验设计 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 探讨新生食蟹猴耳部成纤维细胞在去核卵母细胞中核重塑的规律 |
| 4.2 耳部成纤维细胞构建异种核移植胚胎的发育能力 |
| 4.3 培养基对于异种核移植胚胎发育能力的影响 |
| 5 讨论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
（7）牛体细胞核移植的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.2 哺乳动物胚胎干细胞细胞核移植研究进展 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.3.1 牛体细胞核移植研究进展 |
| 1.3.2 其他动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4 哺乳动物异种体细胞核移植研究进展 |
| 1.5 哺乳动物体细胞核移植相关领域研究进展 |
| 1.5.1 利用体细胞核移植技术生产转基因动物的研究进展 |
| 1.5.2 治疗性克隆的研究进展 |
| 1.6 我国核移植研究进展 |
| 第二章 哺乳动物体细胞核移植理论基础 |
| 2.1 受体胞质 |
| 2.2 供体细胞 |
| 2.2.1 供体细胞类型对发育的影响 |
| 2.2.2 供体细胞周期对发育的影响 |
| 2.2.3 核供体细胞的传代次数和来源 |
| 2.3 核供体细胞与受体细胞之间的相互作用 |
| 2.4 核移植相关问题的研究进展 |
| 2.4.1 重构胚基因组的重编程 |
| 2.4.2 DNA 甲基化 |
| 2.4.3 组蛋白乙酰化 |
| 2.4.3 X 染色体失活 |
| 2.4.4 端粒 |
| 2.4.5 印记基因的表达 |
| 2.4.6 线粒体DNA 的命运 |
| 第三章 哺乳动物体细胞核移植研究存在的问题及应用前景 |
| 3.1 核移植研究中存在的问题 |
| 3.2 哺乳动物核移植的应用前景 |
| 3.2.1 体细胞核移植研究在基础科学研究中的作用 |
| 3.2.2 体细胞核移植研究在医学领域的作用 |
| 3.2.3 体细胞核移植研究与动物保护 |
| 3.2.4 体细胞核移植研究在畜牧生产的作用 |
| 试验研究 |
| 第四章 牛成纤维细胞和颗粒细胞的分离和培养 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 仪器和试剂 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 牛耳皮肤成纤维细胞（BEF）的准备 |
| 4.2.2 颗粒细胞的分离与培养 |
| 4.2.3 牛耳皮肤成纤维细胞核型分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛耳皮肤成纤维细胞的分离和培养 |
| 4.3.2 牛颗粒细胞的分离和培养 |
| 4.3.3 牛耳皮肤成纤维细胞核型分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 BEF 的分离与培养,核型分析 |
| 4.4.2 供体细胞类型对克隆效率的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛卵母细胞体外成熟的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 血清及血清替代物对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.2.2 尿嘧啶对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.2.3 ATP 对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 血清及血清替代物 |
| 5.3.2 尿嘧啶 |
| 5.3.3 ATP |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛体细胞核移植的研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 仪器和试剂 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同融合参数的融合效率 |
| 6.2.2 不同融合电压对融合效率的影响 |
| 6.2.3 不同融合时间对融合效率的影响 |
| 6.2.4 不同激活方法对牛重构胚发育的影响 |
| 6.2.5 不同激活时间对牛重构胚发育的影响 |
| 6.2.6 不同培养液对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.2.7 与牛颗粒细胞共培养对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.2.8 不同供体细胞对牛体细胞核移植的影响 |
| 6.2.9 不同代数供体细胞对牛体细胞核移植的影响（BEF422） |
| 6.2.10 不同品种受体对牛体细胞核移植妊娠率的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 关于电融合 |
| 6.3.2 关于重构胚激活 |
| 6.3.3 关于重构胚培养 |
| 6.3.4 关于供核细胞 |
| 6.3.5 不同品种受体对牛核移植妊娠率的影响 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究新见解 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）东北虎体细胞异种核移植（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 虎的现况和研究进展 |
| 1.1 虎的现况和濒危原因 |
| 1.1.1 虎的现况 |
| 1.1.2 虎面临的危机 |
| 1.2 虎的形态与分类 |
| 1.2.1 形态特征 |
| 1.2.2 分类 |
| 1.3 虎的生物学研究进展 |
| 1.3.1 雌性东北虎生殖系统形态及组织学 |
| 1.3.2 生理生化 |
| 1.3.3 遗传 |
| 1.4 虎的生态学研究进展 |
| 1.4.1 分布与数量 |
| 1.4.2 栖息地 |
| 1.4.3 食性 |
| 1.4.4 行为 |
| 1.5 辅助繁殖技术研究进展 |
| 1.5.1 虎的人工采精技术 |
| 1.5.2 人工授精 |
| 1.5.3 试管内授精及胚胎移植 |
| 1.5.4 精子的低温储藏 |
| 1.6 拯救措施 |
| 1.6.1 老虎面临的危机 |
| 1.6.2 世界自然基金会近年来的工作 |
| 1.6.3 国际野生物保护学会近年来的工作 |
| 1.6.4 我国在虎保护方面所做的工作 |
| 1.6.5 展望 |
| 第二章 异种细胞核移植技术研究进展 |
| 2.1 异种细胞核移植技术研究现状 |
| 2.2 影响种间核移植成功的因素 |
| 2.2.1 不同的杂交组合对杂合重构胚胎的发育率的影响 |
| 2.2.2 胞质的量和培养条件的影响 |
| 2.2.3 哺乳动物异种间的胚胎移植后的胚胎附植 |
| 2.3 异种核移植中线粒体的命运 |
| 2.4 异种细胞核移植技术的意义与应用前景 |
| 2.4.1 拯救濒危动物 |
| 2.4.2 分离克隆人类胚胎干细胞 |
| 2.4.3 研究核质互作 |
| 第三章 东北虎体细胞的培养 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验试剂及仪器 |
| 3.1.2 东北虎耳部皮块的采取 |
| 3.1.3 东北虎皮肤成纤维细胞的分离与原代培养 |
| 3.1.4 东北虎皮肤成纤维细胞培养液的筛选 |
| 3.1.5 不同血清浓度对东北虎皮肤成纤维细胞传代细胞的影响 |
| 3.1.6 不同浓度的EGF 和胰岛素对东北虎皮肤成纤维细胞传代细胞的影响 |
| 3.1.7 细胞的冻存 |
| 3.1.8 冷冻细胞的解冻和培养 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 东北虎耳皮肤组织的原代培养 |
| 3.2.2 培养液的筛选 |
| 3.2.3 不同的血清浓度对传代细胞生长的影响 |
| 3.2.4 不同浓度的EGF 和胰岛素对传代细胞生长的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 细胞原代培养 |
| 3.3.2 不同培养液对东北虎皮肤成纤维细胞生长的影响 |
| 3.3.3 不同血清浓度对东北虎皮肤成纤维细胞生长的影响 |
| 3.3.4 添加EGF、胰岛素对传代东北虎皮肤成纤维细胞生长的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 东北虎体细胞生物学特性和染色体检测 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 形态观察 |
| 4.1.2 生长曲线 |
| 4.1.3 染色体检测 |
| 4.1.4 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 形态 |
| 4.2.2 生长曲线 |
| 4.2.3 染色体检查 |
| 4.2.4 细胞周期 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 形态和生长曲线 |
| 4.3.2 染色体核型分析 |
| 4.3.3 细胞周期 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 受体卵母细胞的成熟 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料及主要试剂仪器 |
| 5.1.2 操作液 |
| 5.1.3 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不同发情时期牛血清对牛卵母细胞成熟效果的影响 |
| 5.2.2 EGF、胰岛素对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 5.2.3 OM 液中添加孕酮对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 5.2.4 发情牛血清有无溶血对卵母细胞成熟的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 卵母细胞成熟在核移植中的作用 |
| 5.3.2 激素和生长因子在卵母细胞成熟中的作用 |
| 5.3.3 不同发情时期牛血清对牛卵母细胞成熟的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 卵母细胞孤雌激活 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试验材料及主要试剂仪器 |
| 6.1.2 操作液 |
| 6.1.3 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 牛卵母细胞孤雌激活 |
| 6.2.2 不同激活方法对兔卵母细胞激活效果的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 卵母细胞的激活 |
| 6.3.2 乙醇激活 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 孤雌激活早期胚胎的体外培养 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 牛卵巢的采集卵母细胞的采集 |
| 7.1.2 牛卵巢卵母细胞的采集 |
| 7.1.3 牛卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟 |
| 7.1.4 成熟卵母细胞的激活 |
| 7.1.5 孤雌激活牛胚胎的体外培养 |
| 7.1.6 实验设计 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 OM 液中添加OCSD0 对早期孤雌胚胎发育的影响 |
| 7.2.2 胚胎培养液中添加EGF、胰岛素、孕酮对孤雌激活胚胎发育潜力的影响 |
| 7.2.3 添加不同时期的发情牛血清对孤雌激活胚胎发育潜力的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 在成熟液中添加OCSD0 对早期胚胎发育的影响 |
| 7.3.2 生长因子和激素对早期胚胎发育的影响 |
| 7.3.3 不同发情时期牛血清对牛孤雌胚胎的发育的影响 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 东北虎体细胞的异种核移植 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 牛卵巢的采集、运输及卵母细胞的采集 |
| 8.1.2 牛卵母细胞的体外成熟培养 |
| 8.1.3 卵母细胞的去核操作 |
| 8.1.4 供体细胞的准备 |
| 8.1.5 供体细胞的注射 |
| 8.1.6 重组胚的激活 |
| 8.1.7 克隆胚胎的体外培养 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 用不同方法处理的供体细胞对重组胚发育的影响 |
| 8.2.2 重构胚激活前不同培养时间对克隆胚胎发育潜力的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 供体细胞不同处理方法对核移植结果的影响 |
| 8.3.2 核质相互作用时间对核移植结果的影响 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 异质克隆重组胚的鉴定 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 一抗制备 |
| 9.2.2 核移胚间接荧光免疫 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 第十章 异质克隆胚线粒体DNA 的检测 |
| 10.1 材料和方法 |
| 10.1.1 材料 |
| 10.1.2 工具酶及试剂 |
| 10.1.3 PCR 模板的制备 |
| 10.1.4 引物设计 |
| 10.1.5 引物特异性及不同阶段线粒体的检测 |
| 10.2 结果 |
| 10.2.1 引物特异性检测 |
| 10.2.2 不同阶段胚胎扩增结果 |
| 10.3 讨论 |
| 10.4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）牛体细胞克隆中供体和受体细胞制备及重构胚构建的影响因素研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 牛体细胞克隆技术研究进展 |
| 2 体细胞克隆技术应用前景 |
| 2.1 高产优质牛扩繁与育种 |
| 2.2 转基因动物和产品生产 |
| 2.3 医疗研究中的应用 |
| 2.4 生殖生物学基础研究手段 |
| 3 体细胞克隆技术主要技术环节 |
| 3.1 供体细胞制备 |
| 3.2 受体细胞制备 |
| 3.3 重构胚构建 |
| 3.4 重构胚激活 |
| 3.5 胚胎培养 |
| 3.6 胚胎移植 |
| 4 影响体细胞克隆技术的因素 |
| 4.1 供体细胞 |
| 4.1.1 细胞类型 |
| 4.1.2 细胞体外培养时间 |
| 4.1.3 细胞周期同步化 |
| 4.2 受体细胞 |
| 4.2.1 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 4.2.1.1 卵母细胞成熟特征 |
| 4.2.2 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 4.2.2.1 卵母细胞来源 |
| 4.2.2.2 卵泡大小 |
| 4.2.2.3 卵母细胞类型 |
| 4.2.2.4 培养条件 |
| 4.2.2.5 血清 |
| 4.2.3 卵母细胞成熟调控机制 |
| 4.3 重构胚构建 |
| 4.3.1 融合法 |
| 4.3.2 胞质内注射法 |
| 4.3.3 去透明带法 |
| 5 实验目的意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 牛供体细胞生产影响因素研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 主要仪器设备及试剂 |
| 1.2.2 牛颗粒细胞制备 |
| 1.2.3 牛输卵管上皮细胞制备 |
| 1.2.4 PI染色法检测细胞周期 |
| 1.2.5 Annexin V/FITC染色法检测细胞凋亡 |
| 1.2.6 实验设计 |
| 1.2.6.1 牛颗粒细胞制备因素对细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 1.2.6.2 牛输卵管上皮细胞制备对细胞周期和细胞凋亡的影响研究 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 牛颗粒细胞制备因素对细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 1.3.1.1 培养代数对细胞G0/G1的影响 |
| 1.3.1.2 血清饥饿对细胞G0/G1期的影响 |
| 1.3.1.3 血清饥饿时间对细胞G0/G1期的影响 |
| 1.3.1.4 培养代数对细胞凋亡的影响 |
| 1.3.1.5 血清饥饿对细胞凋亡的影响 |
| 1.3.1.6 血清饥饿时间对细胞凋亡的影响 |
| 1.3.1.7 z-VAD-fmk对不同浓度血清处理细胞产生凋亡的影响 |
| 1.3.1.8 抗氧化剂对不同浓度血清培养的细胞产生凋亡的影响 |
| 1.3.2 牛输卵管上皮细胞制备因素对细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 1.3.2.1 培养代数对细胞G0/G1期的影响 |
| 1.3.2.2 血清饥饿对细胞G0/G1期的影响 |
| 1.3.2.3 血清饥饿时间对细胞G0/G1期的影响 |
| 1.3.2.4 培养代数对细胞凋亡的影响 |
| 1.3.2.5 血清饥饿对细胞凋亡的影响 |
| 1.3.2.6 血清饥饿时间对细胞凋亡的影响 |
| 1.3.2.7 z-VAD-fmk对不同浓度血清处理细胞产生凋亡的影响 |
| 1.3.2.8 抗氧化剂对不同浓度血清培养的细胞产生凋亡的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 体外培养代数和血清饥饿对细胞周期的影响 |
| 1.4.2 体外培养代数和血清饥饿对细胞凋亡的影响 |
| 1.4.3 血清饥饿诱导细胞产生凋亡的可能机理 |
| 1.4.4 抗氧化剂对血清饥饿诱导细胞产生凋亡的影响 |
| 1.5 结论 |
| 2 牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响因素研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器设备及试剂 |
| 2.2.2 收集卵巢 |
| 2.2.3 培养液中铁和铜添加浓度的确定 |
| 2.2.4 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 2.2.5 颗粒细胞单层制作 |
| 2.2.6 体外受精 |
| 2.2.7 早期胚胎培养 |
| 2.2.8 早期胚胎发育评估 |
| 2.2.9 细胞凋亡检测 |
| 2.2.10 培养不同时期培养液中铁和铜浓度测定 |
| 2.2.11 实验设计 |
| 2.2.11.1 培养液中添加铁的研究 |
| 2.2.11.2 培养液中添加铜的研究 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 培养液中添加铁的研究 |
| 2.3.1.1 铁对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 2.3.1.2 铁对囊胚期细胞凋亡的影响 |
| 2.3.1.3 培养不同时间培养液中铁浓度变化 |
| 2.3.2 培养液中添加铜的研究 |
| 2.3.2.1 铜对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 2.3.2.2 铜对囊胚期细胞凋亡的影响 |
| 2.3.2.3 培养不同时间培养液中铜浓度变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 3 供体细胞的低渗处理在胞质直接注射体细胞克隆中的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器设备及试剂 |
| 3.2.2 受体卵母细胞收集及其体外成熟培养 |
| 3.2.3 供体颗粒细胞制备 |
| 3.2.4 去核和注核 |
| 3.2.5 重构胚激活 |
| 3.2.6 重构胚培养 |
| 3.2.7 细胞荧光染色 |
| 3.2.8 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 低渗液处理颗粒细胞对重构胚构建的影响 |
| 3.3.2 低渗液处理颗粒细胞对重构胚生长发育的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 总体结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 致谢 |
四、胚胎移植牛剖腹产保障犊牛成活的技术探讨（论文参考文献）
- [1]体细胞克隆技术的若干改进及其在转基因克隆牛中的应用[D]. 程磊. 内蒙古大学, 2013(10)
- [2]奶牛体外胚胎生产技术的研究[D]. 朱化彬. 甘肃农业大学, 2011(04)
- [3]特定转录因子诱导新生牛成纤维细胞为多能性干细胞的研究[D]. 辛晓玲. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [4]山羊胎儿成纤维细胞的培养鉴定及其转基因核移植效率的研究[D]. 郑聪颖. 西北农林科技大学, 2010(11)
- [5]猪体细胞核移植相关技术研究[D]. 黄雅琼. 广西大学, 2008(12)
- [6]巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴—猪异种体细胞核移植相关问题的初步研究[D]. 吕培茹. 广西大学, 2008(01)
- [7]牛体细胞核移植的研究[D]. 黄伟伟. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [8]东北虎体细胞异种核移植[D]. 宋继梅. 西北农林科技大学, 2007(01)
- [9]牛体细胞克隆中供体和受体细胞制备及重构胚构建的影响因素研究[D]. 高国龙. 华中农业大学, 2007(10)
- [10]性控胚胎和性控精液的产业化生产和应用[J]. Richard Remillard. 中国畜禽种业, 2007(01)