一、Expression and significance of Rap1A in testes ofazoospermic subjects（论文文献综述）
胡素芹[1]（2021）在《基于TLR/MyD88/NF-κB通路研究五子衍宗丸对热应激诱发睾丸炎症反应的影响》文中认为背景在精子发生的过程中,生精细胞会产生许多具有免疫原性的蛋白,却并没有诱发睾丸内天然免疫反应,这有赖于睾丸免疫豁免功能,它与天然免疫共同调控并维持着睾丸内免疫环境平衡,保证精子发生的顺利进行。迄今为止,多种因素被报道影响男性生殖能力,其中温度甚至被认为是生殖活动和睾丸稳态的重要调节器。研究表明,高温严重影响着男性精子发生和精子质量,甚至导致男性不育。一般阴囊的温度比腹腔温度低2～7℃,才能保证睾丸内精子发生的正常进行。但在日常生活中,男性阴囊温度容易受到生活方式、坐姿、职业等因素影响。大量研究表明,睾丸局部热应激不仅可诱发生精细胞的凋亡,还影响支持细胞和血睾屏障的功能。支持细胞和血睾屏障是免疫豁免的重要物质基础。这提示我们热应激后,睾丸局部豁免功能受到影响,热应激损伤与内源性睾丸炎的发生密切相关。然而,关于热应激对睾丸内免疫豁免和免疫稳态的影响尚未见报道。五子衍宗丸是补肾代表方,中医临床上常用于治疗男性不育,能有效提高精子计数和活力,并且在免疫调控方面的研究也被广泛报道。课题组前期研究发现五子衍宗丸能够抑制生精细胞凋亡,维持支持细胞和血睾屏障功能,有效改善热应激生精障碍。在上述基础上,本研究首次探讨了热应激对睾丸免疫环境的影响及五子衍宗丸对该过程的调控作用和机制,旨在揭示睾丸热应激生殖障碍涉及的免疫学机制及五子衍宗丸干预睾丸热应激损伤的作用靶点,为中医药治疗非感染性睾丸炎提供实验依据。方法1.实验一五子衍宗丸对单次热处理大鼠睾丸免疫环境的作用:①35只雄性SD大鼠按照体重随机分为5组,即对照组（Controlgroup）、模型组（Modelgroup）、五子衍宗丸低剂量组（L-dosegroup）、五子衍宗丸中剂量组（M-dosegroup）和五子衍宗丸高剂量组（H-dosegroup）,每组有大鼠7只。五子衍宗丸（低、中、高）组的大鼠分别按照每天0.5 g/kg、1 g/kg、2g/kg的剂量,给予五子衍宗丸药液灌胃（灌胃体积:1 ml/100g）;对照组和模型组则给予同样体积的生理盐水,连续操作灌胃15天。在第15天时,五组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40～50 mg/kg）麻醉后,将模型组、五子衍宗丸低、中、高剂量组的大鼠睾丸置于43℃恒温水浴锅中热处理20分钟,对照组的大鼠睾丸置于室温。24h后,大鼠麻醉,腹主动脉取血,摘取双侧睾丸。②采用QAH-CAA-640芯片法检测睾丸内细胞因子TNF-α、MCP-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4的表达变化;采用蛋白免疫印迹法（western blot）检测睾丸内Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、磷酸化NF-κBp65、磷酸化IκB-α的表达;实时荧光定量PCR法（RT-PCR）检测睾丸内TAM（Tyro3、Axl和MerTK）受体mRNA的表达。旨在初步探讨单次热处理对睾丸在免疫方面的影响,以及五子衍宗丸对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的作用。2.实验二持续热处理诱发大鼠睾丸内免疫炎症反应:①36只雄性SD大鼠随机分为6组,每组6只,即对照组、20 min×3d组、20 min × 5 d组、20 min × 7 d组、30 min × 3 d组、30 min × 5d组。经戊巴比妥钠麻醉后,对照组的大鼠置于室温,另外5组大鼠每天进行43℃恒温水浴20分钟或30分钟。待大鼠苏醒后,放入笼中继续饲养。热水浴20分钟的大鼠在连续热处理3天、5天和7天后取材,热水浴30分钟的大鼠在连续热处理3天和5天后取材。各组大鼠摘取双侧睾丸和附睾,腹主动脉取血。②大鼠、睾丸和附睾称重后,按照脏器系数%=睾丸或附睾重量/体重公式来计算睾丸和附睾脏器系数;精子自动分析仪检测各组大鼠附睾内精子数量和精子活力;酶联免疫吸附（ELISA）法检测睾丸内MCP-1、TNF-α和IL-6的表达变化;western blot技术检测大鼠睾丸内紧密连接蛋白 ZO-1、occludin 和 claudin11、TLR4、MyD88、磷酸化 NF-κB p65、磷酸化IκB-α、Tyro3、Axl、MerTK以及SOCS1/3的表达,以观察不同强度和时间热处理对大鼠精子参数、睾丸内炎症因子、紧密连接、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路以及睾丸免疫负调控分子TAM受体和SOCS1/3的作用。3.实验三五子衍宗丸对热应激诱发睾丸炎症反应的作用和机制研究:①35只雄性SD大鼠随机分为5组,每组有大鼠7只,分组同实验一。五子衍宗丸（低、中、高）给药组按照实验一给予不同浓度的复方灌胃;对照组和模型组则给予同样体积的生理盐水,连续灌胃15天。从灌胃的第11天开始,模型组、五子衍宗丸低剂量组、五子衍宗丸中剂量组和五子衍宗丸高剂量组的大鼠睾丸置于43℃恒温水浴锅中热处理30分钟,对照组的大鼠置于室温。连续热处理5天后,各组大鼠麻醉后,摘取双侧附睾和睾丸,腹主动脉取血。②采用透射电镜观察睾丸内组织细胞及紧密连接结构;实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测睾丸内TLR1～5、TLR10～11m RNA的表达变化;其余检测指标及检测方法同实验二。结果1.实验一:单次热处理组的大鼠睾丸内MyD88、p-NF-κB和p-IκB-α的表达显着增加,Tyro3、Axl和MerTK的mRNA表达显着下降;五子衍宗丸抑制MyD88表达,阻断NF-κB信号通路,并上调TAM受体基因表达;但各组间促炎因子TNF-α、MCP-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4以及TLR4表达变化没有统计学差异。2.实验二:①热处理后,大鼠体重持续下降,睾丸系数和附睾系数也减少,热处理20 min组并未随着天数增加而显着减少,其中在30 min×5d减少的最多;②热处理20 min连续3天组精子数量和活力有下降趋势;随着热处理天数的增加,精子数量和活力持续下降;相同热处理天数下,睾丸热处理30 min 比 20 min下降的更多,20 min × 7d组与30 min × 5 d组间的差异没有统计学意义。③睾丸内IL-6的表达仅在20 min × 7 d组和30 min × 5 d组显着增加;TNF-α和MCP-1的表达在20 min × 5 d组、20 min × 7 d组和30 min × 5 d组显着增加。热处理后睾丸内紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin11）、TAM 受体及 SOCS1/3 的表达均明显减少,而 TLR4、MyD88、p-NF-κB 和p-IκB-α、p-p38MAPK的表达均显着增多,但30 min × 5 d组表达差异最显着。3.实验三:①五子衍宗丸可增加持续热应激大鼠睾丸和附睾系数及精子数量,增强精子活力,改善睾丸内部超微结构,提高紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin11）表达来维持BTB完整性;②持续性热处理后,睾丸内炎症因子（IL-6、TNF-α和MCP-1）分泌增多,TLR2、TLR4和TLR5的mRNA表达量显着上升,TLR1、TLR3、TLR10和TLR11的mRNA表达量变化没有统计学意义;TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表达显着增加,而五子衍宗丸可抑制上述炎症因子的增加及TLR2或TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活;③持续性热处理后睾丸内TAM受体和SOCS1/3的表达减少,而五子衍宗丸显着上调了它们的表达。结论1.局部单次热处理（43℃,20min）不能引起睾丸内的炎症反应,但上调了 MyD88表达并激活了NF-κB信号通路,还抑制了TAM受体的表达。五子衍宗丸对三者均有显着的调控作用。2.大鼠睾丸连续热处理（43℃,20 min或30 min）5天以上才能促进炎症因子IL-6、TNF-α和MCP-1表达,诱发由TLR2或4/MyD88/NF-κB或p38MAPK信号通路介导的睾丸炎症反应,破坏睾丸内免疫稳态,这与连续热处理后TAM/SOCS负调控分子表达被抑制及BTB被严重破坏密切相关。此外,与热处理20 min × 7 d相比,30 min ×5 d组的指标分子表达变化更显着。3.对于热应激（43℃,30 min × 5d）诱发的睾丸炎,五子衍宗丸可通过直接抑制TLR2/4的表达;或通过上调TAM受体和SOCS1/3,进而减少TRAF6表达和TAK1磷酸化来间接阻断TLR2或4/MyD88/NF-κB信号通路,并恢复BTB结构功能,最终抑制炎症因子表达,降低组织细胞损伤,维持睾丸免疫环境平衡。
吴欢[2]（2021）在《CFAP58与CFAP47基因突变导致精子鞭毛多发形态异常的遗传学及致病机制研究》文中认为CFAP58与CFAP47基因突变导致精子鞭毛多发形态异常的遗传学及致病机制研究研究背景:不孕不育症已经成为影响人类健康的第三大疾病,约15%的育龄期人群受此困扰。男性不育症约占不孕不育病因的50%,其病因复杂多样,而以精子活力下降、形态异常为特征的弱畸形精子症是男性不育的主要原因。精子鞭毛多发形态异常（multiple morphological abnormalities of the flagella,MMAF）是一种由于精子鞭毛严重形态畸形,包括无尾、短尾、折尾、卷尾以及不规则尾等几种类型,造成精子运动功能障碍,导致男性不育的罕见弱畸形精子症。MMAF是一种遗传异质性疾病,研究表明,与轴丝、中心体结构、轴丝蛋白质运输系统等相关的基因突变,均可造成精子鞭毛组装异常,从而导致MMAF的临床表型。目前已知的MMAF致病基因只能解释约60%的MMAF病例。纤毛与鞭毛相关蛋白（CFAPs）家族是一组与纤毛和鞭毛发育及功能相关的蛋白,在纤毛和鞭毛的发生、组装以及运动功能的维持中起重要作用。目前已有多个CFAP基因缺陷被报道与MMAF相关,如CFAP43、CFAP47、CFAP69、CFAP70和CFAP251。目的:本课题以105例中国MMAF相关弱畸精子症患者为研究对象,通过全外显子分析（whole exon sequencing,WES）联合CRISPR-Cas9基因编辑技术构建小鼠同源基因敲除模型的研究策略,鉴定MMAF新的致病基因。并通过探索新基因编码的蛋白在精子鞭毛组装中的作用,初步阐明新基因突变导致MMAF的致病机制。结果:通过WES检测,本课题在5例原发性不育的MMAF患者中筛查出新的候选致病基因CFAP58的5个功能缺失性突变位点,包括3个纯合无义突变（c.2092C>T.p.Arg698*,c.1696C>T.p.Gln566*,c.2274C>A.p.Tyr758*）,一个纯合移码缺失突变（c.2052del.p.His685Thrfs*7）,以及一个杂合移码缺失突变（c.1429del.p.lle477*）。CFAP58（纤毛和鞭毛相关蛋白58）基因编码含有872个氨基酸的蛋白,在睾丸组织中特异性表达。此外,本课题还在3例原发性不育的MMAF患者中筛查出另一个MMAF新的候选致病基因CFAP47的3个半合子错义突变（c.7154T>A.p.Ile2385Asn,c.5224A>G.p.Ser1742Gly,c.8668C>A.p.Pro2890Thr）。CFAP47（纤毛和鞭毛相关蛋白47）是X染色体连锁基因,同样在睾丸组织中高表达,编码含有3187个氨基酸的蛋白。CFAP58和CFAP47基因突变不育患者表现出以短尾、卷尾和无尾为主要特征的MMAF表型。透射电子显微镜精子鞭毛超微结构分析发现:CFAP58基因突变患者精子鞭毛存在轴丝微管和线粒体鞘的缺失或排列紊乱,而CFAP47基因突变患者则表现出精子鞭毛中段和主段的中央微管或外周微管的缺失,以及轴丝外围的线粒体鞘和致密纤维的排列紊乱。上述结果阐明了CFAP58和CFAP47基因突变导致精子鞭毛畸形的超微结构基础。利用基于人体样本的精子免疫荧光实验（immunofluorescence,IF）、实时荧光定量PCR实验以及蛋白质印迹（Western Blotting,WB）实验,本课题分别从CFAP58和CFAP47基因的转录以及蛋白质翻译水平证实了上述突变位点的致病性:CFAP58基因突变患者精子细胞中CFAP58蛋白缺失;CFAP47基因突变患者精子细胞中的CFAP47 m RNA和CFAP47蛋白表现出缺失或显着性降低。为了进一步证实CFAP58和CFAP47基因突变与MMAF的相关性,本课题利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,分别构建Cfap58和cfap47小鼠同源基因敲除模型。Cfap58和cfap47基因敲除小鼠均表现出严重的精子运动功受损和生育障碍。精子表型分析显示Cfap58基因敲除小鼠精子呈现以短尾和卷尾畸形为主要特征的MMAF表型;而Cfap47基因突变小鼠精子呈现出以鞭毛弯折为主要特征的MMAF表型。上述小鼠同源基因敲除模型的精子表型证实了CFAP58和CFAP47基因突变是MMAF相关弱畸精子症的新的致病因素。基于患者精子鞭毛超微结构的异常改变,本课题通过IF、WB和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）实验方法进一步探索CFAP58和CFAP47蛋白参与精子鞭毛组装的作用,初步阐明CFAP58和CFAP47基因突变导致MMAF的致病机制。利用WB和IF实验,本课题在CFAP58基因突变患者的精子细胞中验证了精子鞭毛轴丝蛋白SPAG6和SPEF2以及线粒体鞘蛋白HSP60表达量显着下降或完全缺失。此实验结果与患者精子鞭毛的超微结构缺陷表型相一致。此外,本课题还发现外周致密纤维蛋白ODF2在CFAP58基因缺陷精子鞭毛中段异常蓄积,提示在鞭毛发生中,CFAP58可能参与ODF2蛋白的运输。CFAP58蛋白缺陷可能导致ODF2蛋白的转运异常,从而导致鞭毛组装异常。为了探寻CFAP47蛋白的相互作用蛋白,本课题通过Co-IP实验,在人类精子细胞和小鼠睾丸组织中发现CFAP47蛋白与精子中心粒组装蛋白CFAP65存在相互作用关系。同样,在CFAP47基因突变患者的精子细胞中,定位于鞭毛头尾连接部的CFAP65蛋白信号缺失,提示CFAP47蛋白可能与CFAP65蛋白相互作用,参与精子鞭毛的组装。但其作用的具体分子机制尚不明确。结论:CFAP58/Cfap58双等位基因突变和CFAP47/Cfap47基因半合子突变可导致人和小鼠以精子鞭毛形态异常为特征的弱畸精子症,CFAP58和CFAP47是MMAF新的致病基因。CFAP58基因突变导致精子鞭毛轴丝微管和线粒体鞘的缺失或排列紊乱,CFAP58蛋白可能通过CC结构域参与鞭毛的组装,此外CFAP58缺陷可能造成ODF2蛋白的运输和定位障碍,导致鞭毛结构异常。CFAP47蛋白可能通过与CFAP65蛋白的直接相互作用,参与精子鞭毛的组装。
陈炜康,于冬冬,刘宇鹏,武志刚[3]（2021）在《精子DNA甲基化异常与精液质量相关性的研究进展》文中提出DNA甲基化是表观遗传学内容之一,在精子发生和胚胎发育中有重要作用。近年来,国内外众多研究发现男性不育症（尤其是精液质量异常）与DNA甲基化异常有关。本文重点阐述了印记基因、一些重复元件和非印记基因异常甲基化与精液质量（包括精子数目、形态和活力）的相关性,旨在进一步研究男性不育的具体机制,为将来临床治疗男性不育症提供新的思路和方法。
刘中林[4]（2020）在《AURKC基因多态性与畸形精子症的相关性研究》文中提出目的:研究极光激酶C（AURKC）基因rs1008073、rs11084490和rs2302060位点多态性与畸形精子症发病风险的相关性,及AURKC基因对精浆AURKC蛋白表达水平的影响,为畸形精子症患者临床诊疗和遗传咨询提供参考依据。方法:（1）采用病例-对照研究的方法,研究对象为200例畸形精子症患者作为畸形精子症组（病例组）,200例精子形态学正常的健康男性为对照组。（2）采用多重单碱基延伸PCR基因分型技术对AURKC基因多态性位点进行检测。（3）用酶联免疫法检测畸形精子症组和对照组精浆AURKC蛋白水平。（4）运用相关统计软件分析位点多态性与畸形精子症的相关性及蛋白表达情况。结果:（1）AURKC基因rs1008073位点有GG、GC和CC三种基因型,对照组中基因频率分别为11.00%、46.50%、42.50%,畸形精子症组分别为6.00%、42.50%、51.50%;rs11084490位点有GG、GC和CC基因型,对照组中基因型频率分别为2.00%、37.00%、61.00%,畸形精子症组分别为3.00%、24.00%、73.00%;rs2302060位点存在TT、CT、CC基因型,对照组中基因型频率分别为43.00%、46.00%、11.00%,畸形精子症组分别为51.50%、42.50%、6.00%。（2）在rs11084490位点中,GC和GC/GG基因型与畸形精子症发病风险相关（GC vs.CC:OR=1.863,95%CI为1.199-2.893,P=0.006;GC/GG vs.CC:OR=1.757,95%CI为1.147-2.693;P=0.010）;与rs11084490位点的C等位基因相比,rs11084490位点的G等位基因与畸形精子症风险存在相关性（OR=1.498,95%CI=1.033-2.171,P=0.033）。（3）rs1008073和rs2302060位点的基因型和等位基因频率在两组间无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）。（4）单倍体分析结果:携带C-C-T单倍型的人群可能增加畸形精子症的发病风险（C-C-T:OR=1.370;95%CI=0.760-1.130;P=0.041）;而携带G-G-C单倍型的人群可能降低畸形精子症的发病风险（G-G-C:OR=0.666;95%CI=0.600-1.090;P=0.031）。（5）畸形精子症患者精浆中AURKC蛋白的浓度显着低于对照组（P<0.001）。（6）畸形精子症患者AURKC基因rs11084490位点GC/GG基因型的AURKC精浆蛋白浓度显着低于携带CC基因型的患者（P<0.001）。结论:（1）rs11084490位点GC和GC/GG基因型及G等位基因可能增加畸形精子症的发病风险。（2）rs1008073、rs11084490、rs23020603两两之间存在强连锁不平衡,携带C-C-T单倍型的人群可能增加畸形精子症的发病风险,而携带G-G-C单倍型的人群可能降低畸形精子症的发病风险。（3）畸形精子症患者精浆中AURKC蛋白的浓度显着低于对照组,且携带rs11084490位点GC/GG基因型的AURKC精浆蛋白浓度显着低于携带CC基因型的患者。
覃海媚[5]（2019）在《GRP78基因启动子区多态性及其血清水平与弱精子症相关性研究》文中指出研究背景:不孕症是一种常见的临床问题,其定义为在一年内未采取任何避孕措施却无法自然受孕,大约影响到全世界1315%的育龄夫妇,其病因可分为男性不孕和女性不孕。根据世界卫生组织调查发现,不孕不育发病率不断增加,逐渐影响人类生殖健康。男性不育症约占所有不孕病例的一半,其病因较为复杂多样,是从睾丸中完全没有精子到精子质量的明显改变一系列环节。随着男性不育各项检查的普及和发展,部分确定引起男性不育的病因包括:解剖结构缺陷、精液异常、分子遗传学紊乱、泌尿生殖道感染、内分泌紊乱、遗传变异或环境毒素等。其中弱精子症是男性不育重要因素之一,又称为精子活力低下,其精液参数中前向运动的精子活动力小于32%。弱精子症的病因涉及感染、免疫异常、长期禁欲、不健康生活方式以及遗传因素等。然而,遗传基因引起弱精子症的原因仍然相对不为人知。近年来研究发现,microRNA表达特征、SNP相关性和蛋白质组学对弱精子症发生发展变得越来越重要,这些发现为弱精子症的病理生理学基础提供了线索。本实验通过探究GRP78基因启动子区多态性在弱精子症患者与正常男性中的基因型分布情况,分析两组间基因型与等位基因的分布差异,及分析基因型与精子活力之间的关系,有助于对进一步了解弱精子症的发生的机制,对部分弱精子症患者的诊断及治疗有重要的意义。目的:单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNP）是由于单个核苷酸的突变引起DNA序列多态性,是一种最常见的人类遗传变异。SNP可用于解释不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病的易感性,以及对环境因子反应的表型差异。本文旨在探究葡萄糖调节蛋白78（GRP 78）基因启动子区rs3216733、rs17840761和rs17840762位点多态性在精子活力正常男性（对照组）及弱精子症患者中的分布情况,并在两组中比较三个位点基因型与等位基因频率的分布差异。此外,为了进一步明确位点多态性与弱精子症发病风险的关系,进而分析位点基因型与精子运动参数之间的关系及其对血清GRP 78蛋白表达水平的影响。方法:收集研究对象的精液、全血及血清样本。精液样本经计算机辅助精液分析系统进行分析,应用多重单碱基延伸PCR基因分型技术对研究对象的GRP 78基因启动子区rs3216733、rs17840761和rs17840762位点进行基因分型,用相应的统计学方法分析位点多态性与弱精子症的相关性。我们采用酶联免疫法吸附实验法检测血清中GRP 78蛋白水平表达情况。结果:研究对象包括400例弱精子症不育男性、400例有生育史的健康男性。弱精子症组和对照组的前向运动精子百分率分别为（20.09±8.18）%、（57.16±13.45）%,两者差异具有统计学意义（P<0.001）。Rs3216733位点存在dd、Gd和GG三种基因型,对照组中基因频率分别为46.5%、43.7%、9.8%,弱精子症组分别为38.0%、49.8%、12.2%;Rs17840761位点存在CC、CT、TT基因型,对照组中基因型频率分别为27.3%、45.2%、27.5%,弱精子症组分别为28.0%、47.5%、24.5%;Rs17840762位点存在CC、CT、TT基因型,对照组中基因型频率分别为74.3%、23.0%、2.7%,弱精子症组分别为75.0%、23.5%、1.5%。Rs3216733位点Gd、Gd/GG基因型和G等位基因频率在弱精子症组和对照组中分布具有统计学意义（Gd vs.dd:OR=1.42,95%CI,1.06-1.93,P=0.020;Gd/GG vs.dd:OR=1.43,95%CI,1.08-1.91,P=0.013;G vs.d:OR=1.26,95%CI,1.03-1.56,P=0.027）。但rs17840761和rs17840762位点的基因型和等位基因频率在两组间差异无统计学差异（P>0.05）。经单倍型分析,G-C-C单倍型在弱精子症组和对照组之间频率分布分别为33.9%和29.2%。与对照组相比,G-C-C单倍体显着增加了弱精子症的风险（P=0.026）。我们还比较了rs3216733位点多态性与精子动力学参数的相关性（如前向运动、曲线速率、直线速率、直线性）。在rs3216733位点中,携带Gd、Gd/GG基因型的弱精子症患者与dd基因型相比,其前向运动、曲线速率、直线速率和直线性均显着降低（P<0.01）。此外,弱精子症患者血清中GRP 78蛋白的浓度（0.479±0.104 ng/mL）低于对照组（0.661±0.225 ng/mL,P<0.001）。携带rs3216733 Gd/GG基因型（0.414±0.069ng/mL）的患者GRP78蛋白水平低于携带dd基因型的患者（0.558±0.082 ng/mL,P<0.001）。结论:综上所述,GRP 78基因启动子区rs3216733位点与弱精子症的发病存在着相关性。其中,rs3216733位点Gd/GG基因型可能通过下调GRP 78蛋白表达降低精子活力,从而导致弱精子症的发生。
马莹[6]（2018）在《特发性男性不育症家系的细胞力学、蛋白质组学以及基因组学研究》文中指出研究背景据调查全世界大约8%的育龄男性存在生育障碍,男性不育患者至少达到2000万。男性不育的病因是多方面的,已知的原因包括:先天性或获得性泌尿生殖系统异常,恶性肿瘤,泌尿生殖道感染,阴囊温度升高,内分泌紊乱,免疫因素和一些特征性的遗传异常。但仍有大约40%的男性不育患者的病因尚不明确。尽管辅助生殖技术为不孕不育患者带来了福音,但大约有一半的夫妇即使经过多次治疗仍未能成功怀孕。因此研究不育症的分子机制将有助于将来不育症的精确诊断和精准治疗。第一部分畸形精子的细胞力学研究目的:以特发性不育症家系患者的精子作为研究对象,用原子力显微镜研究精子头部的力学特征以及力学特征和染色质凝集的关系。方法:收集不育症家系病患的精液标本和正常生育能力的志愿者的精液标本。采用上游法分离精子。使用原子力显微镜观察单个无定型头畸形精子和单个正常精子的活体形貌,精子表面粗糙度,并表征单个精子的物理学特性。对比分析正常形态精子和头部畸形精子之间的形貌差异以及物理学特性的差异。分析精子物理学特性和染色质凝集之间的关系。采用苯胺蓝染色、精子染色质结构试验（sperm chromatin structure assay,SCSA）、免疫印迹法以及透射电镜来检测精子染色质凝集状态。结果:发现头部畸形精子的表面形貌,物理学特性,染色质凝集状态与正常形态精子显着不同。头部畸形精子的长、宽、高均大于正常精子。顶体后区长度也大于正常精子。头部畸形精子的表面粗糙度大于正常精子(343.21±94.71 nm vs.232.10±49.65 nm（P<0.0001）,刚度小于正常精子（3.54±0.52 vs.4.25±1.39;P<0.001）。苯胺蓝染色和免疫印迹法结果均提示畸形精子的组蛋白没有完全被鱼精蛋白替换。SCSA结果显示与正常精子相比畸形精子呈现高DNA可染率（high DNA stainability,HDS）（26.95±2.75%vs.9.40±2.87%;P<0.001）,和高精子DNA碎片率（DNA fragmentation index,DFI）（45.69±2.15%vs.8.02±2.57%;P<0.001）。透射电镜超微结构观察显示精子染色质结构松散。Pearson检验发现精子核区刚度和染色质凝集程度呈正相关。结论:精子的物理学特征可以作为评价精子质量的新指标。本研究首次采用物理学方法来研究精子,为进一步了解畸形精子症做出了贡献。第二部分特发性男性不育症家系的蛋白组学研究目的:以不育症家系病患的精子和正常精子为研究对象,通过双向电泳和MALDI-TOF-MS技术研究病患精子和正常精子的差异蛋白图谱,探讨畸精不育的分子机制。方法:收集不育症家系病患的精液标本和40例生育力正常的志愿者的精液标本。采用密度梯度离心分离精子,尿素/硫脲法提取精子蛋白。2-DE分离差异蛋白,银染后用PDQuest8.0软件分析比较病患精子和正常精子的电泳图谱,寻找差异蛋白点。对差异蛋白点行MALDI-TOF-MS分析,将获得的肽质量指纹谱（PMF）进行数据库搜索和生物信息学分析。利用DAVID软件对差异蛋白行功能聚类分析,利用STRING软件预测差异蛋白间相互作用。结果:本实验获得清晰且重复性好的异常精子组和正常精子组的双向凝胶电泳图谱。两组的2-DE图谱中有26个点发生明显变化,其中12个上调,14个下调。将26个蛋白点进行质谱鉴定成功鉴定了26个蛋白。其中在特发性男性不育症家系患者中表达上调的蛋白质:Semenogelin-1、Semenogelin-2、SEMG2 protein。其中表达下调的蛋白质:ropporin-1A isoform a、clusterin preproprotein、ASRGL1protein、Glutathione S-transferase Mu 3、Tubulin alpha-3E chain、Tubulin beta-4B chain、Succinate--CoA ligase[ADP-forming]subunit beta,mitochondrial、Sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome C、SPANX-C。功能富集分析显示,这些差异蛋白主要涉及结合、催化、分子结构这三种分子功能。结论:差异表达蛋白Semenogelin-1 preproprotein,Semenogelin-2preproprotein,SEMG2;GSTMu3可能与家系患者精子的运动能力低下有关。差异表达蛋白TUBB4B,TUBA3E,Ropporin,SPANX-C可能与家系患者精子畸形有关。差异表达蛋白CLU,HYOU1,SUCLA2可能与家系患者精子数量减少有关。第三部分特发性男性不育家系的基因组学研究目的:以特发性男性不育家系患者为研究对象。筛选并鉴定导致不育的致病基因,为临床上不育症患者的基因诊断和遗传咨询提供理论依据。方法:研究对象是两个不育症兄弟。首先,以其父母是近亲婚配为切入点,采用全外显子组重测序方法,对获得的数据按单基因病模式进行生物信息学分析,重点关注可能致病的纯合突变。然后,对家系内所有成员行Sanger测序验证全外显子组测序的结果,并在家系内进行表型与基因型共分离分析。再用计算机结构建模来预测突变导致的功能后果。最后,用Fasttarget二代测序验证候选致病突变在124例散发病患和200例具有生育力的健康人群中的突变情况。结果:在近亲婚配家系中发现一个新的纯合错义突变FBXO43（c.1991C>T/p.Gly664Asp）。在该家系基因突变与表型共分离,并且该基因突变被SIFT,PolyPhen-2和Mutation Taster预测为突变蛋白具有致病性。计算机结构建模预测突变p.Gly664Asp导致FBXO43蛋白增加了一个α-螺旋并缩短两个β-折叠,这可能是导致功能异常的原因。在124例散发不育症患者中对FBXO43进行突变筛查,鉴定出另外4个具有杂合FBXO43突变的病例。并且在200例正常对照中,未发现FBXO43突变。结论:FBXO43突变可能是导致不育症家系患病的原因。FBXO43突变可能与男性不育症和畸形精子症有关。
唐亮[7]（2018）在《CD82在非梗阻性无精症精子发生障碍中的机制研究》文中进行了进一步梳理目的目前,不孕不育症是影响人类健康的一种常见的疾病,约15%的育龄人员有不孕不育疾病的问题,在这里约百分之五十是因为男性原因,在医学中被称之为男性不育。然而,在临床就诊的男性不育症患者中,无精子症患者的治疗最为棘手。根据患者有无输精管梗阻的表现,临床上将无精症分为梗阻性无精症（obstructive azoospermia,OA）和非梗阻性无精症（non-obstructive azoospermia,NOA）两种,其中NOA患者睾丸生精功能严重障碍,多次精液常规检查报告提示镜下见极少量精子或没有精子。NOA患者的睾丸组织病理表型有睾丸生精小管结构紊乱、生精细胞成熟阻滞、生精细胞减数分裂停滞、睾丸生精功能低下等。尽管辅助生殖技术已经帮助很多不育夫妇成功受孕,然而很多NOA患者仍然无法生育自己遗传学上的后代。近年来,关于引起NOA相关的基因突变或多态性现象逐渐成为男性不育症研究的的热点。因此,针对NOA患者精子发生过程中的相关分子生物学机制的深入研究,不仅有助于逐步了解NOA的发病原因,对于男性不育症靶控治疗的发展和辅助生殖技术均有着非常重要的理论指导及应用价值。CD82是近些年在肿瘤领域研究较多的转移抑制基因之一,它属于四穿膜超家族（Transmernbrance 4 superfamily,TM4SF）的成员,其结构为细胞膜糖蛋白,主要生物学功能是对细胞间及细胞与细胞外基质的信号传导产生影响,同时参与调节细胞的增殖与分化。其参与的生物学途径有细胞周期调控、细胞骨架结构改变、蛋白激酶磷酸化调节、细胞凋亡调控、细胞粘附/迁移等。研究发现,在NOA患者睾丸的组织中CD82呈高表达。目前,关于CD82的过表达是否会引起精原细胞分化、增殖过程发生异常进而引起精子生成障碍,国内外前尚无相关的研究及文章报道。本实验首先检测部分梗阻性以及非梗阻性无精子症患者睾丸组织中CD82蛋白的表达情况,比较分析了二组标本之间存在的差异表达,通过向小鼠睾丸组织显微注射CD82转染的腺相关病毒,构建CD82高表达小鼠睾丸组织模型,分析验证了CD82高表达对小鼠生精细胞分化增殖产生的影响,并采用高通量转录组测序的方法对CD82可能引起生精障碍的分子生物学途径进行探讨,为进一步寻找CD82在生精细胞分化过程中相关的分子机制提供理论基础。方法1.HE染色观察无精子症患者睾丸组织中生精细胞不同的形态学表现,免疫组化观察CD82在梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织中的表达情况。2.采用Western blot进行定量检测CD82在梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织中差异表达。3.包装表达CD82的腺相关病毒（AVV）,显微注射法感染小鼠睾丸组织,构建CD82高表达小鼠睾丸组织模型,免疫荧光观察AVV感染效率。4.HE染色观察CD82高表达对小鼠睾丸组织精子发生的影响。5.转录组测序检测CD82高表达小鼠睾丸实验组和对照组之间的差异表达基因。6.随机挑选6个差异表达基因,Q-RTPCR验证高通量转录组测序结果的可靠性。结果1.HE染色观察无精子症患者睾丸组织存在不同形态学改变,其中5例患者生精功能正常,表现为曲细精管密度正常,管腔基底部各级生精细胞存在,管腔内可见成熟精子形成,符合梗阻性无精子症患者病理改变;8例患者生精功能障碍,表现为曲细精管稀疏,管腔基地部各级生精细胞数量减少,厚度变薄,管腔内极少有成熟精子形成,符合非梗阻性无精子症睾丸病理改变。2.免疫组化结果显示,梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织内间质细胞和支持细胞均可见CD82阳性表达,非梗阻性无精子症患CD82表达更为显着,采用Western blot法进行定量检测,结果显示在二组睾丸标本中CD82蛋白的表达差异具有统计学意义（P值<0.05）。3.CD82成功插入腺相关病毒AVV载体,显微注射法成功感染小鼠睾丸组织,1周后免疫荧光显示小鼠睾丸组织外源性CD82表达明显,CD82高表达小鼠睾丸组织模型构建满意。4.C57小鼠（8周龄）睾丸组织的HE染色结果显示,对照组小鼠睾丸组织的生精功能正常,各级生精细胞生长活跃,曲细精管内可见到部分成熟精子,实验组小鼠睾丸组织呈现生精功能异常,各级生精细胞数量减少,管壁变薄,无成熟精子或仅极少量长形精子形成。5.转录组测序结果显示,与对照组相比,CD82高表达组差异表达基因数590个,其中上调基因289个,下调基因301个,主要参与的生物过程包括有细胞周期调控、转录因子调节、细胞凋亡调节、信号传导通路、免疫应答反应、细胞粘附转运、蛋白磷酸化等方面,其中细胞周期调控、转录调节相关基因所占比例较大。6.随机挑选的6个差异基因,各选三份组织样本进行Q-RTPCR验证,分析结果提示基因表达变化水平与高通量转录组测序结果趋势一致,转录组测序结果可靠。结论:1.在OA和NOA患者睾丸组织中,CD82检测结果均呈阳性表达,NOA患者睾丸组中CD82表达更为显着,定量检测法（Western blot）检测两组标本组织的CD82蛋白差异表达有统计学意义2.在高表达CD82小鼠睾丸组织中,曲细精管基底室生殖细胞结构尚清晰,近腔室内生殖细胞减少,极少量精子形成,生殖细胞分化停滞在精原细胞及初级精母细胞早期,预示CD82过表达可能会引起精原细胞分化、有丝分裂-增殖过程发生异常。3.高通量转录组测序显示高表达CD82时差异基因所参与的生物学过程和信号通路涉及细胞周期调控、转录因子调节、细胞凋亡调节、信号传导通路、免疫应答反应、细胞粘附转运、蛋白磷酸化等方面,细胞周期调控和转录调节可能是CD82在精子发生障碍过程中的重要调控环节。
荆涛[8]（2017）在《缺氧诱导因子α在特发性非梗阻性无精子症生精功能障碍中的作用研究》文中认为研究目的:特发性非梗阻性无精子症（idiopathic azoospermia,IA）是男性不育中病因不明、治疗困难的一种病症,主要病理机制是睾丸生精功能障碍,一直是该领域的研究热点。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors,HIFs）是一类在氧稳态失衡状态下激活的重要转录因子,而睾丸在正常生理状态下系低氧器官,有研究显示,在HIF-α基因敲除的小鼠中会出现睾丸生精功能衰竭。本研究拟探讨HIF-α在IA患者睾丸生精功能障碍中的作用。研究方法:本研究按照WHO标准的诊断流程进行病史采集和各项检查,制定严格的入组筛选流程,共募集30例IA患者作为实验组,30例OA患者作为对照组,所有入组患者均实施经皮睾丸穿刺抽吸术（testicular sperm aspiration,TESA）。观察TESA标本H&E染色病理变化,分别计数实验组和对照组的睾丸支持细胞,并应用免疫组化方法检测支持细胞异常增生情况。应用western blotting方法检测两组TESA标本的抗氧化蛋白超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、血红素加氧酶（Hemeoxygenase-1,HO-1）、HIF-1α/2α、紧密连接蛋白Zonula occluden-1（ZO-1）、Claudin和Occludin的表达变化,并进一步检测HIF-α的靶点调节分子铁代谢相关蛋白二价金属离子转运体1（Divalent metal transporter 1,DMT1）、ferroportin1（FPN1）和铁调节蛋白1（Iron regulatory protein1,IRP1）的表达变化。然后在体外培养的小鼠睾丸支持细胞（TM4）系中,应用western blotting方法检测不同浓度双酚A、氮芥处理后上述蛋白的表达变化,并评价了抗氧化剂姜黄素和N-乙酰半胱氨酸（Nacetyl-L-cysteine,NAC）的保护作用。研究结果:1、参考WHO 2000年《男性不育标准化诊疗手册》（2000 WHO Manual for the Standardized Investigation,Diagnosis and Management of the Infertile Male）所述标准的OA和IA诊断流程,经过严格筛选,对招募的220位无精子症志愿者进行分类,将符合上述分类诊断标准者分别纳入实验组（IA组,共30例）和对照组（OA组,共30例）。两组病人在年龄、体重指数、就诊时不育时间方面均无统计学差异。2、IA和OA组患者病因分析表明,IA组病人均无明确病因,且无其他适用的疾病诊断,为特发性无精子症;OA组病人无精子症病因则包括附睾炎、附睾结核、先天性发育异常、医源性病因等多种类型。3、IA和OA组患者体格检查表明:两组患者全面体格检查未发现明显异常,第二性征发育良好,阴茎发育正常;IA组30例患者双侧睾丸、附睾均可于阴囊内扪及,但IA组患者睾丸容积较OA组患者变小,且质地明显变软,OA组患者双侧睾丸查体未及异常,所有OA患者的附睾均可扪及明显膨胀、饱满,另有5例OA患者未能触及输精管结构。阴囊超声检查辅助估算睾丸容积大小,IA组患者睾丸容积明显减小,仅不到OA组患者睾丸容积的一半（6.2m L vs.15.1m L,P<0.001）。4、血清卵泡刺激素（Follicle Stimulating Factor,FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone,LH）、催乳素（Prolactin,PRL）和睾酮（Testosterone,TT）水平检测表明:IA组患者血清FSH（16.40±5.60 IU/L vs.3.64±1.53 IU/L,P<0.001）、LH（10.48±2.20 IU/L vs.4.49±1.59 IU/L,P<0.001）水平较OA组均显着升高,而IA和OA两组患者的血清PRL（10.59±2.00 IU/L vs.10.55±1.91 IU/L,P>0.05）、TT（11.33±2.26 nmol/L vs.10.65±2.10 nmol/L,P>0.05）水平无明显差异。5、IA组和OA组患者睾丸穿刺组织的H&E染色病理分析表明:IA组典型的病理改变包括:（1）生精小管内生殖细胞数量显着减少,且往往精子发生紊乱,几乎不见成熟的精子细胞;（2）生精小管腔内充满脱落的细胞,含有少量生殖细胞的生精小管与仅有支持细胞的生精小管同时存在,支持细胞数量明显增多;（3）生精小管管腔明显缩小;（4）睾丸间质细胞未见明显异常改变。OA组患者睾丸穿刺组织的典型病理改变包括:（1）精子发生的各个阶段都存在,可见成熟的精子细胞,但各阶段生殖细胞正常的排列顺序消失;（2）生精小管结构、管腔直径正常,但是中心腔消失并充满脱落的细胞;（3）睾丸间质细胞未见明显异常改变。6、IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中支持细胞计数表明:IA组生精小管每单位横截面的睾丸支持细胞数量要明显多于OA组（38.0±3.5 vs.19.7±2.6,P<0.001）,IA组生精小管周长与OA组无明显差异（422.15±18.33μm vs.433.17±25.61μm,P>0.05）;IA组患者睾丸组织中的支持细胞分布密度（Sertoli cell density,SCD）显着高于OA组（0.093±0.008 vs.0.044±0.005,P<0.001）。7、IA组和OA组患者睾丸支持细胞增殖活性评价:IA组和OA组的睾丸支持细胞均呈现胞浆内支持细胞标记物抑制素α（Inhibinα）染色强阳性,而且在连续组织切片上,可观察到部分睾丸支持细胞呈现细胞核细胞增殖活性标记物Ki-67染色强阳性;进一步计算Ki-67阳性指数（Ki-67 Labelling Index,Ki-67 LI）,结果提示IA组睾丸支持细胞的Ki-67 LI高于OA组3倍以上（48%±6%vs.13%±5%,P<0.001）。8、免疫印记法检测IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中应激反应蛋白HO-1的表达变化,结果提示IA组与OA组之间无明显变化;但IA组的抗氧化蛋白SOD表达水平明显下降,IA组比OA组降低了75.2%±16.2%（P<0.05）。提示IA患者睾丸组织内存在着抗氧化能力不足。9、免疫印记法检测IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中HIF-1α的表达变化:IA组明显上调,升高达OA组的2.44±0.94倍（P<0.01）;而IA组的HIF-2α表达水平显着下调,比OA组降低了49%±11.3%（P<0.01）。10、免疫印记法检测IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中铁代谢相关蛋白的表达变化:IA组的铁转入蛋白DMT1+IRE表达水平要比OA组高出29%±8.3%（P<0.05）;IA组的铁转出蛋白FPN1表达水平相对比OA组存在升高趋势,但是两组间FPN1的表达水平差异无统计学意义;铁调节蛋白IRP1在IA组患者睾丸穿刺组织中表达水平较OA组升高22%±5.2%（P<0.05）。11、免疫印记法检测IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中紧密连接蛋白的表达变化:IA组ZO-1和Claudin蛋白表达水平较OA组均显着降低,分别为OA组的62.3%和43.5%（P<0.05）;Occludin蛋白表达水平降低最明显,IA组只有OA组的7.2%（P<0.05）。12、体外培养小鼠睾丸支持细胞（TM4）系,分别应用不同浓度（10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L）的双酚A（Bisphenol A,BPA）和氮芥（nitrogen mustard,NM）处理后,在药物浓度低于10-5mol/L时TM4细胞存活率均没有明显变化,但在药物浓度高于10-4mol/L时TM4细胞存活率明显下降,BPA处理组TM4细胞存活率分别仅为对照组的57.8%、24.9%,氮芥处理组分别是对照组的62.2%、38.6%（P<0.05）。13、BPA和氮芥分别处理TM4细胞后,免疫印迹法观察HIF-1α和HIF-2α的表达变化:较低浓度10-6mol/L BPA处理TM4细胞24h后,BPA处理组细胞裂解液中的HIF-2α表达水平明显上调,是对照组的1.41倍（P<0.05）,而HIF-1α的表达有升高趋势,但无统计学意义;10-6mol/L氮芥处理TM4细胞24h后,氮芥处理组的HIF-1α和HIF-2α表达水平均明显上调,分别是对照组的2.71倍和1.72倍（P<0.05）。较高浓度10-5mol/L BPA处理TM4细胞24h后,BPA处理组细胞裂解液中的HIF-1α和HIF-2α表达水平均明显下调,分别仅为对照组的39%和32.2%（P<0.05）;较高浓度10-5mol/L氮芥处理TM4细胞24h后,氮芥处理组的HIF-1α和HIF-2α表达水平也均明显下调,分别为对照组的33.6%和37.7%（P<0.05）。14、BPA和氮芥分别处理TM4细胞后,免疫印迹法观察铁代谢蛋白的表达变化:10-6mol/L和10-5mol/L BPA处理TM4细胞24h后,BPA处理组细胞裂解液中铁转入蛋白DMT1+IRE表达水平均明显上调,分别为对照组的1.83倍和1.72倍（P<0.05）;10-6mol/L和10-5mol/L氮芥处理TM4细胞24h后,氮芥处理组细胞裂解液中的DMT1+IRE表达水平也分别上调1.75倍和1.82倍（P<0.05）。上述不同浓度的BPA和氮芥分别处理TM4细胞24h后,药物处理组的铁转出蛋白FPN1表达水平虽有上升趋势,但差别无统计学意义。铁调节蛋白IRP1在BPA和氮芥处理组表达水平均明显上调,10-6mol/L和10-5mol/L BPA处理组的IRP1表达水平分别是对照组的1.92倍和1.5倍（P<0.05）,10-6mol/L和10-5mol/L氮芥处理组的IRP1表达水平分别是对照组的2.28倍和1.87倍（P<0.05）。15、10-6mol/L和10-5mol/L BPA或氮芥分别处理TM4细胞24h后,免疫印迹法检测TM4细胞裂解液中的应激反应蛋白HO-1和抗氧化蛋白SOD表达水平均没有明显变化。16、分别用1、2、5、10μmol/L姜黄素处理TM4细胞24h后,在5μmol/L时细胞存活率略有下降,为对照组的94.5%,但无统计学意义;10μmol/L姜黄素可引起TM4细胞存活率明显下降,为对照组的81.9%（P<0.05）。应用5μmol/L姜黄素与BPA共孵育,未能观察到姜黄素对TM4细胞存活率的保护作用;强抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）与BPA共孵育,也未能观察到其对细胞存活率的保护作用。研究结论:1.特发性非梗阻性无精子症患者睾丸穿刺组织中存在支持细胞异常增生,抗氧化能力下降,提示特发性非梗阻性无精子症患者睾丸支持细胞存在着数量和功能异常。2.特发性非梗阻性无精子症患者睾丸穿刺组织中,以及药物处理后的体外培养小鼠睾丸支持细胞中,均观察到了缺氧诱导因子-α蛋白表达异常。3.缺氧诱导因子α的下游调控分子紧密连接蛋白和铁代谢相关蛋白表达异常,提示疾病状态下血-睾屏障破坏和铁稳态失衡,这可能是缺氧诱导因子α调控异常参与特发性非梗阻性无精子症患者睾丸生精功能障碍的发病机制。
顾颢[9]（2016）在《miR-17-92基因簇miRNA在染料木黄酮暴露致精子生产障碍中的作用及机制》文中研究表明染料木黄酮（genistein, GEN）是一种典型的植物雌激素,其具有拟雌激素效应,因此可对男性生殖功能产生影响。然而,具体的潜在机制仍然不明。miRNA是一类非编码RNA,可以通过结合靶基因3’-UTR区,并沉默靶基因来发挥生物学功能。已有研究指出miRNA在精子生成中发挥重要作用。此外有报道指出,miR-17-92在精子生成中发挥重要作用,并且雌激素可以导致miR-17-92表达发生改变。为了探讨miR-17-92是否在GEN暴露引起的精子生成障碍中发挥作用,我们通过检测不育男性受试者尿液GEN暴露水平以及精浆中miR-17-92簇miRNA表达水平,发现miR-19b-1、miR-20a和miR-92a-1在GEN较高暴露组显着高表达,并且该组受试者精子活力显着下降,这就提示我们miR-17-92可能在GEN暴露引起的精子生成障碍中发挥作用。随后我们利用成年ICR小鼠,使用不同剂量GEN（包括0,0.5,5,50以及250 mg/kg/day）灌胃染毒35天,发现小鼠附睾精子的平均速率（VAP）、直线速率（VSL）和曲线速率（VCL）在5 mg/kg/day剂量组显着减少,进一步研究发现,该剂量组小鼠睾丸组织中miR-17和miR-20a的表达水平显着高于对照组。通过对比人和小鼠中的结果,我们发现miR-20a在人和小鼠中均呈现显着高表达。通过生物信息学方法分析,发现Limk1是miR-20a的靶基因,并且该基因在精子生成中发挥重要作用,基因和蛋白表达水平检测结果也表明,Limk1表达水平在GEN染毒组显着下降,双荧光素酶报告基因实验也表明Limk1是miR-20a的靶基因。因此这些结果表明,Limk1作为miR-20a的靶基因,可能在miR-20a参与的GEN暴露致精子生成障碍中发挥作用。第一部分：miR-17-92基因簇miRNA表达水平与GEN暴露的关联研究目的在人群水平研究miR-17-92基因簇miRNA和GEN暴露致精子生成障碍的关联。方法1.使用UPLC-MS/MS的方法,检测了130名不育男性尿液GEN暴露水平；2.通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术,检测受试者精浆中的miR-17-92表达水平；3.根据受试者GEN内暴露水平,将受试者分成四组,分析精浆miR-17-92表达水平与GEN暴露之间的关联。结果1.通过比较不同GEN暴露组受试者的精液参数,我们发现在所纳入的不育受试者中,GEN较高暴露组（即组3,GEN暴露量为76.32-281.96 ng/ml）的受试者精子活力与GEN低暴露组相比显着下降（P<0.01）；2.受试者精浆中miR-19b-1、miR-20a和miR-92a-1在组3中显着高表达（P<0.05）,其余几条miRNA则未观察到显着性差异。结论在男性不育患者中,较高暴露的GEN与精子生成障碍有关,并且主要集中在精子活力,而miR-17-92可能在GEN暴露导致的精子生成障碍中发挥作用。第二部分：miR-17-92基因簇miRNA在GEN染毒小鼠生精障碍中的作用及机制目的在GEN染毒小鼠模型中研究miR-17-92基因簇中关键miRNA在GEN染毒引起的小鼠精子生成障碍中的作用以及机制。方法1.通过使用不同剂量的GEN（0,0.5,5,50和250 mg/kg/day）对7周龄雄性ICR小鼠灌胃染毒35天,以研究不同剂量GEN对小鼠精子生成的影响；2.通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术,检测小鼠睾丸组织中miR-17-92表达水平；3.结合人群结果,筛选出人鼠中共同差异的miR-17-92基因簇miRNA,随后通过靶基因预测软件,筛选出共同靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-17-92基因簇关键miRNA与靶基因结合特异性；4.使用qRT-PCR和Western blotting技术,检测靶基因表达水平。结果1.雄性ICR小鼠经5 mg/kg/day的GEN灌胃处理后,小鼠附睾精子运动参数,包括平均速率（VAP）、直线速率（VSL）和曲线速率（VCL）三个指标,均呈显着降低；2.小鼠睾丸组织miR-17及miR-20a在5 mg/kg/day组显着高表达,结合人群结果,发现miR-20a在人鼠中均呈现显着差异表达,因此选定miR-20a作为关键靶标niRNA;3.通过靶基因预测软件以及人鼠通路富集结果比对,发现肌钙蛋白细胞骨架调节通路是人鼠中均存在的miR-20a靶基因富集通路,并且该通路与基于细胞骨架调节的精子发生密切相关,其中Limkl在该通路中发挥重要调控作用；4.双荧光素酶报告基因实验结果表明,Limkl是miR-20a的靶基因；5. Limkl在5 mg/kg/day的GEN灌胃组小鼠睾丸组织中显着低表达,并且蛋白表达结果与基因表达结果一致。结论1.GEN在5 mg/kg/day灌胃剂量下可以导致雄性成年ICR小鼠精子生成障碍；2. Limkl作为miR-20a的靶基因,可能在GEN暴露导致的精子生成障碍中发挥作用。
马宇飞[10]（2014）在《ESR2基因多态性与河南汉族人群男性不育的相关性分析》文中研究说明研究背景和目的由世界卫生组织（WHO）规定,夫妇生活1年以上并且没有采用任何避孕措施,仍然无法生育的称为不孕不育,由男方因素造成的称为不育症。近年来,不孕不育的比例在已婚的适龄夫妇中越来越高,并且,不孕不育给社会带来了很多负面影响。男性不育症中,病因很多并且相当复杂,比如外伤、睾丸发育不良、内分泌或免疫性疾病、梗塞、服用激素药物或肿瘤药物、环境毒物、不良生活习惯以及遗传因素等等。还有少数男性不育不能给出基于分子水平的合理解释,被称为特发性男性不育,这其中约有50%是由遗传因素造成的。近年来,大量研究发现,染色体异常、Y染色体微缺失及相关基因的突变都与男性生殖能力的改变有关。越来越多的学者验证了Y染色体长臂远端AZF区域微缺失与精子发生障碍有重要关系。基于这一结论,要想研究相关基因多态性与男性生殖能力的相关关系,必须先排除Y染色体AZF微缺失的影响。1996年,Mosselman等人首次从睾丸组织中克隆出了雌激素受体的另一种亚型,雌激素受体β （Estrogen receptor β）后来被称为ERβ即ESR2。研究发现,ESR2基因rs4986938G/A位点位于ESR2基因的第8外显子的3’非编码区第1730号核苷酸处。而rs1256049G/A位点则位于ESR2基因的第5外显子的配体结合区的第1082号核苷酸处。2010年,Mohammad Reza Safarinejad等人对伊朗人群ESR2基因这两个位点多态性与男性不育的相关性研究发现,单倍型与男性不育有关系。2011年台湾学者Wen Lee等人的研究发现,ESR2基因的rs4986938、rs1256049位点的多态性与精液浓度有关,rs1256049位点的多态性还与精子运动能力有关。2012年日本学者Tsutomu Ogata等对ESR2基因的多个SNPs位点多态性与男性不育的相关性研究中显示,单倍型“TGTAGA"可能是男性不育的风险单倍型,但其中rs1256049位点的等位基因G/A在病例组和对照组中的频率分布没有显着差异。目前,ESR2基因多态性与男性不育的相关性在不同研究报道中的结果不尽相同,并且国内没有这方面研究的相关报道,故本研究选取ESR2基因的rs4986938、rs1256049位点进行研究,拟分析ESR2基因多态性与河南汉族人群男性不育是否相关。本研究首先用多重聚合酶链式反应（Mutiplex Polymerase chain reaction Mutiplex PCR）对研究对象的病例组进行了Y染色体AZF区域微缺失的检测,排除AZF微缺失之后,对病例组剩下的研究对象再利用聚合酶链式反应-限制性片段多态性（Polymerase chain reaction restriction-fragment length polymorphism, PCR-RFLP）技术对河南汉族人群ESR2基因的rs4986938位点和rs1256049位点多态性进行分析,拟研究这两个位点多态性在河南汉族人群中的分布情况及其与男性生殖能力的相关性,从而为男性不育的临床检测与治疗提供相关理论依据。研究对象：病例组收集2012年11月到2013年3月来郑州大学第一附属医院门诊检验科就诊的397例不育症患者的精液标本,患者年龄22-42岁（平均年龄29.4±6.1岁）。患者均根据世界卫生组织（WHO）标准进行常规精液分析,并且连续三次检查确诊为无精子症、少精子症（精子密度<20×106/m1）。患者均排除生殖器手术、睾丸炎、精索静脉曲张、内分泌疾病、肝肾类疾病、染色体异常、生殖器异常等情况。对照组随机选取通过正常手段生育至少一个健康孩子的健康男性347例作为对照组,年龄22-42岁（平均年龄31.7±2.6岁）。所有病例组和对照组的研究对象均来自河南地区,饮食结构大致相同,并且都知情同意。研究方法：抽取精液用经典的酚-氯仿方法提取基因组DNA,PCR扩增目的片段,再经过Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ限制性内切酶酶切,最后用2.5%的琼脂糖凝胶电泳对扩增片段和酶切片段进行基因型检测,紫外分析凝胶成像系统观察记录。统计学处理：所有得到的数据都采用SHEsis在线软件和SPSS17.0统计软件进行分析,检验水准为：a=0.05。病例组和对照组均使用SHEsis在线软件进行Hardy-Weinberg（HWE）检测,以估计所选资料的人群代表性。使用SPSS17.0计算OR值以及95%置信区间,进行基因突变对男性不育发生的风险性估计。用在线软件SHEsis进行单倍型分析。结果：1.检测出397例病例组中有50例Y染色体微缺失。2.河南汉族人群中,ESR2基因的rs4986938以及rs1256049位点基因型频率都符合Hardy-Weinberg平衡,表明其具有良好的人群代表性。3.本研究中,rs4986938位点在患者组和对照组对比中,基因型和等位基因频率差异具有统计学意义（P<0.05）。4.对rs4986938位点进行的密度分组分析中,GG基因型在重度少精和轻度少精组间差异显着（P<0.05）。5.在本研究中,对于rs1256049位点两组之间的对比显示：基因型和等位基因频率差异具有统计学意义（P<0.05）。6.对rs1256049位点进行的密度分组分析,GG基因型在重度少精和极重、无精组间差异显着（P<0.05）。7.在河南汉族人群中,对rs4986938G/A和rs1256049G/A两个位点在男性不育组与正常对照组间进行单倍型分析,发现A-G、G-A、G-G单倍型在两组间的差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1.ESR2基因rs4986938位点的A等位基因与rs1256049位点的A等位基因可能均是河南汉族人群男性不育的遗传危险因子。2.ESR2基因rs4986938和rs1256049位点的A-G/G-A单倍型可能是河南汉族人群男性不育的风险单倍型,G-G单倍型是男性不育的保护单倍型。3.ESR2基因多态性可能与河南汉族男性不育的发生相关。
二、Expression and significance of Rap1A in testes ofazoospermic subjects（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression and significance of Rap1A in testes ofazoospermic subjects（论文提纲范文）
（1）基于TLR/MyD88/NF-κB通路研究五子衍宗丸对热应激诱发睾丸炎症反应的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 一 文献综述 |
| 综述一 五子衍宗丸免疫调控功能的研究进展 |
| 1. 中药调控机体免疫系统的依据 |
| 2. 五子衍宗丸中的单味药及其提取物对免疫的影响 |
| 3. 五子衍宗丸对免疫调节的研究 |
| 4. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 Toll样受体信号通路对雄性生殖系统的作用 |
| 1. Toll样受体分子的结构和细胞定位 |
| 2. Toll样受体激活及其信号传导途径 |
| 3. 在雄性生殖系统的表达和调控 |
| 4. 中药对Toll样受体通路的调控作用 |
| 5. 结语 |
| 参考文献 |
| 二 实验研究 |
| 前言 |
| 第一章 五子衍宗丸对单次热处理睾丸免疫微环境的作用 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 材料和方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 持续热处理诱发大鼠睾丸内免疫炎症反应 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 五子衍宗丸对热应激诱发睾丸内炎症反应的作用和机制研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 材料和方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）CFAP58与CFAP47基因突变导致精子鞭毛多发形态异常的遗传学及致病机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 人类精子鞭毛的发生 |
| 1.2 人类精子鞭毛的结构 |
| 1.3 精子鞭毛多发形态异常(MMAF)的遗传学研究进展 |
| 1.4 本课题的设计方案 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 精液常规参数分析及样本处理 |
| 2.4.2 精子形态学分析 |
| 2.4.3 提取外周血DNA |
| 2.4.4 全外显子组文库制备 |
| 2.4.5 杂交与捕获 |
| 2.4.6 致病基因与致病突变的筛选 |
| 2.4.7 候选致病基因Sanger测序 |
| 2.4.8 扫描电镜观察 |
| 2.4.9 透射电镜观察 |
| 2.4.10 反转录PCR及实时定量PCR检测 |
| 2.4.11 精子免疫荧光实验 |
| 2.4.12 精子蛋白印迹实验 |
| 2.4.13 蛋白免疫共沉淀实验 |
| 2.4.14 敲除小鼠模型 |
| 3 结果 |
| 3.1 CFAP58基因双等位基因突变导致MMAF |
| 3.2 Cfap58基因敲除雄性小鼠不育,并且精子尾部表型符合MMAF |
| 3.3 CFAP47基因半合子突变导致MMAF |
| 3.4 Cfap47基因突变雄性小鼠不育,并且精子尾部表型符合MMAF |
| 4 讨论 |
| 4.1 CFAP58基因缺陷导致MMAF和男性不育 |
| 4.2 CFAP58参与精子鞭毛组装的分子机制初探 |
| 4.3 CFAP47基因缺陷导致MMAF和男性不育 |
| 4.4 CFAP47参与精子鞭毛组装的分子机制初探 |
| 5 结论 |
| 5.1 CFAP58基因双等位基因突变导致以MMAF为特征的弱畸精子症 |
| 5.2 CFAP47基因半合子突变导致以MMAF为特征的弱畸精子症 |
| 6 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 人类精子鞭毛多发形态异常(MMAF)遗传学研究进展 |
| 参考文献 |
（4）AURKC基因多态性与畸形精子症的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 畸形精子症组的纳入及排除标准 |
| 1.1.3 对照组的纳入及排除标准 |
| 1.1.4 AURKC基因位点的选择 |
| 1.1.5 样本含量的确定 |
| 1.2 试剂及器材 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 精液相关检查 |
| 1.3.2 全血标本、精浆的采集及储存 |
| 1.3.3 基因组 DNA 的提取及保存(离心柱法) |
| 1.3.4 多重PCR测序 |
| 1.3.5 ELISA检测精浆中AURKC蛋白水平(直接法-双抗体夹心法) |
| 1.4 研究对象的一般临床资料和相关结果的收集 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 研究对象的一般临床资料 |
| 2.2 畸形精子症组和对照组AURKC精浆蛋白水平分析 |
| 2.3 AURKC基因rs1008073、rs11084490、rs2302060 位点基因分型结果 |
| 2.4 AURKC基因多态性与畸形精子症的关联性 |
| 2.5 AURKC基因多态性单倍型分析 |
| 2.5.1 AURKC基因rs1008073、rs11084490、rs2302060 位点连锁不平衡分析 |
| 2.5.2 AURKC基因rs1008073、rs11084490、rs2302060 位点单倍型分析 |
| 2.6 畸形精子症患者rs11084490 位点AURKC精浆蛋白水平分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 AURKC精浆蛋白表达 |
| 3.2 AURKC基因SNP与畸形精子症的相关性 |
| 3.3 3个位点的连锁不平衡和单倍型分析 |
| 3.4 rs11084490 位点AURKC精浆蛋白水平分析 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 不同类型畸形精子症致病基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（5）GRP78基因启动子区多态性及其血清水平与弱精子症相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略索引表 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象纳入及排除标准 |
| 1.2 采集血液标本 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要的实验方法 |
| 1.5.1 精液质量分析 |
| 1.5.2 基因组DNA的提取 |
| 1.5.3 DNA浓度及纯度检测 |
| 1.5.4 多重PCR测序 |
| 1.5.4.1 PCR引物 |
| 1.5.4.2 多重PCR反应条件 |
| 1.5.4.3 PCR产物纯化 |
| 1.5.4.4 SNaPshot多重单碱基延伸反应 |
| 1.5.4.5 延伸产物纯化 |
| 1.5.4.6 延伸产物测序 |
| 1.5.5 ELISA检测GRP78血清水平 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 研究对象临床资料 |
| 2.2 GRP78基因启动子区位点基因分型结果 |
| 2.3 GRP78基因启动子区多态性与AZS的关联性 |
| 2.4 GRP78基因启动子区多态性单倍型分析 |
| 2.4.1 连锁不平衡分析 |
| 2.4.2 单倍型分析 |
| 2.5 Rs3216733位点与AZS患者的精子动力学参数的相关性 |
| 2.6 AZS中rs3216733位点GRP78血清蛋白水平的分析 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（6）特发性男性不育症家系的细胞力学、蛋白质组学以及基因组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1. 引言 |
| 1.2. 精子的细胞力学研究 |
| 1.3. 男性不育的差异蛋白质组学分析 |
| 1.4. 男性不育的相关基因 |
| 第二章 畸形精子的细胞力学研究 |
| 2.1. 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 特发性男性不育症家系的蛋白质组学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 畸形精子症家系的基因组学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）CD82在非梗阻性无精症精子发生障碍中的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 2.材料与试剂 |
| 3.研究方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 7.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（8）缺氧诱导因子α在特发性非梗阻性无精子症生精功能障碍中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 临床病例资料收集 |
| 1.2 经皮睾丸穿刺抽吸术获取病人睾丸组织标本 |
| 1.3 病人睾丸穿刺组织苏木精-伊红染色分析和支持细胞计数分析 |
| 1.4 免疫组织化学方法鉴定病人睾丸穿刺组织中的支持细胞并评估支持细胞Ki-67 阳性指数 |
| 1.5 小鼠睾丸支持细胞（TM4）系的体外培养及药物处理 |
| 1.6 免疫印迹方法检测病人睾丸穿刺组织和TM4细胞裂解液中SOD、HO-1、HIF-1α/2α、铁代谢相关蛋白和紧密连接蛋白的表达变化 |
| 1.7 四氮唑盐比色法评价双酚A、氮芥和姜黄素对TM4细胞存活率影响 |
| 1.8 数据分析和统计学处理 |
| 结果 |
| 2.1 临床病例资料分析 |
| 2.2 IA组和OA组患者体格检查、阴囊超声检查及血清激素水平检测结果 |
| 2.3 IA组和OA组患者睾丸穿刺组织病理分析并评价支持细胞增殖活性 |
| 2.4 IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中SOD和HO-1 的表达变化 |
| 2.5 IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中HIF-1α/2α 的表达变化 |
| 2.6 IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中铁代谢相关蛋白的表达变化 |
| 2.7 IA组和OA组患者睾丸穿刺组织中紧密连接蛋白的表达变化 |
| 2.8 不同浓度双酚A和氮芥对TM4细胞系存活率的影响 |
| 2.9 不同浓度双酚A和氮芥处理TM4细胞系HIF-1α/2α 的表达变化 |
| 2.10 不同浓度双酚A和氮芥处理TM4细胞系铁代谢相关蛋白的表达变化 |
| 2.11 不同浓度双酚A和氮芥处理TM4细胞系SOD和HO-1 的表达变化 |
| 2.12 抗氧化剂对不同浓度双酚A和氮芥处理TM4细胞系存活率的影响 |
| 讨论 |
| 3.1 IA病人睾丸支持细胞异常增生 |
| 3.2 IA病人睾丸组织中缺氧诱导因子 α 调控异常 |
| 3.3 IA病人睾丸组织中铁代谢异常 |
| 3.4 IA病人睾丸组织中紧密连接蛋白表达异常 |
| 3.5 IA病人睾丸组织中氧化还原反应失衡 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表（附录） |
| 致谢 |
（9）miR-17-92基因簇miRNA在染料木黄酮暴露致精子生产障碍中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-17-92基因簇miRNA表达水平与GEN暴露的关联研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 第二部分 miR-17-92基因簇miRNA在GEN染毒小鼠生精障碍中的作用及机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 主要缩略词英中文对照 |
| 附录二 主要创新点 |
| 附录三 在校期间发表的论文及获奖情况 |
| 附录四 人群研究相关证明和基础材料 |
| 致谢 |
（10）ESR2基因多态性与河南汉族人群男性不育的相关性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 1 前言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 试剂与器材 |
| 2.3 主要仪器与设备 |
| 3. 试验方法 |
| 3.1 基因组DNA的提取 |
| 3.2 DNA定量及纯度测定 |
| 3.3 排除Y染色体AZF微缺失 |
| 3.4 ESR2基因rs4986938和rs1256049位点多态性检测 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 病例组和对照组人群SHBG基因多态分布的Hardy-weinberg检验 |
| 5.2 两个位点的电泳结果 |
| 5.3 两个位点的测序结果 |
| 5.4 ESR2基因rs4986938位点多态性与男性不育的相关性 |
| 5.5 ESR2基因rs1256049位点的多态性与男性不育的相关性 |
| 5.6 ESR2基因rs4986938 G/A和rs1256049 G/A位点的单倍型分析 |
| 6 讨论 |
| 7、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Expression and significance of Rap1A in testes ofazoospermic subjects（论文参考文献）
- [1]基于TLR/MyD88/NF-κB通路研究五子衍宗丸对热应激诱发睾丸炎症反应的影响[D]. 胡素芹. 北京中医药大学, 2021
- [2]CFAP58与CFAP47基因突变导致精子鞭毛多发形态异常的遗传学及致病机制研究[D]. 吴欢. 安徽医科大学, 2021
- [3]精子DNA甲基化异常与精液质量相关性的研究进展[J]. 陈炜康,于冬冬,刘宇鹏,武志刚. 中华医学遗传学杂志, 2021(02)
- [4]AURKC基因多态性与畸形精子症的相关性研究[D]. 刘中林. 右江民族医学院, 2020(04)
- [5]GRP78基因启动子区多态性及其血清水平与弱精子症相关性研究[D]. 覃海媚. 右江民族医学院, 2019(01)
- [6]特发性男性不育症家系的细胞力学、蛋白质组学以及基因组学研究[D]. 马莹. 兰州大学, 2018(02)
- [7]CD82在非梗阻性无精症精子发生障碍中的机制研究[D]. 唐亮. 安徽医科大学, 2018(04)
- [8]缺氧诱导因子α在特发性非梗阻性无精子症生精功能障碍中的作用研究[D]. 荆涛. 青岛大学, 2017(12)
- [9]miR-17-92基因簇miRNA在染料木黄酮暴露致精子生产障碍中的作用及机制[D]. 顾颢. 南京医科大学, 2016(02)
- [10]ESR2基因多态性与河南汉族人群男性不育的相关性分析[D]. 马宇飞. 郑州大学, 2014(12)