汉坦病毒K24株M段和S段基因的结构特征

一、汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征（论文文献综述）

尚翠^[1]（2020）在《中国汉坦病毒分子流行病学特征研究》文中研究指明汉坦病毒（Hantavirus,HV）是重要的人畜共患病病原体之一,属于汉坦病毒科,正汉坦病毒属的单股负链RNA病毒。人感染后,根据临床表现特征的不同可分为肾综合征出血热（Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus Pulmonary Syndrome,HPS）。HV引起的疾病在世界范围内流行,严重危害人类的身体健康,已经波及世界五大洲70多个国家,成为全球共同关注的公共卫生问题。HFRS在我国流行范围广,疫区类型复杂,是我国最严重的鼠传疾病之一。为了了解中国HV的分子流行病学特征和遗传进化情况,本研究结合国家HFRS监测系统,采集宿主动物标本,开展HV感染状况分子流行病学调查。结果,共收集鼠肺标本284份,通过荧光定量PCR核酸检测阳性的有95份,包括辽宁省24份,18份阳性;云南省70份,19份阳性;河北省20份,18份阳性;黑龙江省24份,12份阳性;江西省8份,6份阳性;安徽省103份,8份阳性;湖南省35份,14份阳性。通过RT-PCR的方法,从阳性鼠肺标本或病毒株中扩增共测得50株HV全基因序列并分型,包括云南省8株（SEOV）,辽宁省16株（SEOV）,黑龙江省5株（SEOV）,河北省10株（SEOV）,安徽省3株（HTNV）,山东省1株（HTNV）,福建省1株（SEOV）,陕西省3株（HTNV）,湖南省3株（1株SEOV,2株HTNV）。另外还获得了 15株HV的Gc部分片段,包括湖南省12株（HTNV）,江西省3株（1株SEOV,2株HTNV）。本研究采用Vero-E6细胞培养的方法从鼠肺标本中共分离到6株HV,包括云南省1 株 SEOV（XY67）、湖南省 2 株 HTNV（2018C024-10 和 2018C024-22）和安徽省 3 株 HTNV（xc028,xc067 和 xc046）。从GenBank等公共数据库中,下载HV参考毒株序列,包含国内外不同种的HV序列,国内包括不同省份的HTNV/SEOV历史毒株序列,共96株,通过软件分析分离株序列与参考序列核苷酸相似性,采用NJ法构建遗传进化树。结果发现,本研究中获得的辽宁省、河北省和黑龙江省HV序列均为SEOV的S3基因型,与各省S3基因型既往分离株和S3基因型参考序列相似性高大于97%。陕西省3株HTNV序列为H4基因型,与历史株84FLi不同。福建省1株SEOV序列为S5基因型,与历史株不同。山东省1株HTNV序列为H5基因型,已知山东省至少存在5个HTNV/SEOV的基因型,种类多样。湖南省1株SEOV序列属于S3基因型,2株HTNV序列与其他各基因型序列相似性小于95%,12株HTNV的Gc部分片段也不在已知基因型分支。安徽省3株HTNV序列属于H9基因型。云南省8株SEOV序列变异大,在进化树中分成了两个分支,显示同一地区可能存在两个基因型病毒同时流行。江西省1株SEOV序列和2株HTNV序列的Gc片段均独自成为一支,变异程度大,基因型种类多前期已有文献报道。对于存储于GenB ank上的大部分HTNV和SEOV的序列分析显示,病毒基因组呈现更加多样化的趋势,聚集而成的独立分支更多,显示出了变异的特征。本研究中还发现了可能的HV的宿主“溢出”现象,在辽宁省黑线姬鼠中检测到SEOV,在湖南、安徽省的小家鼠中检测到HTNV,提示自然选择过程中形成病毒多样性的重要机制。综上所述,本研究初步阐明了中国HV的分子流行病学特征,初步揭示了HTNV和SEOV及其各基因型的地理分布和各地区流行病毒的主要特征,分析了病毒基因组的多样性,获得了中国HFRS重点流行省份的HV基因序列,为开展中国HV在分子水平的研究贡献了宝贵的数据,并且分离到源自3个不同省份的6株病毒流行株,丰富了我国HV的病毒库,对于精准开展HFRS的预防控制措施,评价疫苗免疫效果具有重要意义,也为今后进一步分析研究HV流行特征奠定了坚实的基础。

殷强玲^[2]（2019）在《中国流行性出血热重点流行区汉坦病毒遗传进化特征分析》文中研究表明流行性出血热（Epidemic Hemorrhagic Fever,EHF）又名肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS）,是由汉坦病毒（Hantavirus,HVs）引起的以发热、出血和肾损伤为主要特征的人兽共患传染病。汉坦病毒属汉坦病毒科正汉坦病毒属,有包膜分节段的负链RNA病毒,其基因组由L、M和S三个片段组成,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）、包膜糖蛋白（GPs,Gn和Gc）和核衣壳蛋白（NP）。啮齿类动物为其主要的自然宿主和储存宿主,鼠类感染汉坦病毒后多为无症状持续性感染,长期携带病毒,持续性排毒;该病主要通过吸入带毒鼠的尿液、排泄物污染产生的气溶胶,食用被污染的食物或被嗤齿类动物咬伤等方式传染人;人感染后主要引起以肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）为主要表现的病毒病,中国以肾综合征出血热为主。在中国,HFRS流行范围广泛,除青海省外,其余各省、直辖市和自治区均有病例报告,发病人数多,病死率较高,严重威胁人民生命安全。疫情监测和流行病学研究是疾病预防控制的重要手段,比较研究人和鼠汉坦病毒流行状况对于人间疫情预估及现有疫苗保护性的评价至关重要。为了解中国流行性出血热重点流行区汉坦病毒流行特征,为汉坦病毒现场流行病学调查检测程序优化提供理论支持,本研究于2018年春季在中国流行性出血热重点流行区（河北、辽宁、黑龙江和江西等）采集人和鼠等样本,经Real-time RT-PCR检测,挑选45份阳性鼠肺样本和12份IgM阳性急性期血清样本（发病日期与采样日期间隔6天）通过Vero-E6细胞连续盲法传代培养的方法进行病毒分离,此外通过PCR方法从鼠肺原始样本中直接扩增病毒基因组片段,通过一代或二代测序对所有病毒株进行基因组测序,对获得的全部病毒株基因组进行遗传进化分析。同时,利用采集于以上各省份的不同类型的鼠类样本各392份进行三种常用的核酸、抗原和抗体检测方法的比较研究。结果,从辽宁省鼠肺样本中共分离出2株病毒（LNTL001和LNTL003）,从河北省和黑龙江省鼠肺样本各分离到一株病毒（HBCD041和HLJNH013）,从急性期病人血清中未分离到病毒。通过汉坦病毒全基因组分段PCR扩增方法,从河北、辽宁和黑龙江三省部分病毒分离失败的原始鼠肺样本获得16株汉坦病毒的全基因组片段,同时从江西省病毒分离失败的原始鼠肺样本获得5株汉坦病毒的Gn和Gc基因部分片段。经一代或二代测序获得22株病毒株基因组S、M、L片段全部序列和5株病毒株Gn基因和Gc基因部分片段序列;已经获得的所有基因序列遗传进化分析和同源性分析结果显示,来自河北省、辽宁省和黑龙江省4株汉坦病毒分离株及18株鼠肺原始样本直接测序获得的病毒株S/M/L片段核苷酸同源性与中国汉城型代表株L99、国际标准株80-39及汉城型疫苗株Z37的同源性均较近,与汉滩型中国代表株84Fli、国际标准株76-118及汉滩型疫苗株Z10较远,与汉城型S3亚型病毒在同一遗传进化分支上,由此推测22株病毒株均为汉城型S3亚型病毒。4株分离株之间核苷酸同源性为97%～99%,直接测序获得的18株病毒株之间核苷酸序列同源性为97%～99%;来自同一省份的鼠肺的毒株之间核苷酸序列同源性为99%以上,来自不同省份的鼠肺病毒株核苷酸序列同源性为97%左右,病毒分离株与原始样本测得的病毒株基因组同源性达99%;所有病毒株糖蛋白氨基酸与疫苗株Z37、L99比较,均存在若干个氨基酸位点的差异,且与疫苗株L99差异更大。江西省5株病毒株经型特异性实时荧光RT-PCR验证1株为汉城型病毒,4株为汉滩型病毒,与所有已知亚型病毒株核苷酸同源性小于93.6%,且形成独立的遗传进化分支,推测为新亚型病毒。辽宁省的2株分离株二代测序结果与原始鼠肺一代测序结果一致性达99%,表明一代测序与二代测序结果一致性较好,实际运用中可综合样本情况、实验室条件选择其中一种进行病毒基因组序列测定。汉坦病毒核酸、抗原和抗体检测方法比较结果显示,ELISA法检出抗体阳性鼠血标本46份,阳性率为12.53%;RT-PCR法检出病毒RNA阳性鼠肺标本28份,阳性率为7.63%;IFA检出抗原阳性鼠肺标本24份,阳性率为6.54%。100%（24/24）IFA检测阳性标本和89.3%（25/28）RT-PCR检测阳性标本对应血标本ELISA抗体检测阳性。RT-PCR与IFA检测结果差异无显着性（χa2= 0.64,P>0.05）,一致性检验Kappa系数为0.71,一致性高（Z=13.66,P<0.05）,首先对血标本开展基于ELISA的特异性抗体检测,可显着缩小RT-PCR或IFA法检测病毒RNA或抗原的范围（χb2= 12.04,χc2=20.05,P<0.05）。综上所述,本研究成功从河北、黑龙江、辽宁鼠肺样本中分离到四株病毒,通过直接扩增和病毒分离方法从河北、辽宁、黑龙江、江西省鼠肺原始样本共获得27株病毒,通过一代或二代测序获得22株病毒株基因组全序,5株病毒株Gn和Gc基因部分片段,遗传进化分析提示河北、黑龙江、辽宁宿主动物中汉坦病毒变异较小,江西省宿主动物汉坦病毒变异较大,通过遗传进化分析初步了解流行性出血热重点流行省份宿主间流行的汉坦病毒基因特征;3种检测汉坦病毒的方法比较研究证实,宿主动物组织标本中检出汉坦病毒RNA和（或）结构蛋白抗原的标本,对应的血液标本中可检出病毒特异性抗体,反之亦然,检出抗体的标本基本包含了可检出抗原和RNA的标本,开展HFRS宿主现场流行病学调查研究时,可先进行抗体筛查,再针对抗体阳性样本进行抗原和核酸的验证,该结论为现场流行病学调查工作中检测方法的选择提供理论,减轻现场工作量,提高工作质量和效率。

黄鹏,杨章女,刘源,姚苹苹,胡建利,王笑辰,俞建家,李军,韩亚萍,金柯,杨龙,张云,岳明^[3]（2017）在《东南沿海地区1980-2015年汉坦病毒分子特征及流行病学分析》文中认为目的探讨1980-2015年从东南沿海地区不同地域、时间、宿主、媒介及患者中分离的汉坦病毒（HV）的遗传进化及流行规律。方法运用遗传流行病学、分子流行病学和生物信息学方法分析1980-2015年东南沿海地区（江苏、浙江、福建省和上海市）HV的S、M片段高变区基因的变异位点与频率,结合HV、宿主、媒介与生态环境4个方面及流行病学资料,分析HV在不同地域、时间、自然宿主以及重要传播媒介之间的演变规律。结果东南沿海地区肾综合征出血热（HFRS）临床患者感染的病毒以汉滩型（HTN）HV居多,主要与76-118株同源为主,汉城型病毒（SEOV）与Z37株相似的病毒为主;为HV HTN和SEO的混合型疫区,呈现高度的地理聚集现象;鼠类携带HV以SEOV为主,病毒分支与携带宿主的种类和采集地点有关,SEOV主要来源于褐家鼠,HTNV主要来源于黑线姬鼠。结论 HV和HFRS疫区的形成和维持具有一定的内在规律。

刘冰玉^[4]（2017）在《湖北省褐家鼠汉城病毒感染和MHC-Ⅱ RT1.Ba exon2基因多态性的关系分析》文中研究说明目的:（1）研究湖北省黄冈地区啮齿动物自然感染汉坦病毒的情况及基因分型特征,为黄冈地区肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）的预防提供理论依据。（2）研究湖北省褐家鼠汉城病毒（Seoulvirus,SEOV）感染与MHC-ⅡRT1.Ba exon2基因多态性的关系。方法:（1）于2012-2013年秋冬季在湖北省黄冈地区的野外及居民区采用隔夜法捕鼠。对捕获鼠做初步分类,提取鼠肺组织RNA,根据GenBank合成SEOV以及汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）的M片段引物,RT-PCR扩增M片段,琼脂糖凝胶电泳,特异性产物纯化测序,对序列进行系统发育和序列同源性分析。（2）2014-2015年在湖北的襄阳、宜昌、荆州、武汉四个地区的居民区采用隔夜法捕鼠。间接免疫荧光法（IFA）检测鼠血清SEOV-IgG抗体。提取鼠肺组织总RNA及DNA。根据GenBank序列合成SEOVS片段引物,建立巢式PCR扩增S片段方法,特异性产物纯化测序。设计褐家鼠、黄胸鼠线粒体DNA细胞色素b（cyt-b）特异性引物,PCR扩增,鉴别鼠种。设计褐家鼠MHC-ⅡRT1.Baexon2特异性引物,PCR扩增目的片段MHC-ⅡRT1.Baexon2,特异性产物纯化测序。对MHC-Ⅱ RT1.Ba exon2杂合子进行TA克隆并测序。卡方检验比较湖北省不同地区的SEOV阳性率。分析湖北褐家鼠MHC-Ⅱ RT1.Ba exon2等位基因和杂合度。卡方检验比较湖北不同地区褐家鼠SEOV感染与MHC-ⅡRT1.Baexon2等位基因以及杂合度之间关系。结果:（1）2012-2013年秋冬季在湖北省黄冈地区共捕获啮齿动物95只,其中褐家鼠75只,占捕获啮齿动物总数的78.94%。6份褐家鼠标本SEOV阳性,占褐家鼠总数的8.00%。系统发育分析关系分析显示当地SEOV属于A组,与Z37株核苷酸同源性为95.80%-96.30%,氨基酸同源性为97.90%-100%。黄胸鼠和黑线姬鼠均为SEOV、HTNV阴性。（2）2014-2015年在湖北的襄阳、宜昌、荆州、武汉这四个地区共捕获鼠245只,其中褐家鼠215只,黄胸鼠30只。IFA法检测啮齿动物SEOV-IgG的阳性率为5.71%,巢式RT-PCR检测SEOV部分S片段的阳性率为8.57%。卡方检验比较湖北各地啮齿动物SEOV的阳性率,P<0.05,即有显着性差异。啮齿动物SEOV-IgG阳性率从高到低顺序为:襄阳（12.05%）、武汉（3.80%）、宜昌（1.89%）和荆州（0.00%）。SEOV部分S片段阳性率从高到低顺序为:襄阳（13.25%）、武汉（11.39%）、宜昌（1.89%）和荆州（0.00%）。对204只褐家鼠的MHC-ⅡRT1.Baexon2进行测序,分析出有10种等位基因,且通过SPSS20.0软件使用卡方检验计算分析出:湖北不同地区的褐家鼠MHC-ⅡRT1.Baexon2目的基因片段杂合度比较,P<0.05,具有显着性差异;阴性和阳性褐家鼠之间的MHC-ⅡRT1.Ba exon2基因的杂合度比较,P>0.05,不具有显着性差异;湖北不同地区之间的褐家鼠MHC-ⅡRT1.Baexon2基因等位基因比较,P<0.05具有显着性差异;湖北SEOV阴性和阳性褐家鼠之间MHC-ⅡRT1.Baexon2基因等位基因比较,P>0.05,不具有显着性差异。结论:（1）2012-2013年湖北省黄冈地区的优势鼠种是褐家鼠,汉坦病毒型别主要是SEOV,其系统发育关系属于A组,且与疫苗株Z37同源性最高。（2）2014-2015年湖北省襄阳、宜昌、荆州、武汉这四个地区褐家鼠感染汉城病毒情况不同,襄阳阳性率最高,武汉其次。褐家鼠MHC-ⅡRT1.Baexon2基因杂合度差异在湖北以上地区有显着性差异,在SEOV阳性或阴性褐家鼠之间无显着性差异。褐家鼠MHC-ⅡRT1.Baexon2基因等位基因在湖北以上地区有显着性差异,在SEOV阳性或阴性褐家鼠之间无显着性差异。

李金林^[5]（2012）在《湖北地区汉坦病毒基因特征研究及假病毒的构建》文中研究说明目的：研究近年来流行在湖北地区的汉坦病毒的基因特征,并构建不同型别汉坦病毒假病毒,从而为进一步研究汉坦病毒G蛋白的功能提供新的手段。方法：1.湖北江夏地区鼠肺标本、HFRS患者血清的收集及筛选：获取2009-2011年间江夏区的6个采样点（胡家村、姚家湾、段岭庙、敖家边、山坡和张家湾）的鼠肺标本；并收集2009-2011年间江夏区临床诊断为肾综合征出血热（HFRS）的患者血清标本。利用间接免疫荧光（IFA）,空斑减数中和实验（FRNT）以及RT-PCR对收集的样本进行筛选。2.用RT-PCR法对病毒基因进行扩增,PCR产物克隆并测序,用MEGA等生物学软件对病毒的部分S片段进行系统进化分析。了解江夏区汉坦病毒流行的型别、基因特征。3.采用汉坦病毒感染乳BALB/c小鼠,对阳性标本进行病毒分离、传代,获得病毒株。并进行全基因组测序,用生物学软件分析其基因组特征。4.利用VSV△G-GFP （Luciferase）骨架分别构建含无名病毒（SNV）,安第斯病毒（ANDV）,汉滩病毒（HTNV）以及希望山病毒（PHV）的汉坦病毒假病毒,并对其感染性进行研究。5.用相应的HFRS/HPS抗血清,单克隆抗体等对这些汉坦病毒假病毒的抗原性进行研究。同时用受体特异性的抑制剂与其作用,观察假病毒进入细胞的方式,并与汉坦病毒原型分离株进行比较。6.构建致病性（SNV）和非致病性（PHV）嵌和G蛋白的汉坦病毒假病毒（即：SNVGn与PHVGc组合形成嵌和G蛋白,PHVGn与SNV Gc组合形成嵌合G蛋白）。并用汉坦病毒肺综合征（HPS）病人的抗血清与之反应检测其抗原性。7.用抗体与HV004G蛋白构建的汉坦病毒假病毒反应,然后用流式细胞仪检测。另外用阿比朵尔作用Vero-E6细胞后,再加入假病毒,观察其抑制效果。结果：1.捕获动物的带毒率及血清阳性率：共捕获173只动物,包括黑线姬鼠48只,褐家鼠125只,从3只褐家鼠和4只黑线姬鼠中检测到了汉坦病毒核酸,鼠肺标本中汉坦病毒核酸总检出率为4.05%。同时收集到11份HFRS病人血清,从其中的10份检测到了HTNV或SEOV中和抗体（有2份检测出汉坦病毒核酸）。2.所有汉坦病毒阳性标本部分S片段的测序结果：江夏地区鼠间流行汉坦病毒为HTNV和SEOV型,进化分析显示,来自褐家鼠的汉坦病毒基因序列（JX1143、JX0937、JX1018和JX1028）与SEOV （Z37、ZT10株等）形成一簇,属于SEOV型。从黑线姬鼠中扩增出的汉坦病毒序列（HV003、HV004和HV005）和两个从HFRS病人中得到的病毒序列（s200903和s201012）,属于HTNV型,组成一个新的分枝。3.对分离得到的HV004株全基因组测序结果显示：HV004属于HTNV型汉坦病毒,其全基因序列与其它HTNV （76-118, A9, CGHu2, CGRn45, Q32株等）比较,核酸的同源性为83%-90%,推导出氨基酸的同源性为95%-99%。对S,M和L全序列分析均表明HV004株为一个独立的分枝。在分离过程中,经BALB/c乳鼠传3代后,仅在S片段3’非编码区有一处发生了碱基突变,但其致病性没有变化。4.VSV-G假病毒的滴度从（?）3X105IU/ml （VSV△G-ANDV-GFP）到2×107IU/ml（VSV△G-VSV-GFP）。 VSV G-luc（?）段病毒颗粒与野生的VSV一样有着弹状外形,VSV△G-luc-HTNV平均长度为163.7±10.7nm,平均宽度为71.1±6.6nm。其它型别的假病毒大小与VSV A G-luc-HTNV.相似。5.用抗汉滩型汉坦病毒的单克隆抗体（即抗Gc特异性单克隆抗体HCO2和11E10）,抗VSV单克隆抗体mAb VSV,及SNV, ANDV和HTNV抗血清,分别与对应的汉坦病毒假病毒和原型分离株汉坦病毒反应,同一种抗体对两种病毒表现出相似的抑制效果。6.抗SNV血清可以中和嵌合假病毒,对两个嵌合的假病毒的中和作用介于抗SNV和PHV假病毒之间。另外抗SNV血清对PHVMSNV中和作用比SNVMPHV稍强。7. ReoPro可以同时减少致病性汉坦病毒和相对应的汉坦病毒假病毒进入Vero-E6细胞,紫外灭活的SNV和HTNV可以分别抑制SNV和HTNV假病毒进入细胞。8.阿比朵尔可以特异性抑制汉坦病毒假病毒进入细胞。可以用流式细胞仪对HV004假病毒感染细胞后进行检测,从而有望用于高通量药物筛选。结论：1.湖北HFRS疫区流行一种新亚型HTNV,其很有可能是引起近年来HFRS流行的病原体。2.汉坦病毒假病毒在抗原特征以及进入细胞方式上与原型分离株病毒相似,这为进一步研究汉坦病毒包膜蛋白与细胞的相互作用、病毒趋向性的研究以及应用于抗汉坦病毒药物的筛选提供了新的手段。

姚苹苹,朱函坪,邓小昭,徐芳,谢荣辉,姚晨辉,翁景清,张云,杨占秋,朱智勇^[6]（2010）在《浙江省汉坦病毒基因分子进化分析》文中认为为了分析浙江省汉坦病毒分子流行病学的特点,本文应用分子生物学软件对1981～2007年从浙江省不同地区不同宿主分离的12株汉坦病毒的S、M基因序列进行分子进化分析,结果显示:浙江省属汉滩（HTN）型和汉城（SEO）型的混合型疫区,病毒的基因差异和亲缘远近关系主要表现在地区性,而与病毒分离的年代与宿主关系并不大,表现出明显的地理聚集现象,该现象在HTNV中的表现尤为明显,同一地区分离的病毒表现为较高的基因同源性,系统进化树上分布于同一或临近分支。另外发现分离自浙江省建德地区的Gou3和ZJ5株在SEOV进化枝中构成一独立分支,而且与国内外SEOV其他毒株的基因差异均较大,在浙江省建德地区存在着SOEV的特殊亚型病毒。

李婵,谢荣辉,朱函坪,徐芳,姚苹苹,程胤凯,朱智勇^[7]（2010）在《汉坦病毒Z5株M和S片段全基因序列测定及分析》文中研究表明目的测定汉坦病毒Z5株M、S片段的全长序列,了解其分子结构特征,并分析Z5与其他汉坦病毒株的遗传学差异。方法设计引物,用RT-PCR技术扩增Z5株全长M与S片段。PCR产物纯化后克隆入T载体并测定序列及分析。结果Z5株M片段的全基因序列含有3 616个核苷酸,编码1 135个氨基酸。S全基因序列含有1 700个核苷酸,编码429个氨基酸。经核苷酸与氨基酸同源性分析,Z5株应属于汉坦病毒的汉滩型（HTN型）毒株,与Z10株同属一个亚型。结论Z5株病毒和其他汉滩病毒病毒在核苷酸序列上有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍较高。

李静,孔艳,董关木,安祺,杨立宏,周荔葆,俞永新^[8]（2009）在《肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因核苷酸序列分析》文中研究指明目的对肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因进行核苷酸序列分析,了解该毒种的基因稳定性。方法根据汉坦病毒标准株设计特异的PCR引物,用RT-PCR技术分段扩增疫苗株84FLi株的M和S基因片段,PCR产物纯化后直接测序,并进行遗传进化分析。结果疫苗株84FLi株M基因片段的核苷酸序列与GenBank中收录的HTN型毒株的M基因核苷酸序列的同源性为83.5%～99.9%,而与SEO型毒株的同源性为70.2%～72.0%。其S基因与HTN型毒株的同源性为85.9%～99.6%,与SEO型毒株的同源性为69.4%～70.8%。疫苗株84FLi株的M和S基因的氨基酸序列与GenBank中收录的HTN型汉坦病毒84FLi株M和S基因的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和99.5%。从遗传进化树上可以看出,疫苗株84FLi株与GenBank中收录的84FLi株位于一个独立的分支上,与其他HTN型病毒亚型分布于不同分支上,与其他HTN型病毒亚型亲缘关系较远。结论肾综合征出血热灭活疫苗毒株84FLi株M和S基因片段的核苷酸和氨基酸序列未发生较大变异,说明在传代过程中该疫苗株在基因水平上并未发生较大改变。

杨东靖^[9]（2009）在《天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析及其GP多表位抗原基因的构建与表达的研究》文中认为汉坦病毒（Hantavirus，HV）归属布尼亚病毒科（Bunyaviridae），是有包膜分节段的负链RNA病毒，病毒基因组由长（L）、中（M）、短（S）三个单股负链RNA片段组成，分别编码RNA聚合酶（RNA polymerase），G1、G2糖蛋白（Glycoprotein，GP）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）。人感染汉坦病毒后导致肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）两种严重的病毒性疾病。我国流行的是HFRS，每年报告病例占全球90％以上，报告发病人数2～5万人。该病在我国分布范围广、疫区类型复杂，已成为危害人民健康和生命安全的重点防治传染病之一。天津地区的HFRS发病率从1999年开始明显上升，是全国发病增长速度最快的地区之一，2002年HFRS的报告发病率达到4．05／10万，为天津市HFRS发病的历史最高水平。为了解天津地区HFRS病原体——汉坦病毒的流行型别、核苷酸序列特征及其进化关系，本研究对天津地区人群感染和鼠间传播的汉坦病毒进行分子流行病学分析；并且鉴于汉坦病毒G2包膜糖蛋白的重要研究地位，本研究在对汉坦病毒L99株G2蛋白进行了全面生物信息学分析的基础上，构建了G2多表位抗原基因mea，并对其进行了表达和蛋白纯化，并建立MEA-ELISA方法用于病人检测。第一部分天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析【目的】针对近年来天津地区肾综合征出血热（HFRS）的疫情形势，对宿主动物传播和HFRS病人感染的HV进行了系统的分子流行病学研究，同时对HFRS患者的早期实验室检测和宿主动物标本的检测进行了方法学研究。【方法】（1）收集16份临床诊断HFRS患者血清，分别用间接免疫荧光方法（IFA）和捕获ELISA方法检测特异性IgG和IgM，用RT-Nested PCR方法检测汉坦病毒核酸并分型，用核苷酸序列测定和生物信息学分析进行同源性比对和种系进化分析。（2）采集天津地区的243份鼠肺标本，用rNP抗体-IFA法检测HV抗原，选取阳性鼠肺标本进行病毒RNA提取和RT-Nested PCR分型。用核苷酸序列测定和生物信息学分析进行同源性比对和种系进化分析。同时，将人群感染的HV与鼠间传播的HV进行序列同源性分析。（3）将HTN型HV感染的鼠肺接种Vero-E6细胞，进行病毒分离，通过RT-PCR和T-A克隆获得其S和M全基因片段，进行核苷酸序列分析、同源性分析和种系发生分析。【结果】（1）16例HFRS患者中，用捕获ELISA法检测特异性IgM的阳性率为52．65％（9／16例），用IFA法检测特异性IgG的阳性率为52．65％（9／16例），有11例RT-Nested PCR结果呈阳性，阳性率为68．75％，并且均为SEO型，并且相互间序列同源性为93．7％～100％。（2）rNP抗体-IFA法检测243份鼠肺标本，10份为阳性，阳性率为4．12％，10份阳性标本经RT-Nested PCR分型，有9株为SEO型，1株HTN型。并且9株SEO型HV的同源性为95．4％～100％。（3）天津地区人群感染与鼠间传播的汉坦病毒M片段的序列（1343～1629 nt）同源性分析发现，源自鼠肺组织的BC0207株与源自HFRS患者的1yf、ssg和hcy株的序列同源性为100％。（4）病毒分离获得HTN型汉坦病毒TJJ16株，其S片段与HTN型Q32毒株的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为96．1％和97．9％，其M片段与Q32株的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为99．4％和99．6％；【结论】天津地区人群感染和鼠间传播的HV分子流行病学研究表明均以SEO型为优势流行型，并具有明显区域聚集性特征。首次在社鼠体内分离到1株HTN型毒株TJJ16，与贵州的黑线姬鼠分离株Q32属同一亚型。第二部分汉坦病毒GP多表位抗原基因的构建与表达【目的】构建L99株G2蛋白的多表位抗原基因mea，并进行大肠杆菌表达和纯化，建立MEA-ELISA方法用于HFRS患者特异性抗体的检测。【方法】（1）通过生物信息软件对汉坦病毒L99株M基因及其编码的G2包膜糖蛋白进行了全面综合分析，并从亲水性和表面可及性，抗原性和蛋白二级结构四个方面对其B细胞表位进行分析预测，优选出B细胞表位，引入GPG（甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸）间隔序列将表位串联，设计出G2蛋白的多表位抗原基因mea。（2）利用重叠PCR方法构建mea，并利用pET原核系统表达以获得多表位抗原蛋白MEA，并进行镍亲和层析纯化。（3）利用真核表达载体pcDNA3．1（+）构建L99株G2蛋白的真核表达重组质粒，并经脾和肌肉复合DNA免疫BALB／c小鼠，以获得针对HV G2蛋白抗血清，用IFA法检测抗体效价，用免疫酶细胞化学技术检测抗体特异性。（4）利用G2蛋白抗血清对MEA进行特异性鉴定，并建立MEA-ELISA方法用于临床HFRS患者和健康人特异性抗体的检测。【结果】（1）优选出HV G2蛋白的5个B细胞表位，并构建了长度为534 bp的多表位抗原基因。（2）构建了重组蛋白表达质粒pET32a-mea，对多表位抗原基因mea进行了表达和纯化，获得了纯度为95％的多表位抗原MEA蛋白，得率为0．14mg／mL。（3）构建了真核表达质粒pcDNA3．1-L99G2，并DNA免疫BALB／c小鼠，获得了针对HV G2蛋白的抗血清，抗体效价1：80，质粒转染后胞内产生的瞬时表达G2蛋白证实其抗体特异性。（4）对多表位抗原MEA的抗原性研究表明，DNA免疫抗血清与多表位抗原MEA反应阳性，与重组N蛋白（rNP）反应阴性。（5）MEA-ELISA方法检测30例HFRS患者IgG的阳性率为76．67％，检测10例健康人IgG全部为阴性。【结论】首次构建了汉坦病毒GP的多表位抗原基因，并进行pET原核表达系统表达，获得了多表位抗原MEA，具有高度特异性，可替代HV G2蛋白用于HFRS临床患者特异性抗体的检测，并为构建新型表位疫苗奠定基础。

姚苹苹,朱函坪,徐芳,王志刚,梅玲玲,雷永良,谢荣辉,王复苏,朱智勇,邓小昭,张云^[10]（2009）在《浙江省丽水地区2株汉坦病毒分离株的型别鉴定和基因差异研究》文中进行了进一步梳理目的从浙江省丽水地区肾综合征出血热（HFRS）疫区阳性鼠肺标本中分离汉坦病毒（HV）,并对丽水分离株进行分子生物学鉴定,分析M和S片段基因序列以确定毒株的型别和基因差异程度。方法收集宿主动物标本,采用直接免疫荧光检测鼠肺标本HV抗原。将HV抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离HV。提取病毒总RNA,应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒M和S基因全片段,克隆人质粒载体,纯化后测定序列,并同HV其他病毒株进行比较。结果成功分离到2株HV,扩增出2株病毒的M和S全片段并测定了序列,经对核苷酸序列分析表明,2株病毒与现有的HTNV有最高的同源性,均为HTNV,但与国内外其他的HTNV核苷酸差异高达13.4%～20.7%和10.3%～16.1%。用M和S片段核苷酸序列所构建的系统进化树显示,2毒株分在HTNV发生群,与HTNV的Z10、A9、Z5病毒株亲缘关系最近,但独自构成一进化支。结论浙江丽水分离株可以定型为HTN型病毒,与国内外其他的HTN型病毒基因差异较大。

二、汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征（论文提纲范文）

（1）中国汉坦病毒分子流行病学特征研究（论文提纲范文）

（2）中国流行性出血热重点流行区汉坦病毒遗传进化特征分析（论文提纲范文）

（3）东南沿海地区1980-2015年汉坦病毒分子特征及流行病学分析（论文提纲范文）

（4）湖北省褐家鼠汉城病毒感染和MHC-Ⅱ RT1.Ba exon2基因多态性的关系分析（论文提纲范文）

（5）湖北地区汉坦病毒基因特征研究及假病毒的构建（论文提纲范文）

（6）浙江省汉坦病毒基因分子进化分析（论文提纲范文）

（7）汉坦病毒Z5株M和S片段全基因序列测定及分析（论文提纲范文）

（8）肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因核苷酸序列分析（论文提纲范文）

（9）天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析及其GP多表位抗原基因的构建与表达的研究（论文提纲范文）

四、汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征（论文参考文献）

• [1]中国汉坦病毒分子流行病学特征研究[D]. 尚翠. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
• [2]中国流行性出血热重点流行区汉坦病毒遗传进化特征分析[D]. 殷强玲. 中国疾病预防控制中心, 2019(10)
• [3]东南沿海地区1980-2015年汉坦病毒分子特征及流行病学分析[J]. 黄鹏,杨章女,刘源,姚苹苹,胡建利,王笑辰,俞建家,李军,韩亚萍,金柯,杨龙,张云,岳明. 中国媒介生物学及控制杂志, 2017(04)
• [4]湖北省褐家鼠汉城病毒感染和MHC-Ⅱ RT1.Ba exon2基因多态性的关系分析[D]. 刘冰玉. 武汉大学, 2017(06)
• [5]湖北地区汉坦病毒基因特征研究及假病毒的构建[D]. 李金林. 武汉大学, 2012(08)
• [6]浙江省汉坦病毒基因分子进化分析[J]. 姚苹苹,朱函坪,邓小昭,徐芳,谢荣辉,姚晨辉,翁景清,张云,杨占秋,朱智勇. 病毒学报, 2010(06)
• [7]汉坦病毒Z5株M和S片段全基因序列测定及分析[J]. 李婵,谢荣辉,朱函坪,徐芳,姚苹苹,程胤凯,朱智勇. 中国人兽共患病学报, 2010(03)
• [8]肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因核苷酸序列分析[J]. 李静,孔艳,董关木,安祺,杨立宏,周荔葆,俞永新. 中国生物制品学杂志, 2009(08)
• [9]天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析及其GP多表位抗原基因的构建与表达的研究[D]. 杨东靖. 天津医科大学, 2009(11)
• [10]浙江省丽水地区2株汉坦病毒分离株的型别鉴定和基因差异研究[J]. 姚苹苹,朱函坪,徐芳,王志刚,梅玲玲,雷永良,谢荣辉,王复苏,朱智勇,邓小昭,张云. 中华流行病学杂志, 2009(02)

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