一、肿瘤的自杀基因疗法（论文文献综述）
张文静[1]（2021）在《六味地黄丸增效小鼠黑色素瘤HSV-tk/GCV自杀基因疗法的免疫机制》文中进行了进一步梳理一、目的自杀基因疗法对恶性肿瘤的治疗有着独特且安全有效的作用,寻找增强自杀基因治疗效果的联合治疗方法是新的研究热点。本课题组前期研究显示,六味地黄丸可改善小鼠黑色素瘤细胞及肝癌细胞的缝隙连接通讯功能（GJIC）,且增效自杀基因疗法的抗肿瘤作用,其增效作用可能与GJIC介导的免疫杀伤密切相关,故本实验进一步明确其对小鼠黑色素瘤B16细胞的GJIC功能调控,是否增强HSV-tk/GCV自杀基因疗法对小鼠黑色素瘤的免疫杀伤效果,并对其相关机制进行探索。二、方法（一）体内实验检测六味地黄丸对自杀基因增效的旁观者效应的免疫机制1.CCK8法检测GCV在0-200 μ g/ml、六味地黄丸在0-600 μ g/ml浓度范围内对B16、B16-tk+细胞生长的影响,以确定用于后续研究的用药浓度。2.移植瘤实验检测六味地黄丸对自杀基因疗法旁观者效应的影响 实验分为对照组、六味地黄丸组、GCV组、GCV联合六味地黄丸组。小鼠双侧腋下分别接种B16、B16-tk+细胞,接种后第2天开始灌胃,成瘤当天开始腹腔注射GCV溶液,注射GCV第16天结束动物实验,进行实验结果统计分析。（二）体外实验检测六味地黄丸对自杀基因疗法免疫杀伤效应的增效作用1.培养DC细胞,显微镜观察、流式分析DC细胞的纯度及成熟度。2.脾脏分离淋巴细胞,流式分析CD8+T细胞的纯度。3.凋亡细胞染色实验检测六味地黄丸对自杀基因疗法免疫杀伤的作用。4.CD8+T细胞激活实验明确六味地黄丸是否增效CD8+T细胞杀伤B16细胞的作用。（三）调控Cx43表达及GJIC功能与六味地黄丸增效自杀基因疗法免疫杀伤的相关性1.蛋白印迹检测肿瘤组织Cx43蛋白的表达。2.蛋白印迹、免疫荧光实验检测六味地黄丸体外作用B16细胞48h对Cx43蛋白的影响;荧光黄染料传输实验、钙黄绿素荧光传输实验检测GJIC功能的改变。3.Cx43抑制剂反证免疫杀伤实验 B16-tk+细胞在六味地黄丸作用48h后,用GCV（30 μ g/ml）杀伤,24 h后洗去死细胞,Cx43抑制剂组加入Gapl9-TFA（250 μ M）,培养箱孵育4h后与骨髓来源DC细胞、脾脏CD8+T细胞进行共培养,24h后收集悬浮细胞与B16细胞共培养,48h后洗掉漂浮细胞,用Hoechst、PI染色;4.Cx43抑制剂反证CD8+T细胞激活实验 B16-tk+细胞在六味地黄丸作用48h后,用GCV（30 μ g/ml）杀伤,24h后洗去死细胞,Cx43抑制剂组加入Gap19-TFA（250 μ M）,培养箱孵育4h后与骨髓来源DC细胞、脾脏CD8+T细胞进行共培养,24 h后收集悬浮细胞与B16细胞共培养,48h后收集悬浮细胞进行流式抗体染色（CD8a-PE、CD69-FITC）,BD Fortessa流式细胞仪进行分析检测。三.结果（一）体内实验检测六味地黄丸对自杀基因增效的旁观者效应的免疫机制1.CCK8法检测0-100μg/ml的GCV对B16细胞的24h杀伤不明显,对B16tk+细胞有显着的杀伤作用,为了观察六味地黄丸联合tk/GCV系统对小鼠黑色素瘤的治疗效果,故选用125 mg/kg小鼠体重的注射剂量进行体内实验;根据小鼠与人等效计量换算公式,计算出六味地黄丸的灌胃量为300mg/kg小鼠体重。2.六味地黄丸联合GCV组肿瘤生长速度最为缓慢,与对照组、GCV组比较,六味地黄丸与GCV联合用药组肿瘤重量最小,左侧移植瘤的生长抑制反映自杀基因的杀伤效应,右侧移植瘤的生长抑制作用（P<0.05）,表明六味地黄丸能够增强小鼠黑色素瘤自杀基因疗法的旁观者伤效应的免疫机制,发挥抗肿瘤作用。（二）体外实验检测六味地黄丸对自杀基因疗法免疫杀伤效应的增效作用1.显微镜下观察DC细胞分化良好,流式分析DC细胞的纯度达到85%以上,成熟标记分子表达较高,可用于后续实验研究。2.脾脏提取并分离、提纯淋巴细胞,经流式分析CD8+T细胞纯度达90%以上。3.凋亡细胞染色实验显示,六味地黄组CD8+T细胞对B16细胞的免疫杀伤效果更加显着（P<0.001）。4.CD8+T细胞激活实验显示,与对照组比较,六味地黄丸组的CD8+T淋巴细胞CD69荧光强度增强,其荧光强度增强表示T细胞活化程度升高,因此该结果表明当用六味地黄丸处理过的B16细胞提供抗原时,可以增强CD8+T细胞的活化（P<0.001）。（三）调控Cx43表达及GJIC功能与六味地黄丸增效自杀基因疗法免疫杀伤的相关性1.体内移植瘤组织蛋白印迹结果显示,与对照组比较,六味地黄丸联合自杀基因疗法组Cx43蛋白表达水平增高（P<0.05）;2.体外实验蛋白印迹及免疫荧光实验显示六味地黄组Cx43蛋白表达明显上调,且Cx43蛋白膜定位较明显;荧光传输实验显示六味地黄组B16细胞GJIC功能显着增强,随着浓度增高,荧光染料传输距离越远。3.Cx43抑制剂反证免疫杀伤实验 对照组淋巴细胞对B16杀伤微弱,六味地黄处理组凋亡细胞则明显增多（P<0.001）,T细胞杀伤效应明显增强,在使用Cx43抑制剂Gap19-TFA作用后,T细胞杀伤效应明显减弱（P<0.001）。4.Cx43抑制剂反证CD8+T细胞激活实验显示,与对照组比较,六味地黄丸组的CD8+T细胞CD69-FITC荧光强度增强,在用Cx43抑制剂Gap19-TFA阻断GJIC后,CD69-FITC荧光强度明显减弱（P<0.001）。四.结论六味地黄丸联合自杀基因治疗系统具有免疫杀伤的增效作用;其作用机制是六味地黄丸可上调小鼠黑色素瘤B16细胞的Cx43的表达,改善GJIC功能,促进树突状细胞对肿瘤抗原信息的交叉提呈,更强地激活CD8+T细胞以增强其对肿瘤细胞的免疫杀伤效应。
李艾[2]（2021）在《氧化铁纳米粒改良的间充质干细胞载体构建及用于脑胶质瘤的靶向治疗研究》文中提出目的:本论文采用新型的氧化铁纳米材料来改良天然间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）载体,在实现对MSCs高效自杀基因重组的同时,利用氧化铁纳米粒降解后的产生的铁离子刺激MSCs上间隙连接蛋白（Connexin,Cx）43的过表达,促进活化的前药代谢物通过间隙连接通道向肿瘤细胞的转运,最终实现对脑胶质瘤细胞的高效选择性旁观者效应杀伤作用,为脑胶质瘤的自杀基因治疗提供一种基于改良干细胞载体的新策略。方法:1.构建基于氧化铁纳米组装链（Magnetosome-like ferrimagnetic iron oxide nanochains,MFIONs）的转染体系用于MSCs高效携载和表达编码单纯疱疹病毒胸苷激酶（Herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk）自杀基因的质粒DNA（plasmid DNA,p DNA）,通过考察表达HSV-tk自杀基因的MSCs（MSCs-tk）的体外死亡率评价自杀效应的效率,筛选获得最优的自杀效应条件;2.通过对MSCs-tk与共培养的C6脑胶质瘤细胞的细胞总死亡率和C6脑胶质瘤细胞的单独死亡率评价体外旁观者效应;3.考察经MFIONs转染后的MSCs的Cx43蛋白表达水平及经MFIONs转染后的MSCs与C6脑胶质瘤细胞间的细胞间隙连接通讯（Gap junctional intercellular communication,GJIC）功能,研究经MFIONs转染后MSCs的Cx43蛋白过表达与其旁观者效应之间的作用关系和作用机制;4.采用体外迁移实验及体内荧光示踪技术考察经MFIONs转染后的MSCs对C6脑胶质瘤细胞的体内外靶向效率;5.通过体内治疗实验评价经MFIONs转染后的MSCs作为自杀基因HSV-tk的靶向递送载体对脑胶质瘤的抑制效果,并初步考察该传递载体用于自杀基因治疗的安全性。结果:1.基于MFIONs的转染体系可以在MSCs上实现高效的基因转染,且在适宜的MFIONs浓度下没有引起明显的细胞毒性。经MFIONs转染HSV-tk自杀基因的MSCs-tk显示出良好的体外自杀效应,最优的自杀条件为连续5天给予浓度为200μg/m L的更昔洛韦（Ganciclovir,GCV）溶液;2.经MFIONs转染的MSCstk显示出良好的旁观者效应,可在体外实现对C6脑胶质瘤细胞的有效杀伤,其作用机制除了依赖于MSCs-tk高效表达自杀基因,有效活化前药为肿瘤细胞毒性药物外,还与MFIONs促进MSCs载体与C6脑胶质瘤细胞间通过GJIC的药物传递有关;3.体外迁移实验中,经MFIONs转染的MSCs载体显示出对C6脑胶质瘤细胞明显的趋向能力;在原位脑胶质瘤大鼠模型的体内,尾静脉注射的经MFIONs转染的MSCs显示出对脑部胶质瘤的高效靶向归巢能力,并可较好的侵袭入胶质瘤组织深部;4.体内治疗实验结果显示,经MFIONs转染后的MSCs载体可以携载HSV-tk自杀基因在体内实现对脑胶质瘤的有效治疗,显着促进脑胶质瘤细胞凋亡,抑制脑胶质瘤组织生长,延长荷瘤大鼠的生存期;5.体内初步安全性评价实验结果显示,通过该传递系统进行自杀基因治疗只对肺组织产生轻微的毒性,对正常脑组织及体内其他主要脏器无明显毒副作用。结论:采用氧化铁纳米材料不但可以高效转染MSCs,实现对自杀基因的高效携载和表达,还能促进MSCs与肿瘤细胞间通过GJIC的药物传递,提高HSVtk/GCV自杀基因疗法的旁观者效应。因此有望成为一种潜在的干细胞改良手段,实现干细胞作为自杀基因的传递载体对肿瘤的高效靶向治疗。
侯俊佳[3]（2019）在《Dm-dNK与吉西他滨联用对乳腺癌原代细胞杀伤作用的研究》文中提出目的:乳腺癌是现代女性最常见的恶性肿瘤之一。在中国,乳腺癌的发病率在近几十年来不断增高,死亡率居高不下,并呈年轻化的趋势。最近的几十年间,研究者对于基因治疗在肿瘤、遗传性疾病、血液疾病、感染性疾病等领域的应用开展了广泛研究,有些已在疾病的治疗中取得显着疗效。在肿瘤的治疗领域,基因治疗因其可能根除恶性肿瘤的原发灶、转移灶而同时不伤及正常组织的特点而受到广泛的关注。果蝇多底物脱氧核苷激酶（multisubstrate deoxyribonucleoside kinase of Drosophila melanogaster,Dm-dNK）是一种高效的核苷酸激酶,其催化效率比普通的核苷酸激酶高10-100倍,且具有极其广泛的底物特异性,能够催化自然界全部脱氧核糖核酸的磷酸化反应。目前,作为一种自杀基因,Dm-dNK被用于多种恶性肿瘤细胞中,除了能够直接将其杀伤外,还可以通过旁观者效应间接杀伤肿瘤细胞。我们在前期研究中已经证实,Dm-dNK所产生的激酶能够对核苷类似物（nucleoside analog）等抗肿瘤药物起到有效的磷酸化作用。此外,在肿瘤细胞系中,Dm-dNK的表达还能够显着提高肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感性。但是,该自杀基因体系是否可以在原代培养的肿瘤细胞中正常发挥杀伤作用尚无报道。为此,本研究构建了携带自杀基因Dm-dNK的选择复制型腺病毒,并对该系统对乳腺癌原代细胞的杀伤作用进行了探索性研究,从而为乳腺癌的治疗提供新的思路。方法:选取2017-06-01至2018-06-01期间,就诊于中国医科大学附属第一医院乳腺外科二病区的63例经手术切除的原发性乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织。通过肿瘤细胞的三维立体培养技术对外科手术切除的肿瘤标本进行原代细胞培养（n=63）。加入不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）的重组腺病毒AdGFP,荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白（GFP）的阳性细胞百分比,验证病毒转染效率。构建溶瘤腺病毒载体SG500-Dm-dNK,利用western blot验证相关蛋白表达。使用MOI=1,MOI=10,MOI=20的SG500及SG500-dNK分别感染肿瘤细胞培养48h;使用浓度为1μM,10μM及100μM的吉西他滨（Gemcitabine,DFDC）分别加入肿瘤细胞培养72h;使用MOI=10的SG500和SG500-dNK感染肿瘤细胞培养48h后,再分别加入上述浓度的DFDC培养72h。使用Primage图像分析系统测量上述3组不同处理后的肿瘤细胞存活率。结果:1.携带GFP的选择复制型腺病毒感染人乳腺癌原代细胞后,在荧光显微镜下可观察到发出荧光的肿瘤细胞,且感染效率随MOI升高而提高。2.Western blot对对照组、SG500-dNK组及SG500组的检测发现,SG500携带的Dm-dNK能够在乳腺癌原代细胞中表达相关蛋白产物。3.在MOI=1和MOI=10时,SG500-dNK单独应用于乳腺癌原代细胞的细胞杀伤作用与单独应用空载体对细胞的杀伤作用无显着性差异（p>0.05）;MOI=20时,SG500-dNK的细胞杀伤作用高于SG500（p<0.05）。4.在DFDC浓度相同时,SG500-dNK与DFDC联合应用对乳腺癌原代细胞的杀伤作用显着高于SG500与DFDC联用以及单用DFDC,并随着DFDC浓度的逐步提高而更加明显（均p<0.05）。结论:第一,选择复制型腺病毒SG500携带的外源基因可以转染胶滴中的乳腺癌原代细胞并表达相关蛋白产物。第二,在乳腺癌原代细胞中,Dm-dNK与DFDC联合应用较两者单独应用能更有效的杀伤肿瘤细胞,发挥其抗肿瘤作用,为Dm-dNK/DFDC自杀基因治疗乳腺癌的进一步临床研究和应用提供了有力证据。
谭成光[4]（2017）在《双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究》文中研究说明肝癌系原发于人类肝脏组织及脏器的癌症,也是发生于肝细胞与肝内胆管上皮细胞的恶性病变,是临床肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,也是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一。肝癌细胞具有极强的浸润性,其恶性程度极高,预后极差,且临床确诊患者超过80%以上已是晚期不适宜再进行手术切除,尤其是肝癌患者常出现对多种药物抗药性与耐药性,故对目前放疗和化疗均不敏感。因此,目前临床一线及二线治疗的疗效大多并不满意和理想,致使其发病早期便可发生癌症的肝转移,生存率极低。目的:为了更加深入和系统地探寻和创建更加安全、更有疗效、更有特色、更具实用价值的临床中西医结合抗肝癌疗法,本课题希望通过建立双自杀基因逆转录病毒转移体系在转染人肝癌细胞HepG2的实验研究,观察它们对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用;同时,本课题还希望探索研究天然药物芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用以及它可否共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK,以提高和增加它们之间联合增效的抗癌作用效果;而且,本课题也希望通过此实验研究,探寻天然药物芪三酚共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK的最佳作用时间和剂量效应,为中西医结合应用在临床对人肝癌的有效治疗和早期干预提供新的研究思路和科学依据。方法:1、双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及共稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究的方法是:采用基因工程技术构建pWZLneoCDglyTK质粒,并将其转导至DH5α感受态菌中,再将扩增获得的大量质粒提取并通过脂质体载体进行介导,将含双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglyTK导入至病毒包装细胞PA317中,经过G418筛选带病毒PA317/CD+TK阳性克隆细胞株,进行扩增培养后收集培养液中病毒上清液进行浓缩,随后再在Polybrene介导下转染人肝癌细胞株HepG2;然后经过G418的再次筛选阳性克隆、并进行扩增培养,以获得稳定表达双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞株及建立稳定转染双自杀基因的HepG2细胞系,再采用RT-PCR检测双自杀基因的表达情况。2、双功能融合自杀基因CDglyTK对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及芪三酚协同增强杀伤效应的实验研究的方法:分别采用不同浓度的一种或两种联合的自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）、芪三酚、以及自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）与芪三酚组合物分次处理人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞,分别采用光镜和电镜观察其细胞形态学改变,采用凋亡小体细胞形态学、DNA Ladder、原位末端标记法（TUNEL）、凋亡相关基因检测、流式细胞检测观察其细胞凋亡情况;采用MTT检测和细胞克隆形成实验观察细胞增殖状况;采用流式细胞检测观察细胞周期变化,以综合观察、分析和评价它们分别或联合对人肝癌HepG2细胞和HepG2/CD+TK细胞的杀伤效果及其共济协同与联合增效的生物学作用。结果:第一部分:双自杀基因逆转录病毒转移体系建立及其稳定感染人肝癌细胞HepG2结果:1.双自杀基因逆转录病毒转移体系构建与稳定表达的结果:（1）pWZLneoCDglyTK质粒DNA含Amp抗性基因,其转化阳性菌株可在含Amp琼脂上生长,未转化菌无Amp抗性则不能生长,证实是含单一细菌克隆的转化菌落。（2）质粒pWZLneoCDglyTK经提取其DNA并纯化后检测清晰可见有质粒DNA存在。（3）含pWZLneoCDglyTK的质粒经BamH I单酶切后可形成1.19kb和6.9kb的两条电泳条带;经EcoR I单酶切后可形成8.09kb的一条电泳条带;经BamH I和EcoR Ⅰ双酶切后可形成1.19kb、1.31kb和5.59kb的三条电泳条带,证实此质粒为pWZLneoCDglyTK。另以提取的质粒DNA为模板,以CD和TK引物进行PCR扩增,可见扩增的CD和TK的阳性条带,证实此质粒是含CD和TK基因为pWZLneoCDglyTK质粒。构建的双自杀基因经DNA测序并与genebank标准序列比对后证明其序列正确。对质粒pWZLneoCDglyTK阳性转化菌大量扩增培养提取质粒后进行电泳分析,结果有明亮的阳性条带,证明该质粒大量提取成功,对大量提取pWZLneoCDglyTK质粒纯度及浓度测定计算,DNA浓度（μ g/μ 1）=5.25,DNA纯度=1.81,其与理论预估值1.80基本一致。（4）逆转录病毒载体转入病毒包装细胞PA317后第2天即有80%细胞贴壁,生长状态良好,增殖旺盛,细胞形态呈成纤维样,可见分裂相,细胞透明,细胞内无颗粒。用脂质体将pWZLneoCDglyTK质粒及pLXSN.GFP质粒转入PA317细胞48h后可见对照组细胞有绿色荧光产生,证明质粒转染成功,其转染效率在20-30%。（5）对未转染细胞PA317及转染细胞PA317CD+TK的基因组DNA电泳,清晰可见DNA电泳条带;CD、TK基因PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到PA317细胞的基因组上。（6）对提取转染PA317细胞的总RNA进行电泳,有RNA电泳条带存在,证明RNA提取成功;RNA逆转录后PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物在730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物在650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD,TK基因均为阴性,证明CD,TK基因已在PA317细胞中有表达。（7）将pWZLneoCDglyTK质粒以脂质体包裹后导入病毒包装细胞PA317,电镜可见培养上清液中有病毒颗粒散在或聚集成堆呈圆球形,边缘呈波状,直径约100nm大小,说明其逆转录病毒包装成功。2.双自杀基因逆转录病毒感染人肝癌细胞HepG2的结果:（1）人肝癌HepG2细胞复苏第2天可见大部分细胞贴壁,细胞生长良好,形态呈上皮样,多见分裂相,细胞较透明,高倍镜可见细胞内有少许颗粒及细胞器。（2）荧光显微镜下观察,转有对照组病毒上清液中人肝癌HepG2细胞可见大量绿色荧光产生,感染效率达60-70%。（3）对PA317/CD+TK细胞培养上清液中逆转录病毒感染HepG2细胞镜检,该细胞形态未变,用G418筛选,第2天有少数细胞皱缩、死亡、脱落、形成细胞碎片,继续用G418加压培养,存活细胞持续增殖,形成多个细胞克隆,且细胞克隆密切相连。（4）提取未转染人肝癌细胞HepG2及转染细胞HepG2/CD+TK的DNA,电泳后清晰可见DNA电泳条带,证明其基因组DNA提取成功。进行CD、TK基因PCR扩增电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,未经转染HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到HepG2细胞的基因组上。（5）对提取转染细胞的总RNA电泳,有RNA电泳条带存在,证明其RNA提取成功;将RNA逆转录后PCR扩增后电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物650bp处有一特异性条带,而HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已在HepG2/CD+TK细胞中得到了表达。3.人肝癌HepG2/CD+TK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较结果:将转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞及空白对照HepG2细胞进行传代、冻存、复苏后镜检,处于对数生长期的这两种细胞一般形态学基本相同,均呈上皮样生长,且它们的生长曲线也基本一致,无显着性差异（p>0.05）。流式细胞仪对这两种细胞的细胞周期检测,发现它们的细胞周期分布也无明显差异（p>0.05）。第二部分:双自杀基因前体药物联合芪三酚对人肝癌细胞HepG2细胞及转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的杀伤作用的实验研究结果1.双自杀基因前体药物分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h镜检结果:双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC无论单用或联用均对未转染自杀基因的人肝癌HepG2细胞无作用,但对转染自杀基因的HepG2/CD+TK细胞均有一定作用,联用效果较单一效果更好,且作用效果随前体药物浓度增加而增加,但不同自杀基因前体药物浓度作用HepG2/CD+TK细胞后尚未见死亡细胞增多。2.芪三酚作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:不同浓度芪三酚对人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞均有作用,且其作用效果随着芪三酚作用浓度而增加,杀伤作用呈剂量相关性和浓度依赖性,但相同浓度芪三酚分别作用两类靶细胞,其细胞形态及细胞死亡情况未见明显不同和差异。3.芪三酚联合自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:应用双自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对人肝癌HepG2细胞作用,其作用效果随药物浓度增加而增加,并与单用芪三酚作用无明显差别。应用双自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对转染双自杀基因HepG2/CD+TK细胞作用效果更明显,且影响程度也呈剂量效应和浓度依赖性。4.自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后镜检结果:（1）未转染自杀基因的HepG2细胞,在分别或联合应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）作用72h与作用24h时的情况基本相同;而对转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞在分别或联合应用自杀基因前体药物GCV和/或5-FC作用72h比作用24h时损伤目的细胞加重,且GCV和5-FC联合应用较两者单独作用的效果更好。5.芪三酚分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后的镜检结果:与24h作用相比,芪三酚作用72h对两类靶细胞损伤和杀伤均加重,且随药物浓度增加而增加。但芪三酚在同一浓度分别作用两类靶细胞,其细胞形态及死亡情况未见明显差异。6.芪三酚联合自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞后72h后的镜检结果:与24h相比,应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对HepG2细胞作用72h的效果更明显,且随着药物浓度增加而增加,但与单用芪三酚作用HepG2时无明显差别。但应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对HepG2/CD+TK细胞作用72h与作用24h相比,随着药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞形态和生长状态更差,细胞数量更减少,死亡细胞增多更明显等,且它们之间关系呈剂量效应和浓度依赖性。7.自杀基因前体药物和芪三酚对人肝癌细胞HepG2及HepG2/CD+TK的生长抑制作用:（1）分别单用或合用GCV或/和5-FC对人肝癌HepG2细胞作用时,对其生存与增殖影响不明显,而对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用则随药物浓度增加而增加。合用GCV和5-FC对该细胞生长抑制作用更明显。（2）应用芪三酚对HepG2和HepG2/CD+TK细胞的抑制作用均随药物浓度增加而增加,但抑制程度在这两类细胞间无显着性差异。（3）应用芪三酚和GCV或5-FC对HepG2细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,但芪三酚联合GCV与芪三酚联合5-FC应用,对该细胞增殖影响无明显差异,均与单独用芪三酚对该细胞增殖抑制情况相似。应用芪三酚和GCV或5-FC对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,芪三酚联合GCV与芪三酚联合5-FC,对该细胞增殖抑制无明显差异,但细胞抑制情况均明显高于单独应用芪三酚组。8.凋亡细胞的瑞氏染色光镜观察结果:分别或联合加入GCV和/或5-FC对HepG2细胞作用,该细胞生长与增殖均未受影响,也未见该细胞出现凋亡,且GCV、5-FC、GCV+5-FC之间以及各药物浓度间均未见HepG2细胞凋亡现象。加入低浓度芪三酚后也未见HepG2细胞凋亡;但随芪三酚浓度增加,HepG2细胞凋亡现象逐渐明显。芪三酚和自杀基因前体药物联用与单独使用芪三酚的结果基本类似。而分别或联合加入低浓度GCV和/或5-FC对HepG2/CD+TK细胞作用与干预后,未见HepG2/CD+TK细胞出现凋亡;但随自杀基因前体药物作用浓度增加,HepG2/CD+TK细胞出现明显凋亡;尤其是GCV+5-FC合用,该细胞凋亡较单用GCV或5-FC更明显。加入低浓度芪三酚作用未见HepG2/CD+TK细胞凋亡,但随芪三酚浓度增加,HepG2/CD+TK细胞凋亡逐渐明显。同时加入芪三酚和前体药物作用,HepG2/CD+TK细胞凋亡非常明显,即使在低浓度下亦可出现凋亡现象,且随药物浓度增加,凋亡细胞数增加。9.凋亡细胞DNA Ladder检测结果:加入不同浓度GCV（8μg/ml和4μg/ml）和/或5-FC（160μg/ml和80μg/ml）作用HepG2细胞72h,只在加样孔附近发现DNA条带,但未见有DNA Ladder条带产生。而加入低浓度（0.04mmol/L）和高浓度（0.08mmol/L）芪三酚作用,可见微弱的HepG2细胞DNA Ladder产生,且随芪三酚浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪三酚和前体药物与单独加入芪三酚作用效果类似。而在HepG2/CD+TK细胞中加入不同浓度的 GCV（8μg/ml、4μg/ml）和/或 5-FC（160μg/ml、80μg/ml）72h 后,均可见DNA Ladder产生,随自杀基因前体药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder更明显,且GCV+5-FC较单用GCV或5-FC效果更明显。加入低浓度（0.04mmol/L）和高浓度（0.08mmol/L）芪三酚,可见有微弱的HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder产生,且随药物浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪三酚和自杀基因前体药物作用HepG2/CD+TK细胞,其DNA Ladder较单用芪三酚或自杀基因前体药物更明显。10.TUNNEL法检测细胞凋亡结果:在人肝癌HepG2中分别加入不同浓度GCV（8μg/ml 和 4 μ g/ml）和/或 5-FC（160 μ g/ml 和 80 μ g/ml）作用 72h,TUNEL 结果为阴性。加入芪三酚作用,TUNEL结果为弱阳性;同时加入芪三酚和前体药物共同作用,HepG2细胞大部分为弱阳性,最高浓度时有部分HepG2细胞为阳性。而HepG2/CD+TK中加入不同浓度 GCV（8μg/ml、4ug/ml）和/或 5-FC（160μg/ml、80ug/ml）作用,TUNEL 结果显示每种低浓度前体药物可使大部分HepG2/CD+TK细胞为弱阳性,但每种高浓度前体药物作用均可使少部分细胞为阳性;采用两种前体药物联用,细胞大部分为阳性。加入芪三酚有部分HepG2/CD+TK细胞的为弱阳性,高浓度芪三酚作用,其细胞核黄色加深。同时加入芪三酚和前体药物,HepG2/CD+TK细胞均为阳性,且在高浓度时为强阳性。11.流式细胞检测细胞凋亡结果:在HepG2细胞中分别加入前体药物GCV（8μg/ml）或5-FC（160μg/ml）作用72h后,其细胞凋亡率分别为5.43%和5.49%,结果基本相同;而当二者联用时,其细胞凋亡率可达到11.09%,这可能与自杀基因前体药物联合应用后的非特异性毒性有关。而当加入浓度为0.08mmol/L的芪三酚后,与前体药物组相比,HepG2细胞凋亡率可升至12.02%,说明芪三酚可引起HepG2细胞的凋亡。但当同时加入芪三酚和前体药物后,HepG2细胞凋亡率比单用芪三酚有增高,HepG2细胞的凋亡率为16.32%。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入前体药物GCV（8μg/ml）或5-FC（160μg/ml）作用72h,与HepG2细胞相比,细胞凋亡率明显增加,分别为11.11%和14.37%;当二者联用时,细胞凋亡率为17.89%。加入芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞凋亡率为15.81%,稍高于HepG2。同时加入芪三酚和前体药物作用,HepG2/CDTK细胞凋亡率明显增高,可达到22.64%。12.细胞克隆形成的实验结果:在HepG2细胞中分别加入不同浓度前体药物GCV（8 u g/ml 和 4 u g/ml）和/或 5-FC（160 μ g/ml 和 80 μ g/ml）72h,各孔 HepG2 细胞克隆形成率均在90%以上,各孔间无显着差异,细胞克隆较大,每一克隆有数百细胞,且细胞克隆间距离近,有些紧密相连。加入芪三酚后与前体药物相比,HepG2细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加克隆形成率降低。芪三酚浓度0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,每一细胞克隆均明显缩小,每一细胞克隆内仅有100-200个细胞。同时加入芪三酚和前体药物与单独加入芪三酚的差别不大,在高浓度时的HepG2细胞克隆形成率近50%,细胞克隆内细胞数仅数十个。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入不同浓度前体药物 GCV（8μg/ml,4μg/ml）和/或 5-FC（160μg/ml,80μg/ml）作用 72h,与 HepG2 细胞相比,HepG2/CD+TK克隆形成率明显减少,随前体药物随浓度增加,克隆形成率降低;当增至高浓度时,细胞克隆形成率近50%;两种药物联用,克隆形成率降低更明显,仅为400%,且克隆内细胞数量也逐渐减少,当GCV8μg/ml+5-FC160μg/ml时,细胞数仅数十个。与HepG2细胞实验相似,加入芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加,克隆形成率降低,在芪三酚浓度为0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,细胞克隆也明显缩小,每一克隆仅有100-200个细胞。同时加入芪三酚和前体药物作用的HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显降低,当三者联用高浓度时,未见有细胞克隆产生。13.对相关基因表达水平影响的检测结果:HepG2细胞中分别加入GCV（8μg/ml）、5-FC（160μg/ml）及二者联用,对HepG2细胞凋亡抑制基因c-fos的表达水平影响不大,而bax基因几无表达,二者联用时仅有微弱bax基因表达;而加入芪三酚后的c-fos基因表达明显降低,而bax基因表达明显增高;但前体药物与芪三酚联用与芪三酚单用相比,c-fos基因表达水平变化不大,而bax基因均有较明显表达,但与单用芪三酚结果相比,无显着性差别（P>0.05）。在HepG2/CD+TK细胞中加入GCV（8μg/ml）,5-FC（160μg/ml）后,c-fos基因表达水平均降低,bax基因表达水平均增高。两种前体药物联用的c-fos基因表达降低更明显,而bax基因表达均高于其中任何单一前药使用;加入芪三酚后的c-fos基因表达水平与其对HepG2作用相差不大;但前体药物与芪三酚联用与单用芪三酚相比,c-fos基因表达降低更明显;当三者联用时,c-fos基因几乎无表达。加入芪三酚后,bax基因表达也明显增高;前体药物与芪三酚联用,bax基因表达水平有更明显升高,而三者联用时的bax基因表达水平最高。14.细胞迁移实验的观察结果:在HepG2细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,对该细胞迁移影响较小;加入芪三酚后可抑制HepG2细胞迁移。芪三酚和前体药物联用的细胞划痕间距与单用芪三酚差别不大,对HepG2细胞起不到协同抑制细胞迁移的效果。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,该细胞划痕间距明显增大;当两种前药联用时,细胞划痕间距明显大于单种前药。同样,加入芪三酚后对HepG2/CD+TK细胞划痕间距加大,细胞形态变差。芪三酚和前体药物联用的细胞划痕间距明显增大,细胞形态更差;当三者联用时的细胞划痕周围几乎无状态良好的细胞。15.流式细胞检测细胞周期结果:在HepG2细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞 G1、S、G2 期细胞比例分别为 22.95%、68.14%、8.91%或 30.31%、67.19%、2.50%,统计学处理差别不显着（P>0.05）,且S期细胞所占比例最多;二者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为32.68%、64.51%、2.82%,差别均无显着性意义（P>0.05）。加入芪三酚后该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为66.61%、33.39%、0%,S期细胞比例明显减少,而G1期细胞比例增多。芪三酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为91.83%、8.17%、0%,比单用芪三酚的G1期细胞比例有所增高;三者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为92.23%、5.72%、2.04%。HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为33.62%、47.32%、19.06%和39.22%、58.85%、1.96%,与HepG2细胞相比,S期细胞明显降低,G1期细胞明显增多;两种前药联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为47.57%、49.24%、3.19%,虽S期变化不大,但G1期细胞明显增多,说明两种前体药物联用可使更多HepG2/CD+TK细胞阻止在G1期,不能进一步合成DNA。加入芪三酚后,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为76.78%、23.22%、0%,该细胞DNA合成抑制。芪三酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为97.77%、2.23%、0%,三者联用时,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为99.93%、0.07%、0%,该细胞被阻止在G1期,几乎无DNA合成。16.细胞亚结构观察结果:在HepG2细胞中应用GCV和/或5-FC后,多数HepG2细胞表面光滑,无明显结构改变,且两种前体药物联合对HepG2细胞形态学影响不明显。应用芪三酚后的HepG2细胞表面微绒毛增粗,变成长而粗的细丝,说明HepG2细胞有凋亡。同时应用GCV和/或5-FC后的HepG2/CD+TK细胞膜上出现许多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。应用芪三酚后的HepG2/CD+TK细胞表面出现很多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡产生。联合应用前体药物和芪三酚的HepG2细胞膜表面出现一些穿孔现象,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。联合应用自杀基因前体药物和芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞出现更加明显的凋亡小体。结论:1.自杀基因前体药物作用于未转染有双自杀基因的人肝癌HepG2细胞,在本实验设计的浓度剂量和作用时间等条件下,均未能表现出明显的杀癌或抑癌的生物学作用。2.以逆转录病毒为载体将双自杀基因转染至人肝癌HepG2细胞后,再使用双自杀基因前体药物作用,可分别对人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞发生不同程度的损伤和杀伤,从而有效控制人肝癌细胞的增殖性进展。3.自杀基因前体药物均能有效地抑制或杀伤人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的增殖性生长,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,其作用浓度越高,则效果越显着。4.自杀基因前体药物能诱导人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的凋亡,且自杀基因前体药物联合应用对肝癌细胞的抑制与杀伤效果更好,表现出明显的协同增效作用,即与单独使用GC V或5-FC比较,联合使用GCV和5-FC能是人肝癌细胞存活率明显降低,表明双自杀基因较单自杀基因有更强的抑癌效果。5.芪三酚能影响人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的形态学,使其发生破坏性改变;同时,它还能有效抑制这两类细胞的生长增殖,并呈浓度依赖性;且芪三酚能诱导这两类细胞的凋亡。6.自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪三酚Res联合应用对人肝癌HepG2细胞具有单独使用芪三酚的生物学作用及类似细胞形态学改变;而它们联合应用对人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞能发生更明显的杀伤及破坏性改变,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,浓度越高效果越显着,且表现出双自杀基因前体药物与芪三酚联合应用后更好杀伤效果,呈现出明显的协同增效作用。7.双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪三酚合理应用,特别是联合应用不仅能减低自杀基因前体药物的用量及副作用,还能发挥相互之间的协同效应,并且能发挥更好的效果,这很可能为今后中西医结合及天然抗癌药物与自杀基因及其前体药物的综合应用提供一种更加适应于临床肝癌治疗的新思路、新技术和新方法。
黄暨生[5]（2016）在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中研究表明恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段（如手术治疗、放疗、化疗等）后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能（GJIC）的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯（GJIC）功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP（tk+）细胞混合A375（tk-）细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显着的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高（P<0.05）,说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显着提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能（即缝隙连接机制）发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
张添源[6]（2016）在《基于干细胞的新型基因靶向传递系统的构建及在肿瘤治疗中的体内外研究》文中认为作为一种极具前景的新型肿瘤辅助治疗手段,基因疗法近年来已被证明有着极大的应用潜力,然而,如何安全、有效地将这些治疗基因传递至肿瘤部位,以及跟踪传递至转移瘤却是当前肿瘤基因治疗领域一直面临的一个瓶颈问题。例如,对于抗肿瘤自杀基因疗法,就需要有一种载体,它既要能克服体内的种种生理障碍将治疗基因传递至肿瘤细胞,并促使相关功能蛋白在肿瘤区域获得高表达,又要在抵达肿瘤细胞前能有效保护所携载的治疗基因,避免其在血液循环中被降解,这就对相应的载体系统提出了很高的要求。本课题针对这一肿瘤基因治疗中的重要问题,基于靶向药物传递系统（Target Drug Delivery System, TDDS）的概念,提出了一种以生物活性细胞构建基因靶向传递系统的设想。研究采用非病毒基因转染系统对骨髓间充质干细胞（BMSC）进行基因重组以携载治疗基因,进而利用BMSC的肿瘤归巢性和免疫豁免性等特性,实现将治疗基因靶向运输至肿瘤细胞的目的。并通过体内外研究全面考察了这一基于BMSC的基因靶向传递系统在小鼠肺肿瘤模型中的抗肿瘤治疗效果。同时,对静脉注射的BMSC向肿瘤组织的迁移和穿透以及BMSC作为基因传递载体的安全性进行了探讨。为了使BMSC能高效携载治疗基因,本课题首先对BMSC的体外基因转染系统进行了考察。通过对课题前期工作中合成的一些新型非病毒基因载体以及部分常用的商品化转染试剂在BMSC上的基因转染效率和细胞毒性的筛选,发现精胺修饰的阳离子化普鲁兰多糖（spermine-pullulan, SP）在BMSC上表现了高效的转染效率和较低的细胞毒性。进一步,本课题对SP的合成及转染条件分别进行了优化以获得在大鼠BMSC上最佳的基因转染效率。课题同时还对SP/pDNA复合物入胞后在细胞内的分布和SP的降解过程进行了考察,研究了该载体在干细胞上应用的安全性。随后,本课题分别在体内外考察了BMSC对黑色素转移瘤细胞（B16F10）的趋向性（归巢性）,探讨利用BMSC作为载体向肿瘤组织靶向传递治疗基因的可行性。课题首先通过体外Transwell实验确认了BMSC对B16F10肿瘤细胞的趋向性。进一步在体内通过荧光标记的方式观察BMSC静脉注射后在小鼠主要脏器中的分布及在荷瘤肺部的局部分布,确认了BMSC向肺部黑色素肿瘤细胞的归巢特性。为了研究构建的基于BMSC的靶向基因传递系统在肿瘤基因治疗中的疗效,本课题选择了经典的基于疱疹病毒胸苷激酶／更昔洛韦（Herpes simplex virus thymidine kinase/Ganciclovir, HSV-TK/GCV）的自杀基因治疗系统,考察了以BMSC作为HSV-TK的传递载体结合GCV治疗后在黑色素瘤肺转移小鼠模型上的治疗效果。体外研究结果显示,利用本课题构建的基于SP的非病毒基因转染系统可以有效重组BMSC表达自杀基因HSV-TK,并引起BMSC的自杀,且这种自杀作用与GCV呈明显的剂量依赖关系。体外旁观者效应的考察发现重组自杀基因后的BMSC在一定GCV浓度下能有效抑制B16F10肿瘤细胞的生长。但这种旁观者效应需要BMSC与肿瘤细胞的良好接触才能有效发挥,且对肿瘤细胞的杀伤效率与BMSC和肿瘤细胞的细胞数目比有关,BMSC所占的细胞数比例越高,相应的旁观者效应就越强。体内抑瘤实验进一步证明以BMSC作为HSV-TK的靶向肿瘤的传递载体在GCV存在的条件下可以显着抑制黑色素转移瘤的发展,显示了良好的肿瘤抑制效果。进一步地,为了实现自杀基因和前体药物对于荷瘤组织的同步靶向,提高这一自杀基因治疗策略的抗肿瘤效果,本课题设计了一种可以将基因和前体药物分别靶向到肿瘤组织的组合传递系统。该系统在采用BMSC传递自杀基因HSV-TK靶向至肿瘤细胞的同时利用脂质体载体系统将前体药物GCV共传递至荷瘤肺部。通过同时提高基因在肿瘤组织的表达水平和前体药物在肿瘤负荷脏器的局部浓度来获得更好的抑瘤效果,并降低潜在的毒副反应。课题通过逆向蒸发法制备了具有肺被动靶向功能的GCV脂质体,结果显示该脂质体静脉注射后能显着提高GCV在肺部的药物浓度。体内共靶向研究发现,静脉注射该脂质体后,能将携载的药物有效传递至BMSC与肿瘤细胞所在的区域。体外在三维肿瘤球模型上的治疗结果表明,重组自杀基因HSV-TK的BMSC结合GCV脂质体进行治疗后,能有效抑制肿瘤球体积的增大。体内在黑色素瘤肺转移小鼠模型上的治疗结果也表明,采用该共靶向传递策略进行抗肿瘤治疗亦显示了更好地肿瘤杀伤效率,其对肺肿瘤结节的抑制效果是单用GCV溶液和重组自杀基因HSV-TK的BMSC的两倍,同时小鼠的生存时间相比单用GCV溶液和重组BMSC也得到了明显的延长。TUNEL细胞凋亡染色实验结果也显示使用该共靶向传递策略进行治疗后能引起更多肿瘤细胞的凋亡。为了考察BMSC作为治疗基因的靶向传递载体在趋向肿瘤组织后是否还会产生向肿瘤组织深层穿透的能力。本研究构建了体外三维肿瘤球模型以模拟体内的微小癌巢结构,利用激光扫描共聚焦显微镜观察BMSC对三维肿瘤球模型的穿透能力。结果显示BMSC具有良好的肿瘤球穿透性。在与肿瘤球共孵育48 h后即可观察到BMSC向肿瘤球内部的穿透,在共孵育72h后,则可发现BMSC已分布于肿瘤球的核心区域。而对于其他非干细胞的细胞系,如HEK293细胞,即使孵育72 h后也未观察到其对肿瘤球的穿透。进一步地,研究采用基因重组绿色荧光蛋白的BMSC （GFP-BMSC）观察其在体内向肿瘤组织的穿透能力。结果发现,在BMSC注射后第15天,在肿瘤组织的深层可以观察到明显的绿色荧光信号。为了更好地示踪BMSC向肿瘤组织的迁移和穿透,课题在前期研究的基础上制备了乙二胺-普鲁兰多糖修饰的氧化铁纳米粒,并用该纳米粒标记BMSC。标记后的BMSC用普鲁士蓝（Prussian Blue）染色法特异性显色。对染色后的肺部肿瘤切片的观察证明,BMSC通过静脉注射并被肺部截留后,会逐渐向肺部的肿瘤组织迁移并穿透入肿瘤组织深层。在获得体内外良好的抗肿瘤效果基础上,本课题对BMSC作为基因靶向传递载体对小鼠的潜在毒副作用进行了初步考察。研究结果显示,未经基因重组的BMSC本身并不具备致瘤性,但是在荷瘤小鼠模型上注射大量未经基因重组的BMSC（每只小鼠注射超过1×106个细胞）会一定程度地促进肿瘤生长。对经重组自杀基因的TK-BMSC联合GCV溶液或GCV脂质体治疗后的小鼠体重观察结果显示,该疗法并未造成小鼠体重的急剧变化。研究还对肝和肺这两个BMSC静脉注射后主要的分布脏器在治疗后的毒副作用进行了考察。对血液中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的检测结果显示自杀基因治疗前后小鼠血液中的ALT和AST水平并未发生显着变化。但肺和肝的组织切片显示在治疗后会有轻微的炎症反应,但未见对正常的组织结构形态造成破坏。进一步地,本课题对经自杀基因重组的BMSC和GCV脂质体治疗后的小鼠进行了初步地短期和长期的毒副作用观察。对肺部切片的观察结果显示治疗后短期内（治疗结束后第2天）正常肺部细胞存在着轻微的损伤。但这种损伤是可逆的,在治疗结束后的第90天肺部细胞已完全恢复至正常形态,小鼠亦未见有整体毒性反应。上述结果初步证明本课题构建的基于BMSC的自杀基因治疗策略是相对安全和低毒的。本课题为发展基于干细胞载体的基因靶向传递系统及其在肿瘤基因治疗中的研究提供了理论与实验的基础。
曾玲[7]（2014）在《山奈酚对小鼠黑色素瘤自杀基因系统的增效作用》文中研究说明目的：建立小鼠黑色素瘤B16细胞HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统,为直观研究中药活性成分山奈酚对该自杀基因系统的增效作用的实验研究打下基础；证实中药活性成分山奈酚对小鼠黑色素瘤B16细胞HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统具有增效作用。方法：1.B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统的建立：首先扩增转有质粒pLXSN-tkGFP的大肠杆菌,用Ultra Pure QIAGEN Plasmid Midi Kit抽提质粒；然后参照Lipofectamine2000转染试剂说明书,将重组质粒pLXSN-tkGFP和pLXSN-DsRed2分别转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经过G418筛选、流式分选和有限稀释法,最终获得对G418有抗性并且能自发稳定红绿荧光的单克隆细胞株,分别命名为B16-tkGFP和B16-RFP。用5μmol/L、50μmol/L和500μmol/LGCV验证B16-tkGFP细胞tk基因的表达。将单克隆细胞株B16-tkGFP（能稳定表达绿色荧光蛋白GFP）和B16-RFP（能稳定表达红色荧光蛋白RFP）按不同比例（20%、40%和60%B16-tkGFP）混合,加GCV处理后采用MTT法检测总细胞的抑制率；另外在荧光显微镜下观察混合细胞中B16-tkGFP细胞和B16-RFP细胞的变化,特别是未携带tk基因的B16-RFP细胞被杀伤的情况,以评价该重组自杀基因系统HSV1-tkGFP/GCV的自杀效应及其旁杀伤效应。2.山奈酚对B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统的体外增效作用：先用MTT法找到山奈酚不影响B16细胞生长的安全浓度和作用时间,再用Di1-Calcein双染料流式检测法分析安全浓度范围内的山奈酚对B16细胞GJIC功能的影响,以以检测绿色荧光细胞数量与荧光双阴性受体细胞比值,作为评价GJ功能的指标。应用MTT法检测山奈酚联合GCV对100%tk+和50%tk+增效的量效关系,并利用金正均Q值法分析和判断山奈酚与HSV1-tkGFP/GCV系统联合的作用效果；荧光显微镜观察山奈酚对HSV1-tkGFP/GCV系统旁杀伤效应的影响。3.山奈酚对小鼠黑色素瘤B16细胞株HSV1-tk/GCV自杀基因系统的体内增效作用：将活化的B16-tkGFP细胞和B16-RFP细胞按等比例混合后接种于C57BL/6J小黑鼠右腋皮下,待出瘤（接种后第8天）后将其随机分为致瘤模型组、GCV50mg/kg组、山奈酚40mg/kg组和山奈酚40mg/kg联合GCV50mg/kg组,每组10只小黑鼠,次日起按各给药组要求每天腹腔注射给药0.2ml/只,联合组的GCV和山奈酚分开给药,连续给药13天；同时致瘤模型组小黑鼠每天相应腹腔注射生理盐水0.2ml/只。在给药期间,每三天量一次肿瘤大小和称一次体重,以观测各组药物对小黑鼠的体重变化和给药后的抑瘤效果（n=10）。实验结束后解剖取出各组肿瘤、胸腺和脾脏,称重后用10%中性甲醛固定备用。各组分别取出部分肿瘤组织制作石蜡切片,HE染色后观察各组肿瘤组织形态变化。结果：1.将提取的质粒pLXSN-tkGFP和质粒pLXSN-RFP分别转染入B16细胞,最终成功筛选出对G418具有抗性的单克隆细胞株B16-tkGFP（能自发稳定的绿色荧光）和单克隆细胞株B16-RFP （能自发稳定的红色荧光）；经GCV杀伤实验证实了转入的tk基因在B16-tkGFP细胞中能正常稳定地表达。B16-tkGFP细胞和B16-RFP细胞的混合细胞共培养实验中,MTT检测结果及荧光显微观察图片表明了该重组自杀基因系统具有一定的旁杀伤效应（P<0.01）。2.0μimol/L～12μmol/L山奈酚作用48h对B16生长增殖没有影响,荧光传递实验中用0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L山奈酚处理B16细胞48h后,绿色荧光细胞（凡）与双阴性受体细胞（A3）的比值（A4/A3）分别为0.056±0.006、0.072±0.013、0.079±0.009和0.094±0.013。3μmol/L山奈酚联合3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L的GCV对100%B16-tkGFP细胞作用72h可表现出协同增效作用；6.25μmol/LGCV联合6.25μmol/L和12.5μmol/L的山奈酚对100%B16-tkGFP细胞作用96h也可表现出协同增效作用；浓度为6.25μmol/L的山奈酚联合6.25μmol/L的GCV对含50%B16-tkGFP的混合细胞作用96h能表现出协同增效作用。荧光图片也显示3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L山奈酚联合40μmol/LGCV对50%B16-tkGFP作用72h表现出明显的“旁观者效应”,并且随着联合组山奈酚浓度的增加,旁杀伤效应逐渐显着。3.含50%B16-tkGFP混合细胞致瘤的动物实验结果显示GCV联合山奈酚组的肿瘤增长倍数小于单独GCV组（P<0.05）,苏木素-伊红染色结果显示GCV组和山奈酚联合GCV组肿瘤细胞密度均较模型组低；并且表现出较模型组和GCV组更明显的炎症淋巴细胞浸润现象；山奈酚联合GCV组更明显。而以上现象,GCV联合山奈酚组比GCV组更明显。结论：山奈酚对HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统治疗小鼠黑色素瘤具有一定增效作用,且有可能是通过增强细胞的GJIC功能来实现的,体内实验可能与山奈酚调节机体免疫功能有一定关系,但具体机制还需进一步研究。
李玢[8]（2014）在《薯蓣皂苷通过GJ机制发挥对B16细胞自杀基因的增效作用》文中提出一、研究的目的及意义自杀基因疗法因存在旁杀伤效应的独特机制而成为具有广泛应用前景的肿瘤治疗新方法,增强自杀基因治疗的效果成为研究热点。课题组前期研究表明,体外较低浓度薯蓣皂苷可促进人肾癌786-0细胞缝隙连接的通讯功能,但其作用机制尚未明确。本研究在确定薯蓣皂苷（Dio）具有对小鼠B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用后,通过构建促进/抑制缝隙连接通讯（GJIC）功能的细胞模型,以进一步研究可能是薯蓣皂苷对自杀基因治疗系统发挥增效作用的重要机制——缝隙连接机制。二、方法（一）薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的影响1MTT法检测0-8μMDio对B16细胞生长的影响,以确定用于研究GJIC功能的Dio浓度。2预标记双染料传输流式细胞术检测0-4μMDio对B16细胞GJIC功能的影响,用流式细胞仪分析预先以药物处理及染色标记细胞的缝隙连接功能,检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价缝隙连接功能的指标；比值越大表示细胞间形成的缝隙连接细胞间通讯功能越强。3qPCR检测0-4μMDio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26基因转录的影响,结果用2-ΔΔct法进行相对定量分析Cx43、Cx32、Cx26mRNA水平。4Western Blot检测0-4μMDio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26蛋白表达的影响,对图像进行扫描和分析。（二）薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用1MTT法检测杀伤效应。将B16与B16HSV-tk细胞按3：2比例混合接种到96孔板。混合细胞分为空白组、RA阳性对照组、GCV组、Dio组、Dio+GCV联合组。培养24h后根据分组给药,48h后以MTT法检测各给药组杀伤效应。2Annexin V单染法检测细胞凋亡。将B16与B16HSV-tk细胞按3：2比例混合接种到6孔板。混合细胞分为空白组、RA阳性对照组、GCV组、Dio组、Dio+GCV联合组。培养24h后根据分组给药,48h后AnnexinV单染,流式细胞仪检测各给药组细胞凋亡情况。（三）阻断缝隙连接功能对薯蓣皂苷在自杀基因治疗系统中增效作用的影响1构建pLVmCterry-Cx43慢病毒载体质粒：设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应后扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对Cx43PCR扩增产物及pLVmCherry质粒分别进行双酶切,T4DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α,提取质粒。重组质粒电泳及测序鉴定。所构建的质粒命名为pLVmCherry-Cx43。2构建pLVmCherry-Cx43G21R、pLVmCherry-Cx43G138R基因定点突变慢病毒载体质粒：利用定点突变技术,设计包含一对突变位点的引物,以前期构建的pLVmCherry-Cx43为模版扩增质粒全长,产物用Dpn I消化后转化大肠杆菌DH5α。挑单克隆测序鉴定,所构建基因定点突变阳性克隆质粒命名为pLVmCherry-Cx43G21R、pLVmCherry-Cx43G138R。3构建过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株：提取pLVmCherry-Cx43、pLVmCherry-Cx43G21R, pLVmCherry-Cx43G138R重组慢毒质粒,以293T细胞包装病毒感染B16细胞,5d后观察mCherry表达。所获细胞放大培养后用BD公司FACSJazz型流式细胞仪分选红色荧光细胞,获得稳定过表达细胞株。Western Blot法检测所获稳定株Cx43蛋白表达情况。4荧光示踪法分析缝隙连接功能：供体细胞用5μM的Calcein-AM孵育30min。将供体细胞按1：100比例接种到受体细胞上,继续培养6小时,待形成稳定的GJ后,用荧光显微镜观察分析GJIC功能。实验组与对照组平均每个供体细胞周围发绿色荧光的受体细胞个数的比值,作为评价GJ功能的指标。5MTT法检测过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的影响：将B16与B16HSV-tk细胞按3：2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组、GCV联合薯蓣皂苷组;B16-Cx43与B16HSV-tk按3：2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组;B16-Cx43G21R与B16HSV-tk、B16-Cx43G138R与B16HSV-tk分别按3：2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组、GCV联合薯蓣皂苷组。上述混合细胞培养24小时后加药,终浓度为GCV25μM、Dio4μM,每孔培养液总体积200μl,置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱培养。48小时后MTT法检测杀伤效应。三、结果（一）薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的影响1MTT法检测不同浓度Dio对B16细胞生长的影响：0-4μM Dio处理B16细胞48小时对其生长无明显影响。2预标记双染料传输流式细胞术检测0-4μM Dio对B16细胞GJIC功能的影响：与对照组相比,B16细胞经各浓度梯度Dio处理48小时后,单绿荧光细胞与双阴细胞的比值随加药浓度的升高而增大,表明体外较低浓度Dio能有效促进B16细胞缝隙连接功能,且存在明显的剂量效应关系。3qPCR检测不同浓度Dio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26基因转录的影响：Dio处理细胞48小时,对Cx43及Cx32的RNA转录无明显影响、对Cx26的RNA转录有明显促进作用；4μM Dio处理细胞48小时,明显促进Cx43及Cx32的RNA转录、对Cx26的RNA的转录有明显抑制作用。4Western Blot检测Dio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26蛋白表达的影响：与对照组相比,经0-4μM Dio处理48小时后,Cx43与Cx26蛋白的表达量随加药浓度的升高而增加、Cx32的表达量随加药浓度的升高而减少,表明Dio能有效促进B16细胞缝隙连接蛋白Cx43及Cx26的表达、抑制Cx32的表达。（二）薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用1MTT实验表明联合用药组对60%B16与40%B16/tk混合细胞的抑制率明显高于其他组,25μM GCV+2μM Dio组实际抑制率为49.2%,25μMGCV+4μMDio组实际抑制率为56.5%显着高于理论抑制率（32.4%,35.3%）,且与25μM GCV组抑制率存在显着统计学差异；金正钧Q值分别为1.52、1.60,均大于1.15,说明Dio与GCV具有协同增效作用,Dio对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统具有增效作用。2AnnexinV单染检测细胞凋亡结果显示,联合用药组的细胞早期凋亡率均高于单药组,其中以4μM Dio+25μM GCV组细胞早期凋亡率最高（61.09%）。AnnexinV单染法检测各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致。（三）阻断缝隙连接功能对薯蓣皂苷在自杀基因治疗系统中增效作用的影响1构建pLVmCherry-Cx43’慢病毒载体质粒：对质粒pLVmCherry-Cx43的DNA酶切电泳,可见约8kb（空载体pLVmCherry大小8.2kb）和1kb大小两条带,符合预期结果；pLVmCherry-Cx43中Cx43测序结果与NM000165序列完全一致。2构建pLVmCherry-Cx43G21R、 pLVmCherry-Cx43G138R基因定点突变慢病毒载体质粒：对质粒pLVmCherry-Cx43-G21R、pLVmCherry-Cx43-G138R的DNA酶切电泳,均可见约8kb和lkb大小两条带；重组质粒pLVCx43-mCherry-G21R测序结果显示,其按引物设计第61位鸟嘌呤突变为腺嘌呤,其余序列完全一致；pLVmCherry-Cx43-G138R测序结果显示,其按引物设计第412位鸟嘌呤突变为腺嘌呤、第414位胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,其余序列完全一致。3构建过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株：将重组质粒包装病毒,感染B16细胞5d后荧光显微镜下即可见细胞有mCherry表达；mCherry的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强。Western Blot检测稳定株缝隙连接蛋白,过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞Cx43蛋白表达量明显高于对照组。4荧光示踪法分析缝隙连接功能：过表达野生型Cx43后B16细胞间钙黄绿素传递较正常组增强,过表达突变型Cx43G21R、Cx43G138R后B16细胞间钙黄绿素传递缝隙连接功能较正常组减弱。5MTT法检测过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的影响：混合细胞培养24小时、48小时生长情况无明显差异；培养72小时,B16-Cx43混合组生长情况较其他混合细胞缓慢。GCV组B16与B16HSV-tk混合细胞抑制率为27.46%,B16-Cx43与B16HSV-tk混合细胞抑制率为46.32%（P<0.05vs B16与B16HSV-tk混合细胞）,B16-Cx43G21R与B16HSV-tk混合细胞抑制率为25.07%, B16-Cx43G138R混合细胞抑制率为26.44%；GCV+Dio联合组B16与B16HSV-tk混合细胞抑制率为54.78%,B16-Cx43G21R与B16HSV-tk混合细胞抑制率为32.08%（P<0.05vs B16与B16HSV-tk混合细胞）,B16-Cx43G138R混合细胞抑制率为33.21%（P<0.05vsB16与B16HSV-tk混合细胞）。GCV对混合细胞含过表达野生型Cx43的B16细胞株抑制率,高于混合细胞含普通B16细胞组；Dio与GCV联合组,对混合细胞含过表达突变型Cx43G21R或过表达突变型Cx43G138R的B16细胞株抑制率,低于含普通B16细胞组,且与单纯GCV组无明显统计学差异。四、结论与展望（一）0-4μM Dio处理B16细胞48小时对其生长无明显影响；体外低浓度Dio对B16细胞GJIC功能具有促进作用,且呈量效关系。其作用机制可能由于Dio可促进部分Cx蛋白的表达,从而促进GJIC功能。（二）Dio对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统具有增效作用。（三）成功构建野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R慢病毒载体质粒；获得稳定过表达野生型Cx43、过表达突变型Cx43G21R以及过表达突变型Cx43G138R的B16细胞株。过表达野生型Cx43可促进B16细胞株GJIC功能,过表达突变型Cx43G21R, Cx43G138R可抑制其GJIC功能。（四）旁杀伤效应的缝隙连接机制,是Dio发挥对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统增效作用的重要机制。本研究将中药单体与自杀基因联合应用,在证实体外较低浓度薯蓣皂苷具有促进B16细胞GJIC功能、可增强自杀基因治疗系统旁杀伤效应的基础上,构建过表达Cx43功能正常及功能缺陷细胞株,通过促进及阻断缝隙连接通讯的方式进一步研究自杀基因疗法旁杀伤效应的缝隙连接机制,为中药方药对自杀基因治疗系统增效作用及机制等相关研究奠定更好的实验基础。
刘娟[9]（2014）在《六味地黄入血成分增效黑色素瘤自杀基因治疗的体内实验》文中研究说明一、研究目的及意义：恶性黑色素瘤多发于皮肤、内脏,临床治疗效果不佳。近年来,基因疗法尤其是自杀基因疗法取得了一定的进展。但在研究过程中也逐渐发现不少问题,如自杀基因前体药物活性较低、毒副作用大,载体转染效率不高等,这些问题导致肿瘤自杀基因治疗达不到预想的治疗效果。由于自杀基因系统存在旁杀伤效应的现象,于是通过应用其旁杀伤效应可以提高肿瘤自杀基因治疗的效果。传统的中药方药具有多靶点、多途径作用的特点以及广泛的药理作用,而且价格低廉、毒副作用小,因此中医经典复方联合自杀基因治疗成为我们治疗肿瘤的一种新的尝试。本课题组前期研究结果：体内体外实验表明滋阴补肾经典名方六味地黄丸可以提高自杀基因系统对肿瘤杀伤效应。任何一种药物发挥它的药效必有其作用的物质基础,六味地黄丸之所以能提高肿瘤自杀基因系统的杀伤效应其物质基础是什么?通过哪种机制发挥效应?在前期研究的基础上,我们提出研究假说：“六味地黄丸主要血中移行成分是六味地黄丸提高肿瘤自杀基因系统杀伤效应的物质基础”,并对该假设体外实验进行了验证,结果表明从六味地黄丸的主要的5种血中移行成分的单体及混合5种移行成分与六味地黄丸提高黑色素瘤自杀基因疗法的杀伤效应并无直接的药效关系,但这混合5种移行成分作用于淋巴细胞后,取其细胞上清,发现含药淋巴细胞培养上清对HSV-tk/GCV系统的杀伤B16细胞具有协同增效作用,其增效机制可能为免疫介导及缝隙连接机制。在此基础上,我们设想六味地黄丸主要血中移行成分在体内应该也能增效自杀基因系统杀伤黑色素瘤,并探讨其相应的增效机制,与前面体外实验相呼应共同验证六味地黄丸主要血中移行成分是六味地黄丸提高肿瘤自杀基因系统杀伤效应的物质基础的假说。二、研究方法：1.六味地黄丸入血成分对HSV-tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞增效作用的体内实验最适实验条件摸索1.1鉴定在体内实验中HSV-tk/GCV系统的活性：将单纯的B16/tk细胞接种于小鼠腋下,给予不同剂量的GCV,观察疗效,鉴定tk基因的活性。1.2确定tk+细胞的混合比例及GCV的工作浓度：将GCV的剂量固定为50mg/kg·d, B16/tk细胞与B16细胞按20%、40%、60%的比例混合,观察疗效,确定最适的混合比例；将B16/tk细胞与B16细胞按40%的比例混合（依据前期实验结果预估的最适混合比例）,分别给予50mg/kg·d、100mg/kg·d、200mg/kg·d剂量的GCV,观察疗效,并综合前期实验结果确定最适GCV给药剂量。1.3确定六味地黄丸入血成分与GCV的联合剂量：将GCV给药剂量设定为50mg/kg·d, B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为1：1,丹皮酚：（马钱子苷+獐牙菜苷+莫诺苷）：5-羟甲基-2-糠酸3：8：1的质量比例,混合入血成分的剂量为20mg/kg·d,设置模型组、GCV组、混合入血成分组、GCV联合混合入血成分组,观察疗效,确定最适的混合入血成分剂量。2.六味地黄丸入血成分对HSV-tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞增效作用的体内实验：将GCV给药剂量设定为50mg/kg·d, B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为1：1,混合入血成分剂量为15mg/kg·d,六味地黄丸给药剂量为lOg/kg·d,设置正常组、模型组、GCV组、GCV联合混合入血成分组、GCV联合六味地黄丸组,观察疗效。3.六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清的制备及对HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用的研究3.1六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清的制备：设模型组、混合入血成分组,供接种B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为1：1,混合入血成分组给药剂量为15mg/kg·d,成瘤后治疗14天,眼球取血,4℃过夜后离心获取小鼠血清,-20℃保存备用,其中模型组血清为对照血清,混合入血成分组血清为含药血清。3.2MTT检测六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用按占培养液总体积10%血清加入培养体系,B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为3：7,设置对照组（加培养液）、0%含药血清组（10%对照血清）、GCV联合0%含药血清组（10%对照血清）、GCV联合2.5%含药血清组（2.5%含药血清混合7.5%对照血清）、GCV联合5%含药血清组（5%含药血清混合5%对照血清）、GCV联合7.5%含药血清组（7.5%含药血清混合2.5%对照血清）、GCV联合10%含药血清组（10%含药血清）,GCV的终浓度为30μmol/L, MTT检测细胞抑制率。3.3荧光示踪法检测六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清对HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用按占培养液总体积10%血清加入培养体系,B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为1：1,设置对照组（加培养液）、GCV组、GCV联合0%含药血清组（10%对照血清）、GCV联合2.5%含药血清组（2.5%含药血清混合7.5%对照血清）、GCV联合5%含药血清组（5%含药血清混合5%对照血清）、GCV联合7.5%含药血清组（7.5%含药血清混合2.5%对照血清）、GCV联合10%含药血清组（10%含药血清）,GCV的终浓度为25μmol/L,荧光显微镜观察红绿荧光细胞的凋亡情况。三、研究结果：1.六味地黄丸入血成分对HSV-tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞增效作用最适实验条件摸索1.1HSV-tk/GCV系统体内实验模型可成功构建,其中50mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为78.3%,100mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为85.8%。1.2GCV的给药剂量确定为50mg/kg·d较合适,其中50mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为61.3%,100mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为82.2%,200mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为94.0%。tk+细胞的混合比例确定为50%,其中20%tk+细胞抑瘤率为17.8%,40%tk+细胞抑瘤率为61.3%,60%tk+细胞抑瘤率为73.4%。1.3混合入血成分的剂量确定为15mg/kg·d,其中GCV组抑瘤率5.5%,混合入血成分组抑瘤率36.6%,GCV联合混合入血成分组抑瘤率30.1%。2.六味地黄丸入血成分对HSV-tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞具有增效作用2.1成瘤时间及成瘤率：除模型组一只未出瘤外,各组均于接种后8天触及肿瘤；成瘤率如下所示模型对照组（93%）、GCV组（100%）、混合入血成分组（100%）、GCV联合混合入血成分组（100%）,GCV联合六味地黄丸组（100%）。2.2肿瘤体积（单位：mm3）及肿瘤生长体积曲线：随着治疗进行,GCV组及GCV联合混合入血成分组以及GC.V联合六味地黄丸组肿瘤体积与模型对照组间的差别逐渐增大；从曲线来看,肿瘤呈现生长抑制状态,两组联合治疗组更明显；治疗结束时肿瘤体积GCV组及GCV联合混合入血成分组以及GCV联合六味地黄丸组与模型对照组之间差异有统计学意义（P<0.01）。2.3肿瘤质量（单位：g）及抑瘤率：模型组（5.3378±0.3095g）、混合入血成分组（4.6591±0.3572g,12.7%）、GCV组（2.8959±0.6147g,45.7%）,GCV联合混合入血成分组（1.7059±0.1001g,68.0%）,GCV联合六味地黄丸组（1.9135±0.17538,64.2%）,GCV组和两组联合治疗组肿瘤质量均较模型组轻,且该三组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01）。2.4病理检查：肉眼观察,GCV及2组GCV联合治疗组体积较小,以GCV联合混合入血成分组最明显。镜下：2组GCV联合治疗组肿瘤细胞密度相对较低,肿瘤组织周围有较多纤维结缔组织增生。结果显示GCV联合混合入血成分对小鼠移植性恶性黑色素瘤生长具有抑制作用,其疗效优于单纯GCV治疗和混合入血成分,与GCV联合六味地黄丸疗效相当。3六味地黄丸混合入血成分作用小鼠后外周血血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤有一定的增效作用3.1MTT检测法显示含药血清能在一定程度上增效自杀基因系统杀伤黑色素瘤B16细胞,将各GGCV联合血清组相对抑制率按含药血清浓度从低到高依次为46.4±4.14%%、61.9±3.03%、57.1±1.61%、80.1±1.22%。其中GCV联合2.5%含药血清组与GCV联合对照血清组比较差异具有统计学意义（P<0.01）, GCV联合5%含药血清组与GCV联合对照血清组比较差异具有统计学意义（P<0.05）, GCV联合10%含药血清组与GCV联合对照血清组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。3.2荧光示踪法显示含药血清能在一定程度上增效自杀基因系统杀伤黑色素瘤B16细胞,具体为GCV联合10%含药血清组绿色荧光细胞周围有红色细胞碎片漂浮现象较其余浓度组更明显。四、结论：实验所得结论为：六味地黄丸入血成分对自杀基因系统体内治疗黑色素瘤有增效作用,六味地黄丸入血成分体内作用小鼠取得的小鼠血清在体外研究中对自杀基因杀伤黑色素瘤有一定的增效作用。
牛颖[10]（2014）在《核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究》文中认为世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构（The International Agency forResearch on Cancer）发表的《2014年全球癌症报告》称：2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，中国新增癌症病例高居世界第一位。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。胃癌（gastric cancer）是发生在消化系统胃黏膜上皮组织的恶性肿瘤。它是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率为25.2/10万，占全部恶性肿瘤死亡的23.2%，居各类肿瘤的首位。早期胃癌多无症状或缺乏典型的临床表现，普查的依从性差，费用较高，大部分病人发现时多已处于进展期。传统的治疗效果不理想，预后较差，术后5年生存率并不能让人满意，死亡率仍保持在较高水平。因此寻找一种有效的、新的胃癌治疗方法以提高患者的生存率尤为重要。近年来，分子生物学的发展十分迅速，DNA重组技术日益成熟，基因治疗（gene therapy）在基础研究方面已经取得了很大的进展，成为了一种新的治疗手段。目前肿瘤基因治疗包括许多策略，如基因沉默治疗、自杀基因疗法、反义基因疗法、基因替换疗法、免疫基因治疗、抑癌基因治疗、针对一些细胞因子的基因治疗、针对耐药基因的治疗、肿瘤DNA疫苗、抗端粒酶疗法等几个方面。随着基因治疗策略的不断发展和载体的开发应用，胃癌自杀基因治疗（suicidegene therapy）有望成为一种肿瘤治疗新方法为人们所接受，更多的癌症患者将从中获益。本课题组前期研究结果表明，在survivin基因启动子的驱动下，GFP基因可在胃癌细胞SGC-7901中表达，但在正常胃上皮细胞中不表达。转染的SGC-7901细胞中有胸苷激酶（thymidine kinase, TK）/胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase, CD）（CD/TK）融合基因的表达，但在转染的正常胃上皮细胞中未见CD/TK融合基因的表达产物；转染的胃癌SGC-7901细胞对前体药物高度敏感，CD/TK双自杀基因系统比任一单自杀基因有更好的杀伤靶细胞的效果；体内接种转染SGC-7901细胞的裸鼠移植瘤实验结果表明，与任一单自杀基因相比，双自杀基因系统治疗抑制肿瘤的生长的效果更强更显着尽管自杀基因治疗目前已成功进行体内外实验研究，但是要达到理想的用于临床治疗胃癌的效果还有很大的差距，还有一些问题有待解决，比如外源基因的导入尚缺乏特异性和靶向性，载体特异性受体在肿瘤细胞中表达较低则会导致肿瘤细胞中病毒载体的表达较低等等。核基质附着区（matrix attachmentregion, MAR）是指真核生物染色质中能够与核基质（nuclear matrix）或核骨架产生特异性结合的DNA序列，又称为核骨架附着区（scaffold attachment region,SAR）。MAR序列的功能主要是参与DNA复制调控、转录调控等多种核生化过程，同时MAR可使染色质形成独立的环状结构，从而避免位置效应引起的基因沉默。鉴于MAR序列和基因表达间的这种关系，特别是它能显着地增强外源基因表达、克服位置效应、避免转基因沉默，目前作为一种顺式调控元件已应用于转基因生物工程中。目前，通过应用MAR序列增强survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因表达系统靶向治疗胃癌的研究，迄今为止国内外尚未见报道。因此，本研究中我们构建并验证了含有MAR序列的由survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因表达系统是否可以增强对胃癌细胞及裸鼠的胃癌皮下移植瘤靶向杀伤作用，结果表明MAR序列元件可以显着增强CD/TK双自杀融合基因的表达，表达产物可以选择性的抑制胃癌细胞的增殖和促进细胞凋亡，对裸鼠的胃癌皮下移植瘤具有显着的靶向杀伤作用。研究结果为胃癌的基因治疗提供重要的理论依据，为临床应用奠定实验基础。本实验研究内容共分为四部分：第一部分含有MAR的重组pMS-CD/TK双自杀基因表达载体的构建目的分别克隆Survivin启动子、CD、TK和MAR基因，构建含有MAR的由survivin启动子驱动的CD/TK双自杀基因真核重组表达载体pMS-CD/TK。方法1. CD基因全长序列克隆和分析：设计引物，以提取的细菌E.coli基因组DNA为模板，PCR扩增CD基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-CD，进行酶切鉴定和测序验证。2. TK基因全长序列克隆和分析：设计引物，以提取的细菌E.coli基因组DNA为模板，PCR扩增TK基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-TK，进行酶切鉴定和测序验证。3. Survivin启动子基因序列克隆和分析：设计引物，以提取的人Hela细胞基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-Sur，进行酶切鉴定和测序验证。4. MAR序列克隆和分析：以人β珠蛋白MAR序列为参考设计引物，以提取的人Hela细胞基因组DNA为模板，PCR扩增MAR基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-MAR，进行酶切鉴定和测序验证。5.重组pMS-CD/TK真核表达载体的构建：以质粒载体pEGFP-C1为基础，依次将Survivin启动子基因亚克隆连接构建中间载体pEGFP-Sur，再与CD和TK基因连接构建中间载体pS-CD/TK，最后将MAR基因序列连接构建含有MAR的重组真核表达载体pMS-CD/TK，并进行酶切鉴定和测序验证。结果1. PCR产物经酶切及测序鉴定成功克隆Survivin启动子基因（948bp），MAR基因（787bp），CD基因（约1302bp）和TK基因（约1175bp）。2.经不同体系双酶切和测序鉴定成功构建含有MAR的重组表达载体pMS-CD/TK和不含MAR的重组表达载体pS-CD/TK。第二部分重组pMS-CD/TK表达载体转染胃癌细胞及表达分析目的重组表达载体pMS-CD/TK和pS-CD/TK分别转染胃癌SGC-7901并分析双自杀基因CD/TK在转染细胞的表达情况。方法1.采用脂质体法将构建好的重组表达载体pMS-CD/TK和pS-CD/TK分别转化人胃癌SGC-7901细胞（靶细胞）及人胃黏膜上皮细胞GES-1（对照细胞）并筛选稳定转化株。2.应用实时荧光定量PCR法（Quantitative real-time PCR, qPCR）检测转染细胞株中CD/TK基因表达量；Western blot法检测转染细胞中CD/TK蛋白的表达情况。结果1.通过脂质体介导方法可有效转染SGC-7901和GES-1细胞。RT-PCR结果表明，与未转染SGC-7901细胞组相比，质粒pS-CD/TK或pMS-CD/TK转染组分别扩增出一条与预期CD/TK片段大小相符的特异性条带，而在GES-1细胞各实验组中均检测到CD/TK基因的表达。2. qPCR结果显示，CD/TK基因在转染pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞中的相对表达量是转染pS-CD/TK质粒的7.7倍。3. Western blot结果也表明，与未转染的SGC-7901细胞组相比，在转染pMS-CD/TK或pS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞中可检测到一条单一特异的蛋白条带。第三部分MAR增强双自杀基因CD/TK表达对胃癌细胞的体外作用实验目的观察MAR序列增强pMS-CD/TK双自杀基因表达系统对胃癌SGC-7901细胞的体外杀伤作用。方法1. SGC-7901和GES-1转染细胞中分别加入前体药物5-FC+GCV，MTT法检测前体药物对转染细胞毒性，计算细胞的存活率。2.转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞和未转染的细胞按所设梯度比例混合，加入5-FC和GCV联合用药治疗，MTT检测细胞的存活率以观察有无旁观者效应。3.流式细胞技术进行转染细胞凋亡率的检测。结果1. MTT检测结果显示，与未转染细胞相比，5-FC和GCV联合应用可以显着降低转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞的存活率，差异有统计学意义（P<0.01）。与转染pS-CD/TK质粒组相比，联合应用前体5-FC+GCV后转染pMS-CD/TK质粒组SGC-7901细胞的存活率降低显着，差异具有统计学意义（P<0.01）；与未转染细胞组相比，5-FC和GCV对转染的GES-1细胞存活率均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。2.随着不断增加转染细胞的比例，细胞的存活率呈现逐渐下降趋势，而且存在明显的旁观者效应。3.在给予5-FC+GCV前药处理后，pS-CD/TK和pMS-CD/TK质粒转染组细胞凋亡率分别为17.65±1.58%、26.25±2.63%，明显高于未转染组对照细胞凋亡率（5.01±0.22%（）P<0.05），且pMS-CD/TK转染组细胞凋亡率显着高于pS-CD/TK组。第四部分MAR增强双自杀基因CD/TK表达对体内裸鼠移植瘤的作用研究目的观察含有MAR的双自杀基因CD/TK表达系统对裸鼠胃癌SGC-7901细胞移植瘤的抑制作用。方法1.胃癌细胞裸鼠移植瘤动物模型的建立：Balb/c裸鼠右前肢腋窝皮下接种5×106SGC-7901细胞，第四天原位补种一次，建立胃癌移植瘤动物模型。2.双自杀基因系统对裸鼠胃癌移植瘤模型的疗效观察：等到裸鼠移植瘤生长至直径约为0.5cm时，将小鼠随机分成3组，6只/每组：A组，空白对照组，仅用PBS处理；B组，注射重组pS-CD/TK质粒联合前药5-FC+GCV治疗组；C组，注射重组pMS-CD/TK质粒联合前药5-FC+GCV治疗组。在给药治疗后每三天测量各组小鼠的肿瘤大小，计算瘤体体积，治疗结束时用颈椎脱臼法处死动物，取瘤测瘤重，计算抑瘤率，取肿瘤组织切片行HE染色，镜检观察肿瘤组织的病理变化。3. qPCR法检测裸鼠肿瘤组织中CD/TK双自杀基因的表达结果1.成功建立胃癌细胞裸鼠移植瘤动物模型，当裸鼠成瘤直径达0.5cm后开始进行治疗。各实验组最终瘤重和抑瘤率结果为： A组：557.1±8.9mg；B组：251.7±14.2mg，63.1%；C组：118.8±10.2mg，82.6%。与对照组相比，治疗组肿瘤体积、最终瘤重和抑瘤率明显减小，差异有统计学意义（均P<0.05）。2.肿瘤组织病理学观察结果显示，与对照组相比，治疗组可见肿瘤细胞变性坏死及多发灶性出血散在分布，细胞分裂相少，伴有纤维组织增生，并可见较多的凋亡小体。3. qPCR实验结果表明，在注射转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的移植瘤中检测到CD/TK基因的表达，且后者的表达量是前者的约2.3倍；而PBS处理对照组未检测到CD/TK基因的表达。结论1.成功构建含有MAR的由survivin启动子驱动的CD/TK双自杀基因表达载体系统pMS-CD/TK。2.重组CD/TK融合基因在胃癌细胞SGC-7901中成功表达，MAR基因在转录和蛋白水平均可明显增加CD/TK的表达量。3.双自杀CD/TK融合基因系统对胃癌SGC-7901细胞具有显着的杀伤作用且有明显的旁观者效应。4. MAR序列可通过增强CD/TK基因的表达对胃癌SGC-7901转染细胞产生明显杀伤作用。5. MAR能增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK抑制Balb/c小鼠移植瘤生长的作用
二、肿瘤的自杀基因疗法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤的自杀基因疗法（论文提纲范文）
（1）六味地黄丸增效小鼠黑色素瘤HSV-tk/GCV自杀基因疗法的免疫机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 恶性黑色素瘤概述 |
| 第二章 肿瘤自杀基因疗法研究进展 |
| 一、自杀基因 |
| 二、旁杀伤效应 |
| 三、旁杀伤效应的机制研究 |
| 第三章 缝隙连接通讯及Cx43蛋白的相关研究 |
| 一、缝隙连接通讯 |
| 二、缝隙连接通讯与旁观者效应 |
| 三、缝隙连接通讯与免疫系统 |
| 四、缝隙连接通讯与抗原交叉提呈 |
| 第四章 中医学对肿瘤的认识 |
| 第五章 六味地黄丸的相关研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 体内实验检测六味地黄丸对自杀基因增效的旁观者效应的免疫机制 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、细胞培养方法 |
| 二、CCK8法检测GCV、六味地黄丸对B16、B16-tk~+细胞生长影响 |
| 三、体内移植瘤检测六味地黄丸对自杀基因疗法的增效作用 |
| 四、数据处理 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、CCK8法检测GCV对B16、B16-tk~+细胞生长影响 |
| 二、CCK8法检测六味地黄丸对B16、B16-tk~+细胞生长影响 |
| 三、体内移植瘤检测六味地黄丸对自杀基因疗法的增效作用 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 体外实验检测六味地黄丸对自杀基因疗法免疫杀伤效应的增效作用 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、DC细胞培养及纯度、成熟度检测 |
| 二、CD8+ T细胞分离及纯度检测 |
| 三、六味地黄丸对CD8+ T细胞杀伤B16细胞的影响 |
| 四、数据处理 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、DC细胞培养及纯度、成熟度检测 |
| 二、CD8+T细胞分离及纯度检测 |
| 三、六味地黄丸对CD8+ T细胞杀伤B16细胞的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 调控Cx43表达及GJIC功能与六味地黄丸增效自杀基因疗法免疫杀伤的相关性 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、检测B16肿瘤组织Cx43蛋白表达 |
| 二、肿瘤细胞Cx43表达及GJIC功能 |
| 三、抑制Cx43对免疫杀伤的影响 |
| 四、数据处理 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（2）氧化铁纳米粒改良的间充质干细胞载体构建及用于脑胶质瘤的靶向治疗研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 全文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 氧化铁纳米粒用于MSCs高效携载和表达自杀基因 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.1.1 仪器 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 MFIONs用于MSCs的基因转染 |
| 1.2.2 体外自杀效应 |
| 1.2.3 体外旁观者效应 |
| 1.3 实验结果与讨论 |
| 1.3.1 基于 MFIONs 的转染体系用于 MSCs 的基因转染 |
| 1.3.2 体外自杀效应 |
| 1.3.3 体外旁观者效应考察 |
| 1.4 本章小结 |
| 第二章 氧化铁纳米粒诱导Cx43 过表达改善GJIC功能并促进旁观者效应 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MFIONs对 MSCs及 C6 脑胶质瘤细胞上Cx43 表达的影响 |
| 2.2.2 MFIONs对 MSCs与 C6 脑胶质瘤细胞间GJIC的影响 |
| 2.2.3 MFIONs诱导的Cx43 过表达对GJIC功能的影响 |
| 2.2.4 MFIONs诱导的Cx43 过表达对旁观者效应的影响 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 MFIONs促进Cx43 过表达 |
| 2.3.2 MFIONs诱导的Cx43 过表达促进GJIC功能 |
| 2.3.3 MFIONs诱导的Cx43 过表达促进旁观者效应 |
| 2.3.4 GJIC功能影响旁观者效应的有效发挥 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于MFIONs改良MSCs的肿瘤靶向递送载体的构建 |
| 3.1 仪器与试剂 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 体外肿瘤细胞趋向实验 |
| 3.2.2 静脉注射的经MFIONs改良的MSCs的体内分布 |
| 3.2.3 腹腔注射的GCV的颅内分布 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 MFIONs提高MSCs在体外对C6 脑胶质瘤细胞的趋向性 |
| 3.3.2 MFIONs促进MSCs在体内向脑胶质瘤靶向归巢 |
| 3.3.3 腹腔注射的GCV的颅内分布 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 体内治疗实验及初步的安全性评价 |
| 4.1 仪器与试剂 |
| 4.1.1 仪器 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 体内抗肿瘤疗效研究 |
| 4.2.2 短期安全性评价试验 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 体内抗肿瘤疗效研究 |
| 4.3.2 短期安全性评价试验 |
| 4.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞的肿瘤归巢特性及其肿瘤靶向治疗应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）Dm-dNK与吉西他滨联用对乳腺癌原代细胞杀伤作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 乳腺癌原代细胞3D培养 |
| 2.3.2 病毒载体构建 |
| 2.3.3 腺病毒对乳腺癌原代细胞转染率的测定 |
| 2.3.4 western blot检测重组病毒中蛋白的表达 |
| 2.3.5 选择复制型腺病毒的细胞杀伤作用评估 |
| 2.3.6 不同浓度DFDC的细胞杀伤作用评估 |
| 2.3.7 选择复制型腺病毒SG500与DFDC联合应用对细胞杀伤作用评估 |
| 2.3.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 乳腺癌原代细胞3D培养 |
| 3.2 选择复制型腺病毒感染效率及其表达产物的测定 |
| 3.3 选择复制型腺病毒SG500-dNK及 SG500 对乳腺癌原代细胞的杀伤作用 |
| 3.4 单用DFDC及 SG500-dNK、SG500与DFDC联合应用的细胞杀伤作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 相关文献研究 |
| 第一章 肝癌 |
| 1.1 原发性肝癌的病因学与病理学: |
| 1.2 原发性肝癌的治疗手段与技术方法 |
| 1.2.1 肝癌的外科手术治疗(术疗) |
| 1.2.2 肝癌的化学药物治疗(化疗) |
| 1.2.3 肝癌的放射治疗(放疗) |
| 1.2.4 肝癌的生物学疗法 |
| 1.2.5 肝癌的分子靶向治疗 |
| 1.2.6 肝癌的射频消融治疗 |
| 1.2.7 肝癌的中医中药学疗法 |
| 1.2.8 肝癌的中西医结合疗法 |
| 第二章 芪三酚 |
| 2.1 芪三酚的结构及性质 |
| 2.2 芪三酚的抗癌作用 |
| 2.2.1 诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 2.2.2 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 第三章 自杀基因 |
| 3.1 自杀基因的种类 |
| 3.2 自杀基因的作用及机制 |
| 3.3 自杀基因增效疗法 |
| 第四章 结语 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及其稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株、质粒 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 具体操作方法 |
| 1.2.3 统计学方法: |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 质粒的转化、扩增及鉴定 |
| 1.3.2 逆转录病毒的包装、浓缩、鉴定 |
| 1.3.3 逆转录病毒感染HepG2肝癌细胞 |
| 1.3.4 感染细胞的鉴定 |
| 1.3.5 HepG2/CDTK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 双自杀基因联合芪三酚对肝癌细胞HepG2细胞杀伤作用的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验研究细胞 |
| 2.1.2 实验研究试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 技术路线 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 细胞克隆形成率检测 |
| 2.2.4 凋亡相关基因检测 |
| 2.2.5 细胞迁移能力实验—细胞划痕法 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.7 细胞亚结构 |
| 2.2.8 统计学方法: |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 一般形态学 |
| 2.3.2 MTT法测定双自杀基因和芪三酚对肝癌细胞的生长抑制情况 |
| 2.3.3 细胞凋亡指标检测结果 |
| 2.3.4 细胞克隆形成实验结果 |
| 2.3.5 凋亡基因检测结果 |
| 2.3.6 细胞迁移实验结果 |
| 2.3.7 流式细胞检测细胞周期结果 |
| 2.3.8 细胞亚结构 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 芪三酚对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.2 肝癌自杀基因对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.3 肝癌双自杀基因与芪三酚联合应用对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.4 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 第一章 肿瘤基因治疗概述 |
| 一、 基因沉默疗法 |
| 二、 抑癌基因疗法 |
| 三、 免疫基因疗法 |
| 四、 自杀基因治疗 |
| 五、 抗肿瘤血管生成基因疗法 |
| 六、 肿瘤多药耐药基因疗法 |
| 第二章 肿瘤自杀基因治疗研究进展 |
| 一、 自杀基因及自杀基因治疗系统 |
| 二、 自杀基因疗法的旁杀伤效应及机制 |
| 三、 肿瘤自杀基因疗法的增效方法 |
| 第三章 中医学对肿瘤的认识及治疗法则 |
| 第四章 木犀草素、芹菜素及槲皮素药理作用及抗肿瘤作用 |
| 一、 木犀草素与肿瘤的相关研究 |
| 二、 芹菜素与肿瘤的相关研究 |
| 三、 槲皮素与肿瘤的相关研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 人黑色素瘤细胞HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 RT-PCR扩增人tk读码框 |
| 二、 慢病毒载体质粒pLV-tk/GFP的构建和鉴定 |
| 三、 细胞培养、传代、冻存、复苏 |
| 四、 重组慢病毒的包装与感染 |
| 五、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 六、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 七、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 三、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 第四节 讨论 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第二章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞间缝隙连接通讯的作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 A375生长曲线绘制 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法和流式细胞技术观察GJIC功能 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 五、 统计方法 |
| 第三节 结果 |
| 一、 A375细胞的增殖测定 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法及流式细胞术检测药物对A375细胞GJIC功能的影响 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 四、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 第四节 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件Ⅰ：本论文中使用的缩略语 |
| 附件Ⅱ：pLXSN-tk质粒中tk基因测序图 |
| 附件Ⅲ：已在国内外学术期刊上发表的相关论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
（6）基于干细胞的新型基因靶向传递系统的构建及在肿瘤治疗中的体内外研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(按首字母顺序) |
| 引言 |
| 第一章 非病毒基因转染载体的构建、筛选和安全性考察 |
| 1.1 实验仪器与材料 |
| 1.1.1 仪器 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 动物 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 BMSC的提取分离与纯化、培养 |
| 1.2.2 报告基因的扩增和抽提 |
| 1.2.3 阳离子化普鲁兰多糖衍生物的制备和表征 |
| 1.2.4 载体/pDNA复合物的制备 |
| 1.2.5 BMSC的基因转染 |
| 1.2.6 基因转染效率的测定 |
| 1.2.7 细胞毒性的测定 |
| 1.2.8 SP/pDNA复合物的粒径与电位测定 |
| 1.2.9 SP/pDNA复合物的胞内分布考察 |
| 1.2.10 SP入胞后在内涵体中的降解 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.3.1 SP聚合物的表征 |
| 1.3.2 SP聚合物的合成条件优化 |
| 1.3.3 SP/pDNA复合物在不同N/P比下的粒径和电位变化 |
| 1.3.4 SP/pDNA复合物在不同N/P比下对BMSC转染效率的影响 |
| 1.3.5 不同接枝率对SP转染效率的影响 |
| 1.3.6 不同非病毒基因载体在BMSC上的转染效率考察 |
| 1.3.7 不同非病毒基因载体的细胞毒性考察 |
| 1.3.8 SP/pDNA复合物的细胞内吞过程考察 |
| 1.3.9 SP聚合物在BMSC溶酶体中的降解 |
| 1.4 本章小结 |
| 第二章 静脉注射的BMSC在体内的分布及体内外向肿瘤细胞的趋向性 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 B16F10胞的培养 |
| 2.2.2 体外肿瘤趋向实验 |
| 2.2.3 BMSC的荧光标记 |
| 2.2.4 黑色素瘤肺转移小鼠模型的建立 |
| 2.2.5 荧光标记法观察BMSC在体内的分布 |
| 2.2.6 肺部冰冻切片的制备及观察 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 BMSC体外向B16F10肿瘤细胞的迁移 |
| 2.3.2 黑色素瘤肺转移小鼠模型的考察 |
| 2.3.3 BMSC尾静脉注射后在正常小鼠及肿瘤模型小鼠的体内分布 |
| 2.3.4 BMSC在正常肺部和荷瘤肺部的分布 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于BMSC的自杀基因传递系统的抗肿瘤疗效 |
| 3.1 实验仪器与材料 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 细胞 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组自杀基因HSV-TK的BMSC |
| 3.2.2 GCV溶液的配制 |
| 3.2.3 重组自杀基因的TK-BMSC在体外的自杀作用考察 |
| 3.2.4 MTT法测定细胞死亡率 |
| 3.2.5 体外旁观者效应考察 |
| 3.2.6 表达GFP蛋白的B16F10细胞的诱导和筛选 |
| 3.2.7 体外共培养后旁观者效应的动态过程考察 |
| 3.2.8 体外非接触培养后的旁观者效应考察 |
| 3.2.9 重组自杀基因BMSC对小鼠黑色素肺转移模型的疗效考察 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 BMSC基因重组HSV-TK后的自杀作用考察 |
| 3.3.2 不同条件对重组BMSC自杀作用的影响 |
| 3.3.3 稳定表达GFP的B16F10细胞株的构建 |
| 3.3.4 重组BMSC对肿瘤细胞的体外旁观者效应考察 |
| 3.3.5 重组BMSC自杀作用与旁观者效应间的联系 |
| 3.3.6 BMSC作为自杀基因的传递载体在体内的抑瘤效果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基因-药物共靶向传递系统的协同抗肿瘤疗效 |
| 4.1 实验仪器与试剂 |
| 4.1.1 仪器 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 胞 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 包裹GCV的脂质体制备 |
| 4.2.2 脂质体的粒径测定及形貌观察 |
| 4.2.3 高效液相色谱-紫外分光光度法(HPLC-UV)测定GCV浓度 |
| 4.2.4 脂质体的体外释放考察 |
| 4.2.5 脂质体载体尾静脉注射后的体内分布 |
| 4.2.5.1 包裹荧光探针的脂质体制备 |
| 4.2.5.2 包裹荧光探针的脂质体静脉注射后在小鼠体内的分布 |
| 4.2.6 肺匀浆的制备及肺部GCV浓度的测定 |
| 4.2.7 脂质体和溶液静脉注射后在肺部的GCV浓度比较 |
| 4.2.8 脂质体与BMSC和肿瘤细胞的共定位 |
| 4.2.9 体外三维肿瘤球模型的建立 |
| 4.2.10 TK-BMSC/GCV-lipo对肿瘤球生长抑制评价 |
| 4.2.11 TK-BMSC/GCV-lipo共靶向传递系统的体内抑瘤效率评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 HPLC-UV法检测GCV浓度 |
| 4.3.2 GCV脂质体的表征 |
| 4.3.3 脂质体的体外药物释放过程 |
| 4.3.4 脂质体静脉注射后在体内的分布 |
| 4.3.5 肺部GCV浓度的测定 |
| 4.3.6 脂质体和溶液分别给药后在肺部的GCV浓度比较 |
| 4.3.7 脂质体和重组BMSC分别尾静脉注射后在荷瘤肺部的分布 |
| 4.3.8 体外三维肿瘤球模型 |
| 4.3.9 基于GCV脂质体和重组BMSC的体外肿瘤球生长抑制实验 |
| 4.3.10 TK-BMSC协同GCV脂质体共靶向传递后的体内抑瘤效率评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 BMSC在肿瘤微环境中的分布及对癌巢组织的穿透性 |
| 5.1 实验仪器与材料 |
| 5.1.1 仪器 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 肿瘤球穿透实验 |
| 5.2.2 稳定表达绿色荧光蛋白的BMSC的培养 |
| 5.2.3 BMSC静脉注射后在肿瘤组织内的分布考察 |
| 5.2.4 乙二胺修饰的普鲁兰多糖的制备和表征 |
| 5.2.5 氧化铁纳米粒的制备 |
| 5.2.6 氧化铁纳米粒的粒径、电位及形貌观察 |
| 5.2.7 氧化铁纳米粒的含铁量测定 |
| 5.2.8 磁场响应性考察 |
| 5.2.9 氧化铁纳米粒标记BMSC |
| 5.2.10 普鲁士蓝染色和Nuclear fast red染色 |
| 5.2.11 氧化铁纳米粒标记的BMSC在肿瘤局部组织的示踪 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 BMSC向肿瘤球的穿透 |
| 5.3.2 HEK293细胞向肿瘤球的穿透 |
| 5.3.3 双荧光标记法观察BMSC在肿瘤球内的分布 |
| 5.3.4 稳定表达绿色荧光蛋白的BMSC的观察 |
| 5.3.5 BMSC在肺部肿瘤结节中的分布 |
| 5.3.6 乙二胺-普鲁兰多糖修饰的氧化铁纳米粒表征 |
| 5.3.7 氧化铁纳米粒的浓度 |
| 5.3.8 氧化铁纳米粒标记的BMSC |
| 5.3.9 BMSC尾静脉注射后向肿瘤组织的迁移和穿透 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 自杀基因重组BMSC作为肿瘤靶向传递载体的初步安全性评价 |
| 6.1 实验仪器与材料 |
| 6.1.1 仪器 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 试剂 |
| 6.1.4 实验动物 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 未重组自杀基因的BMSC对肿瘤生长的影响考察 |
| 6.2.2 自杀基因疗法对小鼠的毒副作用考察 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 BMSC的注射数目对肿瘤发展的影响 |
| 6.3.2 自杀基因治疗后的小鼠体重变化 |
| 6.3.3 自杀基因疗法对肝脏毒性的考察 |
| 6.3.4 自杀基因疗法对肺部急性毒性和长期毒性的考察 |
| 6.4 本章小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（7）山奈酚对小鼠黑色素瘤自杀基因系统的增效作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肿瘤自杀基因治疗的研究进展 |
| 一、肿瘤基因治疗的研究进展 |
| 二、肿瘤自杀基因疗法的研究概述 |
| 三、GJIC与自杀基因系统的旁杀伤效应 |
| 四、自杀基因疗法在治疗黑色素瘤方面的研究 |
| 第二节 山奈酚药理作用研究进展 |
| 一、山奈酚的概述 |
| 二、山奈酚在抗肿瘤方面的研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统的建立 |
| 一、质粒的扩增和提取 |
| 二、重组自杀基因系统的建立和鉴定 |
| 三、实验讨论 |
| 第二节 山奈酚对B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV系统的体外增效作用 |
| 一、山奈酚对B16细胞株缝隙连接功能的影响初探 |
| 二、山奈酚对B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV系统的增效作用 |
| 三、实验讨论 |
| 第三节 山奈酚对B16细胞株HSV1-tk/GCV系统的体内增效作用 |
| 一、体内山奈酚对HSV1-tk/GCV系统治疗小鼠黑色素瘤的影响 |
| 二、HE染色法观察山奈酚增效实验各组肿瘤组织变化 |
| 三、实验讨论 |
| 第三章 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ：英文缩略语 |
| 附录Ⅱ：HSV1-tkGFP/GCV系统旁杀伤效应验证结果 |
| 附录Ⅲ：山奈酚增强HSV1-tk/GCV系统旁杀伤效应的结果 |
| 附录Ⅳ：动物实验肿瘤病理组织学检查结果(HE染色法) |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）薯蓣皂苷通过GJ机制发挥对B16细胞自杀基因的增效作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 背景研究 |
| 第一节 肿瘤基因疗法概述 |
| 第二节 自杀基因疗法研究进展 |
| 一、自杀基因的定义 |
| 二、自杀基因疗法的旁杀伤效应及机制 |
| 三、肿瘤自杀基因疗法的增效方法 |
| 第三节 缝隙连接蛋白Cx43的相关研究 |
| 一、Cx43结构 |
| 二、调控Cx43的影响因素 |
| 三、Cx43与相关疾病的研究 |
| 第四节 中医学对肿瘤的认识及治疗法则 |
| 第五节 薯蓣皂苷及苷元的相关研究 |
| 一、薯蓣皂苷的相关研究 |
| 二、薯蓣皂苷元与肿瘤的相关研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤细胞缝隙连接功能的影响 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、细胞培养、传代、冻存、复苏 |
| 二、MTT法测定薯蓣皂苷对小鼠B16细胞生长影响 |
| 三、流式细胞仪分析缝隙连接通讯功能 |
| 四、荧光定量PCR分析Cx43、Cx32和Cx26转录 |
| 五、Western blot检测Cx43、Cx32和Cx26表达 |
| 六、统计学分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、MTT法检测薯蓣皂苷对B16细胞生长的影响 |
| 二、流式细胞术检测薯蓣皂苷对B16细胞株缝隙连接通讯功能的影响 |
| 三、荧光定量PCR检测薯蓣皂苷对B16细胞株缝隙连接蛋白基因转录的影响 |
| 四、Western Blot检测薯蓣皂苷对B16细胞株缝隙连接蛋白表达的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 一、缝隙连接细胞间通讯与肿瘤的关系 |
| 二、相关实验方法技术原理简介 |
| 三、薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤缝隙连接功能的影响 |
| 第二部分 薯蓣皂苷对小鼠B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统增效作用的研究 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、确定GCV浓度 |
| 二、确定TK比例 |
| 三、MTT法检测薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 四、AnnexinV单染法检测细胞凋亡 |
| 五、统计学分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、MTT法检测薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 二、AnnexinV单染法检测细胞凋亡 |
| 第四节 讨论 |
| 第三部分 阻断缝隙连接功能对薯蓣皂苷在自杀基因治疗系统中增效作用的影响 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、RT-PCR扩增人Cx43读码框 |
| 二、慢病毒载体质粒pLVmCherry-Cx43的构建及鉴定 |
| 三、pLVmCherry-Cx43G21R和pLVmCherry-Cx43G138R基因定点突变慢病毒载体质粒的构建与鉴定 |
| 四、重组慢病毒的包装与转染 |
| 五、Western blot检测Cx43表达 |
| 六、荧光示踪法观察GJIC功能 |
| 七、MTT法检测过表达野生型及突变型Cx43细胞株对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的影响 |
| 第三节 结果 |
| 一、构建过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株 |
| 二、Western Blot检测Cx43蛋白表达 |
| 三、荧光示踪检测Cx43功能 |
| 四、薯蓣皂苷对过表达野生型Cx43及突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株自杀基因治疗系统的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 一、过表达及Cx43基因的选择 |
| 二、主要病毒载体的优缺点 |
| 三、本次实验的结果 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详细摘要 |
（9）六味地黄入血成分增效黑色素瘤自杀基因治疗的体内实验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 第一节 肿瘤自杀基因治疗的研究进展 |
| 一、自杀基因治疗概述 |
| 二、自杀基因治疗的旁杀伤效应及机制 |
| 第二节 恶性黑色素瘤的自杀基因治疗研究进展 |
| 一、恶性黑色素瘤的发病与治疗现状 |
| 二、恶性黑色素瘤的自杀基因治疗 |
| 第三节 六味地黄丸的药理作用及六味地黄丸含药血清的研究进展 |
| 一、六味地黄丸组方及药理作用研究 |
| 二、六味地黄丸含药血清的药理作用及研究进展 |
| 第四节 六味地黄丸入血成分研究进展 |
| 一、六味地黄丸入血成分的分离及结构鉴定 |
| 二、六味地黄丸入血成分的药理作用研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一节 六味地黄丸混合入血成分对HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用的体内实验最佳实验条件摸索 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 六味地黄丸混合入血成分对HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用的体内实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清的制备及对HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用的研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 一、主要结论 |
| 二、存在问题 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 本文中使用的缩略语 |
| 附录Ⅱ 黑色素瘤体内实验病理检查结果 |
| 附录Ⅲ 荧光示踪图片11,400× |
| 附录Ⅳ 硕士研究生在读期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（10）核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词及中英文对照索引 |
| 引言 |
| 第一部分 含有 MAR 的重组 pMS-CD/TK 双自杀基因表达载体的构建 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组 pMS-CD/TK 表达载体转染胃癌细胞及表达分析 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MAR 增强双自杀基因 CD/TK 表达对胃癌细胞的体外作用实验 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分 MAR 增强双自杀基因 CD/TK 表达对体内裸鼠胃癌移植瘤的作用研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 癌症的自杀基因治疗发展现状综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
四、肿瘤的自杀基因疗法（论文参考文献）
- [1]六味地黄丸增效小鼠黑色素瘤HSV-tk/GCV自杀基因疗法的免疫机制[D]. 张文静. 广州中医药大学, 2021
- [2]氧化铁纳米粒改良的间充质干细胞载体构建及用于脑胶质瘤的靶向治疗研究[D]. 李艾. 浙江大学, 2021(02)
- [3]Dm-dNK与吉西他滨联用对乳腺癌原代细胞杀伤作用的研究[D]. 侯俊佳. 中国医科大学, 2019(02)
- [4]双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究[D]. 谭成光. 广州中医药大学, 2017(05)
- [5]木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究[D]. 黄暨生. 广州中医药大学, 2016(11)
- [6]基于干细胞的新型基因靶向传递系统的构建及在肿瘤治疗中的体内外研究[D]. 张添源. 浙江大学, 2016(08)
- [7]山奈酚对小鼠黑色素瘤自杀基因系统的增效作用[D]. 曾玲. 广州中医药大学, 2014(01)
- [8]薯蓣皂苷通过GJ机制发挥对B16细胞自杀基因的增效作用[D]. 李玢. 广州中医药大学, 2014(01)
- [9]六味地黄入血成分增效黑色素瘤自杀基因治疗的体内实验[D]. 刘娟. 广州中医药大学, 2014(01)
- [10]核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究[D]. 牛颖. 郑州大学, 2014(02)