一、Genetic Engineering of Cotton (Gossypium hirsutum L. ) for Insect-resistance（论文文献综述）
孙琳[1]（2021）在《CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建》文中提出棉花既是一种重要的纤维作物,也是重要的油料作物。由于棉花生育期较长,从播种到收获期间生长发育的各个时期都会受到多种虫害的影响,因此虫害已经成为影响棉花产量和纤维品质的重要因素之一。棉花作为世界上四大转基因作物之一,Bt棉的应用在一定程度上控制了鳞翅目害虫带来的影响,但导致刺吸式等非Bt基因靶标害虫危害的日益加重逐步成为危害棉花的主要害虫,迫使杀虫剂大量喷施,造成多种害虫对农药的抗性随之进化,这不仅增加了棉花种植成本而且破坏生态环境。另一方面随着Bt棉种植区域的扩大和种植时间的不断延长,害虫对Bt棉的抗性也随之增强,其带来的风险也不容忽视。因此目前需要开发新的策略应用于棉花抗虫研究。鉴定棉花内源抗虫基因用于抗虫育种,可以有效补充Bt棉在抗虫应用中的不足。而开发一种高效、可靠的基因功能分析策略是进行棉花功能基因组学研究的重要方向。CRISPR/Cas9系统现已成为一种强大而有效的基因编辑工具。本课题组已经在棉花中成功构建的高效、精确的适用于棉花的CRISPR/Cas9基因组编辑系统使得大规模构建基因编辑突变体材料成为可能。本研究介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统的高效筛选棉花内源抗虫相关基因突变体库构建的方法,为棉花功能基因组学和育种方向研究提供了高效的新策略。主要取得了以下研究结果:1.sgRNA设计与载体文库构建本研究从之前的转录组和代谢组学分析中选择了528个差异基因,通过全基因组比对筛选到968个高特异性的sgRNA靶向502个基因。通过混合引物池的方法经一次引物设计、PCR扩增和载体克隆,只需花费构建一个载体的时间就可以快速构建大规模载体文库。2.棉花基因组编辑突变体库创建及目的基因识别利用农杆菌介导的遗传转化和组织培养过程,共获得达5000多个独立的胚性愈伤组织,获得2000多独立的基因编辑T0棉花植株。本研究使用基于条形码的高通量测序技术对T0植株的目的基因进行测序分析。我们对1380个T0植株和576份愈伤组织检测了sgRNAs并鉴定了其序列,共鉴定出555条靶向412个基因的不同sgRNA序列,已检测突变体材料的基因覆盖率达82.07%。3.高效的编辑率和遗传率通过高通量测序,软件分析和人工筛选,共获得369个有效T0代基因组编辑数据。结果显示T0代发生有效编辑比例达97.29%,其中,75.61%材料表现出高效的突变率,编辑率超过80%,编辑类型以短片的插入缺失为主。棉花基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。4.低脱靶风险通过高通量测序对9个潜在的脱靶位点进行了检测,结果中没有发现有任何脱靶效应产生,进一步证实CRISPR/Cas9系统在棉花基因组编辑中发生脱靶概率低,具有很高的特异性。5.高效的表型鉴定率在对200个株系的T1和T2代昆虫生物测定中发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状（本研究是针对抗虫性状）构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略。6.抗虫相关候选基因通过抗虫鉴定发现GhMLP423、GhDML1、GhZAT10等基因的突变材料表现出一致的抗性改变表型。本研究所鉴定得到的候选基因在植物抵抗生物和非生物胁迫方面都发挥了十分重要的作用。通过初步验证发现GhMLP423可能参与棉花抗虫相关JA信号路径传导。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了一个同时使用近千个sgRNA针对植物基因组上数百个基因的混合载体文库,并快速生成一个用于表型筛选的高覆盖度的突变库,并鉴定到一些抗虫相关候选基因。该技术为棉花功能基因组学研究提供了坚实的基础。本研究方法也适用于其他基因组复杂的多倍体植物,对其他作物研究具有一定的参考价值。
斯欢[2]（2021）在《全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础》文中进行了进一步梳理植物能够合成大量结构与功能各异的代谢产物,其中一些代谢产物与作物品质以及抗性的形成有着密切的关联。解析这些代谢产物的遗传及生化基础对于解析复杂数量性状形成的调控机制有重要的意义。本研究利用代谢组及全基因组关联分析方法对棉花代谢谱以及代谢产物自然变异的遗传基础进行了研究,结果如下:1、棉花非靶向代谢组学方法的建立为了稳定、高通量地对棉花代谢产物进行分析,本研究基于UPLC-QTOF-MS平台建立了棉花半极性代谢物液相分离和质谱检测的方法,随后结合计算机模拟、手动搜索以及标准品验证等方式对棉花中所检测到的代谢产物进行鉴定,最终注释和鉴定了125个代谢产物,并利用标准品验证了其中的10种。2、昆虫口腔分泌物诱导下的棉花代谢谱研究为了验证上述所建立的方法的有效性,本研究对棉铃虫和斜纹夜蛾口腔分泌物以及机械损伤处理下的棉花叶片的代谢谱进行分析,结果显示,昆虫口腔分泌物处理能够显着地引起棉花代谢谱的变化,而不同的昆虫口腔分泌物所引起的代谢物的差异积累趋势并不相同。棉花受到机械损伤后能够引起棉酚含量的显着积累,而这种积累模式却能够被昆虫口腔分泌物处理显着地抑制,本研究对棉酚合成路径上基因的表达量分析也证明了这种抑制作用的存在。3、棉花种间代谢谱差异及代谢物驯化研究为了探究棉花在驯化和改良过程中代谢谱的变异情况,本研究对25个具有代表性的陆地棉栽培种、6个陆地棉地理种系以及部分野生材料的代谢谱进行了比较,聚类分析和主成分分析都表明栽培种与野生种之间在代谢水平上存在显着的差异。驯化分析表明,在检测到的1775个代谢特征物中,595个代谢物在栽培种与地理种系间存在潜在的选择信号,其中包括了类黄酮路径和谷胱甘肽代谢路径上的代谢产物。4、基于代谢产物的全基因组关联分析为了研究陆地棉代谢产物的遗传基础,本研究将一个包含267份陆地棉栽培种的自然群体种植于不同环境进行取样和代谢组学分析,并在3个不同环境中分别检测到了996（2016年武汉）,828（2016年鄂州）和776个（2017年鄂州）几乎无冗余的代谢信号。随后利用大约270万个高质量的SNP基于代谢性状在混合线性模型下进行全基因组关联分析。最终在不同环境下分别检测到了1877（2016年武汉）,1419（2016年鄂州）和898（2017年鄂州）个m QTL。进一步结合候选基因表达量分析以及同源基因比对,最终得到了14个可能影响代谢物积累的候选基因。5、腺体形成基因编码区的转座子插入影响多种代谢产物的积累为了研究m QTL在染色体分布的均一性,本研究对其分布区域进行了热点区域分析。其中一个位于A12染色体上的区域与包含棉酚在内的多种代谢产物的含量呈现显着的关联。对该热点的进一步分析发现,候选区域内存在一个腺体形成相关基因Ghir＿A12G025340,沉默该基因的表达后棉花植株中超过20%的代谢产物发生差异积累,其中棉酚的含量下调80%以上。超表达该基因能够显着提升棉酚含量,而次生代谢产物的高量积累也同时影响愈伤组织的进一步分化。对极端材料中该基因的序列进行比较发现,低棉酚品种中该基因编码区含的一个～5kb的转座子插入可能是影响腺体发育进而影响代谢物积累的关键。6、多组学结合促进候选基因鉴定为了更加高效地鉴定代谢性状相关的候选基因,本研究利用40份棉花材料的表达谱数据进行e QTL分析以及代谢物与基因表达量的相关性分析,结合关联分析结果构建了“SNP-基因表达量-代谢物含量”的网络,并挑选了其中的两个基因进行了功能验证。其中Ghir＿D13G004710被鉴定为一个编码酰基转移酶的基因,其基因表达量与目标代谢物含量呈显着正相关,且e QTL区间与目标代谢物m QTL区间重叠,沉默该基因的表达可以显着抑制部分丙二酰基化类黄酮的含量。类似地,本研究中利用同样的方法鉴定和验证了Ghir＿A12G019280在调控棉花中山奈酚及其衍生物含量上的功能。7、糖基转移酶影响ABA-GE的合成并参与调控棉花抗旱通过全基因组关联分析,我们在D02染色体上鉴定到一个与ABA-GE含量显着相关的m QTL,进一步分析发现,该区间内存在一个糖基转移酶基基因Ghir＿D02G002230。表达模式分析显示,该基因受干旱诱导下调表达且在耐旱材料中的表达量显着低于敏旱材料。体外表达分析实验证明重组Ghir＿D02G002230蛋白具有糖基化ABA的活性。在棉花体内沉默该基因的表达后,ABA-GE的含量显着下调。抗旱性实验证明沉默该基因的表达能够有效增强棉花对干旱的抗性。8、抗虫相关代谢产物的筛选为了获得与棉花抗虫性相关的代谢产物及其候选基因,本研究结合田间抗虫表型数据和代谢物含量,通过共表达网络分析以及性状与模块的相关性分析鉴定到了一个与植物抗虫性呈显着正相关的代谢物模块,并从该模块中筛选到了一个关键的代谢产物,并将其候选基因定位于A06染色体。
王海燕,龚志云,蒋甲福,周宝良,娄群峰,曹清河,席梦利,陈佩度,顾铭洪,张天真,陈发棣,陈劲枫,李宗芸,王秀娥[3]（2021）在《江苏省植物细胞遗传学研究回顾与展望》文中指出20世纪初"遗传的染色体学说"的提出和证明标志着细胞遗传学交叉学科建立,伴随相关学科的发展,20世纪60年代末期细胞遗传学又与分子遗传学相结合,建立发展了分子细胞遗传学交叉学科。分子细胞遗传学以DNA分子原位杂交技术为核心,不断拓展应用领域,为生命科学研究提供了直观、高效的技术手段。原位杂交技术与基因组、细胞生物学等技术结合,被广泛应用于人类、动物、植物的起源、进化、驯化等基础研究和远缘杂交、染色体工程等应用研究。通过形象地展示DNA、RNA、蛋白质在细胞中的实际位置,揭示DNA序列之间的实际位置和顺序、亲缘物种间的进化关系和结构重排、基因组拼接序列的质量、转录水平RNA和翻译水平蛋白质的位置和数量变化等。江苏省遗传学会会员单位南京农业大学、扬州大学、南京林业大学、江苏师范大学、徐淮地区农科院等自20世纪中期开展细胞遗传学理论技术研究,伴随学科发展不断创新,建立了较完善的分子细胞遗传技术体系,并成功应用于开展植物系统进化、远缘杂交、染色体工程、基因组学等研究,取得了一批研究成果。本文将主要综述江苏省在该领域取得的重要进展,并展望未来发展方向。
刘慧[4]（2020）在《“成花素-抗成花素”调控棉花开花转变和株型发育的功能研究》文中提出植物成花素蛋白FLOWERING LOCUS T（FT）促进开花,调控植株顶端分生组织的有限生长;抗成花素蛋白CENTRORADIALIS/TERMINAL FLOWER1/SELF-PRUNING（CETS）抑制植物开花,调控植株无限生长。二者在植物的顶端分生组织中,竞争与b ZIP转录因子FD蛋白的相互作用,分别形成“成花素激活复合物（florigen activation complex,FAC）”和“抗成花素复合物”,协同调控植物的营养生长和生殖生长,最终决定植物的开花时间和株型结构。在一些作物中,“成花素-抗成花素”系统相关基因的突变或表达量变化,导致作物花期、生育期和株型的改变,为作物的理想株型育种提供了重要的遗传资源,同时也为作物栽培模式的改良和机械化生产做出了重要贡献。棉花作为重要经济作物,株型和生育期是影响棉花种植密度、栽培模式和机械采摘的重要因素。对棉花“成花素-抗成花素”系统进行定向改良,能够塑造棉花的理想株型,调节棉花生育期进程,进而达到提高棉花产量和机械生产效率的目的。本研究旨在通过对棉花成花素GhFT、成花素受体Gh14-3-3、b ZIP转录因子GhFD蛋白以及抗成花素GhCETS蛋白功能的逐个研究,揭示棉花“成花素-抗成花素”系统调控棉花开花转变和株型发育潜在的分子机理,为棉花株型定向改良提供理论依据和基因元件。此外,本研究进一步探索了“成花素-抗成花素”系统相关基因对植物根系发育和氮肥利用效率的影响,旨在为基因新功能的挖掘和利用提供参考依据。本研究主要内容与研究结果如下:1.棉花FAC功能研究棉花基因组中仅存在1个GhFT基因,能够促进开花。通过酵母文库筛选鉴定了一个与GhFT互作的成花素受体Gh14-3-3,二者在植物细胞的细胞质和细胞核中均存在互作。在棉花中共存在5个b ZIP转录因子GhFD,在进化中分为2个亚类,GhFD1/2与模式植物拟南芥FD同源基因具有较高的相似性,GhFD3/4/5为锦葵属植物所特有。GhFT、Gh14-3-3和5个GhFD蛋白均能够在细胞核中互作,形成三复合体。根据GhFD的不同,分别参与调控棉花的开花时间和根系发育。一方面,在地上部分茎尖分生组织中GhFT–Gh14-3-3–GhFD1/2复合体能够激活棉花花身份同源基因APETALA1表达,从而促进棉花开花转变;另一方面在根中GhFT–Gh14-3-3–GhFD3/4/5复合体激活植物侧根发育关键基因AUXIN RESPONSE FACTOR 19的表达,进而促进棉花侧根发育。GhFT–Gh14-3-3–GhFDs复合物调控模块的解析,从分子水平上揭示了棉花开花转变的内在机理以及FAC复合体功能的多样性。2.棉花抗成花素相关基因的功能研究全基因组分析发现在棉花基因组中存在3个抗成花素同源基因,分别命名为Gh SP、Gh TFL1-1和Gh TFL1-2,三者在棉花的根、茎以及花器官相关组织中表达量较高,其他组织中几乎不表达。三者异源过表达均能够促进拟南芥的营养生长,抑制开花转变;基因沉默后都能促进棉花开花。除了促进早花,Gh SP基因沉默终止茎秆的无限生长,导致棉花主茎自封顶。在四倍体棉花中,GoSP等位基因的自然变异,会导致果枝缩短,在海岛棉中Gbsp113Ser突变类型产生零式果枝,在陆地棉中Ghsp73Asn突变产生丛生铃,但是植株顶端仍然保持无限生长状态。Gh SP、Gh TFL1-1和Gh TFL1-2均能与GhFD1、Gh14-3-3在植物细胞体内互作,但是Ghsp73Asn和Gbsp113Ser突变蛋白不与GhFD1互作。3.抗成花素蛋白调控植物根系发育,增加氮肥利用的研究。在拟南芥中,高氮能够诱导抗成花素基因TFL1基因上调表达,同时增加TFL1蛋白的积累和蛋白稳定性。相比于野生型,tfl1突变体对低氮更加敏感,会产生更长的主根和侧根。TFL1过量表达能够同时增加植株地上和地下部分的生物量,增加根系的硝酸盐吸收速率和硝酸还原酶的活性,但是严重推迟植物开花。通过在根中特异性表达TFL1基因,在不影响植株开花时间的同时,能够维持植物在低肥条件下的生物量和籽粒产量。综上所述,棉花中虽然只有1个成花素蛋白,但5个FD蛋白功能的不同,能够实现棉花FAC功能的多样性。棉花中存在3个CETS基因,能够分工调控棉花的开花时间,无限生长以及果枝发育,说明“成花素-抗成花素”系统分子模块能够精密调控棉花多方面的生长发育。此外,在模式植物拟南芥中,抗成花基因AtTFL1还能够增加氮肥利用效率,增加植物生物量,这也为棉花“少投入、多产出”新品种的培育,提供了借鉴和新基因资源。
李鑫[5]（2020）在《陆地棉花青素合成调控基因的定位克隆和功能分析》文中提出花青素是一种重要的植物色素,在植物的花,果实和叶片中广泛分布。花和果实中的花青素起到吸引昆虫授粉和种子传播的功能,而叶片部位积累的花青素会受到阳光和其他胁迫诱导,其生物学功能为保护植物免受紫外线伤害,抵御病虫侵害。陆地棉红色植株R1是因为花青素的积累而导致的叶片颜色改变,并具有抗虫性的优点。另一陆地棉品系亚红株Rs的叶片颜色较红色植株R1稍浅,有较高光合作用效率的特点。由于花青素在陆地棉中的重要功能,对其进行遗传学研究对于改良棉花品质具有重要的理论指导和应用价值。陆地棉品种T586含有红色植株性状,和渝棉一号之间的遗传背景相差较大,前期研究利用SSR分子标记和重组自交系构建了陆地棉的高密度遗传图谱,对于陆地棉的育种研究及基因定位具有重要的价值。但是两种材料之间的SSR标记数量已接近饱和,并且SSR标记的分布密度较低。随着陆地棉的基因组的公布,基因组重测序技术使得陆地棉开发SNP标记和In Del标记也变得较为容易,便于我们对陆地棉的质量性状进行图位克隆和精细定位。本论文通过对陆地棉材料T586和渝棉一号进行基因组重测序,获得了材料间的SNP及In Del位点信息。利用重组自交系群体,通过开发SNP标记成功将红色植株R1基因定位为Gh PAP1D基因,遗传转化实验证实Gh PAP1D在棉花中具有促进花青素合成和积累的功能,并通过转录组和双荧光素酶报告系统对Gh PAP1D在棉花中的花青素调控机制进行了探究。论文还对亚红株突变体的花青素调控基因也进行了基因功能研究,转录组测序分析发现Gh PAP1A的表达差异与亚红株性状相关,序列分析发现亚红株的Gh PAP1A基因启动子区含有50bp的串联重复,GUS染色发现Gh PAP1A的启动子区的50bp串联重复差异是该基因在亚红株中上调表达的原因,并通过烟草遗传转化和VIGS验证了Gh PAP1A基因具有调控花青素合成的功能。主要结果如下:1.通过基因组重测序技术获得陆地棉材料T586和渝棉一号间的SNP和In Del差异信息对陆地棉材料T586和渝棉一号进行了全基因组重测序,分别获得了31.42Gbp和29.55Gbp的Clean data数据,平均测序深度约为10×。对测序数据进行质控发现测序碱基的质量较高（Q20>=96.21%）,且GC含量在36.53%～37.07%之间,表明通过测序获得的数据量和测序质量都合格,并且GC含量分布正常。通过比对陆地棉参考基因组TM-1发现,两个样本的比对率在98.89%～99.53%之间,平均覆盖深度在10.65×～13.19×之间,比对结果正常可以用于后续的SNP和In Del变异检测。SNP检测结果发现,相对于参考基因组TM-1,T586样品和渝棉一号分别检测到2,288,133和1,890,741个SNP位点。其中大部分SNP位点分布在基因间区（2,014,437和1,678,640个）,其次位于内含子区（分别有117,309和88,167个）。同时对T586和渝棉一号进行材料间的SNP检测发现,共检测到2,131,593个SNP位点差异,也是主要分布于基因间区。分析SNP突变频率发现,其中转换突变大于颠换突变（ts/tv=2.2）,总体来说两材料间获得的SNP数量较多,有利于开发相应的分子标记。对In Del位点进行检测发现,相对于参考基因组T586和渝棉一号分别获得了191,876和130,718个In Del位点,主要也是分布在基因间区（151,087和104,163个）,其次分布于内含子区（15,357和10,101个）。统计两样品间的In Del位点发现,材料间共含有184,801个In Del位点,且分布位置也主要位于基因间区。对编码区的In Del长度进行统计,发现In Del的数量随着其长度的增加而逐渐减少,并且其中3倍长度的In Del数量要高于其两侧。2.对棉花红色植株R1基因进行遗传定位、序列分析和功能验证利用重测序获得的SNP数据,在R1基因定位区间内开发SNP标记,共筛选到8个在亲本间具有较好多态性的SNP标记。使用新开发标记对RIL群体进行基因分型,将R1基因定位于新开发标记S5和S6之间,两标记的物理距离约232Kb,区间内包含有3个注释基因。转录组和q RT-PCR分析发现三个基因中只有Gh PAP1D（Gohir.D07G082100）的表达水平有差异。比对克隆发现两种材料中Gh PAP1D启动子区含有一段228bp的串联重复差异,因此遗传定位结果表明Gh PAP1D与红色植株R1性状相关。烟草和棉花遗传转化实验发现,超量表达Gh PAP1D基因的棉花和烟草材料的花青素含量显着上升,并且叶片颜色呈现红色,表明Gh PAP1D基因具有调控花青素的合成和积累的功能;另外通过VIGS方法下调Gh PAP1D在棉花红色植株的表达,发现红色植株的叶片颜色变为绿色,花青素含量也相应下降,进一步证实了在棉花叶片中Gh PAP1D起到了调节花青素合成的作用。为明确Gh PAP1D在棉花叶片中是怎样调控花青素的合成的,对超量表达Gh PAP1D的转基因棉花和其Null系的叶片及群体中的红色植株和绿色植株进行了转录组测序。超量表达植株中共发现567个差异表达基因,其中上调基因有305个,下调基因262个。差异基因中有38个和花青素合成相关的基因上调,没有发现下调表达的花青素合成相关基因。其中花青素合成途径的后期结构基因如DFR（Gohir.D06G004300）,2个UFGT基因（Gohir.A02G139800,Gohir.D03G050200）和2个GST基因（Gohir.A07G074300,Gohir.D07G079000）在群体中的红色植株中也显着上调,说明Gh PAP1D通过调控花青素合成途径的结构基因的表达来行使促进花青素合成的功能。并通过双荧光素酶报告检测实验验证了Gh PAP1D可以与下游结构基因Gh UFGT（Gohir.A02G139800）和Gh GST（Gohir.A07G074300）的启动子结合,并且起到转录激活的作用。另外对超量表达Gh PAP1D的红色棉花叶片的抗虫性进行了检测。叶片对棉铃虫的抗虫性检测结果发现超量表达Gh PAP1D不仅会影响棉铃虫的取食偏好,而且会抑制棉铃虫的生长。叶片对朱砂叶螨的抗虫性检测发现,超量表达Gh PAP1D的红色叶片对朱砂叶螨的生长和繁殖都具有抑制作用。因此超量表达Gh PAP1D增强了棉花叶片对两种害虫的抗虫性,说明Gh PAP1D是一种可利用的广谱抗虫基因位点。3.亚红株中花青素调控基因Gh PAP1A的表达水平分析,序列分析及功能验证表型观察发现亚红株突变体具有和红色植株相似的红色叶片表型,并且颜色浅于红色植株R1,花青素含量测定发现亚红株中的颜色改变与花青素含量相关。对亚红株进行转录组测序,分析其中花青素合成途径相关基因的表达情况,发现5个花青素合成相关的结构基因的表达水平相对绿色植株上升,但是没有红色植株R1上升幅度大。另外检测花青素合成途径的调控基因Gh PAP1的表达情况发现,亚红株中Gh PAP1A基因的表达水平显着上升,而Gh PAP1D基因表达并无变化,因此表明Gh PAP1A与亚红表型相关。对比克隆亚红株和绿色植株Gh PAP1A的启动子和基因组序列发现,两个材料的Gh PAP1A基因组序列之间具有105个SNP和16个In Del差异,其中第三个外显子区具有3个错义突变（T133I,Y180C and C230S）,另外在基因启动子区上游217bp处发现一段50bp的串联重复差异。进一步比对亚洲棉材料相应的Ga PAP1序列发现,亚红株中的Gh PAP1A编码区和内含子区序列与亚洲棉的序列完全一致,启动子区只有50bp串联重复序列的差异,序列的高度相似性表明亚红株中的Gh PAP1A基因是最近由亚洲棉渗入而来。GUS染色发现亚红株的Gh PAP1A启动子活性高于亚洲棉,说明启动子区50bp的串联重复差异引起了亚红株Gh PAP1A基因表达的上调。为了检测亚红株和绿色植株中的Gh PAP1A基因的3个错义突变是否影响基因功能,在烟草中通过遗传转化超量表达这两种来源的Gh PAP1A基因。表型观察发现,两种转基因烟草的表型一致,叶片颜色都呈现红色且花青素含量都相比于野生型烟草显着上升,而两种转化子之间的花青素含量没有差异。因此说明亚红株和绿色植株中的Gh PAP1A基因编码区的差异不影响其调控花青素合成的基因功能,同时也说明亚红株表型是由于Gh PAP1A的表达上调导致的。同时通过VIGS方法在亚红株材料中下调Gh PAP1A的表达,红色叶片转变为绿色并且花青素含量也显着下降,进一步证实了Gh PAP1A基因在亚红株叶片中起到调控花青素合成的功能。
张立华[6]（2020）在《转石竹烯合酶基因GhTPS1棉花对棉花害虫与寄生蜂行为学影响研究》文中指出自1997年Bt抗虫棉商业化以来,棉田主要害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）危害得到非常有效的控制,随之而来的次要害虫如盲蝽蟓、蚜虫的危害日益严重,研究新型、广谱的抗虫策略可以为抗虫棉研发提供创新思路。植物受害虫诱导合成多种次级代谢物以提高植物对于害虫的抵抗能力,包括释放一些挥发性的次级代谢物质（Herbivore-induced plant volatiles,HIPVs）。这些挥发性次级代谢物质被认为在植物的直接和间接防御中发挥重要作用,包括萜类、挥发性吲哚、脂肪酸衍生物、绿叶挥发物和含氮化合物。研究表明,（E）-β-石竹烯作为一种挥发性蓓半萜烯可以通过间接防御机制提高玉米和水稻植株抵御害虫能力,比如吸引害虫的寄生性天敌。但是（E）-β-石竹烯在棉花植株的害虫防御方面的具体功能和应用价值还需要更多研究证据。本研究在已有的工作基础上将棉花中负责（E）-β-石竹烯合成的石竹烯合酶基因GhTPS1转化棉花受体植株R15,展开一系列关于转GhTPS1基因棉花植株对棉花害虫与天敌寄生蜂的行为学影响研究,以期明确该基因在棉花害虫防御中的功能并丰富已有的棉花抗虫策略。主要取得以下进展:（1）通过棉花遗传转化和筛选,共得到4个转GhTPS1基因株系L18、L46、L48和L88。L18和L46转基因株系中GhTPS1基因的表达水平比R15植株升高3-5倍。（2）在实验室条件下,与R15植株释放的石竹烯产量(52–100 ng·plant-1·6 h-1)相比,L18和L46转基因株系可以释放出较高水平的（E）-β-石竹烯(358–363 ng·plant-1·6h-1)。同时,田间种植的L18和L46转基因株系释放的（E）-β-石竹烯也显着高于R15植株。（3）室内行为学研究结果表明,相较于对照植株R15而言,L18和L46转基因株系不仅可以降低棉铃虫的产卵率,还可以排斥棉蚜（Aphis gossypii）和绿盲蝽（Apolygus lucorum）。相应的,田间调查结果也表明,L18和L46转基因株系可以在一定程度上降低棉铃虫产卵率,并对绿盲蝽具有排斥作用。此外,田间调查发现L18和L46转基因株系还可以排斥中黑盲蝽。（4）在室内条件下对于上述害虫的寄生蜂天敌的行为学研究表明,L18和L46转基因株系可以显着吸引红颈常室茧蜂（Peristenus spretus）和烟蚜茧蜂（Aphidius gifuensis）,这二者分别是绿盲蝽和棉蚜的天敌;但是L18和L46转基因株系对于棉铃虫的天敌中红侧沟茧蜂（Microplitis mediator）则没有较为明显的行为学影响。综上所述,将GhTPS1转入棉花受体材料R15中,可以显着提高棉花植株的挥发性物质（E）-β-石竹烯的释放量,进而影响上述棉花害虫及部分天敌的选择行为,提高转GhTPS1基因棉花植株对于棉花害虫的抗性。本研究丰富了植物挥发物介导棉花-害虫-寄生蜂这种三级营养层之间相互关系网络,也为植物挥发性物质在棉花的害虫综合防御策略（Integrated pest management,IPM）中的应用提供了有利实验证据。总之,L18和L46转基因株系可以作为新型的转基因抗虫棉花种质资源被用于后续的抗虫棉育种工作。
陈劲[7]（2020）在《棉花花药发育时期基因表达特征及其高温逆境响应分析》文中认为棉花（Gossypium hirsutum L.）是世界上最重要的经济作物之一,其纤维是世界纺织工业最主要天然来源。棉花最适生长温度范围为20～30℃,当昼/夜温度持续超过30℃/20℃达13h,其生殖生长将受到不可逆的影响,导致花粉育性下降,甚至雄性不育的发生,最终导致传粉受阻进而蕾铃脱落,且高温持续时间越长,蕾铃脱落率越高,最终影响棉花产量的形成。随着人口增长和全球工业化的进程,全球气候变暖已成不可逆转趋势,周期性的高温和干旱等极端天气将会更加频繁发生。因此,深入了解高温对棉花生长发育的影响及其耐性机制,培育耐高温棉花新品种已迫在眉睫。本研究以高温最为敏感的花药为材料,采用高通量深度测序技术对耐高温与高温敏感棉花品系各发育时期花药进行转录组及smallRNA测序,探讨不同耐性棉花在花粉发育过程中高温胁迫响应的差异,解析耐高温品系花粉对高温胁迫的分子适应机理,挖掘耐高温相关基因,为改良棉花高温耐性提供理论基础和基因资源。1、深入分析了棉花花药发育过程中基因表达谱特征植物花药发育是由大量基因精确控制的复杂过程,但参与这一调控过程的基因及其调控机制目前仍不清楚。虽然已有一些关于mRNAs或miRNAs参与棉花花药发育的报道,但尚未见将两者结合起来进行关联分析的研究。通过对处在孢母细胞增殖期（SCP）、减数分裂期（MP）、小孢子释放期（MRP）和花粉成熟期（PM）四个连续发育阶段的棉花花药分别进行转录组及smallRNA测序,并进行了关联分析。结果表明,随着花药发育的进程,越来越多的基因参与到花药发育调控过程中,且不同发育阶段参与花药发育调控基因功能上存在显着差异。Cell cycle,Progesterone-mediated oocyte maturation和Meiosis等信号通路基因主要在花药发育的早期（SCP和MP）表达,而Energy metabolism,Flavonoid biosynthesis,Axon guidance和Phospholipase D signaling pathways相关基因主要在花药发育后期（MRP和PM）表达。表达模式分析表明,差异表达基因数量在MP时期达到最大值,且在MP时期拥有最高的表达量。此外,差异表达miRNAs靶基因预测及分析表明,miRNAs在花药发育调控中同样扮演着重要角色。ghr-miR393、dt＿chr12＿6065和at＿chr9＿3080分别通过靶基因参与到细胞周期、碳水化合物代谢及生长素合成代谢通路调控中,实现对花药发育的调控。通过对棉花花药mRNA和miRNA的关联分析,更好地了解了棉花花药不同发育阶段的基因表达及调控特征,明确了减数分裂期对花药发育的重要性及miRNAs参与花药发育的调控机制,这对于阐明植物花药发育对内外环境的响应机制具有重要意义。2、发现不同的miRNAs参与花药发育过程中高温逆境响应分别对正常对照和高温胁迫（分别为NT和HT）条件下四个连续发育时期棉花花药进行smallRNA测序,以明确棉花花药miRNAs高温逆境响应特征。我们共鉴定出77个miRNAs,其中包括33个已知miRNAs和44个新预测miRNAs。在所有的77个miRNAs中,分别有41个和28个miRNAs在NT和HT条件下差异表达。在剔除NT条件下因不同材料基因型差异导致差异表达的miRNAs后,分别从SCP、MP、MRP和PM四个花药发育时期鉴定出10个（含12个miRNAs）、4个（含6个miRNAs）、4个（含5个miRNAs）和7个（含11个miRNAs）HT胁迫响应miRNA家族。在所有鉴定出的miRNA家族中,总共有7个miRNA家族（SCP时期的miR2949、miR167和miR160,MP时期的miR156和miR172,MRP时期的miR156,PM期的miR393和miR3476）其成员表达丰度之和超过总表达丰度的10%,被认为是各发育时期主要高温逆境响应miRNA家族,这些miRNA家族成员通过调控其相应靶基因的表达,最终导致耐高温与高温敏感品系在高温逆境条件下的花药发育表现出明显的差异。3、分析了高温胁迫对棉花花药转录组和脂肪酸含量的影响对高温胁迫下耐高温与高温敏感棉花品系花药各发育时期进行转录组测序,分析了高温胁迫对花药发育过程中基因表达的影响。KEGG富集结果显示,花药发育前期有四个共有信号通路,分别是糖胺聚糖降解、蛋白质加工、生物膜形成和脂肪酸生物合成;不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢和类黄酮生物合成通路为花药发育后期共有信号通路。将各时期主要高温逆境响应miRNA家族于相同分组的差异表达基因中进行靶基因预测并进行功能富集分析,结果显示,miRNAs主要参与高温逆境下棉花花药糖代谢（淀粉和蔗糖代谢、碳水化合物代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化）和脂肪酸代谢（脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢、ABC运输载体）调控。进一步进行了脂肪酸靶向代谢组检测,发现耐高温品系花药中除Docosadienoic acid、Dodecanoic acid、Eicosadienoic acid和Pentadecenoic acid的含量极显着高于敏感花药外,Arachidic acid、Linoleic acid、Linolenic acid、Oleic acid及γ-Linoenic acid等大量不饱和脂肪酸含量则低于敏感品系花药,特别是在MRP时期表现为极显着低于敏感品系花药。4、鉴定到响应高温胁迫的重要候选基因并进行了其初步功能验证根据上述研究,鉴定出Gh＿D10G2577（Acx）、Gh＿A06G0328（DPBF3）、Gh＿D10G2551（WRI1）和Gh＿A08G1739（FATA）为参与花药高温逆境响应的重要候选基因。分别构建四个基因的植物过表达载体并转化拟南芥,对得到的转基因拟南芥纯合子进行高温胁迫处理发现,过表达Gh＿D10G2577基因拟南芥植株表现出稳定的高温敏感特征,转基因植株全部死亡,而其余三个基因均只有部分转基因株系表现出高温敏感特征,另一部分株系高温逆境表型则相似于对照组。siRNA分析发现,高温逆境下花药发育后期耐高温与高温敏感品系花药Gh＿D10G2577基因编码区附近表现出明显的siRNA差异表达。对Gh＿D10G2577基因启动子区域Cp G岛甲基化进行了检测,发现耐高温品系CHG位点甲基化频率显着高于高温敏感品系。因此,高温逆境下siRNA介导的表观调控可能影响着Gh＿D10G2577基因在花药发育后期的表达,该基因在耐高温与高温敏感品系花药中的表达差异可能是造成耐性不同的重要原因。
梁思佳[8]（2020）在《利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质》文中认为棉花害虫种类繁多,而且在整个生育时期均易遭受各种害虫危害。Bt抗虫棉的广泛种植有效的控制了棉铃虫的爆发,但由于杀虫剂使用量的大幅度减少,导致Bt非靶标害虫盲蝽象为害日益加重,并由次要害虫上升为主要害虫。盲蝽寄住范围广、飞行扩散能力强、爆发频率高,给盲蝽的防治带来了巨大的困难。目前喷洒化学杀虫剂是防治盲蝽的主要方法,但化学杀虫剂不但容易诱发盲蝽抗性的产生,而且给人类健康和环境安全带来威胁。因此迫切需要高效安全的盲蝽防治新策略。近年来,植物介导的RNAi技术由于其高效、特异,对环境无污染等特性被广泛应用于害虫的防治研究。本研究利用植物介导的RNAi技术创造了棉花抗盲蝽新种质,为盲蝽的防治提供了新的策略。主要研究内容如下:1.棉花抗中黑盲蝽新种质的创造本研究利用植物介导的RNAi技术,以影响中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis）生殖能力的As FAR基因为靶标,创造了能够高量表达As FAR基因ds RNA的转基因棉花。当中黑盲蝽取食该转基因棉花后,可以成功诱发其体内的RNAi效应,导致其内源As FAR基因的表达水平显着下降。田间抗虫鉴定结果显示,As FAR转基因棉花受中黑盲蝽危害较轻,平均每株棉花仅捕获中黑盲蝽12-14头。然而对照组棉花受中黑盲蝽危害非常严重,平均每株棉花捕获中黑盲蝽数量大于20头。以上结果表明As FAR转基因棉花可以成功抑制中黑盲蝽的生殖能力,导致其种群数量显着下降,有效减少中黑盲蝽的危害。非靶标害虫的抗性鉴定结果显示As FAR转基因棉花只对中黑盲蝽有抗性效果,对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的体重以及蚜虫（Aphis gossypii）的种群数量均无不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,As FAR转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不利影响。以上结果表明,As FAR转基因棉花对中黑盲蝽有较高的抗性,对非靶标害虫无不良影响,农艺性状良好且稳定,可以作为防治中黑盲蝽的理想种质资源。该研究为中黑盲蝽的防治提供了新的可替换策略策略。2.棉花抗绿盲蝽新种质的创造本研究选择绿盲蝽（Apolygus lucorum）Al LIM基因作为靶标基因,序列分析表明Al LIM基因具有高度特异性。随后将该基因转入棉花,成功创造了能够高量表达绿盲蝽Al LIM基因ds RNA的转基因棉花材料。室内饲喂结果显示,取食Al LIM转基因棉花后,绿盲蝽内源Al LIM基因的相对表达水平显着下降。在幼虫向成虫转化过程中蜕皮发生严重缺陷,最终因蜕皮失败,变态发育被阻断而死亡,死亡率高达33%-41%。此外有少量绿盲蝽可以羽化为成虫,但其翅膀、后腿出现畸形。对分别注射ds RNA-Al LIM（ds Al LIM）和ds RNA-GFP（ds GFP）的绿盲蝽样品进行转录组测序。数据分析结果显示,总共鉴定到4923个差异表达基因,其中有2484个基因在ds Al LIM处理后上调表达,2439个基因在ds Al LIM处理后下调表达。差异基因KEGG通路分析结果显示,与肌肉生长发育相关的信号通路被显着富集。根据KEGG通路分析结果鉴定到一些参与肌肉生长发育且在ds Al LIM处理后发生显着变化的差异基因。以上结果表明,Al LIM基因在绿盲蝽肌肉发育过程中发挥重要作用。肌肉结构和功能的完整性是昆虫变态发育的关键,因此推测绿盲蝽Al LIM基因的缺失会导致绿盲蝽羽化过程中蜕皮所需肌肉发育缺陷,最终导致蜕皮失败,羽化被阻断,死亡率增加。田间抗虫鉴定结果显示,转基因棉花受绿盲蝽危害较轻,每株转基因棉花平均捕获绿盲蝽8.1-10.1头。然而野生型对照组棉花受绿盲蝽危害却非常严重,每株平均捕获绿盲蝽高达21.5-24.1头。取食转基因棉花导致绿盲蝽死亡率增加,种群数量显着下降。此外,在田间依然观察到少量后腿及翅膀缺陷的绿盲蝽成虫。以上结果表明该转基因棉花对绿盲蝽具有较高的抗性水平。非靶标昆虫的生物测结果显示,Al LIM转基因棉对棉铃和蚜虫的生长发育没有负面影响,对有益昆虫瓢虫（Menochilus sexmaculatus）的生长发育没不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不良影响。以上结果充分表明Al LIM转基因棉花目标抗虫性状效果良好,对非靶标害虫、有益昆虫以及人类安全,农艺性状以及纤维品质良好,可以作为防治绿盲蝽的理想种质资源。
李翰鹏[9]（2020）在《二化螟和褐飞虱为害诱导型水稻启动子的克隆及功能分析》文中进行了进一步梳理植物与植食性昆虫长期协同进化过程中,逐渐形成了多种复杂但极精巧的防御反应,用以抵御昆虫的为害。其中茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号途径和绿叶挥发性物质途径（green leaf volatiles,GLVs）是植物防御反应的核心。丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase,AOS）与脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase,HPL）可以催化相同底物分别生成JA与GLVs,AOS与HPL应对不同昆虫为害表现出很高的特异性,影响JA与GLVs的生成量,进而决定植物防御反应的特异性。但目前,有关AOS与HPL基因对害虫为害应答机制的研究还未见报道。因此,本研究拟克隆水稻AOS及HPL基因的启动子,探究两种启动子对刺吸式口器昆虫褐飞虱与咀嚼式口器昆虫二化螟的应答模式,利用启动子5’端渐次缺失、GUS活性测定、GUS组织化学染色、启动子抗虫活性测定等方法,鉴定AOS及HPL启动子中对褐飞虱与二化螟为害产生应答的功能区域。从启动子结构层面解析AOS及HPL基因对害虫为害的应答机制,揭示水稻对不同口器害虫做出特异防御反应的内在原因。在此基础上,用克隆的启动子功能片段驱动抗虫基因,探索这些启动子在抗虫育种上的应用潜能。本研究取得了以下研究结果:1.OsHPL2受二化螟为害诱导高表达,机械损伤、稻飞虱为害和激素（茉莉酸、水杨酸、脱落酸）处理不能诱导其表达;分离克隆的Os HPL2全长启动子位于Os HPL2翻译起始位点ATG（+1）至上游2009 bp;用全长启动子驱动GUS报告基因并克隆到表达载体DX2181上(PHPL2)转化中花11,用GUS活性定量测定、GUS组织化学染色分析和q RT-PCR检测启动子诱导表达活性,结果表明:PHPL2受二化螟为害后,在叶鞘表达活性升高,但是不受褐飞虱为害、机械损伤诱导表达;为了鉴定PHPL2中的二化螟为害应答元件,将PHPL2从5’端渐次缺失,并转化中花11,缺失突变体的GUS活性分析结果证明:-1452至-1213、-903至-624和-376至-176区域存在二化螟为害诱导正调控元件,其中-903至-624区域活性最高;将这3个正调控区域融合并连接min 35S（P2R123-min 35S）,1个-903至-624拷贝加min 35S（P2R2-min 35S）、2个-903至-624拷贝加min 35S（P2DR2-min 35S）、3个-903至-624拷贝加min 35S（P2TR2-min 35S）,全长启动子（P2）和上述4种启动子分别驱动cry1C表达,并转化中花11,发现P2、P2R123-min 35S和P2TR2-min 35S转基因植株中的Cry1C诱导表达能力最强、二化螟初孵幼虫死亡率最高;农艺性状分析结果显示:P2、P2R123-min 35S和P2TR2-min 35S的种子结实率和单株产量与野生型中花11没有显着差异。2.OsAOS1受褐飞虱为害诱导高表达,机械损伤、二化螟为害和激素（茉莉酸、水杨酸、脱落酸）处理不能诱导其表达;分离克隆的Os AOS1全长启动子位于Os AOS1翻译起始位点ATG（+1）至上游1889 bp;用全长启动子驱动GUS报告基因并克隆到表达载体DX2181上(PAOS1)转化中花11,用GUS活性定量测定、GUS组织化学染色分析和q RT-PCR检测启动子诱导表达活性,结果表明:PAOS1受褐飞虱取为害后,在叶鞘表达活性升高,但是不受二化螟为害、机械损伤诱导表达;为了鉴定PAOS1中的褐飞虱为害应答元件,将PAOS1从5’端渐次缺失,并转化中花11,缺失突变体的GUS活性分析结果证明:-1573至-1312、-979至-647和-426至-181区域存在褐飞虱为害诱导正调控元件,其中-1573至-1312区域活性最高;酵母单杂交、双荧光素酶实验证明-800至-758区域可与LOC＿Os01g1227蛋白结合,-274至-181区域可与LOC＿Os03g62790蛋白结合,因此,LOC＿Os01g1227和LOC＿Os03g62790两个蛋白可能参与褐飞虱为害诱导Os AOS1的表达调控。小结:1.Os HPL2基因启动子具有二化螟为害诱导表达特性,内部含有3个二化螟为害正调控功能区域;当二化螟为害后,Os HPL2全长启动子及其正调控区域驱动cry1C的转基因植株,能够被诱导产生高杀虫活性,并且不影响种子结实率和单株产量。因此,Os HPL2全长启动子及其正调控区域具有潜在的应用前景。2.Os AOS1基因启动子具有褐飞虱为害诱导表达特性含有3个褐飞虱为害诱导正调控功能区域;已鉴定出两个与正调控区域结合的蛋白。Os AOS1基因启动子的3个正调控区域的应用潜能有待进一步验证,正调控区域与蛋白的互作及调控机制有待进一步深入研究。
赵亚楠[10]（2020）在《转GNA、ACA、NhaD、HEWL和CP4-EPSPS基因棉花新材料的创制》文中研究表明棉花是我国重要的经济作物,棉花的生产过程中会受到虫害、病害、除草剂和盐碱化土地等因素的影响。为了获得具有抗虫、抗逆、抗病和耐除草剂的多抗性转基因棉花新品种,本实验选取了雪花莲凝集素基因（Galanthus nivals agglutinin,GNA）、苋菜凝集素基因（Amaranthus caudatus agglutinin,ACA）、抗旱耐盐碱基因Na+/H+逆向转运蛋白（NhaD）、抗病基因鸡蛋清溶菌酶基因（Hen Egg White Lysozyme,HEWL）和耐除草剂基因（CP4-EPSPS）,构建具有多功能的多基因植物表达载体,农杆菌介导法转化棉花,以期获得具有抗蚜虫、抗黄萎病、抗旱耐盐碱以及耐除草剂的多功能转基因棉花新材料。本研究构建了含有GNA、ACA、NhaD、HEWL及CP4-EPSPS 5个外源基因的植物表达载体,其中GNA与ACA通过2A多肽连接,由35S启动子和NOS终止子介导;NhaD、HEWL及CP4-EPSPS也分别由2A多肽连接,由质体蓝素启动子与质体蓝素终止子控制表达。通过农杆菌介导法,将外源基因转入棉花基因组中,获得含有5个外源基因的转基因株系5g-1和5g-4。PCR反应证明外源基因整合到棉花染色体上,通过Genome Walking的方法确定了5g-1和5g-4转基因株系T-DNA的准确插入位点:5g-1中T-DNA正向插入在陆地棉A02（11664124-11664203）处,5g-4中T-DNA反向插入A06（95514261-95514281）处。通过qRT-PCR、Western blot和ELISA等方法,确定外源基因在棉花中进行了表达。对获得的转基因植株进行蚜虫接种实验,表明转基因植株对蚜虫具有一定的抑制作用,抑制率为36%～55.50%,明显优于对照植株。由于市面上购买的凝集素抗体针对转基因植株的特异性不高,本论文利用商品化的雪花莲凝集素和苋菜凝集素蛋白,采用皮下多点注射的方式,免疫10只KM小鼠,通过Western blot和ELISA证实所获得的小鼠抗血清符合检测转基因棉花目标蛋白质的要求。在转基因植株qRT-PCR和Western blot检测过程中,发现质体蓝素启动子介导外源基因在棉花中的表达量优于35S启动子,在考虑提高表达量的时候可以考虑更换为质体蓝素启动子。本研究获得了具有5个外源基因且外源基因都进行表达的转基因棉花新材料,为培育多抗性棉花新品种提供了思路与技术支持。研究发现质体蓝素启动子介导外源基因的表达量优于35S启动子,为外源基因在棉花中进行高表达提供了研究思路和研究基础。
二、Genetic Engineering of Cotton (Gossypium hirsutum L. ) for Insect-resistance（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Genetic Engineering of Cotton (Gossypium hirsutum L. ) for Insect-resistance（论文提纲范文）
（1）CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章:文献综述 |
| 1.1 中国棉花生产概况 |
| 1.2 棉花基因组研究进展 |
| 1.3 棉花功能基因组学研究 |
| 1.4 植物应对草食性昆虫的内源防御系统 |
| 1.5 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.5.1 形态抗虫育种阶段 |
| 1.5.2 生化抗虫育种阶段 |
| 1.5.3 棉花抗虫基因工程育种阶段 |
| 1.5.3.1 Bt毒蛋白的发现以及作用机理 |
| 1.5.3.2 Bt转基因棉花研究进展 |
| 1.6 植物突变体创建方法 |
| 1.6.1 自发变异 |
| 1.6.2 物理诱变 |
| 1.6.3 化学诱变 |
| 1.6.4 分子生物学方法 |
| 1.7 基因编辑技术研究进展 |
| 1.7.1 ZFN基因编辑系统 |
| 1.7.2 TALEN基因编辑系统 |
| 1.7.3 CRISPR基因组编辑系统 |
| 1.7.3.1 CRISPR/Cas9 技术原理 |
| 1.7.3.2 CRISPR/Cas9 脱靶效应研究 |
| 1.8 CRISPR/Cas9 系统在作物育种中的应用 |
| 1.8.1 高产育种研究 |
| 1.8.2 品质育种研究 |
| 1.8.3 抗性育种研究 |
| 1.8.4 不育系研究 |
| 1.9 基因编辑检测方法 |
| 1.10 CRISPR/Cas9 技术的局限性 |
| 1.11 植物变体库研究进展 |
| 1.11.1 理化诱变突变体库 |
| 1.11.2 插入突变体库 |
| 1.11.3 基因编辑突变体库 |
| 1.12 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.12.1 本研究的目的与意义 |
| 1.12.2 本研究的技术路线 |
| 第二章:实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 基因编辑载体 |
| 2.1.3 供试的昆虫材料 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sgRNA及引物设计 |
| 2.2.2 GO靶基因功能富集分析 |
| 2.2.3 混合基因组编辑载体文库构建 |
| 2.2.3.1 载体充分酶切控制空载率 |
| 2.2.3.2 混合载体文库构建 |
| 2.2.4 棉花DNA提取 |
| 2.2.5 棉花遗传转化 |
| 2.2.6 Barcode设计和高通量测序检测分析基因编辑目标序列 |
| 2.2.7 基因组编辑检测 |
| 2.2.8 抗虫鉴定 |
| 2.2.8.1 蚜虫及棉铃虫繁殖培养 |
| 2.2.8.2 武汉温室蚜虫抗性表型筛选 |
| 2.2.8.3 海南温室咀嚼式害虫极端表型筛选 |
| 2.2.8.4 室内棉铃虫抗虫验证 |
| 第三章:结果与分析 |
| 3.1 目的基因sgRNA设计及GO富集分析 |
| 3.2 sgRNAs混合载体文库的构建与评估 |
| 3.3 棉花基因编辑突变体材料的获取 |
| 3.4 基于条形码的高通量测序技术检测T0 植株sgRNA信息 |
| 3.5 利用高通量测序方法检测基因组编辑效率 |
| 3.6 高效的棉花T0 代突变体基因组编辑效率 |
| 3.7 棉花T0 单株的编辑概况 |
| 3.8 棉花基因组编辑在后代中的遗传率 |
| 3.9 棉花基因编辑后代材料抗虫表型鉴定 |
| 3.9.1 温室蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.2 T2 代材料蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.3 海南温室咀嚼时害虫危害表型鉴定 |
| 3.10 GhMLP423 基因虫害表型验证 |
| 3.10.1 超表达和基因编辑材料筛选 |
| 3.10.2 棉铃虫饲喂实验 |
| 3.10.3 棉铃虫取食偏好性验证 |
| 3.10.4 JA-Ile相关检测 |
| 3.11 脱靶分析 |
| 第四章:讨论 |
| 4.1 利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统创建陆地棉突变体库的必要性 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统在棉花基因组中高效的编辑及遗传规律 |
| 4.3 CRISPR/Cas9 在陆地棉基因组编辑系统的高特异性 |
| 4.4 棉花基因编辑工具的优化与展望 |
| 4.5 植物在非生物和生物胁迫的响应中可能涉及复杂而重叠的信号网络 |
| 4.6 CRISPR/Cas9 基因组编辑植物相比于转基因植物在育种上的优越性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 混合载体文库构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 棉花RNA提取(天根试剂盒法) |
| 附录5 RNA反转录 |
| 附录6 Real-time |
| 附录7 棉铃虫饲喂 |
| 附表 |
| 附表1 502 个目的基因ID |
| 附表2 968个sgRNA靶标序列 |
| 附表3 barcoded引物序列 |
| 附表4 潜在脱靶位点检测引物序列 |
| 已发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（2）全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 代谢组学概述 |
| 1.1.1 代谢组学的含义 |
| 1.1.2 代谢组学研究的技术手段 |
| 1.1.3 非靶向代谢组学的数据预处理 |
| 1.1.4 代谢物鉴定策略 |
| 1.2 植物代谢组学研究 |
| 1.2.1 代谢谱分析 |
| 1.2.2 代谢物的驯化分析 |
| 1.2.3 基于代谢性状的全基因组关联分析 |
| 1.2.4 基于代谢组学解析植物复杂性状 |
| 1.2.5 多组学整合促进功能基因组学发展 |
| 1.3 棉花代谢组学的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 棉花材料来源和取样 |
| 2.1.1 棉花材料的来源 |
| 2.1.2 关联群体材料的种植和取样 |
| 2.2 样品准备与提取 |
| 2.2.1 化学试剂及仪器 |
| 2.2.2 昆虫口腔分泌物收集和处理 |
| 2.2.3 棉花DNA提取 |
| 2.2.4 棉花RNA提取与目的基因表达量检测 |
| 2.2.5 棉花半极性代谢物提取 |
| 2.3 UPLC-QTOF-MS条件和参数 |
| 2.4 数据处理和分析 |
| 2.4.1 代谢数据预处理 |
| 2.4.2 代谢物驯化分析 |
| 2.4.3 关联群体基因型检测 |
| 2.4.4 群体特征分析 |
| 2.4.5 全基因组关联分析 |
| 2.4.6 转录组分析 |
| 2.4.7 e QTL分析 |
| 2.4.8 进化树分析 |
| 2.4.9 基因表达分析 |
| 2.4.10 统计分析 |
| 2.5 载体构建与转化 |
| 2.5.1 病毒诱导的基因沉默载体构建及转化 |
| 2.5.2 超表达载体构建及转化 |
| 2.5.3 体外表达载体构建及原核表达 |
| 2.5.4 Western Blot |
| 2.5.5 体外活性检测 |
| 2.6 棉花干旱处理 |
| 2.7 ABA-GE检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 棉花代谢组学研究方法的建立 |
| 3.1.1 棉花代谢组学检测方法 |
| 3.1.2 代谢产物的鉴定和注释 |
| 3.2 棉花代谢谱研究 |
| 3.2.1 模拟昆虫取食下陆地棉代谢谱研究 |
| 3.2.2 不同棉种的代谢谱差异研究 |
| 3.2.3 陆地棉代谢产物的驯化研究 |
| 3.3 棉花代谢产物遗传基础解析 |
| 3.3.1 陆地棉栽培种中代谢产物的自然变异 |
| 3.3.2 自然群体的基因组遗传变异分析 |
| 3.3.3 棉花自然群体的m GWAS分析 |
| 3.4 候选基因的功能验证 |
| 3.4.1 一个代谢热点区域的功能解析 |
| 3.4.2 多组学分析验证候选基因 |
| 3.4.3 糖基转移酶对ABA-GE合成的调控 |
| 3.5 抗虫相关代谢产物的发掘 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多种平台的结合促进代谢物检测和鉴定 |
| 4.2 非靶向代谢组学的挑战和机遇 |
| 4.3 多组学分析促进候选基因鉴定 |
| 4.4 代谢组学促进棉花功能基因组学研究 |
| 5 棉花代谢组学研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 关联群体中棉花材料的信息及数据源 |
| 附录2 用于代谢驯化分析的棉花材料详情 |
| 附录3 RNA-Seq数据来源 |
| 附录4 试剂配制 |
| 附录5 本研究所用部分引物 |
| 附录6 作者简介 |
| 已发表和待发表的论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（3）江苏省植物细胞遗传学研究回顾与展望（论文提纲范文）
| 1 小麦分子细胞遗传学及其应用 |
| 1.1 小麦及近缘物种染色体鉴定技术 |
| 1.2 小麦–远缘新种质创制与利用 |
| 2 水稻分子细胞遗传学及其应用 |
| 2.1 水稻染色体鉴定技术 |
| 2.2 水稻染色体生物学 |
| 2.3 稻属远缘新种质创制 |
| 3 甜瓜属分子细胞遗传学及其应用 |
| 3.1 甜瓜属染色体鉴定技术 |
| 3.2 甜瓜属物种起源与进化 |
| 3.3 甜瓜属物种种质创新 |
| 4 棉花分子细胞遗传学及其应用 |
| 4.1 棉花染色体鉴定技术 |
| 4.2 棉花染色体生物学 |
| 4.3 棉花远缘杂交与新种质创制 |
| 5 菊花分子细胞遗传学及其应用 |
| 5.1 菊属染色体鉴定技术 |
| 5.2 菊属起源与演化 |
| 5.3 菊属远缘杂交与种质创新 |
| 6 杨树分子细胞遗传学及其应用 |
| 6.1 杨树分子细胞遗传学技术 |
| 6.2 杨树性染色体的分子细胞遗传学 |
| 7 甘薯分子细胞遗传学及其应用 |
| 7.1 甘薯染色体鉴定技术 |
| 7.2 甘薯起源与进化 |
| 7.3 甘薯远缘杂交和种质创新 |
| 8 植物分子细胞遗传学研究展望 |
| 说明 |
（4）“成花素-抗成花素”调控棉花开花转变和株型发育的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 引言 |
| 2 研究背景 |
| 2.1 植物开花途径 |
| 2.1.1 光周期途径 |
| 2.1.2 春化途径和温度途径 |
| 2.1.3 自主途径 |
| 2.1.4 赤霉素途径 |
| 2.1.5 年龄途径 |
| 2.2 成花素调控植物开花转变的分子机理 |
| 2.2.1 成花素假说和成花素的本质 |
| 2.2.2 成花素激活复合物 |
| 2.3 抗成花素的功能与分子机理研究进展 |
| 2.3.1 抗成花素蛋白CETS的发现 |
| 2.3.2 植物CETS同源基因的功能 |
| 2.3.3 植物CETS基因调控植物花序结构的分子机理 |
| 2.4 “成花素-抗成花素”系统在作物株型育种上的贡献 |
| 2.5 “成花素-抗成花素”平衡假说 |
| 2.6 植物FD同源基因的功能研究进展 |
| 2.7 氮对植物植物的根系发育的影响 |
| 2.7.1 植物的侧根发育 |
| 2.7.2 氮对根系形态构型的调控 |
| 2.8 氮吸收与代谢的研究进展 |
| 2.8.1 植物根系氮吸收的研究进展 |
| 2.8.2 氮同化的研究进展 |
| 2.9 FT/CETS基因调控棉花株型的研究现状 |
| 2.9.1 棉花株型与早熟 |
| 2.9.2 棉花FT/CETS基因家族的研究进展 |
| 3 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料及来源 |
| 1.2 实验所用菌株 |
| 1.3 实验所用载体 |
| 1.4 常用生物试剂、试剂盒和蛋白抗体 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 棉花FT、FD和 CETS基因的全基因组查找 |
| 2.2 植物RNA的提取和反转录合成cDNA反应 |
| 2.3 qRT-PCR实验 |
| 2.4 目的片段的扩增和回收 |
| 2.5 载体的构建 |
| 2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 |
| 2.7 细菌质粒DNA的提取 |
| 2.8 农杆菌GV3101 感受态细胞的制备与转化 |
| 2.9 棉花TRV-VIGS |
| 2.10 拟南芥的种植,遗传转化及阳性苗的筛选 |
| 2.11 酵母感受态制备及其转化 |
| 2.12 烟草SFLC和 BiFC实验 |
| 2.13 拟南芥原生质体的制备 |
| 2.14 拟南芥原生质体转录激活实验 |
| 2.15 拟南芥总蛋白的提取 |
| 2.16 细菌原核蛋白的表达与纯化 |
| 2.17 GST pull-down实验 |
| 2.18 配制SDS-PAGE凝胶的制备 |
| 2.19 Western-Blot |
| 2.20 Cell-Free System检测蛋白稳定性 |
| 2.21 拟南芥GUS染色 |
| 2.22 拟南芥不同浓度硝酸盐处理 |
| 2.23 拟南芥氮吸收速率测定 |
| 2.24 硝酸还原酶(Nitrate Reductase)活性的测定 |
| 第三章 棉花成花素激活复合物的功能分析 |
| 1 结果与分析 |
| 1.1 Gh14-3-3和GhFT蛋白的相互作用关系 |
| 1.2 GhFDs,GhFT,Gh14-3-3 蛋白三者之间的相互作用关系 |
| 1.2.1 棉花FD基因的查找,进化分析和氨基酸比对 |
| 1.2.2 GhFD的亚细胞定位 |
| 1.2.3 GhFDs与 Gh14-3-3、GhFT在细胞核中互作 |
| 1.3 GhFDs基因的组织表达分析 |
| 1.4 GhFDs基因的功能分析 |
| 1.4.1 GhFDs基因调控开花转变 |
| 1.4.2 GhFDs基因调控棉花侧根发育 |
| 1.4.3 GhFDs基因调控棉花调控棉花MADS和 ARF基因的表达 |
| 2 讨论 |
| 2.1 GhFT、Gh14-3-3和GhFD是棉花FAC的重要组分 |
| 2.2 棉花FD的进化 |
| 2.3 GhFD同源基因表达模式和氨基酸的多样性 |
| 2.4 GhFD的功能多样性丰富了棉花FAC的功能 |
| 3 小结 |
| 第四章 棉花抗成花素基因的功能研究 |
| 1 结果与分析 |
| 1.1 棉花CETS基因的查找、进化分析与氨基酸比对 |
| 1.2 GhCETS基因表达分析与功能分析 |
| 1.2.1 GhCETS基因的时空表达分析 |
| 1.2.2 GhCETS互补tfl1-1 突变体拟南芥表型、促进营养生长 |
| 1.2.3 GhCETS过量表达导致拟南芥花序结构异常 |
| 1.2.4 干扰GhCETS基因表达促进棉花早花和降低株高 |
| 1.3 棉花CETS与 Gh14-3-3、GhFD的互作关系 |
| 1.3.1 GhCETS-GFP融合蛋白的亚细胞定位 |
| 1.3.2 GhCETS与 GhFD1、14-3-3-3 蛋白均存在互作 |
| 1.4 GoSP调控棉花零式果枝和丛生铃的功能研究 |
| 1.4.1 GoSP是控制棉花零式果枝和丛生铃的关键基因 |
| 1.4.2 Ghsp~(73Asn)和Gbsp~(113Ser)不能互补tfl1-1 突变体拟南芥的表型 |
| 1.4.3 Ghsp~(73Asn)和Gbsp~(113Ser)不改变蛋白的亚细胞定位 |
| 1.4.4 Ghsp~(73Asn)和Gbsp~(113Ser)突变影响与GhFD蛋白的互作 |
| 2 讨论 |
| 2.1 棉花CETS-like调控棉花生长习性和开花时间 |
| 2.2 GoSP的自然等位基因变异创造了棉花的短果枝株型 |
| 2.3 Ghsp~(73Asn)和Gbsp~(73Asn)造成棉花短果枝可能的分子机制 |
| 3 小结 |
| 第五章 TFL1 基因调控植物根系发育,增加氮肥利用 |
| 1 结果与分析 |
| 1.1 AtTFL1 基因促进拟南芥的根系发育 |
| 1.2 AtTFL1 参与NO_3~-途径,调控侧根发育 |
| 1.2.1 tfl1-1 突变体对NO_3~-敏感性分析 |
| 1.2.2 AtTFL1 转录水平受高氮诱导 |
| 1.2.3 AtTFL1 转录水平受高氮诱导依赖于NRT基因家族 |
| 1.2.4 高氮增加AtTFL1 蛋白含量和蛋白稳定性 |
| 1.3 AtTFL1 增加拟南芥的氮吸收能力和NR酶活 |
| 1.4 AtTFL1 根中特异性表达增加拟南芥的生物量 |
| 1.4.1 根特异性启动子驱动AtTFL1 载体的构建 |
| 1.4.2 根中特异性表达AtTFL1,不推迟植物的开花时间 |
| 1.4.3 根中特异性表达AtTFL1 促进分枝、增加生物量 |
| 2 讨论 |
| 2.1 TFL1 是参与植物NO_3~-响应的关键基因 |
| 2.2 根特异性表达TFL1 基因能够提高植物的氮利用效率 |
| 3 小结 |
| 第六章 研究结论、创新点和展望 |
| 1 研究结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（5）陆地棉花青素合成调控基因的定位克隆和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花基因组特点和研究现状 |
| 1.1.1 棉花的分类 |
| 1.1.2 棉花基因组研究现状 |
| 1.2 基因组重测序及其应用 |
| 1.2.1 基因组重测序与遗传图谱 |
| 1.2.2 基因组重测序与基因定位 |
| 1.2.3 棉花分子标记的发展 |
| 1.2.4 基因组重测序在棉花中的研究应用 |
| 1.3 花青素研究现状和在植物中的改良应用 |
| 1.3.1 花青素的生物学作用 |
| 1.3.2 花青素的合成途径和调控机制 |
| 1.3.3 花青素在改良作物品质的应用 |
| 1.3.4 棉花红色植株突变体 |
| 1.3.5 棉花红色植株R1和亚红株Rs基因的研究现状 |
| 1.3.6 花青素与植物抗虫性 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究意义及立题依据 |
| 2.2 技术路线 |
| 第三章 陆地棉品种T586和渝棉一号的基因组重测序及R1性状的定位克隆 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要药品试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 DNA提取和稀释 |
| 3.2.2 DNA质量检测 |
| 3.2.3 全基因组重测序流程和SNP和InDel检测方法。 |
| 3.2.4 SNP引物开发设计 |
| 3.2.5 HRM高分辨率溶解曲线PCR的反应体系 |
| 3.2.6 遗传连锁图构建 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 T586和渝棉一号的DNA样品提取和质量检测 |
| 3.3.2 全基因组测序获得的数据量和质量可以满足SNP和 InDel检测要求.. |
| 3.3.3 测序数据与参考基因组TM-1的比对情况 |
| 3.3.4 T586 和渝棉一号获得的SNP和 InDel数量统计分析 |
| 3.3.5 比对获得的SNP数目及注释分析 |
| 3.3.6 比对获得的InDel数量及注释结果统计 |
| 3.3.7 染色体上的SNP和 InDel总体分布情况 |
| 3.3.8 红色植株R1的表型观察和性状统计 |
| 3.3.9 R1区域SNP分子标记筛选和R1基因的精细定位 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 陆地棉GhPAP1D的基因功能分析和调控花青素合成机制探究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物和昆虫材料 |
| 4.1.2 菌株和载体 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂和缓存液 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 用于基因克隆和序列分析的引物 |
| 4.2.2 TRV载体构建和瞬时表达 |
| 4.2.3 RNA提取和cDNA合成 |
| 4.2.4 定量PCR分析 |
| 4.2.5 花青素提取和含量测定 |
| 4.2.6 转录组测序和分析 |
| 4.2.7 烟草瞬时表达和双荧光素酶测定 |
| 4.2.8 抗虫性测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 GhPAP1D具有调控花青素合成的功能 |
| 4.3.2 转录组和qRT-PCR探究GhPAP1D基因对花青素合成途径的影响 |
| 4.3.3 GhPAP1D基因可转录激活花青素合成结构基因GhUFGT和GhGST |
| 4.3.4 GhPAP1D对自身启动子具有转录激活作用 |
| 4.3.5 棉花叶片中GhPAP1D调控花青素合成的模式 |
| 4.3.6 超量表达棉花GhPAP1D基因可提高棉花的抗虫性 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 亚红株性状的控制基因及其功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株和载体 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 主要试剂和缓存液 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Rs基因克隆引物和表达量测定引物 |
| 5.2.2 RNA提取和cDNA合成 |
| 5.2.3 转录组测序和分析 |
| 5.2.4 GUS染色测定GhPAP1A启动子活性 |
| 5.2.5 VIGS载体构建和棉花叶片瞬时表达 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 亚红株材料的性状观察和花青素含量测定 |
| 5.3.2 亚红株中花青素合成相关基因的表达分析 |
| 5.3.3 亚红株中GhPAP1A基因的序列分析 |
| 5.3.4 亚红株中GhPAP1A基因与Rs性状相关联 |
| 5.3.5 GUS染色分析发现亚红株的GhPAP1A启动子活性增强 |
| 5.3.6 亚红株中的GhPAP1A基因的功能验证 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 棉花的遗传定位研究 |
| 6.2 棉花中花青素合成途径 |
| 6.3 棉花花青素与抗虫的关系 |
| 6.4 串联重复序列可能在棉花等物种的启动子中起重要作用 |
| 6.5 花青素途径是遗传改造棉花纤维颜色的重要途径 |
| 第七章 主要结论和创新点 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 缩写词 |
| 附录二 T586和渝棉一号的测序质量分布 |
| 附录三 T586 和渝棉一号重测序获得的Raw reads的分类情况 |
| 附录四 T586 和渝棉一号的reads的错误率分布 |
| 附录五 T586和渝棉一号的测序深度分布 |
| 附录六 T586 和渝棉一号各染色体上的SNP和 InDel数量 |
| 附录七 超量表达GhPAP1D植株和Null系花青素合成相关基因FPKM值 |
| 附录八 T586 和渝棉一号中GhPAP1D基因编码区和启动子区序列比对 |
| 附录九 亚红株中花青素合成基因表达FPKM值 |
| 附录十 亚红株,红色植株,绿色植株和亚洲棉中GhPAP1A序列比对 |
| 附录十一 参与课题 |
| 附录十二 发表文章 |
| 致谢 |
（6）转石竹烯合酶基因GhTPS1棉花对棉花害虫与寄生蜂行为学影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写表 |
| 第一章 挥发物参与植物间接防御 |
| 1 植物抗虫机制概述 |
| 2 参与间接防御的害虫天敌 |
| 2.1 捕食者 |
| 2.2 寄生蜂 |
| 2.3 无脊椎动物 |
| 2.4 杂食动物 |
| 3 昆虫的嗅觉系统及相关蛋白 |
| 4 植物挥发物参与植物防御的具体机制 |
| 4.1 驱避害虫 |
| 4.2 吸引害虫天敌 |
| 4.3 植物挥发物影响害虫的信息素识别过程 |
| 4.4 植物挥发物直接影响害虫生存能力 |
| 4.5 邻近植物间的挥发物交流提高植物的防御抗性 |
| 4.6 植物挥发物之间的协同防御效应 |
| 4.7 植物挥发物对植物防御的负面效应 |
| 5 植物萜烯合成途径 |
| 5.1 底物的从头合成 |
| 5.2 萜烯合成 |
| 5.3 萜烯合酶 |
| 6 石竹烯合酶基因参与植物防御研究进展 |
| 第二章 GhTPS1参与棉花间接防御的机制研究 |
| 1 引言 |
| 1.1 棉田生态系统常见害虫及其天敌 |
| 1.2 棉花抗虫研究与育种进展 |
| 1.3 现有抗虫基因存在的问题 |
| 1.4 棉花挥发性物质研究进展 |
| 1.5 棉花萜烯合酶基因鉴定 |
| 1.6 GhTPSs基因的应用研究及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 石竹烯合酶的同源进化分析 |
| 3.2 GhTPS1基因的棉花遗传转化与纯系获得 |
| 3.3 GhTPS1转基因棉花的分子和生化水平鉴定 |
| 3.4 GhTPS1转基因棉花对棉田害虫的行为学影响 |
| 3.5 GhTPS1转基因棉花吸引棉花害虫的天敌寄生蜂 |
| 4 讨论 |
| 4.1 石竹烯参与棉花防御 |
| 4.2 合成生物学在植物防御中的应用前景 |
| 4.3 挥发物合酶基因的组合表达策略 |
| 4.4 野生植物TPS基因发掘助力抗虫作物育种 |
| 4.5 植物挥发物提高植物对病原微生物抵抗能力 |
| 4.6 昆虫嗅觉系统中的石竹烯结合蛋白分析 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
（7）棉花花药发育时期基因表达特征及其高温逆境响应分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 植物对高温逆境的感知 |
| 1.1.1 细胞膜对高温逆境的感知 |
| 1.1.2 未折叠蛋白参与植物对高温逆境的感知 |
| 1.1.3 代谢变化与活性氧信号介导植物对高温逆境的感知 |
| 1.2 高温逆境对植物的影响 |
| 1.2.1 高温逆境对植物光合作用的影响 |
| 1.2.2 高温逆境对蒸腾速率的影响 |
| 1.2.3 高温逆境对植物渗透调节物浓度的影响 |
| 1.2.4 高温逆境导致雄性不育的发生 |
| 1.3 植物对高温逆境的响应 |
| 1.3.1 MicroRNAs参与高温逆境的响应 |
| 1.3.2 钙离子信号参与高温逆境响应 |
| 1.3.3 热激蛋白参与高温逆境响应 |
| 1.3.4 信号通路在高温胁迫中的作用 |
| 1.3.5 表观遗传调控参与高温逆境响应 |
| 第二章 棉花花药发育时期基因表达特征 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 花药不同发育时期差异表达基因筛选 |
| 2.2.2 差异表达基因功能分析 |
| 2.2.3 差异表达基因表达模式分析 |
| 2.2.4 花药不同发育时期差异表达miRNAs |
| 2.2.5 差异表达miRNA靶基因预测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 花药发育时期基因表达调控 |
| 2.3.2 减数分裂期是花粉发育过程中最重要的阶段 |
| 2.3.3 花药发育过程中的代谢与信号通路 |
| 2.3.4 miRNA参与花药发育的调控 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 棉花花药中miRNAs高温逆境响应特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 smallRNA测序数据分析 |
| 3.2.2 miRNA鉴定及命名 |
| 3.2.3 差异miRNAs筛选及表达丰度统计 |
| 3.2.4 花药各发育时期高温逆境响应miRNA家族 |
| 3.2.5 MIRNA靶基因预测及功能分析 |
| 3.2.6 主要高温逆境响应miRNA家族靶基因预测及功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 棉花花药发育前期为miRNAs参与高温逆境响应的重要时期 |
| 3.3.2 miRNA通过表达丰度的变化响应高温胁迫 |
| 3.3.3 花药不同发育阶段高温逆境响应miRNA家族不同 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 高温胁迫下棉花花药转录组和脂肪酸含量分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 高温胁迫处理下耐高温与敏感品系花粉发育时期表现 |
| 4.2.2 转录组测序数据分析 |
| 4.2.3 差异表达基因筛选 |
| 4.2.4 差异表达基因功能注释 |
| 4.2.5 主要高温逆境响应miRNA家族靶基因预测及功能分析 |
| 4.2.6 靶向代谢组检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 高温逆境诱导基因上调表达 |
| 4.3.2 高温逆境对信号通路的影响 |
| 4.3.3 花药不同发育时期miRNAs参与不同生物学过程调控 |
| 4.3.4 脂肪酸参与高温逆境响应 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 高温逆境响应候选基因功能初步验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 候选基因功能预测和表达分析 |
| 5.2.2 候选基因扩增 |
| 5.2.3 候选基因表达载体构建及拟南芥遗传转化 |
| 5.2.4 转基因拟南芥阳性植株鉴定 |
| 5.2.5 转基因拟南芥高温逆境处理 |
| 5.2.6 Acx基因同源性分析 |
| 5.2.7 Gh_D10G2577 基因调控区siRNA分析及甲基化检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文总结、创新点和下一步研究计划 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.1.1 形态抗虫育种 |
| 1.1.2 生化抗虫育种 |
| 1.1.3 分子标记辅助选择抗虫育种 |
| 1.1.4 转外源抗虫基因抗虫育种 |
| 1.1.5 利用RNAi技术沉默昆虫靶标基因抗虫育种 |
| 1.2 盲蝽的危害特点及抗盲蝽研究的必要性 |
| 1.2.1 盲蝽的种类及形态特征 |
| 1.2.2 盲蝽的生活习性以及危害特点 |
| 1.2.3 开展棉花抗盲蝽研究的重要性和必要性 |
| 1.3 RNAi的研究进展及在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.3.1 RNAi现象的发现及定义 |
| 1.3.2 RNAi的作用机理及特点 |
| 1.3.3 RNAi的种类 |
| 1.3.4 昆虫摄取dsRNA的方式 |
| 1.3.5 植物介导的RNAi技术在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.4 FAR基因研究进展 |
| 1.5 LIM基因研究进展 |
| 1.6 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.6.1 本研究的目的与意义 |
| 1.6.2 本研究的技术路线 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 植物表达载体 |
| 2.1.3 基因的来源 |
| 2.1.4 供试的昆虫材料 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 棉花遗传转化 |
| 2.2.3 棉花DNA提取与Southern杂交 |
| 2.2.4 棉花RNA提取,表达量分析以及Northern杂交 |
| 2.2.5 盲蝽RNA提取,反转录以及RT-qPCR基因表达量分析 |
| 2.2.6 盲蝽的田间抗虫鉴定 |
| 2.2.7 转基因棉花大田农艺性状评价 |
| 2.2.8 非靶标昆虫的室内抗性鉴定 |
| 2.2.9 绿盲蝽的室内抗性鉴定 |
| 2.2.10 dsAl LIM和 dsGFP处理后绿盲蝽的转录组分析 |
| 第三章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质 |
| 3.1 结果与分析 |
| 3.1.1 AsFAR转基因棉花的获得与分子检测 |
| 3.1.2 AsFAR转基因棉花的表达量检测 |
| 3.1.3 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽种群数量的影响 |
| 3.1.4 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 3.1.5 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽的抗性显着增强 |
| 3.1.6 AsFAR转基因棉花对非靶标害虫的影响 |
| 3.1.7 不同世代AsFAR转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 3.2 讨论 |
| 第四章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗绿盲蝽新种质 |
| 4.1 结果与分析 |
| 4.1.1 基因序列分析及载体构建 |
| 4.1.2 AlLIM转基因棉花的获得 |
| 4.1.3 AlLIM转基因棉花的阳性检测及拷贝数分析 |
| 4.1.4 AlLIM转基因棉花的表达量检测 |
| 4.1.5 AlLIM转基因棉花对绿盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 4.1.6 AlLIM转基因棉花的室内饲喂效果检测 |
| 4.1.7 ds Al LIM处理后绿盲蝽转录组分析 |
| 4.1.8 AlLIM转基因棉花的田间抗绿盲蝽效果检测 |
| 4.1.9 不同世代AlLIM转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 4.1.10 AlLIM转基因棉花对非靶标昆虫的影响 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 AlLIM转基因棉花的抗虫性研究 |
| 4.2.2 绿盲蝽AlLIM基因的功能研究 |
| 4.2.3 AlLIM转基因棉花的环境安全性评价 |
| 4.2.4 RNAi转基因作物与Bt转基因作物的叠加是未来抗虫育种发展的新方向 |
| 4.2.5 植物介导的RNAi技术面临的挑战 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 载体构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 Sourthern杂交(地高辛标记法) |
| 附录5 棉花RNA提取 |
| 附录6 Northern杂交(地高辛标记法) |
| 附录7 AsFARDNA序列 |
| 附录8 AlLIMDNA序列 |
| 附表 |
| 附表1 本研究所用的引物序列 |
| 已发表和待发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（9）二化螟和褐飞虱为害诱导型水稻启动子的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物对昆虫防御反应的研究进展 |
| 1.1.1 植物对昆虫防御反应的类型 |
| 1.1.2 引起植物抗虫反应的激发子 |
| 1.1.3 植物对咀嚼式口器昆虫防御反应的机理 |
| 1.1.4 植物对刺吸式口器昆虫防御反应的机理 |
| 1.1.5 植物针对咀嚼式与刺吸式口器昆虫防御反应的差异 |
| 1.2 水稻对昆虫防御反应的研究进展 |
| 1.2.1 水稻主要害虫及其为害 |
| 1.2.2 二化螟简介 |
| 1.2.3 褐飞虱简介 |
| 1.2.4 水稻对二化螟及褐飞虱防御反应的研究进展 |
| 1.3 丙二烯氧化物合酶及脂氢过氧化物裂解酶的研究进展 |
| 1.3.1 植物丙二烯氧化物合酶的研究进展 |
| 1.3.2 水稻丙二烯氧化物合酶的研究进展 |
| 1.3.3 植物脂氢过氧化物裂解酶的研究进展 |
| 1.3.4 水稻脂氢过氧化物裂解酶的研究进展 |
| 1.4 启动子的概述 |
| 1.4.1 原核生物启动子的结构与功能 |
| 1.4.2 真核生物启动子的结构与功能 |
| 1.5 植物启动子的类型 |
| 1.5.1 诱导型启动子 |
| 1.5.2 组成型启动子 |
| 1.5.3 组织特异型启动子 |
| 1.5.4 人工合成启动子 |
| 1.6 启动子研究常用方法与技术 |
| 1.6.1 启动子生物信息学分析 |
| 1.6.2 候选基因表达模式检测 |
| 1.6.3 启动子的分离 |
| 1.6.4 启动子表达强度的定量及定性分析 |
| 1.6.5 启动子顺式元件及反式作用因子鉴定分析 |
| 1.7 诱导型启动子分析在植物抗虫机理研究中的作用 |
| 1.8 诱导型启动子分析在植物抗虫应用研究中的作用 |
| 2 目的意义及创新点 |
| 2.1 目的意义 |
| 2.2 本研究的创新点 |
| 第二章 水稻中昆虫诱导型启动子克隆及功能分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 水稻材料 |
| 1.2 供试昆虫 |
| 1.3 菌株及质粒 |
| 1.4 酶及化学试剂 |
| 1.5 主要常用仪器 |
| 1.6 序列分析 |
| 1.7 候选基因信息 |
| 1.7.1 OsHPL2候选基因信息 |
| 1.7.2 OsAOS1候选基因信息 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 验证候选基因 |
| 2.1.1 水稻接虫及激素处理 |
| 2.1.2 水稻叶鞘组织RNA抽提及反转录 |
| 2.1.3 Os HPL2及Os AOS1 候选基因表达量检测 |
| 2.2 启动子的克隆、载体构建及遗传转化 |
| 2.2.1 启动子序列分析 |
| 2.2.2 全长及系列5’端缺失启动子的克隆及载体构建 |
| 2.2.3 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 2.3 转基因植株检测 |
| 2.3.1 转基因植株阳性检测 |
| 2.3.2 转基因植株拷贝数检测 |
| 2.3.3 转基因植株纯合家系检测 |
| 2.4 GUS组织化学染色 |
| 2.5 GUS活性定量测定 |
| 2.5.1 所用试剂配制 |
| 2.5.2 总蛋白的抽提 |
| 2.5.3 总蛋白浓度测定 |
| 2.5.4 GUS活性测定 |
| 2.6 二化螟为害正调控序列驱动cry1C基因功能验证 |
| 2.6.1 二化螟为害正调控序列启动子载体构建 |
| 2.6.2 Cry1C的 ELISA检测 |
| 2.6.3 二化螟初孵幼虫死亡率检测 |
| 2.7 P2、P2R123-min35S、P2TR2-min35S转基因植株农艺性状考查 |
| 2.8 褐飞虱为害正调控序列缺失突变体启动子构建 |
| 2.9 酵母单杂交筛选互作蛋白 |
| 2.10 互作蛋白EGY48酵母菌株“点对点”验证 |
| 2.11 水稻原生质体瞬时转化 |
| 2.12 双荧光素酶激活实验 |
| 2.13 P_(AOS1)中与正调控序列互作蛋白的表达模式 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 水稻中二化螟为害诱导启动子P_(HPL2)的克隆及功能分析 |
| 3.1.1 二化螟为害诱导候选基因的表达检测 |
| 3.1.2 激素和机械损伤处理下OsHPL2表达检测 |
| 3.1.3 P_(HPL2)转基因植株拷贝数及纯合家系检测 |
| 3.1.4 P_(HPL2) 启动子驱动下,GUS的表达特性 |
| 3.1.5 P_(HPL2)系列缺失启动子转基因植株拷贝数及纯合家系检测 |
| 3.1.6 P_(HPL2)系列缺失启动子组织化学染色分析 |
| 3.1.7 P_(HPL2)及其系列缺失启动子GUS活性定量测定 |
| 3.1.8 P-1452、P-903和P-376对褐飞虱为害的反应 |
| 3.1.9 二化螟为害诱导正调控序列中潜在顺式元件分析 |
| 3.1.10 二化螟幼虫为害不同启动子驱动cry1C转基因水稻的死亡率 |
| 3.1.11 二化螟幼虫为害后,不同启动子驱动cry1C转基因水稻中Cry1C蛋白含量ELISA检测 |
| 3.1.12 不同启动子驱动cry1C转基因水稻对激素和机械损伤的反应 |
| 3.1.13 转基因植株田间农艺性状考查 |
| 3.2 水稻中褐飞虱为害诱导启动子P_(AOS1)的克隆及功能分析 |
| 3.2.1 褐飞虱为害诱导候选基因的表达检测 |
| 3.2.2 激素和机械损伤处理下OsAOS1表达检测 |
| 3.2.3 P_(AOS1)转基因植株拷贝数及纯合家系检测 |
| 3.2.4 P_(AOS1)启动子驱动下,GUS的表达特性 |
| 3.2.5 P_(AOS1)系列缺失启动子转基因植株拷贝数及纯合家系检测 |
| 3.2.6 P_(AOS1)系列缺失启动子组织化学染色分析 |
| 3.2.7 P_(AOS1)及其系列缺失启动子GUS活性定量测定 |
| 3.2.8 P-1573、P-979和P-426对二化螟为害的反应 |
| 3.2.9 褐飞虱为害诱导正调控序列中潜在顺式元件分析 |
| 3.2.10 正调控序列缺失突变体启动子GUS活性定量测定 |
| 3.2.11 筛选与褐飞虱为害诱导正调控序列互作的蛋白 |
| 3.2.12 酵母单杂交验证候选蛋白 |
| 3.2.13 互作蛋白的双荧光素酶激活验证 |
| 3.2.14 互作蛋白受褐飞虱与二化螟为害后表达检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 二化螟与褐飞虱接虫实验方法探讨 |
| 4.2 二化螟为害诱导正调控区域用于转基因抗虫水稻的潜力 |
| 4.3 P_(HPL2)和P_(AOS1)可能的诱导表达模式 |
| 4.4 P_(HPL2)和P_(AOS1)中顺式元件分析 |
| 4.5 P_(AOS1)启动子上的结合蛋白 |
| 4.6 昆虫为害诱导型启动子研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ:部分实验操作步骤 |
| 附录 Ⅱ:部分实验图 |
| 附录 Ⅲ:核苷酸序列 |
| 附录 Ⅳ:水稻受二化螟与褐飞虱为害的转录组分析 |
| 附录 Ⅴ:作者简介 |
| 致谢 |
（10）转GNA、ACA、NhaD、HEWL和CP4-EPSPS基因棉花新材料的创制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 转基因棉花的研究现状 |
| 1.2 蚜虫的发展现状 |
| 1.3 抗蚜虫基因的分类 |
| 1.3.1 蛋白酶抑制剂 |
| 1.3.2 凝集素 |
| 1.3.3 其他抗蚜虫的基因 |
| 1.4 几种重要的凝集素 |
| 1.4.1 雪花莲凝集素 |
| 1.4.2 尾穗苋凝集素 |
| 1.4.3 刀豆凝集素 |
| 1.4.4 半夏凝集素 |
| 1.4.5 大蒜凝集素 |
| 1.5 植物基因工程的前景展望 |
| 1.6 耐盐碱基因的选择 |
| 1.6.1 Na~+/H~+逆向转运蛋白的生物学功能 |
| 1.6.2 Na~+/H~+逆向转运蛋白的应用 |
| 1.7 黄萎病的危害及应对策略 |
| 1.7.1 抗黄萎病基因的选择 |
| 1.7.2 溶菌酶的生物学功能 |
| 1.8 杂草的危害及应对策略 |
| 1.8.1 抗除草剂基因的选择 |
| 1.8.2 抗除草剂基因的应用 |
| 1.9 创新点和立项依据 |
| 1.10 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 转化植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 培养基配制 |
| 2.1.6 相关缓冲液的配制 |
| 2.1.7 相关引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pBI-5g载体的构建 |
| 2.2.2 质粒提取 |
| 2.2.3 pBI-5g质粒转入农杆菌 |
| 2.2.4 菌落PCR反应鉴定阳性单菌落 |
| 2.2.5 棉花转化 |
| 2.2.6 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.7 转基因棉花分子水平的鉴定 |
| 2.2.8 边界序列的测定 |
| 2.2.9 不同启动子间基因表达水平的差异 |
| 2.2.10 转基因棉花的抗虫性分析 |
| 第三章 结果分析 |
| 3.1 转入外源基因生物安全性的评估 |
| 3.1.1 外源基因理化性质及结构预测 |
| 3.1.2 外源基因与毒蛋白的比对分析 |
| 3.1.3 外源基因与抗营养因子的比对分析 |
| 3.1.4 外源基因与过敏原的比对分析 |
| 3.2 pBI-5g植物表达的载体的获得 |
| 3.3 菌落PCR鉴定阳性菌株 |
| 3.4 农杆菌介导法转化棉花 |
| 3.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 蛋白电泳检测抗原质量 |
| 3.5.2 ELISA鉴定抗体的质量 |
| 3.5.3 小鼠抗血清的Western blot检测 |
| 3.6 转基因棉花分子水平的鉴定 |
| 3.6.1 试纸条初筛阳性植株 |
| 3.6.2 PCR检测阳性植株内的基因 |
| 3.6.3 qRT-PCR检测植株基因在RNA水平上的表达 |
| 3.6.4 Western blot检测植株基因外源蛋白质的表达 |
| 3.6.5 转基因植株的ELISA检测 |
| 3.7 外源基因侧翼序列的分析 |
| 3.8 启动子对外源基因表达的影响 |
| 3.8.1 RNA表达水平上的分析 |
| 3.8.2 蛋白质表达水平比对 |
| 3.9 转基因棉花抗蚜实验 |
| 第四章 结论 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、Genetic Engineering of Cotton (Gossypium hirsutum L. ) for Insect-resistance（论文参考文献）
- [1]CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建[D]. 孙琳. 华中农业大学, 2021
- [2]全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础[D]. 斯欢. 华中农业大学, 2021
- [3]江苏省植物细胞遗传学研究回顾与展望[J]. 王海燕,龚志云,蒋甲福,周宝良,娄群峰,曹清河,席梦利,陈佩度,顾铭洪,张天真,陈发棣,陈劲枫,李宗芸,王秀娥. 遗传, 2021(05)
- [4]“成花素-抗成花素”调控棉花开花转变和株型发育的功能研究[D]. 刘慧. 石河子大学, 2020(01)
- [5]陆地棉花青素合成调控基因的定位克隆和功能分析[D]. 李鑫. 西南大学, 2020(04)
- [6]转石竹烯合酶基因GhTPS1棉花对棉花害虫与寄生蜂行为学影响研究[D]. 张立华. 内蒙古大学, 2020
- [7]棉花花药发育时期基因表达特征及其高温逆境响应分析[D]. 陈劲. 湖南农业大学, 2020
- [8]利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质[D]. 梁思佳. 华中农业大学, 2020(01)
- [9]二化螟和褐飞虱为害诱导型水稻启动子的克隆及功能分析[D]. 李翰鹏. 华中农业大学, 2020
- [10]转GNA、ACA、NhaD、HEWL和CP4-EPSPS基因棉花新材料的创制[D]. 赵亚楠. 中国农业科学院, 2020(01)