一、体外培养成骨细胞的影响因素（论文文献综述）
徐慧慧[1]（2021）在《基于成骨和破骨细胞PI3K/Akt信号通路的右归丸对雌雄去势大鼠骨质疏松症治疗作用性别差异的机制研究》文中提出实验目的本研究从成骨细胞（osteoblast,OB）和破骨细胞（osteoblast,OC）PI3K/Akt信号调控通路的角度,采用体内实验与体外实验相结合的方法,揭示具有温补肾阳作用的右归丸对雌、雄去势大鼠骨质疏松症治疗作用的性别差异及作用机制,以进一步阐明“肾主骨”的科学内涵,为中医药治疗骨质疏松症提供实验依据。实验方法与结果为了阐明上述问题,本研究通过以下4个实验进行探讨。实验一 右归丸对雌、雄去势大鼠骨质疏松症治疗作用差异及对PI3K/Akt信号通路的影响实验方法选用3月龄SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠,雌雄各78只,适应性饲养后,将雌性大鼠按体重随机分为基础组12只、空白对照组12只、假手术组12只和造模组42只;雄性大鼠分组方法同雌性大鼠。分组结束后,先将雌、雄基础组大鼠经麻醉后处死,取第4腰椎和右侧胫骨检测骨组织形态指标数据,作为基础值。然后对雌、雄造模组分别进行去势手术（卵巢切除和睾丸切除）,制备“肾虚”OP大鼠模型。去势手术13周后,将造模组大鼠分别按体重再随机分为卵巢切除（OVX）组（13只）、雌激素组（12只）、雌性右归丸组（12只）;睾丸切除（ORX）组（13只）、雄激素组（13只）、雄性右归丸组（12只）。对各给药组大鼠分别进行灌胃给药,各组每日给药1次,每7d休息1d,连续给药13周。给药结束后,各组大鼠经麻醉处死后,取第4腰椎和双侧胫骨,分别用于Micro-CT骨组织形态指标的检测,及制作脱钙骨冰冻切片,采用免疫荧光方法分别检测各组大鼠胫骨骨髓中成骨细胞和破骨细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白的表达;采用免疫组化方法检测大鼠胫骨骨髓中BGP、RANKL、OPG、p-GSK-3β、β-catenin、Runx2,TRAP,TRAF-6,c-Src,NFATc1 蛋白的表达。实验结果1右归丸对雌、雄去势大鼠腰椎BMD变化率的影响雌性和雄性空白对照组、假手术组BMD变化率均为正值,表示骨量增加,而模型组（OVX组、ORX组）大鼠BMD变化率为负值,表示骨丢失。模型组（OVX组、ORX组）大鼠腰椎骨丢失较同性别假手术组显着升高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠腰椎骨丢失率比较:OVX组骨丢失明显多于ORX组（P<0.05）。雌激素组、雌性右归丸组以及雄激素组、雄性右归丸组BMD变化率均呈现负增长（P<0.01,P<0.05）,表明这些组仍处在骨丢失的状态;但与同性别模型组相比,其骨丢失的程度明显降低（P<0.01,P<0.05）。雌、雄大鼠给药后腰椎骨丢失率比较:雄性右归丸组骨丢失程度明显多于雌性右归丸组（P<0.05）。2右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨微观结构的影响2.1右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨BV/TV变化率的影响雌性和雄性空白对照组、假手术组大鼠胫骨BV/TV变化率均明显增加,OVX组和ORX组的BV/TV变化率呈现明显负增长（P<0.01）。雌激素、雌性右归丸组以及雄激素、雄性右归丸组的BV/TV变化率均呈现负增长,与同性别假手术组比较,差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.05）,但其减少程度要明显低于同性别模型组大鼠（OVX组/ORX组）（P<0.01,P<0.05）。雌、雄去势大鼠及雌、雄去势大鼠给药后BV/TV变化率均具有显着差异,其中OVX组BV/TV变化率的减少程度明显大于ORX组（P<0.05）;雌性右归丸组的减少程度明显小于雄性右归丸组（P<0.05）。2.2右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨Tb.N变化率的影响雌性和雄性空白对照组、假手术组大鼠胫骨松质骨Tb.N变化率均明显增加,而OVX组和ORX组Tb.N变化率大幅度减少,呈现负增长,与同性别假手术组比较,差异具有统计学意义（P<0.01）。雌激素、雌性右归丸组以及雄激素、雄性右归丸组的Tb.N变化率均呈现负增长,与同性别假手术组比较,差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.05）,但其减少程度要明显低于同性别模型组（P<0.01,P<0.05）。OVX组Tb.N变化率的减少程度明显大于ORX组（P<0.05）,雌性右归丸组其减少程度明显小于雄性（P<0.05）。2.3右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨Tb.Sp变化率的影响雌性和雄性空白对照组、假手术组大鼠胫骨松质骨Tb.Sp的变化率呈现负增长,即骨小梁分离度变小,而OVX组和ORX组Tb.Sp变化率则呈正值,即骨小梁分离度变大,较同性别假手术组明显增加（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间比较:OVX组Tb.Sp变化率的增加程度明显大于ORX组（P<0.05）,雌激素、雌性右归丸组以及雄激素、雄性右归丸组的Tb.Sp变化率均明显增加,与同性别假手术组比较,差异具有统计学意义,但其增加程度要明显低于同性别模型组（P<0.01）。雌、雄大鼠给药后比较:雌性右归丸组Tb.Sp变化率的增加程度则明显小于雄性右归丸组（P<0.05）。2.4右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨SMI的影响模型组（OVX组和ORX组）SMI较同性别假手术组明显增加（P<0.01）。雌激素、雌性右归丸组以及雄激素、雄性右归丸组SMI较同性别模型组明显下降（P<0.01,P<0.05）,但仍明显高于同性别假手术组（P<0.01,P<0.05）。雌、雄之间模型组及给药组比较:OVX组SMI明显大于ORX组（P<0.05）;雌性右归丸组SMI明显小于雄性右归丸组（P<0.05）。3右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL蛋白表达及RANKL/OPG比值的影响3.1右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中OPG蛋白表达的影响模型组大鼠（OVX组和ORX组）胫骨骨髓中成骨细胞OPG蛋白表达较同性别假手术组大鼠显着降低（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比,OVX组大鼠OPG蛋白表达显着低于ORX组（P<0.01）。阳性药组（雌激素和雄激素组）、雌性右归丸组大鼠胫骨骨髓中成骨细胞OPG蛋白表达较同性别模型组（OVX组/ORX组）显着升高（P<0.01,P<0.05）,但雄性右归丸组较ORX组则无明显差异。不同性别右归丸组之间相比,雌性右归丸组OPG蛋白表达显着高于雄性右归丸组（P<0.01）。3.2右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中RANKL蛋白表达的影响模型组大鼠（OVX组和ORX组）胫骨骨髓中成骨细胞RANKL蛋白表达较同性别假手术组大鼠显着增高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比,OVX组大鼠RANKL蛋白表达显着高于ORX组（P<0.01）。阳性药组（雌激素和雄激素组）、右归丸组大鼠胫骨骨髓中成骨细胞RANKL蛋白表达较同性别模型组（OVX组/ORX组）显着降低（P<0.01,P<0.05）,但雄性右归丸组仍高于雄性假手术组（P<0.05）。不同性别右归丸组之间相比,雄性右归丸组RANKL蛋白表达显着高于雌性右归丸组（P<0.05）。3.3右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中RANKL/OPG比值的影响模型组大鼠（OVX组和ORX组）胫骨骨髓中RANKL/OPG比值较同性别假手术组大鼠显着增高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比,OVX组大鼠RANKL/OPG 比值显着高于ORX组（P<0.01）。阳性药组（雌激素和雄激素组）、右归丸组大鼠胫骨骨髓中成骨细胞RANKL/OPG比值较同性别模型组（OVX组/ORX组）显着降低（P<0.01,P<0.05）,但雄性右归丸组仍高于雄性假手术组（P<0.05）。不同性别右归丸组之间相比,雄性右归丸组RANKL/OPG 比值显着高于雌性右归丸组（P<0.01）。4归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中成骨细胞BGP蛋白表达的影响模型组大鼠（OVX组和ORX组）胫骨骨髓中成骨细胞BGP蛋白表达较同性别假手术组大鼠显着增高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比,OVX组大鼠BGP蛋白表达显着高于ORX组（P<0.05）。阳性药组（雌激素和雄激素组）、右归丸组大鼠胫骨骨髓中成骨细胞BGP蛋白表达较同性别模型组显着降低（P<0.01,P<0.05）,但右归丸组及雄激素组仍高于同性别假手术组（P<0.01）。不同性别右归丸组之间相比,雌性右归丸组BGP蛋白表达显着低于雄性右归丸组（P<0.01）。5右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中成骨细胞PI3K/Akt信号通路的影响5.1右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中成骨细胞p-PI3K、p-Akt蛋白表达的影响模型组（OVX组/ORX组）大鼠胫骨骨髓成骨细胞中p-PI3K和p-Akt表达荧光面积较同性别假手术组大鼠显着增高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比:OVX组大鼠p-PI3K和p-Akt表达显着高于ORX组（P<0.05）。阳性药组（雌激素组和雄激素组）、雌/雄右归丸组大鼠胫骨骨髓中成骨细胞中p-PI3K和p-Akt表达荧光面积较同性别模型组（OVX组/ORX组）显着降低（P<0.01,P<0.05）。雌、雄右归丸组之间相比:雌性右归丸组p-PI3K和p-Akt表达显着低于雄性右归丸组（P<0.05）。5.2右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中成骨细胞p-GSK-3β、β-catenin、RUNX2蛋白表达的影响模型组大鼠（OVX组和ORX组）胫骨骨髓中p-GSK-3β、β-catenin、RUNX2蛋白表达较同性别假手术组大鼠均显着增高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比,OVX组大鼠三者表达显着高于ORX组（P<0.01）。阳性药组（雌激素和雄激素组）、右归丸组大鼠胫骨骨髓中胫骨骨髓中p-GSK-3β、β-catenin、RUNX2蛋白表达较同性别模型组显着降低（P<0.01,P<0.05）。三者表达在不同性别右归丸组之间比较,雌性右归丸组p-PI3K和p-Akt表达显着低于雄性右归丸组（P<0.01）。6右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中破骨细胞TRAP蛋白表达的影响模型组大鼠（OVX组和ORX组）胫骨骨髓中TRAP蛋白表达较同性别假手术组大鼠显着增高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比,ORX组大鼠显着低于OVX 组（P<0.05）。阳性药组（雌激素和雄激素组）、右归丸组大鼠胫骨骨髓中胫骨骨髓中TRAP蛋白表达较同性别模型组显着降低（P<0.01,P<0.05）。不同性别右归丸组之间比较,雌性右归丸组TRAP表达显着低于雄性右归丸组（P<0.05）。7右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中破骨细胞PI3K/Akt信号通路的影响7.1右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中破骨细胞p-PI3K、p-Akt蛋白表达的影响模型组（OVX组/ORX组）大鼠胫骨骨髓破骨细胞中p-PI3K和p-Akt表达荧光面积较同性别假手术组大鼠显着增高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比,OVX组大鼠p-PI3K和p-Akt表达显着高于ORX组（P<0.01,P<0.05）。雌/雄阳性药组（雌激素组、雄激素组）、雌/雄右归丸组大鼠胫骨骨髓中破骨细胞p-PI3K和p-Akt表达荧光面积较同性别模型组（OVX组/ORX组）显着降低（P<0.01,P<0.05）。不同性别右归丸组之间相比,雌性右归丸组p-PI3K和p-Akt表达显着低于雄性右归丸组（P<0.01,P<0.05）。7.2右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中破骨细胞TRAF-6、c-Src、NFATc1蛋白表达的影响模型组大鼠（OVX组和ORX组）胫骨骨髓中TRAF-6、c-Src、NFATc1蛋白表达较同性别假手术组大鼠均显着增高（P<0.01）。雌、雄去势大鼠之间相比,OVX组大鼠三者表达显着高于ORX组（P<0.01）。阳性药组（雌激素和雄激素组）、右归丸组大鼠胫骨骨髓中胫骨骨髓中TRAF-6、c-Src、NFATc1蛋白表达较同性别模型组显着降低（P<0.01,P<0.05）。三者表达在不同性别右归丸组之间比较,雌性右归丸组p-PI3K和p-Akt表达显着低于雄性右归丸组（P<0.01）。实验二雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞PI3K/Akt信号通路的影响实验方法（1）制作含药血清:选用3月龄SD大鼠80只,SPF级,雌雄各半,首先雌、雄大鼠适应性饲养后,按体重随机分为假手术组及造模组,造模组的造模及分组方法同实验一,分组结束后,按组别对各组大鼠灌胃给药,每日给药2次,连续7d,末次给药1h后,将各组大鼠麻醉后于无菌条件下经腹主动脉取血,分离血清,经灭活、过滤除菌、分装后,于-80℃冰箱冻存备用。（2）将小鼠颅顶前成骨细胞株MC3T3-E1以5×104个/孔接种于6孔板中,24h细胞贴壁后,加入10%各组大鼠血清培养。实验分组如下:雌性假手术血清组、雄性假手术血清组、OVX血清组、ORX血清组、雌激素血清组、雄激素血清组、雌性右归丸血清组、雄性右归丸血清组。作用48h后,收集细胞进行后续指标检测。采用免疫组化方法检测OB中BGP、RANKL、OPG的蛋白表达;采用 Real-time PCR 方法检测 OB 中 PI3K、Akt、GSK-3β、β-catenin、Runx2mRNA的表达;采用 Western-Blot 方法检测 OB 中 p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin、RUNX2 蛋白的表达。实验结果1雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞BGP蛋白表达的影响OVX血清组、雌激素含药血清组和雌性右归丸含药血清组BGP蛋白表达水平与雌性假手术组血清组相比,明显上升（P<0.01）;ORX血清组、雄激素含药血清组和雄性右归丸含药血清组BGP蛋白表达水平与雄性假手术血清组相比,明显上升（P<0.01）。雌雄之间比较,OVX血清组BGP蛋白表达明显高于ORX血清组（P<0.05）,雌性右归丸含药血清组BGP蛋白表达明显亦高于雄性右归丸组（P<0.05）。2雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞OPG、RANKL蛋白表达及RANKL/OPG比值的影响与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组OB的RANKL蛋白水平、RANKL/OPG 比值明显上调（P<0.01）,OPG蛋白水平明显下调（P<0.01）。与OVX血清组比较,雌性右归丸含药血清和雌激素血清可明显降低OB的RANKL蛋白及RANKL/OPG 比值（P<0.01）,并显着促进OB分泌OPG（P<0.01）。ORX血清组OB的RANKL蛋白表达、RANKL/OPG比值与雄性假手术血清组相比,明显上升（P<0.01）,OPG蛋白水平明显下调（P<0.05）。雄激素血清和雄性右归丸含药血清对OB的RANKL蛋白表达与ORX血清组比较,具有明显下调作用（P<0.05,P<0.01）,雄激素组OPG蛋白表达明显上调（P<0.05）,但雄性右归丸含药血清组OPG较ORX组未见明显差异。雌雄之间OVX血清组RANKL蛋白表达、RANKL/OPG雌性明显高于OVX组（P<0.05,P<0.01）,OPG蛋白表达ORX血清组明显高于OVX血清组（P<0.05）。雌性右归丸含药血清组RANKL蛋白水平、RANKL/OPG明显低于雄性右归丸组（P<0.05,P<0.01）,OPG蛋白表达雌性右归丸含药血清组明显高于雄性（P<0.01）。3雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞PI3K、Akt、GSK3β、β-catenin和Runx2 mRNA表达的影响与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组、雌激素组和雌性右归丸含药血清组PI3K和Akt mRNA表达水平明显增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。与雄性假手术血清组相比,ORX血清组和雄性右归丸含药血清组PI3K mRNA表达水平明显增加,ORX血清组、雄激素组和雄性右归丸含药血清组AktmRNA表达水平明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与OVX组相比,雌激素和雌性右归丸含药血清对PI3K、Akt mRNA表达水平的影响,差异不具有统计学意义。雌雄模型组之间,OVX血清组PI3K和Akt mRNA表达明显高于ORX组,差异具有统计学意义（P<0.05）。与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组GSK3β、β-catenin和Runx2 mRNA表达水平明显增加（P<0.01,P<0.05）,雌激素组和雌性右归丸组Runx2mRNA表达水平亦明显增加（P<0.01）,差异具有统计学意义。与雄性假手术血清组相比,ORX血清组GSK3β、β-catenin和Runx2 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）,雄性右归丸组GSK3β mRNA表达水平亦明显升高（P<0.05）。与ORX组相比,雄激素和雄性右归丸含药血清对上述三种mRNA表达水平的影响,差异不具有统计学意义。雌雄模型组之间亦未见明显差异。4雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin 和 RUNX2 蛋白表达的影响与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组、雌激素组和雌性右归丸含药血清组p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化表达水平明显升高（P<0.01,P<0.05）,差异具有统计学意义。与雄性假手术血清组相比,ORX组和雄激素组p-PI3K蛋白磷酸化表达水平明显增加（P<0.01,P<0.05）,ORX组、雄激素组和雄性右归丸含药血清组p-Akt蛋白磷酸化表达水平明显升高（P<0.01,P<0.05）,差异具有统计学意义。雌、雄模型血清组之间,OVX血清组p-Akt蛋白水平明显高于ORX血清组（P<0.01）,雌、雄右归丸组之间未见明显差异。PI3K和Akt各组之间均未见明显差异。与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组p-GSK3β、β-catenin和RUNX2蛋白表达水平明显增加（P<0.01,P<0.05）,雌激素组β-catenin蛋白表达水平明显增加（P<0.05）,差异具有统计学意义。与OVX组相比,雌激素组和雌性右归丸含药血清组差异无统计学意义。与雄性假手术血清组相比,ORX组和雄激素组β-catenin和RUNX2蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,雄性右归丸组β-catenin蛋白表达水平显着增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。与ORX组相比,雄激素组和雄性右归丸含药血清组差异无统计学意义。GSK3β各组之间差异无统计学意义。雌雄各组之间各指标差异亦无统计学意义。实验三雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞PI3K/Akt信号通路的影响实验方法将小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7以2×103个/孔接种于96孔板或6×104个/孔接种于6孔板,96孔板中预置骨片,细胞经24h贴壁后,加入分化培养基（DMEM+10%FBS+50ng/mL RANKL）,诱导 48h,加入 10%各组大鼠血清（分组方法同实验二）,细胞培养至第5d,对OC进行抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色观察和计算TRAP阳性细胞数（细胞核≥3个）;细胞培养至第9d,对骨片进行骨陷窝甲苯胺蓝染色,计算骨吸收陷窝面积。采用免疫组化方法检测OC的TRAP蛋白表达;Real-time PCR方法检测OC中PI3K、Akt、TRAF-6、c-Src、NFATcl 的 mRNA水平,Western-Blot 方法检测 OC中 p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、TRAF-6、c-Src、NFATc1 等蛋白表达水平。实验结果1雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞分化的影响OC经TRAP染色后细胞呈紫红色,多核,将细胞核≥3的TRAP+细胞视为破骨细胞,进行计数。OVX血清组TRAP+破骨细胞数量较雌性假手术组明显增加（P<0.01）,ORX血清组较雄性假手术组明显增加（P<0.01）。雌激素和雌性右归丸含药血清组TRAP+破骨细胞数量较OVX组大鼠明显降低（P<0.01）,雄激素组和雄性右归丸含药血清组与ORX组比较,TRCP+破骨细胞数量明显降低（P<0.05,P<0.01）,但雄性右归丸含药血清组仍显着高于雄性假手术组（P<0.01）。OVX组与ORX组之间比较,OVX组TRAP+破骨细胞数量显着高于ORX组（P<0.05）;雌性右归丸含药血清组则明显低于雄性右归丸含药血清组（P<0.05）。2雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞骨吸收功能的影响骨片经甲苯胺蓝染色后,OC形成的骨吸收陷窝呈蓝色,形态为圆形、椭圆形或腊肠形,说明诱导的OC有噬骨功能。OVX组/ORX组骨吸收陷窝面积较同性别假手术组明显增加（P<0.01）,各含药血清组与同性别模型组（OVX组/ORX组）相比,骨吸收陷窝面积明显降低（P<0.01）。雄性右归丸含药血清组高于雄性假手术组,有统计学差异（P<0.01）。OVX组与ORX组之间比较,OVX组骨吸收陷窝面积显着高于ORX组（P<0.05）;雌性去势大鼠含药血清组则明显低于雄性去势大鼠含药血清组（P<0.05）。3雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞的TRAP蛋白表达的影响OVX/ORX血清组TRAP蛋白表达水平明显高于同性别假手术血清组（P<0.01）。各含药血清组与同性别模型组（OVX组/ORX组）相比,TRAP蛋白表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。雌雄模型组之间存在明显差异,OVX组TRAP蛋白表达水平明显高于ORX组（P<0.05）。雌性去势大鼠含药血清组则明显低于雄性去势大鼠含药血清组（P<0.05）。4雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞PI3K、Akt、TRAF6、c-Src、NFATc1 mRNA表达的影响与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组PI3K、AktmRNA水平明显升高（P<0.01）。与OVX血清组相比,雌激素和雌性右归丸含药血清组PI3K、Akt mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。与雄性假手术血清组相比,ORX组和雄性右归丸含药血清组PI3K、AktmRNA表达水平明显增加（P<0.05,P<0.01）。与ORX血清组相比,雄激素组和雄性右归丸含药血清组PI3K、AktmRNA表达水平明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。雌雄模型组之间存在明显差异,OVX血清组PI3K、AktmRNA表达水平明显高于ORX血清组（P<0.05）。雌性右归丸含药血清组则明显低于雄性右归丸含药血清组（P<0.05）。与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组TRAF6、c-Src、NFATc1 mRNA水平明显升高（P<0.01）。与OVX血清组相比,雌激素和雌性右归丸含药血清组TRAF6、c-Src、NFAc1 mRNA表达水平明显降低（P<0.01,P<0.05）。与雄性假手术血清组相比,ORX组PI3K、Akt、TRAF6、c-Src、NFATc1 mRNA表达水平明显增加（P<0.05）。与ORX血清组相比,雄激素组和雄性右归丸含药血清组TRAF6、NFATc1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01）,雄性右归丸含药血清c-Src mRNA表达水平较ORX组具有下降趋势。雌雄模型组之间存在明显差异,OVX血清组TRAF6、c-Src、NFATc1 mRNA表达水平明显高于ORX血清组（P<0.05）。5雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、TRAF6、c-Src、NFATc1蛋白表达的影响与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组、雌激素组和雌性右归丸组p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化水平明显升高（P<0.01,P<0.05）。与雄性假手术血清组相比,ORX血清组和雄性右归丸含药血清组PI3K、Akt蛋白磷酸化表达水平明显增加（P<0.01）。各含药血清组与同性别模型组（OVX组/ORX组）相比,PI3K、Akt蛋白磷酸化水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。雌、雄之间模型组、右归丸组存在明显差异。OVX组PI3K和Akt蛋白磷酸化表达水平明显高于ORX组（P<0.05,P<0.01）。雌性右归丸含药血清组则明显低于雄性右归丸含药血清组（P<0.01）。与雌性假手术组血清组相比,OVX血清组TRAF6、c-Src、NFATc1蛋白表达水平明显增加（P<0.01）。与OVX血清组比较,雌激素和雌性右归丸含药血清可明显降低TRAF6、c-Src、NFATc1蛋白表达水平（P<0.01）。与雄性假手术血清组相比,ORX组TRAF6、c-Src、NFATc1蛋白表达水平显着升高（P<0.01）。与ORX组相比,雄激素组和雄性右归丸含药血清组可明显降低TRAF6、c-Src、NFATc1蛋白表达水平（P<0.05,P<0.01）。雌雄之间比较,OVX组NFATc1蛋白水平明显高于ORX组（P<0.05）。雌性去势大鼠含药血清组则TRAF6明显低于雄性去势大鼠含药血清组（P<0.05）。实验四 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清在PI3K激动剂作用下对破骨细胞分化、功能及其PI3K/Akt信号通路的影响实验方法将小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7以以2×103个/孔接种于96孔板或6×104个/孔接种于6孔板,96孔板中预置骨片,细胞经24h贴壁后,加入分化培养基（DMEM+10%FBS+50ng/mL RANKL）,诱导48h,在分组含有激动剂组的培养孔中,加入10μM浓度PI3K激动剂740Y-P刺激24h,并按分组方法加入10%各组大鼠血清,实验分组如下:OVX大鼠血清组、OVX大鼠血清+740Y-P组、雌性右归丸大鼠含药血清+740Y-P组、ORX大鼠血清组、ORX大鼠血清+740Y-P组、雄性右归丸大鼠含药血清+740Y-P组。对OC进行TRAP染色观察和计算TRAP+细胞数（细胞核≥3个）;细胞培养至第9d,对骨片进行骨陷窝甲苯胺蓝染色,计算骨吸收陷窝面积。免疫组化方法检测OC的TRAP蛋白表达;Real-time PCR 方法检测 OC 中 PI3K、Akt、TRAF-6、c-Src、NFATc1 的 mRNA 水平,Western-Blot 方法检测OC中 p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、TRAF-6、c-Src、NFATc1等蛋白表达水平。实验结果1 PI3K/Akt信号通路在雌、雄去势大鼠右归丸含药血清抑制破骨细胞分化中的作用加入PI3K激动剂740Y-P后,TRAP+破骨细胞数较同性别模型组（OVX血清组/ORX血清组）明显增加（P<0.05）,与OVX+740Y-P组比较,雌性右归丸含药血清+740Y-P组TRAP+细胞计数显着降低（P<0.05）;与ORX+740Y-P组比较,雄性右归丸含药血清+740Y-P组TRAP+细胞计数显着降低（P<0.05）。2 PI3K/Akt信号通路在雌、雄去势大鼠右归丸含药血清抑制破骨细胞功能中的作用雌雄模型血清组加入PI3K激动剂740Y-P后,OVX+740Y-P组骨吸收陷窝面积较同性别模型组（OVX血清组/ORX血清组）明显增加（P<0.05）。与OVX血清+740Y-P组比较,雌性右归丸含药血清+740Y-P组骨吸收陷窝面积显着降低（P<0.01）;与ORX血清+740Y-P组比较,雄性右归丸含药血清+740Y-P组骨吸收陷窝面积显着降低（P<0.05）。3 PI3K/Akt信号通路在雌、雄去势大鼠右归丸含药血清抑制破骨细胞TRAF6、c-Src、NFATc1 mRNA 表达的作用OVX和ORX血清组加入PI3K激动剂740Y-P后,OVX+740Y-P组PI3K、AktmRNA相对表达明显较OVX组明显增加（P<0.01）,ORX+740Y-P组PI3K、AktmRNA相对表达明显较ORX组明显增加（P<0.01）,说明PI3K/Akt信号通路被激活。与OVX+740Y-P组比较,雌性右归丸含药血清组+740Y-P组PI3K、AktmRNA相对表达表达显着降低（P<0.01）;与ORX+740Y-P组比较,雄性右归丸含药血清组+740Y-P组PI3K、AktmRNA相对表达显着降低（P<0.05）,说明雌、雄右归丸含药血清可明显抑制PI3K/Akt信号通路。雌雄模型血清组加入PI3K激动剂740Y-P后,OVX+740Y-P组TRAF-6、c-Src、NFATc1 mRNA表达水平明显较OVX组明显增加（P<0.01）,ORX+740Y-P 组 TRAF-6、c-Src、NFATc1 mRNA 表达水平较 ORX 组明显增加（P<0.01）。与OVX+740Y-P组比较,雌性右归丸含药血清组+740Y-P组TRAF-6、c-Src、NFATc1 mRNA表达水平表达显着降低（P<0.01）;与ORX+740Y-P组比较,雄性右归丸含药血清组+740Y-P组TRAF-6、c-Src、NFATc1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。4 PI3K/Akt信号通路在雌、雄去势大鼠右归丸含药血清抑制破骨细胞TRAF6、c-Src、NFATc1蛋白表达中的作用雌雄模型血清组加入PI3K激动剂740Y-P后,OVX+740Y-P组p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化水平明显较OVX组明显增加（P<0.05,P<0.01）,ORX+740Y-P组p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化水平较ORX组明显增加（P<0.05,P<0.01）,说明PI3K/Akt信号通路被激活。与OVX+740Y-P组比较,雌性右归丸含药血清组+740Y-P组p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化水平表达显着降低（P<0.01）;与ORX+740Y-P组比较,雄性右归丸含药血清组+740Y-P组p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化水平显着降低（P<0.05）,说明雌、雄右归丸含药血清可明显抑制PI3K/Akt信号通路。雌雄模型血清组加入PI3K激动剂740Y-P后,OVX+740Y-P组TRAF-6、c-Src、NFATc1蛋白表达水平明显较OVX组明显增加（P<0.05,P<0.01）,ORX+740Y-P组c-Src、NFATc1蛋白表达水平较ORX组明显增加（P<0.05,P<0.01）,TRAF-6具有升高趋势,但差异未见统计学意义。与OVX+740Y-P组比较,雌性右归丸含药血清组+740Y-P组TRAF-6、c-Src、NFATc1蛋白表达水平表达显着降低（P<0.01）;与ORX+740Y-P组比较,雄性右归丸含药血清组+740Y-P 组 TRAF-6、c-Src、NFATc1 蛋白表达水平显着降低（P<0.05,P<0.01）。实验结论（1）去势可导致同龄雌、雄大鼠发生高转换型骨质疏松症,但去势所导致的雌雄之间骨转换及骨丢失率存在性别差异,OVX大鼠骨转换及骨丢失率明显高于ORX大鼠。去势大鼠骨吸收增加,骨形成代偿性增加,但由于骨吸收大于骨形成而导致骨量丢失。其具体机制是:大鼠去势后,可引起OC的PI3K/Akt信号通路及其关键因子TRAF6、c-Src、NFATc1的mRNA及蛋白表达明显升高,OC活性增强;并可引起OB的PI3K/Akt信号通路及其关键因子GSK3β、β-catenin和Runx2的mRNA及蛋白表达均明显升高,OB活性增强,RANKL/OPG比值增加。但由于OC所致的骨吸收大于OB所致的骨形成,而导致骨质疏松症的发生。OVX大鼠的上述改变明显强于ORX大鼠,这是雌性去势大鼠骨转换及骨丢失率均明显高于雄性的机制之一。（2）右归丸对雌、雄去势大鼠骨质疏松症的作用存在性别差异,右归丸对OVX大鼠的疗效明显优于ORX大鼠。右归丸可使去势大鼠OC的PI3K/Akt信号通路及其关键因子TRAF6、c-Src、NFATc1的蛋白表达明显降低,导致OC活性减弱;并也可使OB的PI3K/Akt信号通路及其关键因子GSK3β、β-catenin和RUNX2的蛋白表达以及RANKL蛋白表达、RANKL/OPG 比值均明显降低。RANKL/OPG比值降低则表明,右归丸还可通过抑制RANKL/OPG 比值来降低OC的活性。右归丸的以上作用最终导致骨吸收与骨形成均降低,使两者恢复到一个相对的平衡状态,从而抑制骨的高转换状态,防止骨量丢失。右归丸对OVX大鼠OB和OC中PI3K/Akt信号通路抑制作用明显大于ORX大鼠,这是右归丸对雌、雄去势大鼠骨质疏松症治疗作用存在性别差异的机制之一。综上,右归丸对同龄雌雄大鼠OB和OC中PI3K/Akt信号通路的差异调控作用是其对雌雄去势大鼠骨质疏松症治疗产生性别差异的机制之一。
司誉豪[2]（2021）在《龟鹿二仙胶经成骨细胞来源外泌体抗骨质疏松的作用与机制研究》文中提出背景:骨质疏松症发病的根本机制在于成骨—破骨细胞交互的骨稳态失衡。中医“阴阳平衡”理论与成骨—破骨细胞间的骨稳态平衡具有极其微妙的关联性。课题组前期探索在成骨细胞机制的基础上,对龟鹿二仙胶影响成骨—破骨细胞信号交互的机制展开探索,发现其机制包括:①上调TGF-β/Smads信号通路中TGF-β、Smad3、P-smad3的表达。②激活MMP3-OPN-MAPK通路,平衡成骨—破骨细胞之间的耦联。进一步的研究发现,外泌体包裹并传递信号分子,是成骨—破骨细胞间交互的主要中介因素。目的:优化外泌体制备技术;从离体与在体实验分别验证龟鹿二仙胶干预后的成骨细胞来源外泌体对成果-破骨细胞的影响,从骨代谢指标、骨密度、骨微结构、生物力学等方面,通过PRM与PCR技术揭示龟鹿二仙胶通过外泌体途径调控TGF-β/Smads信号通路及破骨分化信号通路起抗骨质疏松的作用机制,为阐明中医“阴阳平衡”理论指导下的骨稳态平衡调节机制提供实验基础。方法:①原代成骨细胞体外提取技术优化:针对原代成骨细胞提取效率低下的问题,通过优化提取步骤,以提高成骨细胞提取与培养效率,采用ALP与茜素红染色鉴定成骨细胞。②成骨细胞源性外泌体制备与验证:使用超速离心法制备去外泌体血清与分离成骨细胞来源外泌体,通过透射电镜、NTA、Western Blot验证外泌体制备成功。③GEG-OB-EV对去势大鼠骨质疏松模型的作用与机制:切除大鼠双侧卵巢以建立骨质疏松模型,分为生理盐水组（NS）、模型组（OVX）、阿仑膦酸钠组（ALN）、OB-EV组（OB-EV）、GEG-OB-EV 组（GEG-OB-EV）。通过 CCK-8 法确定 GEG 对 OB 的最佳给药浓度,使用ELISA技术检测血清骨代谢指标,Micro-CT观察骨微观结构改变,HE染色观察骨组织病理学变化,三点弯折试验测试骨组织生物力学性能,PRM与RT-PCR技术检测TGF-β与RANK/RANKL/OPG信号通路中相关指标的蛋白与mRNA表达变化。④GEG-Mc3t3-EV对RAW264.7诱导破骨细胞的影响:建立Mc3t3-E1与RAW264.7培养体系,采用RANKL与M-CSF诱导RAW264.7为破骨细胞作为干预对象,分为空白对照组（BC）、外泌体抑制组（GW4869）、GEG含药血清组（GEG）、Mc3t3-EV组（Mc3t3-EV）、GEG-Mc3t3-EV 组（GEG-Mc3t3-EV）、阿仑膦酸钠组（ALN）。通过 EDU 法确定GEG对Mc3t3-E1的最佳给药浓度,通过transwell小室与PKH26标记EV评估RAW264.7对Mc3t3-EV摄取情况,使用流式细胞术评价RAW264.7凋亡情况,采用TRAP染色半定量、骨吸收板、RT-PCR等技术评价破骨细胞分化与功能情况。结果:①原代成骨细胞体外提取技术优化:对传统二次酶消化法进行改良,将原先操作难度高、操作时间长的剥除骨面多余组织替代为振荡涡旋冲洗,将剪碎块步骤替代为50mL离心管内批量剪碎,使成骨细胞提取效率大大提高,且ALP与茜素红染色鉴定无误。②成骨细胞源性外泌体制备与验证:OB-EV透射电镜图像显示,EV形态完整、近似球形、大小较为均一,平均粒径为74.75nm,30～150nm颗粒占比为97.66%,颗粒浓度为1.67*109个/mL。OB-EV经BCA定量浓度约为1.106±0.082μg/μL,标记蛋白CD63、CD9、TSG101均呈阳性,而Calnexin呈阴性。③GEG-OB-EV对去势大鼠骨质疏松模型的作用与机制:CCK-8结果显示24h10%GEG含药血清培养的OB活性最接近正常生长状态。体重:造模12周后,OVX组、ALN组、GEG-OB-EV组、OB-EV组大鼠体重在0-2周时有一个较为明显上升,随后趋于平缓,四组之间体重变化上没有显着差异（P>0.05）,而四组较NS组大鼠体重有明显增加,差异具有显着统计学意义（P<0.05）;血清骨代谢指标:与NS组比较,OVX组的雌激素（estrogen,E）、Pi、OPG显着下降,ALP、TRACP、β-CTX、PINP明显上升,差异具有显着统计学意义（P<0.05）。与OVX组比较,GEG-OB-EV可明显提高血清Pi、OPG、E,抑制血清ALP、TRACP、β-CTX、PINP水平,差异具有显着统计学意义（P<0.05）;Micro-CT:三维建模分析结果表明,OVX组骨小梁丢失十分明显,GEG-OB-EV、OB-EV与ALN组骨小梁较OVX组有显着改善,其中GEG-OB-EV与ALN组改善更为明显,但仍不如NS组。与NS组比较,OVX组的BV/TV、Tb.N、BMD、Tb.Th均有显着下降,但Tb.SP显着上升,差异均具有显着统计学意义（P<0.01）。相较于OVX组,GEG-OB-EV组的BV/TV、Tb.N、BMD、Tb.Th均有明显上升,Tb.SP显着下降,差异具有显着统计学意义（P<0.05）。OB-EV、ALN组相较于OVX组也具有相似的结果（P<0.05）。HE染色:OVX组较NS组的骨小梁变细,间距增大,结构紊乱,有断裂现象。出现骨髓水肿,成骨细胞大量丢失,骨髓腔内骨细胞明显减少,脂肪细胞增多、增大明显。而GEG-OB-EV组较OVX组骨小梁结构有所改善,排列略整齐,骨细胞增多,脂肪细胞减少。相关分子机制结果:OVX组的RANKL、CTSK、MMP14、Atp6v0d2、NFATc1等表达较NS组均明显升高,在各药物干预后均有明显下降,其中GEG-OB-EV与ALN抑制作用最为明显,而GEG-OB-EV还可明显上调TGF-β/Smads信号通路中关键分子Smad3与TGF-β。④GEG-Mc3t3-EV对RAW264.7诱导破骨细胞的影响:EDU结果显示24h10%GEG含药血清培养的Mc3t3-E1的活性最佳;EV摄取结果:transwell小室显示,荧光标记的Mc3t3-E1细胞膜会分泌物质通过1μm孔径的滤膜进入下层,RAW264.7细胞膜上可见呈圆形或不规则型的荧光物质。PKH26-Mc3t3-EV直接加入RAW264.7中则见橙红色的PKH26-Mc3t3-EV紧紧围绕在蓝色的细胞核周围。TRAP染色及半定量分析:RAW264.7经RANKL及M-CSF诱导4-5d后可融合成体积较大的多核细胞,TRAP染色后呈不规则形或椭圆形,边界清晰。GEG-Mc3t3-EV可明显抑制RANKL及M-CSF诱导的破骨细胞分化,其效果明显优于Mc3t3-EV（P<0.05）。骨吸收功能:RAW264.7诱导后可见骨吸收板上出现明显呈圆形的骨吸收陷窝。GEG-Mc3t3-EV可明显减少破骨细胞形成的骨吸收陷窝数量,其效果与GEG含药血清相当,优于Mc3t3-EV,但弱于ALN,差异均具有统计学意义（P<0.05）。相关分子机制结果:与BC组比较,GEG-Mc3t3-EV组的c-FOS、CTSK、NFATC1、TRAP的mRNA表达量均有显着下降,且差异均具有显着统计学意义（P<0.05）。结论:龟鹿二仙胶可通过成骨细胞源性外泌体在动物体与细胞水平上发挥抗骨质疏松作用,其机制可能与上调TGF-β/Smads信号通路中Smad3与TGF-β以及抑制RANK/RANKL/OPG中NFATc1等转录和破骨特异因子有关,继而双向平衡成骨—破骨细胞之间的耦联,改善骨代谢、微观结构及生物力学性能。
任莉[3]（2021）在《木香烃内酯对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理骨质疏松症是一种以骨量减少,骨组织微结构被损坏,导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的全身性代谢性骨病,其发生的根本原因是破骨细胞的骨吸收作用大于成骨细胞的骨形成作用。然而,存在于骨髓中的骨髓间充质干细胞是的一种多能成体干细胞,它不仅可以分化为成骨细胞,还可以分化为脂肪细胞。已有研究发现,在幼年和青少年时期,BMSCs更多分化为成骨细胞,而较少分化为脂肪细胞;但在老年阶段则相反,BMSCs更多分化为脂肪细胞,而较少分化为成骨细胞。这些研究表明,BMSCs的分化方向与骨质疏松的发生密切相关。因此,如果能有效促进BMSCs的成骨性分化或抑制BMSCs的成脂性分化就能够有效促进骨形成作用,从而达到治疗骨质疏松的效果。大量研究发现,药物可通过定向诱导BMSCs的成骨性分化过程来促进成骨细胞的骨形成作用,从而达到减缓骨质疏松的效果。目前已发现多种中药及其中药单体成分对治疗骨质疏松和提高峰值骨量具有显着效果。本实验室已证实了多种中药单体对成骨细胞活性、矿化能力和大鼠峰值骨量的提高具有显着作用,其中包括淫羊藿苷、金丝异黄铜和异补骨脂素等。木香烃内酯是从传统中药木香中提取的一种倍半萜内酯,其具有抗炎、抗癌、抗真菌等多种药理活性。已有许多报道表明,木香烃内酯具有抗氧化作用和抗炎特性,且以剂量依赖性方式抑制RANKL诱导HSCs向破骨细胞分化。已有报道,木香烃内酯能有效降低炎症信号通路NF-κB通路和激活Wnt/β-catenin信号通路。因此考虑木香烃内酯是否有促进BMSCs分化为成骨细胞的作用。本实验用木香烃内酯作为诱导剂,体外检测其对BMSCs向成骨细胞分化的诱导效果,研究木香烃内酯对大鼠骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响,探究其在治疗和预防骨质疏松中的应用价值。现将论文报告如下:本论文采用的主要研究方法:1.采用全骨髓贴壁培养法提取分离和培养rBMSCs,通过细胞形态学观察、成骨性诱导培养9d后的ALP组织化学染色和成骨性诱导培养12d后的钙化结节组织化学染色建立起rBMSCs体外培养体系和成骨性诱导培养体系;2.比较不同浓度木香烃内酯(1×10-8mol/L～1×10-5mol/L)对rBMSCs成骨性诱导培养9d后ALP活性的影响,确定木香烃内酯成骨性诱导rBMSCs的最佳成骨诱导浓度并用于后续实验;3.通过检测最佳浓度木香烃内酯对rBMSCs成骨性诱导培养9d后ALP阳性克隆形成的影响、成骨性诱导培养12d后钙化结节阳性克隆形成的影响、成骨性诱导培养24h、48h和96h后成骨相关基因（Collagen1、RUNX2、OSX、BMP-2）m RNA表达的影响、成骨性诱导培养48h和96h后成骨相关蛋白（Collagen1、RUNX2、OSX、BMP-2）蛋白表达的影响,确定木香烃内酯对rBMSCs成骨性分化的影响;4.通过检测最佳浓度木香烃内酯对成骨性诱导培养rBMSCs 9d后脂滴形成的影响、木香烃内酯成骨性诱导培养24h、48h和96h后脂肪标志基因（PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、adiponectin）m RNA表达的影响,确定木香烃内酯对rBMSCs成脂性分化的影响;5.通过检测最佳浓度木香烃内酯成骨性诱导培养rBMSCs 24h、48h和96h后对Wnt/β-catenin和OPG/RANKL/RANK信号通路的关键因子Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL m RNA的影响、成骨性诱导培养48h和96h后对Wnt/β-catenin和OPG/RANKL/RANK信号通路的关键因子Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL蛋白表达的影响,确定木香烃内酯促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨性分化的机制。本论文得到的主要实验结果如下:1.1×10-6mol/L木香烃内酯具有最佳的促进rBMSCs成骨性分化活性;2.木香烃内酯组ALP阳性克隆形成数明显多于对照组（P<0.01）;3.木香烃内酯组形成钙化结节数显着多于对照组（P<0.01）;4.木香烃内酯处理BMSCs 24h、48h、96h后,木香烃内酯组Collagen1、RUNX2、OSX和BMP-2的m RNA表达水平显着高于对照组;5.木香烃内酯处理BMSCs 48h、96h后,木香烃内酯组Collagen1、RUNX2、OSX和BMP-2蛋白的表达水平显着高于对照组;6.木香烃内酯组形成的脂滴明显少于对照组（P<0.01）;7.木香烃内酯处理BMSCs 24h、48h、96h后,PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和adiponectin的m RNA表达水平均低于对照组;8.木香烃内酯处理BMSCs 24h、48h、96h后,木香烃内酯组Wnt10b、β-catenin和OPG的m RNA表达水平均高于对照组（P<0.01）,RANKL m RNA表达水平显着低于对照组（P<0.01）;9.木香烃内酯处理BMSCs 48h、96h后,木香烃内酯组Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白表达水平明显高于对照组,RANKL蛋白表达水平明显低于对照组。以上结果表明:本论文成功分离和培养了rBMSCs,并筛选出1×10-6mol/L木香烃内酯作为诱导rBMSCs成骨性分化的最佳药物浓度;木香烃内酯不仅可以促进rBMSCs的成骨活性还可以抑制rBMSCs的成脂性分化;木香烃内酯在提高Wnt/β-catenin信号途径活性的同时还升高OPG/RANKL比值。木香烃内酯可能通过发挥对Wnt/β-catenin和OPG/RANKL/RANK信号通路促进rBMSCs的成骨性分化。
吴思敏[4]（2021）在《松脂醇二葡萄糖苷对体外培养成骨细胞成骨性分化的影响与机制研究》文中研究说明骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种严重困扰中老年健康的代谢性骨病,目前还没有理想的治疗药物,虽然双膦酸盐已非常普及,但其口服的吸收性不好,并且有明显的副作用。因此,寻找新的安全有效的抗骨质疏松药物仍是一项当务之急。近年来,中草药因其成本低、易获取、副作用小等特点而在骨质疏松防治方面引起人们的浓厚兴趣,相关文献报道呈快速增长之势。本论文根据文献报道和前期研究结果选取淫羊藿苷（ICA）、松脂醇二葡萄糖苷（PDG）、木香烃内酯（COS）和去氢木香内酯（DEH）四种中草药单体,比较研究了它们对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞（ROBs）成骨性分化的影响,在确定其中最优者后对其促进成骨活性的信号通路进行了研究,以期为开发抗骨质疏松新药奠定基础。本论文的主要实验方法和步骤如下:1.应用酶解法对出生48h内的大鼠乳鼠颅骨成骨细胞进行提取、分离和培养;2.ICA、PDG、COS和DEH均采用6种浓度(0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L)进行比较研究,以碱性磷酸酶（ALP）活性、成骨相关基因和蛋白表达量为衡量指标,筛选确定最佳单体化合物;3.应用组织化学染色法,探究最佳单体化合物对成骨细胞形成ALP染色阳性克隆和钙化结节的影响;4.用Western blot和Real time-PCR研究最佳单体化合物对成骨相关BMP-2、RUNX-2、CollagenⅠ和OSX基因与蛋白表达量的影响;5.用Western blot、Real time-PCR和免疫荧光染色技术来探索最佳单体对Wnt和BMP-2信号通路活性的影响。以上实验得到的主要结果如下:1.根据对ALP活性的影响,以PDG对ALP活性的提高幅度最大,ICA居其次。2.ICA、PDG和COS均可提高ROBs成骨性标志蛋白的表达量,只有DEH无明显效果。基因表达检测结果与蛋白相似。总体而言,PDG的提高效果最高最稳定。3.PDG可显着增加ROBs形成的ALP染色阳性克隆和钙化结节数量（P<0.01）。4.用PDG处理ROBs 24h后,OSX、OCN和CollagenⅠ的基因表达量显着高于对照组,48h后OSX和CollagenⅠ的表达量开始下降。5.PDG处理ROBs 24h后,Wnt 10b和β-catenin的蛋白表达量均升高,β-catenin发生了明显的核转位;BMP-2信号通路中的BMP-2与RUNX-2在PDG处理24h后表达量增高,48h后BMP-2进一步升高但RUNX-2略有下降。上述实验结果表明,在ICA、PDG、COS和DEH四种中药单体中,以PDG促进体外培养成骨细胞骨形成的效果最好。最佳浓度(1×10-6mol/L)的PDG显着提高ROBs的ALP活性,ALP染色染色阳性克隆和钙化结节数量,促进成骨相关基因和蛋白的表达。PDG既激活了Wnt信号通路,又提高了BMP-2信号通路活性,说明其促进成骨活性可能是在两条途径的协同作用下完成的。
王梦溪[5]（2020）在《2.4 GHz Wi-Fi电磁辐射对成骨细胞影响的研究》文中研究表明无线上网（Wireless Fidelity,Wi-Fi,也称无线保真或行动热点）因其覆盖范围广、传输速度快、无需布线等优势,已被广泛的应用于各类无线电电子设备的信号传输,成为环境电磁辐射的最大来源。近身接触的手机、人体域网、可穿戴电子设备或者笔记本电脑等移动电子产品发出的Wi-Fi信号辐射可以穿透手指和头面部较薄的皮肤肌肉到达骨组织,对骨细胞的主要功能造成潜在影响。长期以来,人们所关注的都是电磁辐射对器官、组织、机体的电磁效应生物实验的宏观性表面所展示的现象观察,缺乏微观的细胞层面的研究,而且在结果的分析和论述上对于实际上的“生物”——“电磁”效应之间设立了专业界限,往往分离为“生物”结果与“电磁”效应的两个不同的独立分析方法而导致结论的片面性,最终的研究结论无法全面解释生物电磁机理的实质。随着Wi-Fi信号辐射源、辐射强度、暴露时间、覆盖面积和覆盖密度的不断增加,Wi-Fi信号辐射的电磁生物效应已经成为不可忽视的问题,有必要从构成生物的基本单元——细胞为突破口,开展更深层次生物电磁效应方面的探索研究。本研究以日常应用最为广泛的2.4 GHz Wi-Fi信号作为电磁激励辐射源,从WiFi信号辐射的机理出发,以离体成骨细胞作为研究的生物基本单元,通过全波电磁仿真实验研究离体成骨细胞接受Wi-Fi照射后的辐射吸收量和温升状况,将生物电磁效应的理论研究与细胞离体实验观察研究有机结合,进行数据的比对和思维的交叉,以电磁仿真为依据,以实验为证据,以生物细胞电磁效应为机制,分析电磁辐射本质与生物现象之间的直接关系,揭示“热效应”、“非热效应”和“积累效应”三大生物电磁效应在Wi-Fi信号辐射引起的成骨细胞生物反应的内在实质,更加全面地认识细胞电磁效应的量变与质变关系。本文的主要内容概括如下:（1）从样本最佳能量耦合角度设计Wi-Fi辐射系统“类TEM小室”实验装置,明确基本物理参数并进行物理建模;结合时域有限差分方法（Finite Difference Time Domain,FDTD）的全波电磁仿真原理和运算特点推导电磁波吸收比值（Specific Absorption Rate,SAR,或比吸收率）和温升值的计算公式,确定模型吸收边界条件与热交换边界条件;严格按照离体生物细胞样本标准进行成骨细胞生物建模,选择具有代表性的可量化的成骨细胞生物检测项。（2）利用FDTD仿真分析2.4 GHz电磁波的波特征与细胞皿的尺寸对细胞层SAR值的影响,证实了细胞皿的尺寸影响细胞层的能量耦合强度,电磁波的极化特性决定SAR值分布形态,60 mm细胞皿的细胞样本模型在垂直入射的2.4 GHz频率的平面波可获得最大能量耦合。对细胞培养箱内2.4 GHz Wi-Fi信号辐射成骨细胞的模型进行FDTD仿真,获得了细胞层电场值、SAR值和温升值及其分布。通过能量透射效率和细胞层温升模型仿真理论数值和实测值对比证实二者吻合较好。（3）通过对成骨细胞早期分化标志蛋白Runx2（Runt-related Transcription Factor 2或Cbfa1）和OSX（Osterix）、成骨细胞功能信号蛋白Eph B4和ephrin B2、氧化应激（Oxidative Stress,OS）指标氧自由基（Reactive Oxygen Species,ROS）和谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、矿化结节染色等检测,发现了成骨细胞“非热效应”与Wi-Fi信号辐射时间和强度的依赖性,验证了非热效应的“积累效应”与电磁效应的生物反应程度之间的关系,证实2.4 GHz Wi-Fi信号辐射近距离、较高辐射强度、多次连续照射对成骨细胞分化、功能、矿化等主要功能的潜在影响。（4）通过对2.4 GHz Wi-Fi信号长时间、多次辐射成骨细胞的离体实验,证实Wi-Fi信号辐射是一种外源性氧化应激刺激源,“非热效应”多次照射的“累积效应”会加剧ROS的生成、降低细胞自身清除ROS的速度。运用药物梯度“干预法”证实维生素C可有效抑制2.4 GHz Wi-Fi信号辐射所引起的成骨细胞ROS的生成、促进GSH的生成、加快ROS的清除和减轻“积累效应”的不良生物影响。细胞培养箱单纯升温实验排除了细胞层“热效应”升温和辐射系统产热对实验结果的干扰,证实2.4 GHz Wi-Fi信号辐射引起的成骨细胞ROS的升高是“非热效应”作用结果。通过各细胞皿间ROS生成量对比分析的生物验证法证实系统辐射电磁场与生物组织相互作用均匀性较好。
黄俊飞[6]（2016）在《摩鲁新-L衍生物的合成及其抗骨质疏松活性研究》文中指出骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种全身系统性骨骼疾病,主要以骨量减少从而导致骨折危险性增加并伴着剧烈疼痛,某些情况下会导致死亡。由于雌激素替代疗法的毒副作用,传统民族药更具安全性和实用性,多年来学者一直致力从动植物药材中开发新的抗骨质疏松天然产物或其衍生物。本课题在前期研究中发现,桑白皮中的主要活性成分Morusignin-L在一定浓度范围内对破骨细胞分化及功能有抑制作用,对成骨细胞增殖有促进作用。为进一步开发桑白皮对骨质疏松的作用,本研究以Morusignin-L骨架为目标化合物,对其进行合成及结构修饰,然后考察其抗骨质疏松的活性,为抗骨质疏松的新药研究提供数据支持。课题第一部分进行的是破骨细胞和成骨细胞的体外培养。破骨细胞的培养采用原代分离诱导的方法得到诱导剂选用1α,25-（OH）2Vit D3进行诱导;成骨细胞的培养,选用subclone14 MC3T3-E1成骨细胞株为对象,经过复苏,培养,传代后进行试验。课题的第二部分对Morusignin-L等7个化合物进行了体外抗骨质疏松活性研究,首先是破骨细胞活性考察,于培养后的第八天,对其进行TRAP活力测定、TRAP+细胞计数和骨吸收陷窝面积检测衍生物对破骨细胞分化及骨吸收活性的影响;然后是成骨细胞活性考察,本实验采用MTT法测定化合物对成骨细胞增殖作用的影响,结果表明此类化合物具有良好的体外抗骨质疏松活性。课题的第三部分对Morusignin-L骨架化合物进行合成及结构修饰。首先,以丙二酸单乙酯钾盐和不同取代的苯甲酰氯作为原料合成了邻氯、邻溴等两个同骨架类似物。然后,以丁烯酮为原料引入3-丁酮侧链,继而在微波辅助下与间苯三酚一步合成黄酮骨架,随后与丁烯醛微波干法反应合成Morusignin-L骨架化合物,最后还原3-丁酮侧链中的羰基或格式试剂引入其他基团等对Morusignin-L骨架进行结构修饰,共合成14个衍生物。课题第四部分实验对合成的18个Morusignin-L衍生物进行体外抗骨质疏松活性研究,指标测定参照第二部分实验进行考察。数据统计分析结果表明:化合物Morusin、西瑞香素、Morusignin-L、BC-8、H-L-1b、H-X-2b、H-X-3a、H-X-4a能够有效的抑制破骨细胞分化和促进成骨细胞增殖。化合物1×10-5mol/L浓度组抑制破骨细胞分化作用最为显着（P<0.01）,1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L浓度组也能够有效抑制破骨细胞分化;促进成骨细胞增殖研究中,除了Morusignin-L和BC-8两个化合物的1×10-5mol/L浓度组对成骨细胞增殖有抑制作用外,其他化合物各浓度组均能促进成骨细胞增殖。
魏双平,李蒙,李瑞玉,吴立萍,孙艳孚,颜军礼[7]（2013）在《传统中药对成骨细胞及骨钙素合成的影响》文中研究表明背景:成骨细胞体外培养及其中药干预是研究和开发中药治疗骨质疏松症的重要手段之一。目的:观察中药对成骨细胞增殖、分化及对骨钙素合成的影响。方法:收集不同类别中药载药血清对体外成骨细胞及骨钙素分泌影响的相关研究,进行实验数据分析,从细胞分子生物学水平认识传统中药影响成骨细胞合成骨钙素的作用。结果与结论:部分单味中药和中药复方有促进成骨细胞增殖、分化及骨钙素的合成作用,并且不同中药成分对成骨细胞增殖和分化的促进作用及提高骨钙素表达水平不同,与这种中药载药血清浓度在一定范畴内呈正相关。通过对成骨细胞体外培养方法的筛选,找出促进细胞增殖和分化的药物及适宜剂量,对研制治疗骨质疏松症的药物具有积极促进作用。
周建[8]（2011）在《低频电磁场促进骨形成最佳参数筛选研究》文中研究说明1994年世界卫生组织（world health organization,WHO）对骨质疏松症（osteoporosis，OS）的定义为骨量减少、骨组织细微结构破坏、骨的脆性增加，导致骨折危险性增加为特征的一种全身系统性骨骼疾病。许多研究结果表明：低频电磁场具有缓解骨质疏松患者疼痛和提高骨密度等优点，因此具有良好的开发应用前景。但不同研究机构、不同作者所采用磁场参数差别很大，出现不同的实验结果。本论文系统筛选了频率为50Hz电磁场促进骨形成的最佳磁场强度、波形、处理时间等，并研究了所筛选获得的最佳参数对体外培养大鼠股骨组织代谢活性影响。体外分离培养新生大鼠原代成骨细胞，传一代（P1）后分别用电磁场处理。1、用50Hz、0.9～4.8mT （间隔0.3mT）的正弦交变电磁场处理P1代成骨细胞每天30min；2、用50Hz1.8mT正弦交变电磁场每天处理成骨细胞不同时间0.5h3.0h（间隔0.5h）；3、用50Hz1.8mT四种不同波形（正弦、三角、方波和锯齿）电磁场每天处理P1成骨细胞1.5h；4、用50Hz1.8mT处理体外分离培养的大鼠股骨组织每天1.5h；结果发现0.9～4.8mT之间有两个促进成骨细胞分化成熟的最佳磁感应强度，即1.8mT和3.6mT，各个磁场强度均抑制成骨细胞增殖；正弦波抑制成骨细胞增殖，方波促进成骨细胞增殖，三角波显着促进成骨细胞的分化成熟、正弦波次之；50Hz、1.8mT正弦交变磁场每天处理成骨细胞1h和1.5h较其他组能极显着促进成骨细胞成熟分化；同时发现50Hz、1.8mT正弦交变磁场每天处理大鼠股骨细胞1.5h能极显着促进相关骨代谢活性。结果表明，电磁能促进成骨细胞的分化成熟，在促进其分化成熟的过程中存在一个最佳的强度、时间、波形效应参数。采用上述最佳的参数研究电磁对大鼠股骨组织的影响，结果发现电磁能提高股骨组织的代谢活性。
范桂金[9]（2011）在《As2O3对体外培养成骨细胞增殖与凋亡和BMP-2基因表达的影响》文中认为目的：观察不同剂量三氧化二砷对体外培养成骨细胞形态特征的影响；检测不同剂量三氧化二砷对成骨细胞增殖与凋亡的影响及其BMP-2基因表达的影响,以期从基因水平上探讨三氧化二砷对成骨细胞的作用机制,为砷的毒理作用和应用药理学的研究提供实验依据。方法：不同浓度（100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L）的三氧化二砷作用于体外培养的成骨细胞后,进行如下检测：倒置显微镜观察成骨细胞的形态；MTT法检测成骨细胞的增殖；AnnexinV-FITC双染法和TUNEL法检测成骨细胞的凋亡；RT-PCR检测成骨细胞BMP-2基因的表达情况。结果：①形态学观察显示：100μmol/L组成骨细胞出现核溶解、胞质空泡化现象,无法分辨细胞质和细胞核,10μmol/L组可见部分成骨细胞变圆变小,细胞核固缩、碎裂,细胞膜皱褶、凹陷；1mol/L组成骨细胞数目众多和分裂相明显；0.1μmol/L组成骨细胞间连接紧密。②MTT法结果显示：100μmol/L和10μmol/L组OD值明显低于对照组,且72h OD值低于48h OD值,统计学比较有显着性差异（P<0.01）；1μmol/L组OD值明显高于对照组,且72h OD值高于48h OD值,统计学比较有显着性差异（P<0.01）;0.1μmol/L组72h OD值与48h OD值比较无统计学意义（P>0.05）,且OD值与对照组比较无统计学意义（P>0.05）、③AnnexinV-FITC/PI双染法和TUNEL法结果均显示：与对照组凋亡率（8.13%、12.12%）比较,10μmol/L组凋亡率（21.6%、18.4%）升高,有显着性差异（P<0.01）；1μmol/L组凋亡率（5.27%、9.35%）下降,有统计学意义（P<0.05）；0.1μmol/L组凋亡率（7.86%、10.26%）无统计学意义（P>0.05）。④RT-PCR结果显示：10μmol/L组72h BMP-2基因表达（0.15±0.03）明显低于48h BMP-2基因表达（0.31±0.11）,且BMP-2的表达明显低于对照组（0.86±0.13、0.84±0.08）,统计学比较有显着性差异（P<0.01）; 1μmol/L组72h BMP-2基因表达（0.84±0.06）与48h BMP-2基因表达（0.81±0.22）比较无统计学意义（P>0.05）,且BMP-2基因表达与对照组比较无统计学意义（P>0.05）；0.1μmol/L组72h BMP-2基因表达（4.49±0.19）明显高于48h BMP-2基因表达（1.29±0.14）,且BMP-2的表达明显高于对照组,统计学比较有显着性差异（P<0.01）。结论：1.As2O3对体外培养大鼠成骨细胞增殖和凋亡具有双向调节作用；2.As2O3对体外培养大鼠成骨细胞BMP-2基因表达具有双向调控作用；3.As2O3可能通过调控BMP-2基因的表达,影响成骨细胞的增殖和凋亡,从而影响其成骨功能。
张晓玮[10]（2010）在《补肾中药血清对成骨细胞中BMP2、7与Smad1/5信号转导蛋白活性的影响》文中指出目的:通过研究补肾中药血清对离体SD大鼠成骨细胞中BMP2、BMP7、Smad1/5在细胞中活性的变化,探讨骨质疏松症病机的分子生物学机制;研究补肾益髓壮骨中药防治骨质疏松症的作用机理,从而为临床防治骨质疏松症提供科学的实验依据。材料与方法:采用多次胶原酶消化法获取新生SD大鼠颅盖骨中的成骨细胞进行体外培养,并应用Gomori改良钙钴法对其进行碱性磷酸酶表达的鉴定。随机将实验用大鼠分为正常组、骨疏康颗粒对照组（骨疏康组）、补肾中药组（补肾组）、补中益气颗粒对照组（补脾组）;对实验大鼠给药干预8天后,通过血清药理学的方法使用各组大鼠血清培养成骨细胞48小时,另设加入UPP通路的蛋白酶体抑制剂MG132作为对照组;应用MTT法检测离体成骨细胞的增殖率,并应用免疫组化SABC法检测成骨细胞中BMP2、BMP7、Smad1/5活性的表达。结果:1补肾中药血清作用于体外培养的成骨细胞48小时后可以明显促进成骨细胞的增殖（P< 0.01）。2应用UPP通路蛋白酶体抑制剂MG132可以明显抑制成骨细胞的增殖（P<0.01）。3成骨细胞碱性磷酸酶染色结果:成骨细胞经Gomori改良钙钴法染色和苏木精复染后,可见棕黑色细微颗粒,多数分布于细胞膜上以及周围,胞浆中也可见到少量颗粒。阴性对照组细胞内无棕黑色颗粒,细胞核内可见嗜苏木精之蓝色颗粒。4成骨细胞BMP2免疫组化结果:与正常组比较,骨疏康组和补肾组表达水平明显上升（P<0.01）;补脾组、MG132+正常组、MG132+骨疏康组、MG132+补肾组和MG132+补脾组表达水平明显降低（P<0.01）。与补肾组比较,各组的表达水平均明显降低（P<0.01）。5成骨细胞BMP7免疫组化结果:与正常组相比,补肾组表达水平明显上升（P<0.01）;骨疏康组、补脾组、MG132+正常组、MG132+骨疏康组、MG132+补肾组和MG132+补脾组表达水平明显降低（P<0.01）。与补肾组比较,各组表达水平均明显降低（P<0.01）。加入MG132的各含药血清组中,MG132+正常组表达水平最高,MG132+补肾组与MG132+正常组比较其阳性表达水平降低（P<0.01）。6成骨细胞Smad1/5免疫组化结果:与正常组相比,补肾组、骨疏康组、补脾组、MG132+正常组、MG132+骨疏康组、MG132+补肾组和MG132+补脾组表达水平明显降低（P<0.01）。与补肾组比较,骨疏康组、补脾组、MG132+正常组、MG132+骨疏康组、MG132+补肾组和MG132+补脾组表达水平明显降低（P<0.01）。加入MG132的各含药血清组中,MG132+正常组表达水平最高,MG132+补肾组与MG132+正常组比较阳性表达水平降低（P<0.01）;MG132+补肾组与MG132+骨疏康组、MG132+补脾组比较阳性表达水平上升（P<0.01）。结论:1采用多次胶原酶消化法获取大鼠成骨细胞进行体外培养的方法是可靠、简便、易行的,可以提供大量高纯度的成骨细胞用于科学研究使用。2体外培养的新生大鼠颅盖骨中存在BMP2、BMP7和Smad1/5的活性表达,表明正常大鼠成骨细胞中存在BMP-Smad信号转导通路。3补肾中药血清可以明显促进成骨细胞的增殖,明显升高成骨细胞中BMP2、BMP7和Smad1/5的表达水平,提示补肾益髓壮骨中药具有防治骨质疏松症的作用。4应用UPP通路的蛋白酶体抑制剂MG132可以明显抑制成骨细胞的增殖,并且明显降低成骨细胞中BMP2、BMP7和Smad1/5的表达水平。5应用补肾益髓壮骨中药血清具有干预蛋白酶体抑制剂MG132抑制成骨细胞增殖的作用,对体外培养成骨细胞中BMP2、BMP7和Smad1/5活性的表达有明显提升作用。
二、体外培养成骨细胞的影响因素（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、体外培养成骨细胞的影响因素（论文提纲范文）
（1）基于成骨和破骨细胞PI3K/Akt信号通路的右归丸对雌雄去势大鼠骨质疏松症治疗作用性别差异的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 中医药防治骨质疏松症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验一 右归丸对雌、雄去势大鼠骨质疏松症治疗作用差异及对PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 右归丸对雌、雄去势大鼠腰椎BMD变化率的影响 |
| 2 右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨微观结构的影响 |
| 3 右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL蛋白表达及RANKL/OPG比值的影响 |
| 4 右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中成骨细胞BGP蛋白表达的影响 |
| 5 右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中成骨细胞PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 6 右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中破骨细胞TRAP蛋白表达的影响 |
| 7 右归丸对雌、雄去势大鼠胫骨骨髓中破骨细胞PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 小结 |
| 实验二 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 成骨细胞形态学观察 |
| 2 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞BGP蛋白表达的影响 |
| 3 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞OPG、RANKL蛋白表达及RANKL/OPG比值的影响 |
| 4 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞PI3K、Akt、GSK3β、β-catenin和Runx2 mRNA表达的影响 |
| 5 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对成骨细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin和RUNX2蛋白表达影响 |
| 小结 |
| 实验三 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 破骨细胞形态学观察 |
| 2 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞分化的影响 |
| 3 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞骨吸收功能的影响 |
| 4 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞TRAP蛋白表达的影响 |
| 5 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞PI3K、Akt、TRAF6、c-Src、NFATc1 mRNA表达的影响 |
| 6 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清对破骨细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、TRAF6、c-Src、NFATc1蛋白表达的影响 |
| 小结 |
| 实验四 雌、雄去势大鼠右归丸含药血清在PI3K激动剂作用下对破骨细胞分化、功能及其PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 PI3K/Akt信号通路在雌、雄去势大鼠右归丸含药血清抑制破骨细胞分化中的作用 |
| 2 PI3K/Akt信号通路在雌、雄去势大鼠右归丸含药血清抑制破骨细胞功能中的作用 |
| 3 PI3K/Akt信号通路在雌、雄去势大鼠右归丸含药血清抑制破骨细胞TRAF6、c-Src、NFATc1 mRNA表达的作用 |
| 4 PI3K/Akt信号通路在雌、雄去势大鼠右归丸含药血清抑制破骨细胞TRAF6、c-Src、NFATc1蛋白表达中的作用 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
| 附图 |
| 附件 |
（2）龟鹿二仙胶经成骨细胞来源外泌体抗骨质疏松的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 龟鹿二仙胶在骨质疏松症领域研究进展及其现代应用迷思 |
| 1.1 临床应用 |
| 1.2 基础研究 |
| 1.3 现代应用迷思 |
| 1.4 小结 |
| 2 龟鹿二仙胶治疗原发性骨质疏松症有效性与安全性的Meta分析 |
| 2.1 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 局限性 |
| 2.5 结论 |
| 3 前期研究基础及本课题的研究思路 |
| 3.1 “阴阳平衡”与骨稳态 |
| 3.2 成骨细胞-破骨细胞间信号通路的交互 |
| 3.3 外泌体介导的成骨—破骨细胞间交互作用 |
| 第二部分 成骨细胞来源外泌体的提取、制备与鉴定 |
| 1 材料与设备 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 主要实验方法 |
| 2.1 制备去外泌体血清 |
| 2.2 成骨细胞体外分离培养与鉴定 |
| 2.3 OB-EV制备 |
| 2.4 OB-EV透射电镜观察 |
| 2.5 粒径与浓度检测 |
| 2.6 Western Blot技术检测EV标志蛋白 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 去外泌体血清制备效果验证 |
| 3.2 成骨细胞分离、培养与鉴定 |
| 3.3 EV分离与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 GEG-OB-EV对去势大鼠骨质疏松模型的作用与机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制方法 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 体重指数 |
| 2.2 GEG含药血清对OB活性的影响 |
| 2.3 血清骨代谢指标 |
| 2.4 Micro-CT |
| 2.5 骨组织病理学染色 |
| 2.6 PRM检测目标蛋白 |
| 2.7 荧光定量PCR检测TGF-β/Smads通路与破骨分化通路相关指标 |
| 2.8 生物力学测试 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 GEG-Mc3t3-EV对体外培养破骨细胞功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 主要试剂与配制方法 |
| 1.3 细胞系来源 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GEG含药血清对Mc3t3-E1活性的影响 |
| 2.2 EV摄取实验 |
| 2.3 TRAP染色及Image半定量分析破骨细胞分化程度 |
| 2.4 破骨细胞骨吸收能力检测 |
| 2.5 流式细胞术检测RAW264.7凋亡情况 |
| 2.6 RT-PCR检测破骨细胞mRNA表达水平 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 创新之处 |
| 3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）木香烃内酯对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 骨质疏松症概述 |
| 1.2 骨髓间充质干细胞及其成骨性分化分子机制 |
| 1.2.1 骨髓间充质干细胞及其功能 |
| 1.2.2 BMSCs成骨性分化的调控因素 |
| 1.3 木香与木香烃内酯 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 大鼠骨髓间充质干细胞的提取、培养与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的提取及培养 |
| 2.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的纯化及传代 |
| 2.2.3 大鼠骨髓间充质干细胞的定向成骨性分化 |
| 2.2.4 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大鼠骨髓间充质干细胞的细胞形态学观察结果 |
| 2.3.2 大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 木香烃内酯对RBMSCS成骨性分化的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备与耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CL成骨诱导培养基的配制及实验分组 |
| 3.2.2 CL成骨诱导rBMSCs的最佳浓度的筛选 |
| 3.2.3 ALP组织化学染色 |
| 3.2.4 钙化结节组织化学染色 |
| 3.2.5 RT-q PCR检测CL对 rBMSCs成骨相关基因表达的影响 |
| 3.2.6 western blotting检测CL对 rBMSCs成骨相关蛋白表达的影响 |
| 3.2.7 统计与分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CL处理rBMSCs对其ALP活性的影响 |
| 3.3.2 CL处理rBMSC对其碱性磷酸酶阳性克隆形成的影响 |
| 3.3.3 CL处理rBMSCs对其钙化结节阳性克隆形成的影响 |
| 3.3.4 CL处理rBMSCs对其成骨相关基因表达的影响 |
| 3.3.5 CL对其成骨相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 木香烃内酯对RBMSCS成脂性分化的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备与耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 油红O组织化学染色 |
| 4.2.2 RT-qPCR检测CL对 rBMSCs脂肪相关基因的影响 |
| 4.2.3 统计与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CL处理rBMSCs对其脂滴形成的影响 |
| 4.3.2 CL处理rBMSCs对其脂肪相关基因表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 木香烃内酯诱导RBMSCS成骨性分化的机制研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 RT-qPCR检测成骨性分化信号通路相关基因表达的影响 |
| 5.2.2 western blotting检测成骨性分化信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 5.2.3 统计与分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CL对 Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 5.3.2 CL对 OPG/RANKL/RANK信号通路的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文 |
（4）松脂醇二葡萄糖苷对体外培养成骨细胞成骨性分化的影响与机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 骨质疏松症 |
| 1.1.1 骨质疏松症的定义及其危害 |
| 1.1.2 骨质疏松症的发病机制 |
| 1.1.3 骨重建相关信号通路 |
| 1.2 骨质疏松症的治疗 |
| 1.2.1 骨质疏松症的治疗药物及其进展 |
| 1.2.2 淫羊藿苷等中药单体的抗骨质疏松研究进展 |
| 1.3 课题意义 |
| 第2章 四种中药单体成骨活性的比较研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 新生大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(ROBs)的提取分离与培养 |
| 2.2.2 最佳单体浓度的筛选 |
| 2.2.3 碱性磷酸酶(ALP)的活性测定 |
| 2.2.4 Western Blotting分析 |
| 2.2.5 Real Time RT-PCR检测 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 新生大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(ROBs)的形态观察 |
| 2.3.2 最佳药物浓度的筛选结果 |
| 2.3.3 对成骨细胞相关蛋白表达的影响 |
| 2.3.4 对成骨细胞相关基因表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 松脂醇二葡萄糖苷对成骨细胞成骨性分化的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 新生大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(ROBs)的提取分离与培养 |
| 3.2.2 细胞分组与加药处理 |
| 3.2.3 碱性磷酸酶(ALP)染色 |
| 3.2.4 钙化结节染色 |
| 3.2.5 Western Blotting蛋白表达分析 |
| 3.2.6 Real Time RT-PCR基因检测 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PDG对 ROBs形成ALP染色阳性克隆的影响 |
| 3.3.2 PDG对成骨细胞形成钙化结节的影响 |
| 3.3.3 PDG对成骨相关蛋白表达量的影响 |
| 3.3.4 PDG对成骨相关基因表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 松脂醇二葡萄糖苷对成骨相关信号通路的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 新生大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(ROBs)的提取分离与培养 |
| 4.2.2 细胞分组与加药处理 |
| 4.2.3 Western Blotting蛋白表达分析 |
| 4.2.4 Real Time RT-PCR基因检测 |
| 4.2.5 免疫荧光染色 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PDG对 Wnt10b和 β-catenin蛋白表达量的影响 |
| 4.3.2 PDG对 Wnt10b和 β-catenin基因表达量的影响 |
| 4.3.3 PDG对 β-catenin发生核转位的影响 |
| 4.3.4 PDG对 BMP-2和RUNX-2 蛋白表达量的影响 |
| 4.3.5 PDG对 BMP-2和RUNX-2 基因表达量的影响 |
| 4.4 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
（5）2.4 GHz Wi-Fi电磁辐射对成骨细胞影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.1.1 课题背景 |
| 1.1.2 课题研究的目的及意义 |
| 1.2 Wi-Fi信号辐射生物电磁效应国内外研究现状 |
| 1.2.1 生物电磁效应的基础理论研究 |
| 1.2.2 Wi-Fi信号辐射生物电磁效应的应用研究 |
| 1.3 本文的主要研究内容 |
| 第2章 Wi-Fi信号辐射作用于成骨细胞的模型构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 Wi-Fi信号辐射作用于成骨细胞的物理模型构建 |
| 2.2.1 细胞皿建模 |
| 2.2.2 细胞辐射建模系统 |
| 2.2.3 细胞辐射系统模型FDTD仿真原理分析 |
| 2.2.4 细胞辐射系统模型FDTD仿真参数 |
| 2.3 体外成骨细胞培养的生物特征及其模型建模表征方法 |
| 2.3.1 体外成骨细胞培养诱导和鉴定 |
| 2.3.2 成骨细胞模型表征方法 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 Wi-Fi信号辐射成骨细胞电磁仿真的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 成骨细胞SAR值分布分析与仿真 |
| 3.2.1 细胞皿尺寸对SAR值分布的影响 |
| 3.2.2 波形对SAR值分布的影响 |
| 3.2.3 极化对SAR值分布的影响 |
| 3.3 成骨细胞Wi-Fi信号辐射模型仿真 |
| 3.3.1 电场强度仿真 |
| 3.3.2 SAR值计算 |
| 3.3.3 温升效应仿真 |
| 3.4 实测值与仿真数值的比较分析 |
| 3.4.1 能量透射特性分析 |
| 3.4.2 细胞层温度特性分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 Wi-Fi信号辐射成骨细胞生物应答反应机制的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 Wi-Fi信号辐射成骨细胞的观测 |
| 4.2.1 Wi-Fi信号辐射成骨细胞单日照射暴露观测与时长确定 |
| 4.2.2 Wi-Fi信号辐射成骨细胞多日照射观测与采样日的确定 |
| 4.3 Wi-Fi多日照射成骨细胞的生物电磁效应 |
| 4.3.1 Wi-Fi信号辐射对成骨细胞矿化的影响 |
| 4.3.2 Wi-Fi信号辐射对成骨细胞分化标志Runx2、OSX的影响 |
| 4.3.3 Wi-Fi信号辐射对成骨细胞跨膜蛋白EphB4/ephrinB2的影响 |
| 4.3.4 Wi-Fi信号辐射对成骨细胞ROS、GSH的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 Wi-Fi信号辐射激发成骨细胞氧化效应的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 Wi-Fi信号辐射对成骨细胞氧化的影响 |
| 5.2.1 Wi-Fi信号单次长时间照射ROS和GSH的生成量 |
| 5.2.2 Wi-Fi信号单次照射后ROS的清除速度 |
| 5.2.3 Wi-Fi信号多次照射后ROS的清除速度 |
| 5.3 抗Wi-Fi信号辐射成骨细胞氧化作用的研究 |
| 5.3.1 维生素C的抗氧化作用和最佳浓度的确定 |
| 5.3.2 维生素C对 Wi-Fi单次照射后ROS生成量和清除速度的影响 |
| 5.3.3 维生素C对 Wi-Fi多次照射后ROS生成量和清除速度的影响 |
| 5.4 温升及SAR值均匀性对实验结果可靠性影响分析 |
| 5.5 ROS和SAR的关系 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
（6）摩鲁新-L衍生物的合成及其抗骨质疏松活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Morusignin-L的研究进展 |
| 1.2 骨质疏松的症的预防和治疗 |
| 1.3 抗骨质疏松药物研究进展 |
| 1.4 骨质疏松症的模型 |
| 1.4.1 骨质疏松症的动物模型 |
| 1.4.2 骨质疏松症的其他模型 |
| 1.5 骨质疏松症的机制研究 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 第二章 Morusignin-L等几个化合物体外抗骨质疏松活性研究 |
| 2.1 实验材料及主要试剂、仪器 |
| 2.1.1 实验动物及细胞 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 实验主要仪器 |
| 2.2 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 破骨细胞的分离培养 |
| 2.3.2 实验分组及相关检测指标 |
| 2.3.3 破骨细胞形态学观察 |
| 2.4 成骨细胞的体外培养及指标测定 |
| 2.4.1 成骨细胞的复苏 |
| 2.4.2 成骨细胞的冻存 |
| 2.4.3 MTT法测试成骨细胞的活细胞数量 |
| 2.5 统计学分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 Morusignin-L的体外抗骨质疏松活性 |
| 2.6.2 Morusin的体外抗骨质疏松活性 |
| 2.6.3 西瑞香素的体外抗骨质疏松活性 |
| 2.6.4 化合物BC-6的体外抗骨质疏松活性 |
| 2.6.5 化合物BC-7的体外抗骨质疏松活性 |
| 2.6.6 化合物BC-8的体外抗骨质疏松活性 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 Morusignin-L衍生物的合成 |
| 3.1 实验仪器和主要试剂 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验主要试剂 |
| 3.2 实验路线及方法 |
| 3.2.1 实验路线 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 第四章 Morusignin-L衍生物的体外抗骨质疏松活性研究 |
| 4.1 实验材料及主要试剂、仪器 |
| 4.2 试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 统计学分析 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 LLCCG-4a的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.2 LLCCG-4b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.3 LXCCG-4a的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.4 LXCCG-4b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.5 H-L-1a的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.6 H-L-1b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.7 H-L-3a的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.8 H-L-3b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.9 H-X-1a的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.10 H-X-1b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.11 H-X-2a的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.12 H-X-2b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.13 H-X-3a的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.14 H-X-3b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.15 H-X-4a 的体外抗骨质疏松活 |
| 4.5.16 H-X-4b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.17 H-L-2a的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.5.18 H-L-2b的体外抗骨质疏松活性 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（7）传统中药对成骨细胞及骨钙素合成的影响（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 成骨细胞的起源及骨形成机制 |
| 2.2 骨钙素的生物学特征 |
| 2.3传统中药对成骨细胞以及骨钙素合成影响的国内外相关研究分析 |
| 2.3.1 传统中药对成骨细胞影响的相关研究分析 |
| 2.3.2 中药对成骨细胞骨钙素分泌的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1传统中药对成骨细胞作用、骨钙素合成影响研究所面临的问题 |
| 3.2 小结 |
（8）低频电磁场促进骨形成最佳参数筛选研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 电磁场的生物效应发展 |
| 1.1 电磁场生物效应的类型 |
| 1.2 电磁场类型 |
| 1.3 电磁场频率范围 |
| 2 生物电磁场的几个主要参数 |
| 2.1 强度参数 |
| 2.2 时间 |
| 2.3 频率 |
| 2.4 波形 |
| 3 电磁场生物效应的作用机理 |
| 4 存在的问题 |
| 5 本课题主要研究内容 |
| 第二章 成骨细胞体外培养与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 成骨细胞的分离与培养 |
| 1.6 成骨细胞培养及鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 形态学观察 |
| 2.2 生长动力学分析 |
| 2.3 碱性磷酸酶染色 |
| 2.4 Collagen-Ⅰ免疫组化染色 |
| 2.5 矿化结节染色 |
| 2.6 碱性磷酸酶测定结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 电磁场促进体外培养成骨细胞分化成熟的最佳磁场强度筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞分组与磁场处理 |
| 1.3 成骨细胞增殖分析 |
| 1.4 成骨细胞成熟分化分析 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 成骨细胞形态 |
| 2.2 SEMFs 对成骨细胞增殖的影响 |
| 2.3 SEMFs 对 ALP 活性影响 |
| 2.4 钙化结节染色结果 |
| 2.5 基因表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 电磁场促进体外培养成骨细胞分化成熟的最佳时间筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 对细胞增殖影响 |
| 1.3 成骨性成熟分化分析 |
| 1.4 基因表达水平分析 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 对细胞增殖的影响 |
| 2.2 对 ALP 活性影响 |
| 2.3 SEMFs 对钙盐沉积的影响 |
| 2.4 Real-time time PCR 检测结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 电磁场促进成骨细胞分化成熟波形比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞分组与磁场处理 |
| 1.3 增殖分析 |
| 1.4 成骨细胞成熟分化分析 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态观察 |
| 2.2 增殖分析 |
| 2.3 ALP 活性 |
| 2.4 Collagen-Ⅰ免疫组织化学分析 |
| 2.5 钙盐沉积结果 |
| 2.6 基因表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 最佳参数正弦交变电磁场对体外培养大鼠股骨组织影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 正弦交变磁场发生仪 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 股骨组织分离培养 |
| 1.4 股骨组织分组与磁场处理 |
| 1.5 ALP 活性测定 |
| 1.6. 钙含量测定 |
| 1.7 基因表达水平分析 |
| 1.8 Western blot 印迹检测 BMP-2 蛋白表达量变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 ALP 活性 |
| 2.2 钙含量 |
| 2.3 基因表达分析 |
| 2.4 Western blot 检测型胶原-I |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A：攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
（9）As2O3对体外培养成骨细胞增殖与凋亡和BMP-2基因表达的影响（论文提纲范文）
| 英汉缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）补肾中药血清对成骨细胞中BMP2、7与Smad1/5信号转导蛋白活性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 实验一 补肾中药血清对体外培养成骨细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据处理 |
| 4 结果与分析 |
| 实验一小结 |
| 附图 |
| 实验二 补肾中药血清对体外培养成骨细胞中 BMP2 活性表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 BMP2 在体外培养成骨细胞中的免疫组化表达 |
| 4 数据处理 |
| 5 结果与分析 |
| 实验二小结 |
| 附图 |
| 实验三 补肾中药血清对体外培养成骨细胞中 BMP7 活性的表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 BMP7 在体外培养成骨细胞中的免疫组化检测 |
| 4 数据处理 |
| 5 结果与分析 |
| 实验三小结 |
| 附图 |
| 实验四 补肾中药血清对体外培养成骨细胞中 Smad1/5 活性表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 Smad1/5 在体外培养成骨细胞中的免疫组化检测 |
| 4 数据处理 |
| 5 结果与分析 |
| 实验四小结 |
| 附图 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、体外培养成骨细胞的影响因素（论文参考文献）
- [1]基于成骨和破骨细胞PI3K/Akt信号通路的右归丸对雌雄去势大鼠骨质疏松症治疗作用性别差异的机制研究[D]. 徐慧慧. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]龟鹿二仙胶经成骨细胞来源外泌体抗骨质疏松的作用与机制研究[D]. 司誉豪. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]木香烃内酯对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响及其机制研究[D]. 任莉. 兰州理工大学, 2021(01)
- [4]松脂醇二葡萄糖苷对体外培养成骨细胞成骨性分化的影响与机制研究[D]. 吴思敏. 兰州理工大学, 2021(01)
- [5]2.4 GHz Wi-Fi电磁辐射对成骨细胞影响的研究[D]. 王梦溪. 哈尔滨工业大学, 2020
- [6]摩鲁新-L衍生物的合成及其抗骨质疏松活性研究[D]. 黄俊飞. 贵州大学, 2016(05)
- [7]传统中药对成骨细胞及骨钙素合成的影响[J]. 魏双平,李蒙,李瑞玉,吴立萍,孙艳孚,颜军礼. 中国组织工程研究, 2013(11)
- [8]低频电磁场促进骨形成最佳参数筛选研究[D]. 周建. 兰州理工大学, 2011(01)
- [9]As2O3对体外培养成骨细胞增殖与凋亡和BMP-2基因表达的影响[D]. 范桂金. 遵义医学院, 2011(06)
- [10]补肾中药血清对成骨细胞中BMP2、7与Smad1/5信号转导蛋白活性的影响[D]. 张晓玮. 辽宁中医药大学, 2010(05)