一、HBV感染研究的转基因小鼠模型（论文文献综述）
湛梦茹[1]（2021）在《激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究》文中进行了进一步梳理背景与目的:慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的一种慢性传染性疾病,全球疾病负担重,其中大部分慢性乙肝病毒携带者均在5岁之前被感染。目前没有能够彻底清除HBV的治疗方法。免疫治疗能够实现CHB患者的功能性治愈,是具有前景的乙肝治疗策略之一。慢性HBV感染时免疫系统往往是免疫耐受或衰竭状态。免疫检查点是表达在免疫细胞表面对免疫反应起活化或抑制作用的分子,通过对他们的调节能够打破这种耐受状态。共刺激分子OX40/OX40L、4-1BB是肿瘤坏死因子（受体）超家族（tumor necrosis factor（receptor）superfamily,TNF（R）SF）的成员,在免疫反应的活化尤其是T细胞的活化中起到了重要作用。而程序性死亡受体-1（programmed cell death 1,PD-1）是免疫球蛋白受体CD28亚家族的成员,作为抑制性的信号分子与免疫系统的耐受或衰竭有关。然而目前为止,这些免疫检查点能否作为免疫调节的靶点治疗CHB尚不能明确。相对于婴幼儿,成人对HBV可以产生更强的更有效的免疫反应从而清除病毒,其中发挥年龄依赖性作用的免疫分子尚不清楚。本研究立足于慢性乙型肝炎感染的背景下,通过对OX40/OX40L、PD-1、4-1BB在CHB患者中的表达特点的研究,从而明确其临床意义,及其与年龄的关系。接着我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40,研究其对HBV复制的影响及相关机制,以期为以OX40为靶点治疗CHB的策略提供更多的理论依据。材料与方法:本研究首先收集人的样本用以检测免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。外周血样本来自我们从2018年9月到2019年6月在吉林大学白求恩第一医院纳入的64名慢性乙肝患者和另外招募的37名健康志愿者。其中慢性乙肝患者包括52名未进行抗病毒治疗的患者和12名应用恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗的患者,健康志愿者包括24名成人和13名儿童。从外周血中分离出血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。肝脏组织病理标本来自18名进行肝脏穿刺的患者和6名进行肝脏血管瘤手术的成人患者。其中18名慢性乙肝患者包括9名慢性乙型肝炎发作的患者和9名慢性乙型病毒感染未发作的患者。在收集的人的样本中我们先后检测了OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。为了研究OX40/OX40L在人群中的表达特点,我们应用流式细胞术检测PBMCs中膜形式的OX40和OX40L（membrane-bound OX40,m OX40;membrane-bound OX40L,m OX40L）的表达;应用酶联免疫吸附试验检测血浆中可溶性形式的OX40和OX40L（soluble OX40,s OX40;soluble OX40L,s OX40L）水平;应用免疫组化的方法对肝组织中OX40和OX40L的表达量进行检测。之后为了研究PD-1和4-1BB在CHB患者中表达特点,我们应用前期检测OX40/OX40L的人群样本外加从我院病理科另申请到的6名儿童的肝组织样本,对PD-1和4-1BB在CHB患者中的表达情况进行了检测。我们应用磁珠分选的方法将PBMCs中的CD4+和CD8+T细胞分选出来,应用q RT-PCR的方法检测了各个T细胞亚群PD-1和4-1BB mRNA的水平;应用酶联免疫吸附试验法检测血浆中可溶性的PD-1和4-1BB（soluble PD-1,s PD-1;soluble 4-1BB,s4-1BB）的水平;应用免疫组化的方法检测了肝组织中关于PD-1和4-1BB的表达情况。最后我们将以上检测结果与CHB患者的疾病特点及临床指标进行相关性分析从而探究他们在慢性乙肝感染中的临床意义,及与年龄的关系。基于前期临床样本的结果,我们应用尾静脉注射腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）的方法构建了rAAV/1.3HBV小鼠模型,首次将OX40激动性的单抗应用于该模型以观察其产生的作用。为了明确激活免疫检查点OX40对HBV复制的作用,我们应用全自动电化学发光分析仪检测血清内乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）和乙肝e抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）的水平,用q RT-PCR法检测HBV DNA定量,用免疫组化法检测小鼠肝组织内HBs Ag和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen,HBc Ag）的表达水平。为了明确激活OX40靶点对HBV复制的作用的同时产生的肝脏炎症变化,我们应用微孔板法检测小鼠血清中ALT、AST的水平,应用HE染色的方法观察小鼠肝脏炎症病理变化。为了观察这个过程中伴随的免疫变化,我们分离了小鼠肝脏内浸润的淋巴细胞,应用流式细胞术对其中T细胞亚群的比例进行了检测,同时我们应用流式微球检测法（cytometric bead array,CBA）对该过程中小鼠血清中Th1、Th2、Th17相关的细胞因子进行了评估。期间我们还对小鼠脾脏的长度和重量进行了评估与检测。为了探究上述过程的机制,我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型的基础上将CD4+和CD8+T细胞进行分别剔除,构建了CD4+和CD8+T细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型,连同安慰剂组小鼠同时给予OX40激动剂。应用上述检测方法分别对模型中病毒学变化和血清转氨酶变化进行了检测。同时为了进一步从mRNA水平研究激活OX40靶点对HBV复制的作用过程中基因表达的变化,我们分离了小鼠肝内的淋巴细胞对其进行mRNA转录组测序（mRNA sequencing,mRNA-seq）。测序所得的差异表达的mRNAs（differentially expressed mRNAs,DEmRNAs）分别纳入火山图和聚类热图,并分别应用Go功能富集及KEGG、Reactome通路富集的方法对这些DEmRNAs所富集的功能和通路进行初步探索。研究结果:关于OX40/OX40L在人的样本中的表达结果显示在外周血PBMCs中表达OX40+T细胞的百分比在CHB患者中是减少的,其中在高病毒载量组和肝炎发作组中这种减少的趋势尤其明显,且OX40+T细胞的百分比与血清病毒学指标呈负相关。而OX40L+B细胞和单核细胞的百分比在CHB患者的PBMCs中是增多的,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作的组中也比较明显,且他们主要与肝脏炎症指标呈正相关。同时我们还发现慢性乙肝患者外周血中s OX40/OX40L表达明显升高,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组比较明显,且s OX40/OX40L的水平与病毒复制及肝脏炎症指标均呈正相关。另外ETV治疗前后血浆中s OX40水平没有明显变化。同时我们发现肝组织中OX40/OX40L的表达趋势与血浆中s OX40/OX40L表达趋势相似,即在CHB患者中是表达升高的,且在肝炎发作的患者中升高的趋势更明显。最后我们发现在健康人外周血中总T细胞中OX40+细胞的百分比,CD4+T细胞中的OX40+细胞的百分比,CD14+单核细胞中OX40L+细胞的百分比及血浆中s OX40的水平与年龄呈正相关,具有年龄依赖性。其次关于PD-1和4-1BB在人群中表达的相关研究结果显示在CHB患者中无论是PBMCs中CD4+T细胞还是CD8+T细胞中PD-1 mRNA的水平与健康组相比均是升高的,这与CHB患者肝脏组织中PD-1的表达趋势是一致的。在CHB患者血浆中s PD-1也是升高的,且这种升高的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组也比较明显,ETV治疗前后s PD-1水平没有明显变化。另外血浆中s PD-1的水平不仅与HBV的病毒学指标呈正相关还与肝脏炎症指标呈正相关。4-1BB在CHB患者中的表达特点大致与PD-1相似,简单来讲血浆中的s4-1BB的水平在CHB患者中也是异常升高的,且在高病毒载量组和肝炎发作组升高趋势比较明显,ETV治疗前后s4-1BB水平没有明显变化。血浆中s4-1BB水平主要与血清病毒学指标呈正相关。肝组织中4-1BB的表达趋势与血浆中s4-1BB的趋势相似,即与健康对照组相比,CHB患者的肝脏组织中4-1BB的表达水平更高。而在总PBMCs、CD4+T细胞以及CD8+T细胞中4-1BB mRNA的水平在CHB患者中均有升高的趋势但无统计学差异。最后我们观察到在健康人群中无论是PD-1还是4-1BB的表达在不同年龄组均无明显差异。通过对上述免疫检查点的表达特点及临床意义的分析,我们选择将OX40靶点激动剂应用于已经构建成功的rAAV8/1.3HBV小鼠模型中。我们发现小鼠血清中HBs Ag和肝内HBV DNA水平均有所下降,且血清中HBs Ag的水平在第8天达到最低值。同时我们观察到小鼠肝组织内HBs Ag和HBc Ag表达与安慰剂组相比也有减少的趋势。但激活OX40靶点似乎对血清HBV DNA及HBe Ag水平没有影响。在HBV小鼠模型中激活OX40靶点HBV被抑制的同时还伴随着肝脏炎症的产生,表现为血清中ALT和AST不同程度的升高,肝脏组织内炎症细胞的浸润。除此之外,小鼠肝脏内T细胞亚群比例及血清中免疫细胞因子也发生了变化,表现为CD8+T细胞比例的升高及Th1、Th2及Th17相关的细胞因子升高,且相关细胞因子的水平均表现为先升高再下降的趋势,与病毒清除的过程一致。另外我们发现使用OX40激动剂能够引起小鼠脾脏的增大。同时我们还发现在该模型中应用OX40激动剂的效应呈剂量依赖性,主要表现在血清HBs Ag、肝内HBV DNA的下降水平,CD8+T细胞比例升高的水平以及脾脏增大的程度上。在应用OX40激动剂抑制HBV过程相关机制的探索中,我们发现CD4+/CD8+T细胞缺陷和免疫正常的rAAV8/1.3HBV小鼠同时给予OX40激动剂后,在给药第8天和第12天CD4+T和CD8+T细胞缺陷的小鼠血清中HBs Ag水平与免疫正常组HBV小鼠相比均是升高的,其中以CD8+T细胞缺陷的小鼠升高趋势更明显。与免疫正常组的小鼠相比,CD4+T细胞缺陷小鼠肝内HBV DNA水平没有明显变化,而CD8+T细胞缺陷小鼠则有轻度升高趋势。对于小鼠血清ALT水平,免疫正常的和CD4+T细胞缺陷的HBV小鼠给予OX40激动剂后转氨酶均有所升高,而CD8+T细胞缺陷的HBV小鼠则没有明显升高。关于应用OX40激动剂和安慰剂的HBV小鼠肝内淋巴细胞基于mRNA水平的转录组学测序结果显示,经过OX40激动剂处理后小鼠肝内淋巴细胞表达上调的mRNAs有3008个,下调的有2269个,并可聚类成簇。经Go功能富集分析后,我们发现在生物进程方面这些DEmRNAs主要富集到了白细胞的分化,染色质及组蛋白的修饰调节等过程;在细胞成分方面他们主要富集到了核内的染色质、异染色质及中心体等细胞组成成分上;而在分子功能方面他们主要富集在转录、翻译及小分子GTP酶的结合、Ras GPT酶结合等功能上。经KEGG通路富集分析我们发现这些GEmRNAs主要富集在HBV、人类嗜T淋巴细胞白血病病毒（human T-cell leukemia virus,HTLV）、EB病毒感染相关通路、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、趋化因子及NF-kapa B等信号通路。而经Reactome分析这些GEmRNAs主要富集在中性粒细胞脱颗粒,细胞因子,白细胞介素,转录调控等相关信号通路。研究结论:免疫检查点OX40/OX40L、PD-1及4-1BB在人的样本中的表达特点向我们提示这几个免疫检查点可能均与慢性HBV感染相关。但其中只有OX40的表达与HBV病毒学指标呈负相关,考虑其与病毒清除密切相关,且只有OX40/OX40L表达呈年龄依赖性。因此我们将OX40激动剂首次应用于rAAV8/1.3HBV小鼠模型,发现激活OX40靶点对HBV复制具有抑制作用,是一个具有前景的治疗CHB的免疫检查点,但激活OX40靶点不能完全清除HBV因此未来可能还需要联合其它治疗方式。对于激活OX40靶点抑制HBV复制的机制显示该过程相对依赖CD4+T细胞似乎更依赖于CD8+T细胞,CD4+T细胞的重要性不可否认,但未来对于HBV的免疫治疗我们也许应该将更多的关注点放在CD8+T细胞上。
杨炜峰,苗振川,宋希军,尹明[2]（2021）在《HBV感染的动物模型研究进展》文中研究表明理想的HBV临床前动物模型,其肝细胞应包括允许HBV进入、cccDNA形成和与之相互作用的先天性及获得性免疫系统。由于HBV严格的种属特异性,自然只感染人类和黑猩猩,至今还没有建立一个有效的模型,能够真实地再现HBV感染的免疫和发病机制。综述了目前常用的五种小鼠模型:HBV转基因模型、高压水动力注射模型、AAV-HBV转染模型、cccDNA替代模型和人鼠嵌合肝脏模型。展望了未来可能出现的模型,比如hNTCP转基因的食蟹猴、恒河猴和猪等模型等。以期为研究人员选择这些模型提供参照,加快药筛进程、验证新疗法和更好解决HBV生物学发病机制等方面的问题。
张雨琪,郑海香,丁明珠,施佳健,王星[3]（2021）在《乙型肝炎病毒感染与复制模式的动物模型研究进展》文中提出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是我国面临的重大公共卫生问题。尽管过去30年人们对HBV及HBV感染相关性肝细胞癌已有了相当深入的认识,但仍有大量关于HBV生命周期和病毒发病机制的问题亟待解决。由于缺乏HBV感染背景下可广泛使用的模式动物模型,所以制约了HBV研究的快速发展。本研究全面梳理了现有HBV小鼠模型在病毒学特征和致病性方面的不同侧重点。以HBV关键病毒学行为如病毒复制、共价闭合环状DNA的形成和持续性感染为关键词,建立不同处理手段与模型特征之间的相关性,从而便于选择正确模型开展针对性的研究,并基于此筛查有效治疗方案。
胡杰[4]（2021）在《SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究》文中认为目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一个全球性的公共卫生问题,全球范围内有大约2.4亿人感染乙肝病毒[1],乙肝病毒慢性感染可导致肝硬化、肝衰竭和肝癌[1]。目前两类HBV感染的治疗药物（干扰素类（Interferon）和核苷/核苷酸类似物（NAs））的疗效十分有限（1年期治疗HBs Ag阴转率通常<5%,延长治疗HBs Ag阴转率通常亦<10%）[2],加之HBV耐药突变株的出现,核苷酸类似物治疗效果常常不能持久;因此寻找新的抗病毒靶点具有非常重要的意义。代谢是生命活动中生物化学过程的总称,病毒在细胞内完成复制和包装等生活周期必然伴随着代谢的变化。细胞代谢重编程在激活免疫系统和炎症反应中起着关键的作用。一方面,在应对病原体感染或组织损伤时,激活的免疫反应向代谢系统发出反馈信号,诱导代谢重编程,增强分解代谢,从而向其他系统传递应激信号,引发一系列恢复性应激反应。另一方面,分解代谢的增强可以满足快速有效的免疫应答如免疫细胞迁移、吞噬和细胞因子产生等对生物分子和能量的需求。病毒感染诱导的代谢重编程不仅涉及代谢通路的改变,代谢酶和代谢产物还可以直接参与免疫调控[3-5]。最近的研究表明己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthesis pathway,HBP）在宿主先天免疫中发挥重要作用。大约2%-5%的进入细胞的葡萄糖被转化为HBP的最终产物尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）[6],并作为O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）修饰的供体[7]。HBP及其介导的蛋白O-GlcNAc修饰在宿主抗水泡性口炎病毒（VSV）[8]、流感病毒[9]和丙型肝炎病毒[10]的抗病毒免疫中起积极作用。包含SAM和HD结构域的I型蛋白（SAMHD1）是一种干扰素诱导的限制宿主因子,在先天性免疫反应中发挥重要的抗病毒作用[11]。宿主限制因子SAMHD1具有d GTP/GTP依赖的三磷酸水解酶活性（d NTP水解酶活性）,通过降低细胞内d NTP浓度,限制HIV-1的复制[12];同时SAMHD1蛋白还具有核酸酶活性,能够直接降解病毒RNA基因组,抑制病毒的复制和转录。研究发现SAMHD1的d NTP水解酶活性可以特异性抑制HBV DNA的合成和病毒复制,但不影响HBV ccc DNA的转录和基因表达[13,14]。对SAMHD1蛋白的翻译后修饰研究发现,SAMHD1可以发生磷酸化、乙酰化、氧化和泛素化修饰等,可能对其抗病毒功能发挥多重调控作用。我们之前的研究已经证明,Cyclin E2-CDK2可以介导SAMHD1磷酸化以消除其对HBV复制的抑制作用[14]。然而,目前尚不清楚SAMHD1是否可以发生O-GlcNAc修饰,以及SAMHD1的O-GlcNAc修饰是否影响其抗病毒功能。本研究将首先在HBV感染细胞模型和临床标本中检测糖代谢、HBP途径以及O-GlcNAc修饰的变化,观察干预O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响,深入探讨HBV感染后上调HBP途径和O-GlcNAc修饰的分子机制,并进一步阐明病毒感染通过代谢重编程促进宿主限制因子SAMHD1的O-GlcNAc修饰,在抗病毒天然免疫中的作用机理。方法:1.HBV感染细胞糖代谢、HBP途径以及O-GlcNAc修饰的变化:我们在HepG2细胞中过表达Ad HBV1.3,或者HBV感染的HepG2-NTCP细胞收集细胞代谢物,采用非靶标和靶标代谢物分析,检测葡萄糖和UDP-GlcNAc水平。同时通过Western blot检测HBV感染后蛋白O-GlcNAc修饰水平和HBP关键酶GFPT1,OGT,OGA的蛋白表达变化,通过q RT-PCR和免疫荧光检测HBV感染后葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达水平。2.干预O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响:通过GLUT1抑制剂WZB117,GFPT1抑制剂DON,OGT抑制剂ST045849,以及OGA抑制剂Thiamet G处理HBV感染的Hep AD38、HepG2-NTCP和HepG2细胞,Western blot检测O-GlcNAc修饰水平,q PCR或Southern blot检测HBV DNA。我们还将在上述HBV感染复制细胞模型中采用shRNA分别敲低GFPT1,OGT,OGA,Western blot检测O-GlcNAc修饰水平,q PCR或Southern blot检测HBV DNA的变化水平。3.鉴定HBV感染后发生O-GlcNAc修饰的关键分子及其在抗病毒天然免疫中的作用:裂解去掉四环素的Hep AD38细胞,加入O-GlcNAc抗体孵育,富集可能有O-GlcNAc修饰的蛋白,通过LC-MS/MS鉴定可能发生O-GlcNAc修饰的蛋白。通过GO分析筛选与免疫相关的蛋白。进一步通过Co-IP实验和免疫荧光实验检测与OGT发生相互作用的蛋白,并筛选与OGT相互作用蛋白的主要区段。通过IP实验和LC-MS/MS鉴定发生O-GlcNAc的位点并再次通过IP实验及s WGA实验验证其O-GlcNAc修饰位点。通过寡聚化实验检测HBV感染对SAMHD1四聚化的作用,通过HPLC实验检测原核表达的SAMHD1WT及S93A蛋白的d NTPase活性。我们将SAMHD1野生型WT或S93A变体转染到SAMHD1基因敲除的Hep AD38,HepG2以及HepG2-NTCP细胞中。提取HBV DNA后,通过荧光定量PCR,Southern blot检测S93A突变后对HBV复制的影响。将SAMHD1野生型WT或S93A突变体转染到SAMHD1基因敲除的THP-1细胞中,加入带有荧光素酶表达基因的HIV-1的单轮复制的假病毒,通过荧光素酶实验检测SAMHD1 S93A突变对HIV-1的抑制作用。4.在HBV转基因小鼠和临床标本中验证SAMHD1的O-GlcNAc修饰:通过LC-MS/MS检测慢性HBV感染者血浆中的UDP-GlcNAc水平。通过Western blot检测HBV转基因小鼠及慢性HBV感染者的O-GlcNAc修饰,s WGA实验检测慢性HBV感染者肝组织SAMHD1的O-GlcNAc修饰。结果:1.通过非靶标和靶标代谢检测发现HBV感染后Glucose和UDP-GlcNAc显着升高:Western blot检测发现HBV感染后HBP途径和蛋白O-GlcNAc修饰是显着增强的。HBV感染后,HBP关键酶GFPT1,OGT,OGA的蛋白水平没有明显变化,通过q PCR和免疫荧光发现HBV感染后上调了肝细胞表面葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达,促进了葡萄糖摄取,为HBP合成UDP-GlcNAc提供了底物,导致蛋白O-GlcNAc修饰增加。2.GLUT1抑制剂WZB117,GFPT1抑制剂DON,OGT抑制剂ST045849处理细胞后,O-GlcNAc修饰降低,并促进HBV复制。而OGA抑制剂Thiamet G处理细胞后O-GlcNAc修饰增强,能够显着抑制HBV的复制。shGFPT1,shOGT处理细胞后,O-GlcNAc修饰降低,并促进HBV复制。而shOGA处理细胞后O-GlcNAc修饰增强,能够显着抑制HBV的复制。3.通过LC-MS/MS鉴定可能发生O-GlcNAc修饰的蛋白有1034种。通过GO分析筛选与免疫相关的蛋白SAMHD1。进一步通过Co-IP实验和免疫荧光实验检测SAMHD1与OGT发生相互作用,并筛选与OGT相互作用的区段为1-150aa。通过IP实验和LC-MS/MS鉴定SAMHD1的Ser93为O-GlcNAc修饰的位点,并通过IP实验及s WGA发现S93A突变后O-GlcNAc修饰降低,说明SAMHD1的Ser93为主要的O-GlcNAc修饰位点。通过寡聚化实验检测HBV感染后SAMHD1四聚化增强,通过HPLC实验检测原核表达的SAMHD1 S93A蛋白的d NTPase活性降低。SAMHD1 S93A突变后丧失了对HBV复制的抑制作用,SAMHD1 S93A突变对HIV-1的抑制作用也消失了。4.通过LC-MS/MS检测慢性HBV感染者血浆中的UDP-GlcNAc水平升高。通过Western blot检测HBV转基因小鼠及慢性HBV感染者的O-GlcNAc修饰增高,s WGA实验检测慢性HBV感染者肝组织SAMHD1的O-GlcNAc修饰显着升高。结论:HBV感染促进HBP途径,使UDP-GlcNAc底物显着升高,并增强O-GlcNAc修饰。而HBP介导的高的O-GlcNAc修饰水平能够抑制HBV的复制,质谱检测到靶蛋白宿主限制性因子SAMHD1有O-GlcNAc修饰,进一步检测到Ser93位点为其发生O-GlcNAc修饰的关健位点,且SAMHD1的Ser93位O-GlcNAc正向调节宿主体内外抗HBV免疫应答。这些发现揭示了HBP、O-GlcNAc修饰和以SAMHD1为靶点的先天抗病毒免疫之间的联系。
魏杰[5]（2020）在《Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究》文中指出目的:乙型肝炎病毒（HBV）是一种小病毒基因组的部分双链DNA病毒,HBV导致的慢性乙肝仍然是一个全球公共卫生问题,即使得益于乙肝疫苗和抗病毒药物的临床应用,目前全世界仍超过2亿人患有慢性乙肝,乙肝的长期发展又会导致肝硬化和肝癌的发生,对人类的身体健康造成严重威胁。Id1蛋白是分化抑制因子（Id1-4）中的一员,属于bHLH转录因子家族,由于Id1缺少了与DNA结合的碱性（basic）区,导致Id1蛋白通过与其他bHLH转录因子结合形成异源二聚体从而抑制了bHLH转录因子对下游靶基因的调控。Id1的功能主要与促进细胞增殖和抑制分化相关,许多参与调控细胞增殖的基因,同样参与HBV的表达调控,此外如E2F4转录因子也属于H（helix）超家族,已被报道与Id2存在相互作用,而该因子在HBV的复制调控中的作用还未见报道。因此本文重点研究了宿主因子Id1及相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录过程中的调控作用及其分子机制,其研究结果进一步丰富宿主因子对HBV的调控网络,并有助于基于该机制研发新的抗病毒药物。方法:1,在临床样本中,运用qRT-PCR和western blot实验分析HBV相关的肝细胞肝癌中癌旁与肿瘤的HBV pgRNA的转录水平以及Id1和HBV核心蛋白的表达水平。2,在细胞水平和动物水平,同样应用western blot实验比较HBV复制阳性和HBV复制阴性的细胞以及HBV转基因小鼠和非转基因小鼠中Id1的表达水平。3,进一步应用western blot分析HBV四种蛋白（HBc/p/s/x）对Id1的影响以及研究HBV在HepG2-NTCP感染模型中对Id1的作用。4,运用Id1Ad感染HBV复制的细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1）实现Id1蛋白的过表达,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化;应用qPCR检测HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA和pgRNA的变化。5,运用pCDNA3.1-Id1转染HBV感染HepG2-NTCP模型,应用qPCR检测其中HBV DNA的变化。6,应用靶向Id1的shRNA1/2干扰序列降低HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞中的Id1水平,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化。7,通过尾静脉注射Id1Ad感染HBV-TgM,在体内小鼠过表达Id1,同样应用Southern blot和qPCR检测小鼠肝脏组织中HBV DNA的变化,应用western blot和IHC检测肝组织细胞Id1和HBc蛋白的变化,采用ELISA检小鼠血清中HBeAg的变化。8,通过qRT-PCR和western blot筛查Id1过表达对调控HBV的经典宿主因子的影响。9,通过qRT-PCR筛查HBV复制的细胞中的mRNA水平发生改变的HLH转录因子。10,构建潜在的发生变化的HLH因子的过表达质粒,通过筛查它们对HBV Cp启动子的影响,特别是E2F4发挥了对Cp启动子活性显着的促进作用。11,进一步研究比较了E2F4在HBV复制的HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞中以及25对临床样本中癌组织和癌旁组织的各自表达情况。12,利用E2F4Ad感染HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞过表达E2F4,应用qPCR检测其中HBV DNA和pgRNA的变化。13,免疫荧光试验,免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验检测E2F4与Id1之间的相互作用。14,胞浆胞核蛋白分离联合western blot试验检测HBV复制和Id1对细胞中E2F4的核内外分布的影响。15,HepG2.2.15分别在过表达E2F4和干扰Id1以及过表达Id1和干扰E2F4之后,Southern blot检测HBV DNA的复制水平。16,ChIP实验检测Cp启动子是否招募E2F4蛋白,Id1对该招募的影响。17,应用体外EMSA实验检测Cp启动子和E2F4蛋白是否存在直接相互作用。18,根据E2F4的二级结构和识别位点规律,生物信息学进行分析E2F4在Cp启动子上存在的潜在识别位点,构建相应的启动子突变体,应用荧光素酶活性实验验证潜在位点的缺失是否导致E2F4对HBV的调控受阻。19,体外SPR实验和ITC实验检测E2F4截短蛋白和Cp启动子DNA链的相互结合作用。20,根据潜在位点构建相应的HBV1.3倍体突变体,通过ChIP实验检测突变的Cp启动子对E2F4的招募情况。21,在Huh7细胞中转染HBV1.3倍体突变体,qPCR检测该细胞分别感染E2F4Ad和Id1Ad后HBV DNA的变化,ELISA检测细胞上清中HBeAg的变化。22,生物信息学比对分析常见的四种HBV基因型（Gt A/B/C/D）中E2F4潜在识别位点的保守性,进而应用southern blot和qPCR检测E2F4和Id1对四种HBV复制调控作用的普适性。结果:1,在25对HBV相关的肝癌与癌旁组织样本中,癌旁样本的pgRNA整体表达水平大约是肝癌组织的两倍（P<0.05）,其中20对样本的HBc的蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织,有18对样本的Id1的蛋白表达水平在肝癌组织中明显高于癌旁。2,在HBV稳定复制的细胞和HBV瞬时转染的细胞中Id1 mRNA和蛋白水平均明显低于非HBV复制的对照肝癌细胞。3,在HBV感染细胞模型中,HBV的感染导致Id1的蛋白水平明显减少,过表达HBV相关蛋白HBp和L-HBs同样导致Id1蛋白水平的降低,HBV转基因小鼠的肝组织中,Id1蛋白水平也显着低于普通C57小鼠。4,Id1过表达可显着抑制HBV复制细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体,pgRNA和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.01）,此外过表达Id1也显着下调HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的复制水平和Cp启动子的活性（P<0.05）。5,下调Id1的表达可显着促进HBV复制细胞（HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.05）。6,Id1过表达可显着抑制HBV转基因小鼠肝组织中HBV DNA复制水平和HBc的表达水平,也导致血清HBeAg分泌水平的显着下降（P<0.05）。7,在HepG2.2.15细胞中,Id1过表达没有导致经典的HBV调控因子发生明显变化,但HBV的复制导致4种HLH因子mRNA（E2F4,TCF3,E40和USF1）发生显着上调和2种HLH因子（Clock和HIF1α）的显着下调。8,E2F4过表达可以显着促进HBV Cp启动子活性和上调HBV pgRNA,HBV DNA的复制。9,在HBV复制的细胞中E2F4蛋白水平明显高于对照肝癌细胞;在HBV相关的肝癌临床样本中,E2F4的整体蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织（P<0.05）。10,通过IP和GST-pulldown实验表明E2F4和Id1存在相互作用,Id1的过表达减弱了HBV复制引起的p130和E2F4的核转移。11,过表达E2F4可以进一步促进干扰Id1导致HBV DNA的上调,相反过表达Id1并没有显着抑制干扰E2F4导致HBV DNA的下调。12,ChIP实验证实E2F4能被Cp启动子招募,Id1的过表达同样也阻止了Cp启动子对E2F4的招募作用。13,EMSA实验中,随着E2F4截短蛋白(E2F41-180)的增加,Cp启动子的迁移速率明显下降,并且Cp冷探针可以竞争结合E2F4截短蛋白。14,生物信息学表明E2F4在Cp上存在潜在的识别位点5’-1758TTAAAGGTC1766-3’,该位点的缺失导致E2F4对HBV Cp启动子活性的促进作用消失;在相应的HBV1.3突变体（HBV1.3 mut2.3）中,E2F4和Id1都失去了对HBV的调控作用。15,SPR和ITC实验表明包含5’-1758TTAAAGGTC1766-3’的Cp2短链可以直接与E2F4的DNA识别区域相互结合。16,进步分析发现5’-1758TTAAAGGTC1766-3’在HBV Gt A/B/C/D基因型中高度保守,并且E2F4和Id1对这四种基因型的HBV的调控具有普适性。结论:在本研究中,我们阐明了Id1及其相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录中的协同调控作用。研究结果显示,无论是在HBV复制背景下的细胞水平还是组织水平中,Id1表达水平均显着下调,而E2F4表达水平则显着上调;E2F4可以通过上调HBV Cp启动子活性从而促进HBV复制和相应的转录;上游Id1分子则通过与E2F4相互作用抑制其核内转移,导致HBV的复制和转录受抑制;5’-1758TTAAAGGTC1766-3’是E2F4在Cp启动子上的直接识别位点,在HBV A/B/C/D四种基因型中高度保守,是Id1和E2F4实现对四种基因型HBV调控的基础。我们的研究进一步完善了宿主因子对HBV的调控网络,为研发新的抗病毒策略提供了新的思路。
姜慧[6]（2020）在《SIRT6抑制剂，OSS128167对HBV复制的影响及机制研究》文中研究表明背景:乙型肝炎病毒感染是严重的公共卫生问题。据估计,全球慢性HBV感染者约有2.57亿,而中国的慢性HBV感染者约有8600万。慢性HBV感染严重危害人类健康,可逐渐发展为肝炎、肝硬化和肝癌,每年因HBV感染导致的各种终末期疾病死亡约88.7万。目前,临床上用于治疗慢性HBV感染的药物主要分为核苷（酸）类似物和干扰素,然而这两种药物均不能完全清除HBV。因此,研发一种新型抗HBV药物至关重要。我们通过筛查小分子化合物库,发现SIRT6抑制剂OSS28167可有效地抑制HBV的复制。本研究利用HBV稳定表达细胞系Hep G2.2.15细胞、HBV感染细胞模型Hep G2-NTCP细胞及HBV转基因小鼠模型全面系统研究了OSS28167对HBV复制的影响,并进一步阐明了其发挥抗病毒作用的分子机制。目的:1.在Hep G2.2.15和Hep G2-NTCP细胞中研究SIRT6抑制剂OSS128167对HBV复制的影响。2.在HBV转基因小鼠模型中研究OSS128167的抗病毒作用。3.阐明OSS128167发挥抗病毒作用的分子机制。方法:1.MTS实验分析SIRT6抑制剂OSS128167对Hep G2.2.15和Hep G2-NTCP的细胞毒性。2.用100μM浓度的OSS128167处理Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞,Real-time PCR和southern blot检测OSS128167对HBV core DNA水平的影响;QRT-PCR分析OSS128167对HBV 3.5-kb RNA水平的影响;ELISA检测OSS128167对HBs Ag和HBe Ag分泌水平的影响;Western blot检测OSS128167对HBs蛋白质水平的影响。3.在HBV转基因小鼠中,通过腹腔注射50mg/kg浓度的OSS128167溶液,光比色法分析小鼠血清中ALT的水平;Real-time PCR检测小鼠血清中HBV DNA的水平;ELISA检测小鼠血清中HBs Ag和HBe Ag的水平。此外,Real-time PCR分析小鼠组织中HBV DNA水平;QRT-PCR分析小鼠组织中total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平;IHC检测小鼠组织中HBc蛋白质水平。4.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中转染sh SIRT6质粒,real-time PCR和southern blot检测SIRT6沉默对HBV core DNA水平的影响;QRT-PCR分析SIRT6沉默对total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平的影响;IFC和western blot分别检测SIRT6沉默对HBc和HBs蛋白质水平的影响;ELISA分析SIRT6沉默对HBs Ag和HBe Ag分泌水平的影响;Taqman probe specific real-time PCR分析 SIRT6沉默对HBV ccc DNA水平的影响。5.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中转染Flag-SIRT6质粒,同时用100μM OSS128167处理细胞,western blot分析OSS128167对SIRT6蛋白质水平及其去乙酰化酶活性的影响;Real-time PCR和southern blot检测HBV core DNA水平;QRT-PCR检测total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平;Taqman probe specific real-time PCR检测HBV ccc DNA水平,分析OSS128167是否拮抗SIRT6过表达对HBV复制和转录的调控作用。6.在Huh7细胞中共转染HBV启动子和Flag-SIRT6质粒,双荧光素酶报告系统分析过表达SIRT6对HBV启动子活性的影响。7.在Hep G2.2.15细胞中转染Flag-SIRT6质粒,q RT-PCR筛查SIRT6对HBV Cp活性相关的转录因子m RNA水平的影响,western blot进一步分析SIRT6对PPARα蛋白质水平的影响。8.在Hep G2.2.15细胞中转染sh SIRT6质粒,q RT-PCR和western blot分别检测沉默SIRT6对PPARαm RNA和蛋白质水平的影响。9.用100μM OSS128167处理Hep G2.2.15细胞,q RT-PCR和western blot分别检测OSS128167对PPARαm RNA和蛋白质水平的影响。10.在Huh7细胞中共转染p GL3-Cp和sh PPARα质粒,双荧光素酶报告系统验证沉默PPARα对HBV Cp活性的影响。11.在Hep G2.2.15细胞中转染sh PPARα质粒,real-time PCR和q RT-PCR分别检测沉默PPARα对HBV core DNA和3.5-kb RNA水平的影响;ELISA分析沉默PPARα对HBs Ag和HBe Ag分泌水平的影响;Western blot分析沉默PPARα对HBs蛋白质水平的影响。12.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中共转染Flag-SIRT6和sh PPARα质粒,real-time PCR和southern blot检测HBV core DNA水平,q RT-PCR检测HBV 3.5-kb RNA水平,分析PPARα在SIRT6调控HBV复制和转录过程中的作用。13.Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞用100μM OSS128167处理,同时转染Flag-SIRT6或Flag-PPARα质粒,real-time PCR和southern blot检测HBV core DNA水平,q RT-PCR检测HBV3.5-kb RNA水平,分析SIRT6和PPARα是否参与了OSS128167对HBV复制和转录过程的抑制作用。结果:1.在小于400μM浓度范围内,OSS128167对Hep G2.2.15和Hep G2-NTCP细胞无明显毒性作用。2.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,OSS128167显着降低HBV core DNA水平、HBV 3.5-kb RNA水平、HBs Ag和HBe Ag分泌水平以及HBs蛋白质水平（P<0.05）。3.OSS128167以50mg/kg浓度给药对小鼠血清中ALT的水平无明显影响;OSS128167呈时间依赖性降低小鼠血清中HBV DNA、HBs Ag和HBe Ag水平（P<0.05）;OSS128167给药组小鼠肝组织中HBV DNA水平、total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平以及HBc蛋白质水平显着低于阴性对照组（P<0.05）。4.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,SIRT6沉默显着降低HBV core DNA水平、total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平、HBc和HBs蛋白质水平、HBs Ag和HBe Ag分泌水平（P<0.05）,然而SIRT6沉默不影响Hep G2-NTCP细胞中HBV ccc DNA的水平。5.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,OSS128167明显抑制SIRT6的去乙酰化酶活性（P<0.05）,而对SIRT6蛋白质水平无明显影响;此外,OSS128167显着减弱了SIRT6对HBV转录和复制的促进作用。6.SIRT6过表达明显增强HBV Cp活性（P<0.05）,而对HBV其它三个启动子活性无明显影响。7.在Hep G2.2.15细胞中,过表达SIRT6显着上调转录因子PPARα的m RNA和蛋白质水平（P<0.05）。8.在Hep G2.2.15细胞中,沉默SIRT6则显着下调PPARα的m RNA和蛋白质水平（P<0.05）。9.在Hep G2.2.15细胞中,OSS128167明显降低PPARα的m RNA和蛋白质水平（P<0.05）。10.PPARα沉默明显降低HBV Cp的活性（P<0.05）。11.在Hep G2.2.15细胞中,PPARα沉默明显抑制HBV的转录和复制。12.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,PPARα沉默后,SIRT6促HBV转录和复制的作用明显减弱。13.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,过表达SIRT6或PPARα减弱了OSS128167对HBV转录和复制的抑制作用。结论:在本文中,我们首先分析了SIRT6抑制剂OSS128167对HBV复制的影响,结果表明,OSS128167可抑制HBV稳定表达细胞系和HBV自然感染模型中HBV的复制;此外,OSS128167在HBV转基因小鼠中也具有有效的抗病毒作用;进一步,我们发现OSS128167可通过抑制SIRT6的去乙酰化酶活性下调PPARα的表达,降低HBV Cp的转录活性,最终抑制HBV的转录和复制。综上所述,OSS128167可能是一种潜在的抗HBV药物。
姚方龙[7]（2020）在《雌三醇对乙型肝炎病毒转录和复制水平的影响》文中指出背景:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是严重威胁人类健康的世界性卫生难题,HBV感染可导致急慢性肝炎,并且可逐步发展为肝硬化和肝癌。目前,在临床上用来治疗乙型肝炎病患的主要药物是干扰素和核苷类似物两大类。干扰素包括普通干扰素和长效干扰素。核苷类似物包括,拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺。干扰素主要作用于mRNA,从而抑制病毒蛋白的表达。核苷类似物则是抑制逆转录过程,从而抑制HBV的复制。虽然这两种药物在临床上都得到很广泛的使用,但是他们各自都有自身的局限性。干扰素存在应答率低、副作用明显、耐受性差等缺点。核苷类似物则需要长期用药,停药易导致病情反复和恶化,易产生耐药性,病人的经济负担较重。因此要进一步改善乙肝现症患者的治疗效果,需要鉴定新型抗病毒作用因子。雌三醇（Estriol,EST）是存在于人体内的一种天然雌激素。越来越多的报道显示雌激素与慢性HBV感染以及HBV相关性肝癌在流行病学上呈现出性别相关性。此外,也有报道显示雌三醇可影响多种病毒在体外的复制水平,但是雌三醇可否直接影响HBV的转录和估值尚待研究。目的:研究雌三醇对乙型肝炎病毒转录和复制水平的影响。方法:1.MTS实验分析雌三醇在HepG2.2.15细胞和HepG2-NTCP细胞中的CC50,检测雌三醇的细胞毒性。2.在HepG2.2.15细胞和HepG2-NTCP细胞中加入不同浓度的雌三醇,RT-qPCR分别检测雌三醇对HBV DNA和HBV RNA水平的影响,ELISA分别检测雌三醇对HBsAg、HBeAg分泌水平的影响。3.在HBV转基因小鼠中,腹腔注射5mg/kg的雌三醇溶液,比色法检测小鼠血清中AST、ALT水平,ELISA法检测HBsAg、HBeAg水平,RT-qPCR分析小鼠血清中HBV DNA水平和肝组织中HBV DNA、HBV RNA水平。结果:1.雌三醇在HepG2.2.15细胞和HepG2-NTCP细胞中的CC50分别是181.5μmol/L和218.6μmol/L。2.10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L雌三醇可以降低HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg水平及细胞中HBV DNA、HBV RNA的水平（P<0.05）。3.10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L雌三醇可以降低HepG2-NTCP细胞分泌的HBsAg和HBeAg水平及细胞中HBV DNA、HBV RNA的水平（P<0.05）。4.在HBV转基因小鼠中,雌三醇对小鼠血清中AST和ALT的水平无明显影响;雌三醇可以显着降低小鼠血清中HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平以及小鼠肝组织中HBV DNA和HBV RNA水平（P<0.05）。结论:雌三醇可明显抑制HepG2.2.15、HepG2-NTCP细胞和HBV转基因小鼠模型中HBV转录和复制水平的作用。
张先姚[8]（2020）在《基于PD-1/PD-L1和CD28/CD80信号通路的软肝饮对HBV转基因小鼠iNKT细胞功能的影响》文中指出研究目的:本课题从PD-1/PD-L1和CD28/CD80信号通路为切入点,观察软肝饮对HBV转基因小鼠i NKT细胞功能的影响,揭示软肝饮治疗HBV转基因小鼠的免疫调节机制。研究方法:将50只雌雄各半的SPF级BALB/C品系HBV转基因小鼠随机分为中药治疗组（软肝饮高剂量组、中剂量组、低剂量组）、阳性对照组、模型对照组以及10只雌雄各半同窝非HBV转基因正常小鼠作为空白对照组。中药治疗组予不同剂量中药软肝饮（含软肝饮方生药浓度为2、1、0.5g/ml）灌胃,阳性对照组予恩替卡韦分散片液灌胃,模型对照组及空白对照组予生理盐水灌胃,各组均连续给药4周后取材。用q-PCR技术检测外周血及肝组织中HBV DNA表达,HE染色观察肝组织病理。ELISA检测血清中ALT、AST、TBIL、LN、HA、IV-C、PCIII、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量,流式细胞仪检测外周血i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80表达,免疫荧光法检测肝脏i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80表达。研究结果:1、在用q-PCR技术检测小鼠外周血及肝组织中HBV DNA表达结果中:与模型组比较,软肝饮高剂量、中剂量组及阳性对照组HBV转基因小鼠血清和肝组织中HBV DNA含量明显降低,有统计学差异性（P<0.01/P<0.05）;而软肝饮低剂量组HBV转基因小鼠血清及肝组织中HBV DNA含量虽有下降趋势,但无明显差异性（P>0.05）。2、在肝脏病理HE染色结果中:模型组小鼠肝细胞排列欠规整,细胞肿胀变形严重,甚至死亡,肝索形态消失,炎性细胞浸润;而软肝饮高剂量、中剂量组及阳性对照组均有不同程度的改善病变,中药软肝饮低剂量效果不显着。3、在ELISA检测血清中ALT、AST、TBIL、LN、HA、IV-C、PCIII、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量结果中:（1）与空白对照组相比,模型组ALT、AST、TBIL水平明显比空白对照组高,有显着差异性（P<0.01）;与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组ALT、AST、TBIL水平均明显低于模型组,有统计学意义（P<0.01/P<0.05）;而治疗后软肝饮中剂量、低剂量组ALT、AST、TBIL水平与模型组无统计学意义（P>0.05）。（2）与空白对照组相比,模型组LN、HA、IV-C、PCIII水平明显比空白对照组高,有显着差异性（P<0.01）;与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组LN、HA、IV-C水平明显低于模型组,有显着差异性（P<0.01）;治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组PCIII水平低于模型组,有一定差异性（P<0.05）;而治疗后软肝饮中剂量、低剂量组LN、HA、IV-C、PCIII水平与模型组无统计学意义（P>0.05）。（3）与空白对照组相比,模型组IL-10、IL-2、IFN-γ水平明显比空白对照组低,有显着差异性（P<0.01）;模型组IL-4水平明显比空白对照组高,有显着差异性（P<0.01）;与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量、中剂量组和阳性对照组IL-10水平明显高于模型组,有显着差异性（P<0.01）;软肝饮低剂量组IL-10水平与模型组无明显差异性（P>0.05）;治疗后软肝饮高剂量、中剂量组和阳性对照组IL-2、IFN-γ水平高于模型组,有一定差异性（P<0.05）;软肝饮低剂量组IL-2、IFN-γ水平与模型组无明显差异性（P>0.05）;治疗后软肝饮高剂量、中剂量组和阳性对照组IL-4水平明显低于模型组,有显着差异性（P<0.01）;软肝饮低剂量组IL-4水平与模型组无明显差异性（P>0.05）;4、在流式细胞仪检测外周血i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80表达结果中:（1）与空白对照组相比,模型组i NKT细胞表达明显降低,有显着差异性（P<0.01）;与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组i NKT细胞表达明显增高,有显着差异性（P<0.01）;软肝饮中剂量组i NKT细胞表达有一定增加,有一定差异性（P<0.05）;软肝饮低剂量组i NKT细胞表达无明显变化,无明显差异性（P>0.05）;（2）与空白对照组相比,模型组i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达水平明显增高,有显着差异性（P<0.01）;与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达水平降低,有一定差异性（P<0.05）;软肝饮中剂量、低剂量组i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达水平无明显变化,无明显差异性（P>0.05）;（3）与空白对照组相比,模型组i NKT细胞表面CD28、CD80的表达水平有一定的下调趋势,有统计学意义（P<0.01/P<0.05）;与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量、中剂量组和阳性对照组i NKT细胞表面CD28、CD80的表达水平明显升高,有显着差异性（P<0.01）;软肝饮低剂量组i NKT细胞表面CD28、CD80的表达水平无明显变化,无明显差异性（P>0.05）。5、在免疫荧光法检测肝脏i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80表达结果中:HBV转基因小鼠肝脏中细胞i NKT表面的表达明显低于空白对照组,i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达明显高于空白对照组,而i NKT细胞表面CD28、CD80的表达则明显低于空白对照组,均有统计学意义（P<0.05）。通过软肝饮高、中、低剂量组及阳性对照组治疗4周后,与模型组相比,软肝饮高、中剂量组及阳性对照组HBV转基因小鼠肝脏细胞i NKT细胞的表达均明显增加,i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达均明显降低,而i NKT细胞表面CD28、CD80的表达则明显升高,有一定差异性（P<0.05）;软肝饮低剂量组HBV转基因小鼠肝脏细胞i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80的表达与模型组相比无明显变化,无统计学意义（P>0.05）。结论:1、中药软肝饮能够改善HBV转基因小鼠肝组织损伤,具有一定的保护肝功能、抗肝纤维化作用。2、中药软肝饮对HBV转基因小鼠有一定的抑制HBV的作用,其作用机制可能与调控IL-10、IL-2、IL-4、IFN-γ水平有关。3、中药软肝饮治疗HBV转基因小鼠的免疫机制可能通过阻断i NKT细胞上PD-1/PD-L1信号通路以及激活i NKT细胞上CD28/CD80信号通路,调控i NKT细胞功能发挥抗HBV作用。
韦武均[9]（2020）在《反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究》文中认为第一章HBV C编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定目的:针对乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）编码链C基因设计合成反基因锁核酸（locked nucleic acid,LNA）片段,以HBV转基因小鼠为研究对象,筛选出最佳给药剂量、给药途径和给药方式。方法:针对乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点,利用RNAstructure 5.0软件设计合成反基因LNA片段5ˊ-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3ˊ,设置不同给药剂量组、给药途径组和给药方式组,以阳离子聚合物介导转染HBV转基因小鼠,分别于给药前、给药后1、3、5和7 d,采集眼眶静脉血,采用PCR荧光探针法和磁微粒化学发光法检测血清HBV DNA和HBs Ag、HBe Ag含量。采用单链特异性核酸内切酶酶切实验鉴定LNA片段稳定性。结果:给药后第7d,0.5μg/g剂量组、尾静脉注射组和1次/48h给药组对病毒HBV DNA复制和HBs Ag、HBe Ag表达抑制效果较明显,HBV DNA复制抑制率分别为57.09%、56.61%和57.22%,HBs Ag表达抑制率分别为49.29%、48.65%和48.41%,HBe Ag分别为71.72%、69.95%和69.44%。LNA抗核酸酶降解能力较强。结论:LNA片段5ˊ-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3ˊ的最佳给药剂量为0.5μg/g,给药途径为尾静脉注射,给药方式为1次/48h。第二章反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达目的:探讨针对乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点的反基因LNA在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果。方法:将30只HBV转基因小鼠完全随机分为5组,每组6只,分别为5%GLU空白对照组、无关序列对照组、拉米夫定对照组、反义LNA对照组和反基因LNA实验组,采用尾静脉注射法对5%GLU空白对照组、无关序列对照组、反义LNA对照组和反基因LNA实验组给药,采用连续灌胃法对拉米夫定对照组给药,分别于给药前、给药后1、3、5和7 d,采集眼眶静脉血,采用PCR荧光探针法和磁微粒化学发光法检测血清HBV DNA和HBs Ag、HBe Ag含量,利用RT-PCR法和免疫组化技术检测肝脏HBV Cm RNA和HBs Ag、HBe Ag表达水平。通过HE染色和血常规、生化指标判断反基因LNA对肝肾细胞结构和功能的改变。结果:给药后第1、3、5和7d,反基因LNA组对HBV DNA复制和HBs Ag、HBe Ag表达均有较明显的抑制效果,HBV DNA复制抑制率分别为20.68%、45.66%、52.33%和55.68%,HBs Ag表达抑制率分别为20.44%、36.17%、44.90%和47.87%,HBe Ag分别为35.65%、54.29%、65.08%和72.67%,与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05;肝脏HBV C m RNA相对表达量和HBs Ag、HBcAg阳性细胞率为0.36和38.20%、32.50%,与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05。HE染色和血常规、生化指标未发现肝肾细胞结构和功能有明显改变。结论:乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点是反基因LNA治疗的有效靶点。
郝晓磊[10]（2019）在《新型HBV相关肝细胞癌小鼠模型的构建及其免疫致病机理探究》文中认为慢性HBV感染是全球一大公共健康问题,全球约2.6亿的人口面临着因慢性HBV感染导致的肝炎,肝纤维化,肝硬化以及肝癌的威胁。虽然目前已经开发出了预防性疫苗,可以有效的降低HBV新发感染的几率,但是在低收入国家预防性疫苗的普及率仍然很低。另外,针对慢性HBV病人尚未建立有效的治疗手段,通用的核苷类似物联合干扰素的治疗方法虽然可以有效地抑制病毒的复制,但是并不能彻底清除病毒,并且在停药后有明显的反弹现象,慢性HBV感染患者仍面临着发生肝癌的风险。因此,阐明慢性HBV感染导致肝癌发生的机制就尤为重要。HBV病毒可以通过宿主细胞基因整合而导致肝细胞中原癌基因的活化或者抑癌基因的失活进而导致细胞的恶性转化,同时机体免疫系统对被HBV感染的肝细胞的持续攻击会导致肝细胞的反复损伤和再生,免疫攻击也是致使肝细胞癌恶性转化的必要因素之一。HBV抗原特异性的CD8+T对被感染的肝细胞的攻击是导致免疫损伤的最主要的因素,但是因为没有合适的动物模型,目前还没有对这一免疫损伤过程进行深入细致的研究。本研究主要通过利用肝细胞替代技术建立了一种构建HBV小鼠模型的方法,用于HBV的免疫损伤研究,并获得了以下几项结果:1.利用肝细胞替代技术成功构建HBV相关肝癌小鼠模型。首先通过肝脏灌流的方法分离了 HBs转基因（HB s-Tg）小鼠和野生型（C57BL6/J）小鼠的肝实质细胞;然后使用脾内转输的方法把1.0×106肝实质细胞转输给8-12周龄免疫系统健全的Fah缺陷小鼠,进行肝细胞重建;撤去Fah缺陷小鼠的NTBC水供应,让受体小鼠肝实质细胞死亡,为供体小鼠肝细胞的生长提供空间。经过12周的肝细胞重建,我们可以成功构建HBs-Tg肝细胞取代小鼠（HBs-HepR）和其对照B6-HepR。HBs-HepR小鼠血清和组织中均可以检测到HBsAg表达。2.肝脏取代重建的HBs-HepR小鼠表现出慢性肝炎,肝纤维化和肝癌。相较于对照B6-HepR小鼠,当延长肝细胞的重建时间至18周后,HBs-HepR小鼠表现为ALT水平的升高,并在重建6个月后肝脏出现了纤维化。当重建到9个月后,所有的HBs-HepR小鼠肝脏中均出现肿瘤结节,经基因水平和组织水平的鉴定证实其为HCC,该HBV相关的HCC模型与已有的其他小鼠HCC模型不同,且与人HBV感染导致的HCC具有相同的分子表型。3.抗原特异性CD8+T细胞在HBV相关肝细胞癌发生发展中发挥关键作用。通过单细胞测序技术发现,在HBs-HepR小鼠肝脏中的CD8+T细胞发生了明显的活化,并且在免疫攻击的时间点有更多CD8+T细胞由naive表型向效应性表型转化。进一步我们通过流式细胞分析和免疫荧光检测验证了在HBs-HepR小鼠肝脏中存在HBsAg特异性CD8+T细胞,并且介导了肝细胞的凋亡。进一步通过抗体的清除和基因缺陷的方法,我们证明CD8+T细胞的缺失可以显着降低HCC的发生率。HBsAg致敏过的脾脏CD8+T细胞的回输可逆转HBs-HepR-CD8KO小鼠肝脏HCC的发生发展。4.在HBs-HepR小鼠介导的损伤中B细胞,CD4+T细胞和NK细胞不起关键作用。在HBs-HepR小鼠中不能产生针对HBsAg的抗体,甚至使用铝佐剂的HBsAg疫苗外周免疫攻击也不能产生Anti-HBs抗体,说明HBs-HepR小鼠的肝细胞损伤可能不是由B细胞产生的抗体导致的。而使用抗体清除CD4+T细胞或者NK细胞后,HBs-HepR小鼠仍然全部会发生HCC,与未清除组小鼠相比没有明显的变化,说明CD4+T细胞与NK细胞在HCC的发生发展中不起重要作用。5.在HBs-HepR成瘤小鼠肝脏中的T/NK细胞处于功能耗竭的状态。使用单细胞测序技术发现在形成肿瘤的HBs-HepR小鼠肝脏中T细胞和NK细胞的功能性分子IFN-γ等表达下降,同时利用流式细胞分析验证了这一现象。说明在发生肿瘤后,肿瘤微环境导致了肝脏内免疫细胞的功能耗竭促进了肿瘤的逃逸。6.利用HBV全基因转基因小鼠来源的肝实质细胞亦可建立HBV小鼠模型。当使用1.0×106个C57BL/6J背景的HBV全基因转基因小鼠来源的肝细胞进行模型构建时,我们也可以成功构建肝细胞替代的HBV小鼠模型（HBV-HepR）,在受体小鼠Fah缺陷的小鼠体内可以检测到HBcAgp阳性的肝细胞,并且在血清中可以检测到HBeAg,HBsAg以及HBV-DNA的表达。但是重建12个月后,的HBV-HepR小鼠模型并不会自发HCC。
二、HBV感染研究的转基因小鼠模型（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV感染研究的转基因小鼠模型（论文提纲范文）
（1）激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 慢性HBV感染的自然史 |
| 1.2 慢性HBV感染的免疫应答 |
| 1.2.1 慢性HBV感染中固有免疫反应 |
| 1.2.2 慢性HBV感染中适应性免疫反应 |
| 1.3 慢性乙型肝炎免疫治疗进展 |
| 1.3.1 靶向固有免疫的治疗策略 |
| 1.3.2 靶向适应性免疫的治疗策略 |
| 1.3.3 其它免疫治疗策略 |
| 1.4 免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB研究现状 |
| 1.4.1 OX40/OX40L相关研究进展 |
| 1.4.2 PD-1 相关研究进展 |
| 1.4.3 4-1BB相关研究进展 |
| 第2章 OX40/OX40L及其可溶性分子在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人的样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血采集及血浆分离与保存 |
| 2.2.2 外周血单个核细胞提取 |
| 2.2.3 流式细胞术检测PBMCs中OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.4 免疫组化检测肝组织内OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆中sOX40/OX40L水平 |
| 2.2.6 统计处理方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 2.3.2 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的表达 |
| 2.3.3 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的水平与临床的相关性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 PD-1、4-1BB分子及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 人的样本来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 复苏外周血单个核细胞和准备血浆 |
| 3.2.2 磁珠分选人外周血T细胞亚群 |
| 3.2.3 PBMCs中总RNA的提取 |
| 3.2.4 qRT-PCR检测PBMCs中PD-1和4-1BB mRNA水平 |
| 3.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆sPD-1和s4-1BB |
| 3.2.6 免疫组化检测肝脏内PD-1和4-1BB的表达 |
| 3.2.7 统计处理方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 3.3.2 慢性乙肝患者中PD-1及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.3.3 慢性乙肝患者中4-1BB及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建及在HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响的相关研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和r AAV8/1.3HBV病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 建立经尾静脉注射腺相关病毒的HBV模型 |
| 4.2.2 检测小鼠血清内HBsAg、HBe Ag水平 |
| 4.2.3 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 4.2.4 小鼠肝脏组织全基因组DNA提取 |
| 4.2.5 qRT-PCR法检测小鼠HBV DNA定量 |
| 4.2.6 流式细胞术检测小鼠肝内T细胞亚群比例 |
| 4.2.7 CBA法检测小鼠血清内细胞因子 |
| 4.2.8 检测小鼠血清ALT,AST水平 |
| 4.2.9 处理小鼠肝脏组织和制备切片 |
| 4.2.10 小鼠肝脏组织HE染色 |
| 4.2.11 免疫组化检测小鼠肝组织内HBsAg和HBcAg |
| 4.2.12 数据统计处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 rAAV8/1.3 HBV小鼠模型的构建 |
| 4.3.2 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制同时伴随着肝脏炎症的产生 |
| 4.3.3 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制的同时伴随着T细胞亚群比例及免疫细胞因子的变化 |
| 4.3.4 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制具有药物剂量依赖性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制相关机制的初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠体内CD4~+和CD8~+T细胞的剔除 |
| 5.2.2 流式细胞术检测小鼠外周血的T细胞 |
| 5.2.3 小鼠血清HBsAg和肝脏组织内HBV DNA的检测 |
| 5.2.4 小鼠血清ALT水平检测 |
| 5.2.5 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 5.2.6 小鼠肝脏内淋巴细胞mRNA的提取及文库构建测序 |
| 5.2.7 数据统计处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CD4~+T和CD8~+T 细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建 |
| 5.3.2 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程相对于CD4~+ T细胞似乎更依赖于CD8~+ T细胞的作用 |
| 5.3.3 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程中基于mRNA测序的小鼠肝内浸润淋巴细胞的转录组学研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）HBV感染的动物模型研究进展（论文提纲范文）
| 1 HBV转基因小鼠模型 |
| 2 HDI小鼠模型 |
| 3 AAV-HBV转染小鼠模型 |
| 4 cccDNA替代小鼠模型 |
| 5 人鼠嵌合肝脏小鼠模型 |
| 5.1 uPA-SCID小鼠 |
| 5.2 FRG小鼠 |
| 5.3 TK-NOG小鼠 |
| 5.4 AFC8小鼠 |
| 5.5 URG?小鼠 |
| 6 小结 |
（4）SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HBV感染促进己糖胺生物合成途径 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 SAMHD1蛋白O-GlcNAc修饰增强其抑制HBV的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 体内实验验证HBV感染后促进SAMHD1蛋白O-GlcNAc修饰 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 O-GlcNAc修饰与病毒感染免疫 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表的学术论文,申请课题,参加会议及获奖情况 |
（5）Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 Id1在HBV表达的环境中发生下调 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中pgRNA的表达水平 |
| 2.2 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中Id1和HBc的蛋白表达水平 |
| 2.3 HBV复制在细胞水平对Id1表达水平的影响 |
| 2.4 比较HBV转基因小鼠和普通C57 小鼠中Id1 蛋白表达水平 |
| 2.5 HBV感染HepG2-NTCP对 Id1 表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Id1通过抑制核心启动子的活性下调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.2 过表达Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.3 过表达Id1对HepG2-NTCP模型中HBV复制水平的影响 |
| 2.4 过表达Id1对HBV4个启动子活性的影响 |
| 2.5 沉默Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.6 沉默Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.7 过表达Id1对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 E2F4通过激活核心启动子的活性上调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1筛查对HBV转录调控的转录因子的影响 |
| 2.2 HepG2 转染HBV1.1 倍体分析HLH转录因子表达变化 |
| 2.3 过表达E2F4激活HBV核心启动子活性 |
| 2.4 过表达E2F4促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中E2F4的蛋白表达水平 |
| 2.6 沉默E2F4对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Id1 通过结合E2F4 并阻断其对HBV核心启动子的激活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Id1抑制E2F4的核转移 |
| 2.2 Id1和E2F4的相互作用 |
| 2.3 E2F4介导Id1对HBV抑制作用 |
| 2.4 E2F4通过识别核心启动子促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 Id1阻断核心启动子对E2F4的招募 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 E2F4 通过识别结合Cp启动子上5'-1758TTAAAGGTC1766-3'位点对HBV表达调控中的实现促进作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选E2F4在Cp启动子上的识别位点 |
| 2.2 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'是E2F4和Cp的相互作用的基础 |
| 2.3 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的突变体导致E2F4和Id1 失去对HBV调控作用 |
| 2.4 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的保守性是E2F4和Id1对A-D基因型HBV发挥调控作用的基础 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的文章 |
（6）SIRT6抑制剂，OSS128167对HBV复制的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 体外验证SIRT6 抑制剂,OSS_128167对HBV复制的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 小分子化合物、质粒和抗体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 MTS实验分析OSS_128167在HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞中的半数细胞毒性浓度(CC50) |
| 1.2.3 HBV core DNA的提取及检测(real-time PCR) |
| 1.2.4 Southern blot |
| 1.2.5 RNA的提取及检测 |
| 1.2.6 ELISA检测HBsAg的分泌 |
| 1.2.7 ELISA检测HBeAg的分泌 |
| 1.2.8 Western blot |
| 1.2.9 分析OSS_128167对HepG2.2.15和已感染HBV的HepG2-NTCP细胞中HBV复制的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 OSS_128167在HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞中的半数细胞毒性浓度(CC50)大于400μM |
| 2.2 OSS_128167 可降低HepG2.2.15 和已感染HBV的 HepG2-NTCP细胞中HBV的复制水平 |
| 2.3 OSS_128167 可降低HepG2.2.15 和已感染HBV的 HepG2-NTCP细胞中HBV3.5-kb RNA的水平 |
| 2.4 OSS_128167 可降低HepG2.2.15 和已感染HBV的 HepG2-NTCP细胞中HBV蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体内验证SIRT6 抑制剂,OSS_128167 的抗病毒作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 抗体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HBV转基因小鼠实验流程 |
| 1.2.2 小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)水平的检测 |
| 1.2.3 小鼠血清中HBV DNA的提取与检测 |
| 1.2.4 小鼠血清中HBsAg和 HBeAg水平的检测 |
| 1.2.5 小鼠肝脏中HBV DNA的提取与检测 |
| 1.2.6 小鼠肝脏中HBV RNAs的提取与检测 |
| 1.2.7 免疫组化小鼠肝脏中HBc蛋白质水平的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 OSS_128167 处理不影响HBV转基因小鼠血清中ALT的水平 |
| 2.2 OSS_128167 处理后,HBV转基因小鼠血清中病毒复制的指标呈时间依赖性降低 |
| 2.3 OSS_128167 处理可降低HBV转基因小鼠肝组织中病毒复制的指标 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SIRT6 抑制剂,OSS_128167 调控HBV转录和复制的分子机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 质粒和抗体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 验证SIRT6沉默水平 |
| 1.2.2 分析SIRT6 沉默对HBV转录和复制的影响 |
| 1.2.3 分析OSS_128167 是否通过调控SIRT6 影响HBV的转录和复制 |
| 1.2.4 cccDNA的提取及检测 |
| 1.2.5 免疫荧光技术检测SIRT6 沉默对HBc蛋白质水平的影响 |
| 1.2.6 双荧光素酶报告系统检测SIRT6对HBV启动子活性的影响 |
| 1.2.7 分析SIRT6对HBV Cp活性相关的转录因子表达的影响 |
| 1.2.8 分析SIRT6 沉默对PPARα表达水平的影响 |
| 1.2.9 分析OSS_128167对PPARα表达水平的影响 |
| 1.2.10 检测PPARα沉默对HBV核心启动子活性的影响 |
| 1.2.11 检测PPARα沉默对HBV转录和复制的影响 |
| 1.2.12 分析PPARα是否参与了SIRT6促HBV复制的过程 |
| 1.2.13 分析SIRT6和PPARα是否参与了OSS_128167 的抗HBV过程 |
| 2 结果 |
| 2.1 SIRT6 沉默可抑制HBV的转录和复制 |
| 2.2 OSS_128167 通过调控SIRT6 抑制HBV的转录和复制 |
| 2.3 SIRT6 过表达显着增强HBV Cp的转录活性 |
| 2.4 SIRT6 过表达上调转录因子PPARα的表达 |
| 2.5 OSS_128167 处理下调PPARα的表达 |
| 2.6 PPARα沉默可抑制HBV的转录和复制 |
| 2.7 SIRT6和PPARα参与了OSS_128167 的抗HBV过程 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
（7）雌三醇对乙型肝炎病毒转录和复制水平的影响（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 MTS实验分析雌三醇在HepG2.2.15细胞和HepG2-NTCP细胞中的半数细胞毒性浓度(CC50) |
| 1.2.3 接种HepG2.2.15细胞和药物处理 |
| 1.2.4 接种HepG2-NTCP细胞、感染HBV病毒粒子和药物处理 |
| 1.2.5 ELISA分析雌三醇对细胞中HBV表面抗原(HBsAg)分泌的影响 |
| 1.2.6 ELISA分析雌三醇对细胞中HBV e抗原(HBeAg)分泌的影响 |
| 1.2.7 RT-qPCR检测雌三醇对细胞中HBV RNA水平的影响 |
| 1.2.8 RT-qPCR检测雌三醇对细胞中HBV DNA水平的影响 |
| 1.2.9 HBV转基因小鼠的分组和实验处理 |
| 1.2.10 可见光比色法检测雌三醇处理后HBV转基因小鼠血清中AST和ALT的水平 |
| 1.2.11 ELISA检测雌三醇处理后HBV转基因小鼠血清中表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌水平 |
| 1.2.12 RT-qPCR检测雌三醇处理后HBV转基因小鼠血清中HBVDNA水平 |
| 1.2.13 RT-qPCR检测雌三醇处理后HBV转基因小鼠肝组织中HBVDNA水平 |
| 1.2.14 RT-qPCR检测雌三醇处理后HBV转基因小鼠肝组织中HBVRNA水平 |
| 2 结果 |
| 2.1 雌三醇对HepG2.2.15细胞和HepG2-NTCP细胞的毒性影响 |
| 2.2 雌三醇对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响 |
| 2.3 雌三醇对HepG2-NTCP细胞中HBV复制的影响 |
| 2.4 雌三醇在HBV转基因小鼠模型中的抗病毒效能 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
（8）基于PD-1/PD-L1和CD28/CD80信号通路的软肝饮对HBV转基因小鼠iNKT细胞功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要器材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 药物的制备 |
| 2.2 动物饲养及标本处理 |
| 2.2.1 小鼠分组及饲养 |
| 2.2.2 标本取材及处理 |
| 2.3 流式细胞仪检测 |
| 2.4 ELISA法检测 |
| 2.5 实时荧光定量PCR技术检测 |
| 2.6 组织石蜡包埋切片及HE染色 |
| 2.7 免疫荧光 |
| 3 数据统计及处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 各组小鼠血清中和肝组织中HBVDNA的表达水平 |
| 4.2 各组小鼠肝脏病理HE结果 |
| 4.3 各组小鼠肝功能以及肝纤维化等相关因子的监测 |
| 4.4 各组小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等炎性细胞因子水平的变化 |
| 4.5 各组小鼠外周血i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD表达水平情况比较 |
| 4.6 各组小鼠肝脏iNKT细胞及其表面 PD-1、PD-L1、CD28、CD80 表达水平比较 |
| 5 讨论 |
| 5.1 中医对CHB的认识 |
| 5.2 软肝饮组方特点及药物研究 |
| 5.3 软肝饮对HBV转基因小鼠抗病毒作用机制的探讨 |
| 5.4 软肝饮对HBV转基因小鼠i NKT细胞功能的探讨 |
| 6 结论 |
| 7 存在问题和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性乙型肝炎中PD1/PD-L1及CD28/CD80信号通路的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（9）反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一章 HBVC编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV转基因小鼠体内病毒活性与亚型检测结果 |
| 2.2 LNA稳定性鉴定结果 |
| 2.3 给药剂量对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 2.4 给药途径对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 2.5 给药方式对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二章 反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 反基因LNA对 HBV病毒DNA复制的影响 |
| 2.2 反基因LNA对 HBV病毒C-m RNA表达的影响 |
| 2.3 反基因LNA对 HBV病毒HBs Ag、HBe Ag表达的影响 |
| 2.4 反基因LNA对 HBV病毒HBcAg表达的影响 |
| 2.5 反基因LNA对肝肾脏细胞结构和功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒免疫治疗研究新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（10）新型HBV相关肝细胞癌小鼠模型的构建及其免疫致病机理探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝脏免疫系统的特性 |
| 1.1.1 肝脏的生理学结构 |
| 1.1.2 肝脏的免疫微环境 |
| 1.2 乙型肝炎病毒的研究模型 |
| 1.2.1 乙型肝炎病毒特征及其感染 |
| 1.2.2 乙型肝炎病毒研究的细胞模型 |
| 1.2.3 乙型肝炎病毒研究的动物模型 |
| 1.3 HBV慢性感染及其免疫致病机制 |
| 1.3.1 HBV导致慢性肝炎的发生发展 |
| 1.3.2 HBV导致肝癌的发生发展 |
| 1.4 结语 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 材料方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验细胞系 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.3.1 实验动物相关试剂 |
| 3.1.3.2 细胞培养的相关试剂 |
| 3.1.3.3 蛋白质分子生物学相关试剂 |
| 3.1.3.4 分子克隆技术相关试剂 |
| 3.1.3.5 细胞分离相关试剂 |
| 3.1.3.6 流式细胞术检测的相关试剂 |
| 3.1.3.7 组织病理学实验相关试剂 |
| 3.1.3.8 血清学指标检测相关试剂 |
| 3.1.4 实验器材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.1.1 细胞复苏 |
| 3.2.2.2 细胞传代 |
| 3.2.2.3 细胞冻存 |
| 3.2.2 抗体制备纯化 |
| 3.2.3 SDS-PAGE鉴定蛋白 |
| 3.2.4 抽提基因组DNA |
| 3.2.5 鉴定小鼠基因型 |
| 3.2.6 单个核细胞分离 |
| 3.2.7 小鼠肝细胞分离 |
| 3.2.8 小鼠肝脏Kupffer细胞分离 |
| 3.2.9 流式细胞术 |
| 3.2.10 组织病理切片 |
| 3.2.11 组织免疫化学染色 |
| 3.2.12 组织免疫荧光染色 |
| 3.2.13 TUNEL染色 |
| 3.2.14 细胞清除 |
| 3.2.15 细胞转输 |
| 3.2.16 Western Blot |
| 3.2.17 淋巴细胞分选 |
| 3.2.17.1 流式细胞术分选 |
| 3.2.17.2 磁珠分选技术 |
| 3.2.18 单细胞文库制备 |
| 3.2.19 组织RNA抽提和反转录 |
| 3.2.20 定量PCR |
| 3.2.21 转录组生物信息学分析 |
| 3.2.22 单细胞转录组生物信息学分析 |
| 3.2.23 ELISA检测 |
| 3.2.24 血清学指标检测 |
| 3.2.25 放射免疫法检测血清中anti-HBs滴度和HBeAg滴度 |
| 3.2.26 HBV-DNA测定 |
| 3.2.27 疫苗免疫 |
| 3.2.28 统计分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 利用肝细胞替代技术成功构建HBV相关肝癌小鼠模型 |
| 4.1.1 利用肝细胞替代技术在受者Fah~(-/-)小鼠中成功重建HBsAg~+肝细胞 |
| 4.1.2 HBsAg~+肝细胞重建小鼠(HBs-HepR)模型的动力学特征 |
| 4.1.3 HBsAg~+肝细胞重建诱导肝脏慢性炎症、纤维化和肝细胞癌的发生 |
| 4.2 HBs-HepR小鼠机体中诱导体液免疫耐受 |
| 4.2.1 HBsAg疫苗免疫HBs-HepR小鼠不能有效产生anti-HBs抗体 |
| 4.2.2 HBs-HepR小鼠脾脏中产生了更多的Treg细胞 |
| 4.2.3 HBs-HepR小鼠肝脏Kupffer细胞表现为免疫抑制的表型 |
| 4.3 抗原特异性CD8~+T细胞在HBV相关肝细胞癌发生发展中发挥关键作用 |
| 4.3.1 HBs-HepR小鼠体内存在抗原特异性的CD8~+T细胞 |
| 4.3.2 HBs-HepR小鼠CD8~+T细胞介导肝细胞凋亡 |
| 4.3.3 CD8~+T细胞清除显着降低HBs-HepR小鼠肝癌的发生率 |
| 4.3.4 HBsAg疫苗致敏的脾脏CD8~+T细胞转输显着逆转HBs-HepR-CD8KO小鼠HCC的发生 |
| 4.4 CD4~+T细胞及NK细胞对HBV相关肝细胞癌发生发展无明显影响 |
| 4.5 HBV相关肝细胞癌诱导T/NK细胞免疫耗竭 |
| 4.5.1 HBs-HepR小鼠在肿瘤形成阶段其免疫细胞在转录水平上表现为耗竭状态 |
| 4.5.2 HBs-HepR小鼠在肿瘤形成阶段其CD8~+T细胞功能耗竭 |
| 4.5.3 HBs-HepR小鼠在肿瘤形成阶段其CD4~+T细胞功能耗竭 |
| 4.5.4 HBs-HepR小鼠在肿瘤形成阶段其NK细胞功能耗竭 |
| 4.6 利用HBV全基因转基因小鼠来源的肝实质细胞建立HBV小鼠模型 |
| 4.6.1 利用肝细胞替代技术在受者Fah~(-/-)小鼠中成功重建HBV~+肝细胞(C57BL6/J背景) |
| 4.6.2 利用肝细胞替代技术在受者Fah~(-/-)小鼠中成功重建HBV~+肝细胞(BALB/c背景) |
| 第五章 讨论和总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
四、HBV感染研究的转基因小鼠模型（论文参考文献）
- [1]激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究[D]. 湛梦茹. 吉林大学, 2021(01)
- [2]HBV感染的动物模型研究进展[J]. 杨炜峰,苗振川,宋希军,尹明. 临床肝胆病杂志, 2021(05)
- [3]乙型肝炎病毒感染与复制模式的动物模型研究进展[J]. 张雨琪,郑海香,丁明珠,施佳健,王星. 中华传染病杂志, 2021(05)
- [4]SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究[D]. 胡杰. 重庆医科大学, 2021(01)
- [5]Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究[D]. 魏杰. 重庆医科大学, 2020(01)
- [6]SIRT6抑制剂，OSS128167对HBV复制的影响及机制研究[D]. 姜慧. 重庆医科大学, 2020(12)
- [7]雌三醇对乙型肝炎病毒转录和复制水平的影响[D]. 姚方龙. 重庆医科大学, 2020(12)
- [8]基于PD-1/PD-L1和CD28/CD80信号通路的软肝饮对HBV转基因小鼠iNKT细胞功能的影响[D]. 张先姚. 安徽中医药大学, 2020(03)
- [9]反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究[D]. 韦武均. 右江民族医学院, 2020
- [10]新型HBV相关肝细胞癌小鼠模型的构建及其免疫致病机理探究[D]. 郝晓磊. 中国科学技术大学, 2019(02)